Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik 16S rRNA
IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT ISOLAT BIOGEN
CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Bakteri
Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik PCR 16S rRNAadalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Rizki Muhammad Perceka
NIM G84090039
ABSTRAK
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CCE76 dengan Teknik PCR 16S rRNA. Dibimbing oleh SURYANI dan TRI PUJI
PRIYATNO.
Bakteri endofit merupakan bakteri yang mampu bersimbiosis dengan
organisme lain secara mutualisme untuk memenuhi kebutuhan nutrisinya. Bakteri
endofit bermanfaat dalam bidang pertanian, terkait dengan perlawanan terhadap
patogen atau kemampuan untuk membentuk metabolit yang dapat ditranspor satu
sama lain pada bakteri endofit dan jaringan tanaman. Salah satu isolat bakteri
endofit yang berhasil dikoleksi adalah isolat Biogen CC-E76. Penentuan strain
bakteri endofit ini belum dilakukan. Tujuan penelitian adalah melakukan
identifikasi strain bakteri endofit menggunakan teknik PCR 16S rRNA, yaitu
teknik identifikasi yang mengacu pada tingkat homologi sekuen RNA subunit
kecil yang berukuran 16S pada beragam bakteri. Analisis dilakukan dengan Hasil
penyejajaran (blast) sekuen DNA menunjukkan bahwa isolat Biogen CC-E76
merupakan strain bakteri Burkholderia sp. bB24 dengan tingkat homologi sebesar
97%.
Kata kunci: Blast, Burkholderia sp. bB24, Isolat Biogen CC-E76, PCR 16S rRNA.
ABSTRACT
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Indentification of Endophytic Bacteria Biogen
CC-E76 Isolate by 16S rRNA PCR Technique. Supervised by SURYANI and TRI
PUJI PRIYATNO.
Endophytic bacteria is bacteria, which is capable to symbiosis with other
organisms mutualistically to fulfill nutrition needs. Endophytic bacteria is useful
in the fields of agriculture, associated with resistance to pathogens or the ability to
form a metabolite that can be transported to each other on endophytic bacteria and
plant tissues. One of the endophytic bacterial isolate that successfully collected
was Biogen CC-E76 isolate. Strain determination of the endophytic bacteria
hasn’t been done. The purpose of this research was to identify endophytic bacteria
strain by using 16S rRNA PCR technique, the identifying technique depended on
the degree of sequence homology of the small subunit RNA size 16S in diverse
bacteria. DNA sequence alignment result (blast) showed that the Biogen CC-E76
isolate is a strain of the bacterium Burkholderia sp. bB24 with homology level of
97%.
Keywords: Biogen CC-E76 isolate, Blast, Burkholderia sp. bB24,16S rRNA PCR
technique.
IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT ISOLAT BIOGEN
CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik
16S rRNA
Nama
: Rizki Muhammad Perceka
NIM
: G84090039
Disetujui oleh
Dr Suryani, SP, MSc
Pembimbing I
Dr Tri Puji Priyatno, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmaanirrahiim
Puji serta syukur penulis ucapkan pada Allah, Tuhan semesta alam yang
telah mencurahkan nikmat dan kemudahan dalam hidup, hingga penulis mampu
menyelesaikan penelitian ini dengan lancar. Tak lupa pula shalawat serta salam
kepada Nabi besar penyampai risalah Allah, penerus ajaran Ibrahim dan penutup
para nabi yaitu Nabi Muhammad Sallallahu ‘Alaih Wasallam, yang berkat jasa
beliau manusia bisa mengenal Allah lewat Islam.
Terima kasih juga penulis ucapkan pada Ibu Dr Suryani, SP, MSc dan
Bapak Dr Tri Puji Priyatno, MSc atas bimbingan, arahan berikut kritik dan
sarannya dalam penulisan hasil penelitian ini. Secara khusus juga penulis ucapkan
terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak Dadang Djatnika Sukandar
dan Ibu Ika Kartarineka atas doa dan dorongan semangat untuk kesuksesan,
kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada Kakak Rida Nurbanida Hayyinuriah dan Adik penulis Rifan
Muhammad Furqon, peneliti dari biogen Bu Ifa dan Mba Pipit serta teman-teman
dari biokimia khususnya Ka Faris, Mba Titi, Nasruddin, Solikers, Jarvis dan
teman-teman BEM KM IPB yang dengan kepedulian mereka penulis dapat
menyelesaikan penelitian ini.
Semoga hasil penelitian ini berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya
dalam pengembangan dan penerapan ilmu biokimia dalam bidang pertanian.
