Tabel 3 Aktivitas antimikrob fraksi senyawa hasil kromatografi kolom. Sistem Eluen dan Fraksi
Senyawa Strain Uji
PA SA
EPEC K1-1 CA
CT Klorofom-metanol 90-10
Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2
Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4
Fraksi BS13-5
Klorofom-metanol 80-20 Fraksi BS13-1
Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3
Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5
Fraksi BS13-6 Fraksi BS13-7
Fraksi BS13-8
Fraksi BS13-9 Fraksi BS13-10
Fraksi BS13-11 Klorofom-metanol 70-30
Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2
Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4
Fraksi BS13-5 Fraksi BS13-6
Klorofom-metanol 50-50 Fraksi BS13-1
Fraksi BS13-2 Fraksi BS13-3
Fraksi BS13-4 Fraksi BS13-5
Fraksi BS13-6 Fraksi BS13-7
Fraksi BS13-8
Klorofom-metanol 30-70 Fraksi BS13-1
Fraksi BS13-2 Klorofom-metanol 10-90
Fraksi BS13-1 Fraksi BS13-2
Fraksi BS13-3 Fraksi BS13-4
Fraksi BS13-5 -
- -
-
+ -
- -
- -
-
+ -
- -
+ -
- -
- -
-
- +
+ -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
-
+ -
- -
- -
-
+ -
- -
+ -
- -
- -
-
- -
+ -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
-
+ -
- -
- -
-
+ -
- -
+ -
- -
- -
-
- +
+ -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
-
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
-
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
-
Keterangan: + = Fraksi senyawa memiliki aktivitas terhadap strain uji. - = Fraksi senyawa tidak memiliki aktivitas terhadap strain uji.
Gambar 5 Aktivitas antibakteri berspektrum luas yang ditunjukkan oleh fraksi BS13-5 dan BS13-11 yang dielusi dari kolom dengan eluen klorofom-
metanol 90-10 dan klorofom metanol 80-20. K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6 mm.
Pemurnian Senyawa Antimikrob dengan Teknik Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Senyawa antimikrob yang terdapat dalam fraksi aktif dapat diekstraksi secara terpisah dari lempeng gel silika pada pengerjaan KLT. Fraksi BS13-5
merupakan fraksi yang membawa paling banyak senyawa aktif dibandingkan fraksi aktif lainnya Tabel 4.
Empat senyawa dengan nilai R
f
0.35, 0.41, 0.72, dan 0.87 berhasil didapatkan dari fraksi BS13-5 melalui teknik KLT preparatif Gambar 6.
Keempat senyawa tersebut memiliki aktivitas antibakteri. Analisis KLT untuk fraksi aktif BS13-7 hanya menghasilkan satu bercak senyawa pada nilai R
f
0.73. Dua senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri juga didapatkan dari fraksi
BS13-11. Kedua senyawa tersebut memiliki nilai R
f
0.27 dan 0.66 Gambar 6. Dua senyawa dengan nilai R
f
0.35 dan 0.41 dari fraksi aktif BS13-5 menunjukkan aktivitas antibakteri terbaik terhadap strain uji EPEC K1-1. Zona
bening yang dibentuk oleh kedua senyawa tersebut mencapai 12 mm untuk masing-masing senyawa Gambar 7.
BS13-5 BS13-11 BS13-5 BS13-11
BS13-5 BS13-11
EPEC K1-1 P. aeruginosa
S. aureus
K K K
Tabel 4 Hasil analisis kromatografi lapis tipis terhadap fraksi aktif. Fraksi Aktif
Eluen KLT Nilai R
f
Bercak Senyawa Aktif 254 nm
366 nm BS13-5
Etil asetat R
f
= 0.87 R
f
1 = 0.35; R
f
2 = 0.41; R
f
3 = 0.72 BS13-7
Klorofom-metanol 9:1
R
f
= 0.73 R
f
= 0.73
BS13-11 Klorofom-metanol
8:2 R
f
= 0.27; R
f
= 0.66
BS13-2 Klorofom-metanol
7:3 -
BS13-3 Klorofom-metanol
7:3 -
Gambar 6 Kromatografi lapis tipis fraksi aktif BS13-5 dan BS13-11 yang menunjukkan nilai R
f
senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Deteksi senyawa dilakukan pada panjang gelombang UV 366 nm.
Senyawa aktif R
f
0.35 Senyawa aktif
R
f
0.41 Senyawa aktif
R
f
0.72
Senyawa aktif R
f
0.27 Senyawa aktif
R
f
0.66
BS13-5 BS13-11
Gambar 7 Aktivitas antibakteri enam senyawa R
f
0.35, R
f
0.41, R
f
0.72, R
f
0.87, R
f
0.27 dan R
f
0.66 yang diperoleh dengan teknik KLT preparatif terhadap EPEC K1-1. K: Kontrol negatif; Diameter kertas cakram 6
mm.
Amplifikasi Fragmen DNA Penyandi Domain Ketosintase
Fragmen DNA penyandi domain ketosintase berhasil teramplifikasi dalam penelitian ini. Visualisasi DNA amplikon hasil PCR menggunakan elektroforesis
gel agarosa 1 bv memperlihatkan DNA penyandi domain ketosintase yang diperoleh dalam penelitian ini berukuran sekitar 700 pasang basa Gambar 8.
Kloning dan Analisis Bioinformatika
Kloning molekuler fragmen DNA penyandi domain ketosintase untuk ketiga isolat dalam penelitian ini telah berhasil dilakukan dengan menggunakan vektor
kloning pGEMT-Easy PROMEGA. Pemotongan plasmid rekombinan hasil isolasi dari beberapa koloni putih E. coli
DH5α menggunakan enzim restriksi EcoRI telah menghasilkan pita berukuran sekitar 3000 pb yang menunjukkan
ukuran pGEMT-Easy, serta pita berukuran sekitar 700 pb yang menunjukkan ukuran dari fragmen penyandi domain ketosintase Gambar 9.
BS13-5 R
f
0.35 BS13-5
R
f
0.41
BS13-11 R
f
0.27 BS13-11
R
f
0.66 BS13-5
R
f
0.72
BS13-5 R
f
0.87 K
K
K
K
K K
K K
Hasil analisis bioinformatika menggunakan program BLASTX menunjukkan bahwa sekuen fragmen penyandi domain ketosintase dari isolat
HAL-13 dan HAA-01 memiliki homologi sebesar 98 dengan domain ketosintase dari kluster gen PKS tipe 1 B. subtilis BSN5. Sedangkan fragmen
penyandi domain ketosintase dari isolat HAL-74 memiliki homologi sebesar 87 dari fragmen penyandi ketosintase B. amyloliquefaciens Tabel 5.
Gambar 8 Elektroforesis gel agarosa fragmen DNA penyandi domain ketosintase yang berukuran 700 pb hasil amplifikasi dengan teknik PCR. M = 1 kb
DNA Ladder; Lane 1 = HAL-13; Lane 2 = HAL-74; Lane 3 = HAA-01.
Gambar 9 Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan pGEMT-Easy-KS yang dipotong dengan enzim restriksi EcoR1. Lane 1: 1 Kb DNA Ladder
; Lane 2, 3, dan 4: Fragmen DNA penyandi domain ketosintase isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01.
M 1 2 3
1500 pb 750 pb
500 pb 10000 pb
3000 pb
750 pb pGEMT-Easy 3kpb
DNA sisipan 700 pb 700 pb
M 1 2 3