Bogor, Februari 2014
Rizki Muhammad Perceka
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Lokasi Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
6
6
10
12
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
Elektroforegram gel isolat DNATotal
Elektroforesis agarosa gel produk PCR 16S rRNA
Kromatogram hasil sequencing isolat Biogen CC-E76
Hasil blast sekuen isolat Biogen CC-E76
Pohon filogeni sekuen 16S rRNA
6
7
8
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Alur Penelitian
2 Sekuen 16S rDNA B. Cepacia
15
16
PENDAHULUAN
Bakteri endofit adalah bakteri yang bersimbiosis dengan tanaman secara
mutualisme. Interaksi ini berperan dalam proses penyediaan bahan baku
metabolisme seluler dan peningkatan pertahanan tanaman setelah berintegrasi
dengan bakteri endofit. Bakteri endofit memperoleh komponen esensial dari
tanaman untuk menghasilkan senyawa organik yang dibutuhkan (Eyberger 2006).
Pengetahuan tentang bakteri endofit, sifat, karakteristik dan interaksi yang
terbentuk dengan inang berperan penting dalam bidang pertanian. Hal ini dapat
digunakan untuk meningkatkan produktivitas dan kualitas komoditi pertanian,
seperti sifat resistensi terhadap hama tanaman dan kemampuan pemeliharaan
tanaman. Bakteri endofit yang bersifat antogonis berpotensi untuk digunakan
sebagai agen biokontrol karena relung ekologinya sama dengan patogen tanaman,
sehingga aplikasinya dapat mengenai sasaran yang tepat (Strobel et al. 2004).
Bakteri endofit juga dapat menghasilkan fitohormon yang mampu menstimulasi
perkecambahan dan pertumbuhan tanaman serta meningkatkan serapan hara
(Bacon et al. 2000). Peran menguntungkan lain dari bakteri endofit adalah fiksasi
nitrogen, peningkatan ketahanan kekeringan, perlindungan termal, kelangsungan
hidup dibawah tekanan osmotik dan potensi mendegradasi beberapa polutan (Ezra
et al. 2004).
Salah satu koleksi bakteri endofitik yang tersedia di Balai Penelitian Biogen
adalah isolat Biogen CC-E76. Isolat bakteri ini diperoleh dari tanaman padi yang
memiliki ketahanan yang baik terhadap hama. Penentuan strain isolat bakteri ini
belum dilakukan. Oleh karena itu, identifikasi bakteri isolat endofit perlu
dilakukan, agar identitasnya dapat diketahui dengan jelas. Cara memperoleh
informasi tentang strain bakteri endofit, sangat beragam, mulai dari pengamatan
bentuk sel, habitat, ukuran, sampai ke tingkat molekuler. Pengamatan di tingkat
molekuler, yaitu identifikasi materi genetiknya, berupa DNA. Perkembangan
teknologi informasi genetika memungkinkan penyediaan sarana identifikasi
mikroba mengalami perkembangan yang besar. Salah satunya adalah penemuan
asam nukleat sebagai materi genetika (Cole et al. 2013).
RNA ribosomal pada organisme prokariot terdiri dari dua subunit, yaitu
subunit besar yang berukuran 50S dan subunit kecil yang berukuran 30S. Subunit
kecil ini mengandung rRNA yang berukuran 16S. Sekuen nukleotida 16S
ribosomal DNA merupakan salah satu perangkat biologis yang dapat diterapkan
dalam pengidentifikasian strain bakteri isolat Biogen CC-E76. Sekuen 16S
ribosomal DNA merupakan materi genetika yang terletak pada ribosom subunit
kecil. Satuan S (Svedberg) menunjukan kemampuan DNA untuk mengalami
sedimentasi pada waktu 10-13 detik (Cole et al. 2013). Sekuen ini umumnya
digunakan dalam penentuan hubungan kekerabatan strain bakteri melalui proses
penyejajaran (Cole et al. 2013). Sekuen 16S digunakan karena bersifat spesifik
untuk prokariot, sehingga kesalahan (galat) yang terjadi selama proses
penyejajaran nukleotida dapat diminimalisir, yang membedakannya dengan
eukariot. Cara lain yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi strain bakteri
adalah pengamatan morfologi sel bakteri isolat Biogen CC-E76. Hasil
penyejajaran (blast) sekuen nukleotida 16S ribosomal DNA pada bakteri isolat
Biogen CC-E76 dengan sekuen nukleotida pada database, diharapkan dapat
2
mengidentifikasi strain bakteri dan hubungan kekerabatan dengan bakteri lain
berdasarkan tingkat homologi sekuen nukleotida.
Bakteri endofit mampu berinteraksi dengan tanaman secara mutualisme.
Salah satu jenis bakteri endofit telah berhasil dikoleksi, yaitu isolat Biogen CCE76. Isolat ini belum diketahui dengan jelas strainnya, sehingga perlu dilakukan
identifikasi. Identifikasi strain bakteri isolat Biogen CC-E76 dapat dilakukan
dengan membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA isolat tersebut dengan
sekuen nukleotida DNA yang tersedia pada database NCBI.
Penelitian ini bertujuan melakukan identifikasi bakteri isolat Biogen CCE76 melalui teknik PCR16S rRNA. Penelitian ini juga bermanfaat untuk
memperoleh informasi tentang strain bakteri endofit Biogen CC-E76, sehingga
kajian tentang karakteristiknya dapat diaplikasikan pada bidang pertanian, seperti
produksi protein rekombinan yang berperan dalam menginduksi ketahanan
tanaman terhadap hama.
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga bulan Desember 2013
di Laboratorium Biokimia, Balai Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Biogen CC-E76
yang berasal dari daun padi. 10 gL-1 tripton, 10 gL-1 NaCl, dan 5 gL-1 ekstrak
khamir, 100 µL-1larutan I (50 mM glukosa, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 8.0, 2
mgmL-1 lisozyme, 200 µL larutan II (0.2 M NaOH, 1% SDS), 150 µl larutan III
(3 M NaOAc pH 4.8), 300 µL phenol kloroform, etanol absolut 2 x volume, 800
µL etanol 70%, 30 µL buffer TE atau ddH2O,larutan PCI, 0.3 g agarosa, 30 mL
TBE 0.5x, 1 L EtBr, bufer TBE 0.5x, 1 L loading buffer,17.5 L MW
(Molecular Water), 2.5 L Bufer 10x, 0.75 L MgCl2, 1 L dNTPs, 1 L primer
forward, 1 L primer reverse dan 0.25 L Taq polymerase, 3.5 L DNA isolat
Biogen CC-E76,250 L larutan resuspensi yang mengandung RNAse, 30 L bufer
elusi, media LB, bufer lisis dan PCR mix.
Alat yang digunakan diantaranya adalah autoklaf, laminar air flow cabinet
Hitachi Clear Bench, inkubator, sentrifus Hitachi CR-21F, gel elektroforesis
Biorad Mini Protean, dan peralatan gelas, spektrofotometer UV-Vis Hitachi U
2000 untuk analisis spektrofotometri. Selain itu, dibutuhkan juga mikropipet
Gilson Pipetman, magnetic stirrer, dan pH meter Thermo Orion 410 A+.
3
Metode Penelitian
Identifikasi Bakteri Isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan
membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA dari isolat tersebut dengan sekuen
nukleotida yang tersedia pada database. Tahapan awal yang dilakukan adalah
isolasi dan purifikasi bakteri isolat Biogen CC-E76 dari akar tanaman padi.
Selanjutnya akar padi dihomogenisasi, kemudian homogenat tersebut diinokulasi
ke media Luria Bertani (LB) padat. Selanjutnya bakteri isolat Biogen CC-E76
diregenerasi kembali ke media cair Luria Bertani (LB). DNA total bakteri isolat
Biogen CC-E76 diisolasi dengan metode alkalin lisis. Hasil isolasi DNA total
bakteri isolat Biogen CC-E76 diamati tingkat kemurniannya menggunakan teknik
elektroforesis dan spektrofotometri. Setelah diperoleh DNA total murni, kemudian
amplifikasi gen 16S rRNA bakteri isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan teknik
PCR. Produk amplifikasi gen 16S rRNA selanjutnya dikonfirmasi melalui
elektroforesis. Fragmen DNA atau pita yang terbentuk pada gel agarosa
diekstraksi kembali untuk keperluan analisis sekuen DNA. Kemudian hasil
purifikasi digunakan untuk analisis sekuen DNA melalui proses pengurutan DNA.
Sekuen DNA yang telah diperoleh selanjutnya disejajarkan (blast) dengan sekuen
DNA yang terdapat pada database. Hasil blast ini digunakan untuk membuat
pohon filogenetik, yang menyatakan hubungan kekerabatan berdasarkan tingkat
homologi.
Penyegaran Bakteri
Media Luria-Bertani (LB) dibuat sebanyak 100 mL dengan komposisi 10
g/L tripton, 10 g/L NaCl, dan 5 g/L ekstrak khamir. Campuran komposisi media
dilarutkan dengan akuades sampai 100 mL. Media dibagi ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15
menit pada tekanan 1.5 atm dan suhu 121oC. Satu tabung media diinokulasi
dengan satu ose isolat Biogen CC-E76 dari stok agar miring. Kultur diinkubasi
dalam suhu ruang selama 16 jam sambil digoyang dengan kecepatan 75 rpm
(Gozan 2007).
Isolasi DNA Total Bakteri dengan Metode Alkalin Lisis
Satu koloni bakteri diinokulasi ke dalam 10 ml LB dan diinkubasi semalam
pada suhu 37 °C, kemudian dipindahkan ke tabung Eppendorf 1.5 mL dan
disentrifugasi 12.000 rpm pada 4 °C selama 2 menit. Setelah itu supernatan
dibuang. Lalu pelet diresuspensi dengan 100 µL larutan I dan dikocok dengan
menggunakan vortex. Selanjutnya campuran tersebut ditambahkan 200 µL larutan
II dan dikocok dengan menggunakan vortex. Suspensi tersebut kemudian
ditambahkan 150 µL larutan III (3 M NaOAc pH 4.8), tabungnya dibolak-balik
agar bercampur dan diinkubasi 15-30 menit pada suhu ruang. Campuran tersebut
lalu disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung
Eppendorf baru dan ditambahkan 300 µL fenol kloroform. Selanjutnya suspensi
tersebut dikocok dengan menggunakan vortex lalu sentrifus 12.000 rpm 5 menit.
Larutan yang paling atas dipindahkan ke tabung yang baru dan ditambahkan
etanol absolut 2x volume dan disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit.
Supernatannya lalu dibuang dan dicuci dengan 800 µL etanol 70%. Selanjutnya
suspensi dikocok dengan menggunakan vortex dan disentrifus 12.000 rpm selama
4
5 menit. Supernatannya kemudian dibuang, pelet dikering-anginkan lalu
diresuspensi dengan 30 µL buffer TE atau ddH2O (Adams 2004).
Elektroforesis Gel Agarosa
Pembuatan Gel Agarosa 1%. Sebanyak 0.3 gram agarosa ditambah
dengan 30 mL TBE 0.5x, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut dengan
sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian tambahkan 1 L
EtBr dan kocok perlahan hingga homogen, lalu dituang ke dalam cetakan yang
dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira 30 menit
sampai gel tersebut benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan dalam
alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TBE 0.5x (Boyer 2000).
Elektroforesis Gel Agarosa. Sebanyak 1 L sampel DNA dicampurkan
dengan 1 L loading buffer di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet
kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah elektroforesis
selesai, gel dikeluarkan dari alat elektroforesis kemudian dilihat dengan bantuan
sinar Ultraviolet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam
perangkat dokumentasi gel (gel-documentation) (Harisha 2007).
Amplifikasi 16S rRNA
Identifikasi bakteri endofit dari isolat Biogen CC-E76 dilakukan
berdasarkan sekuen nukleotida 16S rRNA. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan
dengan sepasang primer 63F (C A G G C C T A) dan 1387R (G G G C G G W G
T G T A C A A G G C) menggunakan mesin PCR. Komposisi 20 µL reaksi PCR
terdiri dari 2 µL 10x bufer PCR, 1.5 µL 50 mM MgCl2, 0.5 µL 4 mM dNTP, 1 µL
20 mM primer forward, 1 µL 20 mM primer reverse, 0.5 µLTaq Polymerase, dan
13.5 µL air destilasi steril. Reaksi PCR diletakan dalam tabung mikro berukuran
200 µL. DNA cetakan untuk PCR menggunakan koloni tunggal bakteri dari
biakan yang berumur 18 jam pada media LB agar. Mesin PCR dijalankan dengan
program sebagai berikut, yaitu denaturasi awal DNA pada suhu 94°C selama 10
menit, denaturasi kedua 94°C selama 1 menit, annealing 50°C selama 5 detik, dan
extension 72°C selama 1 menit 30 detik dengan siklus sebanyak 35 kali.
Penentuan suhu annealing dilakukan secara bertingkat pada interval suhu 50-60oC.
Hasil penentuan tersebut menunjukan bahwa suhu annealing yang memberikan
hasil amplikon terbaik yang dapat dilihat pada pita elektroforegram, yaitu pada
suhu 50oC. Produk PCR diidentifikasi pada gel agarosa yang dielektroforesis
dengan 90 volt selama 30 menit dalam bufer TAE (Harisha 2007).
Ekstraksi DNA dari Gel Agarosa
Pita DNA target hasil amplifikasi 16S rRNA yang sesuai dengan ukuran
panjang basanya (1.5 kb) dipotong dari gel agarosa dan dilakukan purifikasi DNA
menggunakan kit agarose gel extraction. Langkah awal dengan dilakukan
pemotongan gel agarosa yang mengandung fragmen DNA hingga halus di cawan
Petri. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung yang telah dilapisi membran
hybon+150µL larutan penyangga elusi, kemudian disentrifugasi pada 14.000 rpm
selama dua menit dan ditambahkan larutan PCI. Tahap selanjutnya sampel
dikocok selama satu menit dengan vortex, kemudian disentrifugasi pada 1.400
rpm selama lima menit. Setelah sentrifugasi tersebut akan terdapat endapan,
kemudian diambil sebanyak 500 µL sepernatan dan ditambahkan 2 µL etanol
5
absolut yang dilakukan dalam suhu rendah selama 15 menit. Tahap selanjutnya
sampel disentrifugasi pada 10.000 rpm selama dua puluh menit, lalu diambil
peletnya dan ditambahkan 500 µL etanol 70%. Kemudian sentrifugasi pada
10.000 rpm selama lima menit lalu divakum dan diresuspensi dengan 15 µL H2O
(Ali 2009).
Pengurutan (sequencing) dan Analisis Sekuen Basa Nukelotida
DNA produk hasil amplifikasi (amplikon) 16S rRNA Isolat Biogen CCE76 yang telah diperoleh lalu diurutkan basa nukleotidanya. Pengurutan basa
nuleotida (sequencing) dilakukan di PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta.
Hasil sekuen selanjutnya dianalisis dengan program bioinformatika yaitu dengan
program BLASTX (www.ncbi.nlm.nih.gov). Program BLASTX mentranslasi
sekuen nukleotida menjadi protein, kemudian membandingkannya dengan protein
yang terdapat pada pangkalan data (database). Homologi yang tinggi ditunjukkan
dengan nilai skor bits yang semakin besar (>150) dan E value yang kecil (
CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Bakteri
Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik PCR 16S rRNAadalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Rizki Muhammad Perceka
NIM G84090039
ABSTRAK
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CCE76 dengan Teknik PCR 16S rRNA. Dibimbing oleh SURYANI dan TRI PUJI
PRIYATNO.
Bakteri endofit merupakan bakteri yang mampu bersimbiosis dengan
organisme lain secara mutualisme untuk memenuhi kebutuhan nutrisinya. Bakteri
endofit bermanfaat dalam bidang pertanian, terkait dengan perlawanan terhadap
patogen atau kemampuan untuk membentuk metabolit yang dapat ditranspor satu
sama lain pada bakteri endofit dan jaringan tanaman. Salah satu isolat bakteri
endofit yang berhasil dikoleksi adalah isolat Biogen CC-E76. Penentuan strain
bakteri endofit ini belum dilakukan. Tujuan penelitian adalah melakukan
identifikasi strain bakteri endofit menggunakan teknik PCR 16S rRNA, yaitu
teknik identifikasi yang mengacu pada tingkat homologi sekuen RNA subunit
kecil yang berukuran 16S pada beragam bakteri. Analisis dilakukan dengan Hasil
penyejajaran (blast) sekuen DNA menunjukkan bahwa isolat Biogen CC-E76
merupakan strain bakteri Burkholderia sp. bB24 dengan tingkat homologi sebesar
97%.
Kata kunci: Blast, Burkholderia sp. bB24, Isolat Biogen CC-E76, PCR 16S rRNA.
ABSTRACT
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Indentification of Endophytic Bacteria Biogen
CC-E76 Isolate by 16S rRNA PCR Technique. Supervised by SURYANI and TRI
PUJI PRIYATNO.
Endophytic bacteria is bacteria, which is capable to symbiosis with other
organisms mutualistically to fulfill nutrition needs. Endophytic bacteria is useful
in the fields of agriculture, associated with resistance to pathogens or the ability to
form a metabolite that can be transported to each other on endophytic bacteria and
plant tissues. One of the endophytic bacterial isolate that successfully collected
was Biogen CC-E76 isolate. Strain determination of the endophytic bacteria
hasn’t been done. The purpose of this research was to identify endophytic bacteria
strain by using 16S rRNA PCR technique, the identifying technique depended on
the degree of sequence homology of the small subunit RNA size 16S in diverse
bacteria. DNA sequence alignment result (blast) showed that the Biogen CC-E76
isolate is a strain of the bacterium Burkholderia sp. bB24 with homology level of
97%.
Keywords: Biogen CC-E76 isolate, Blast, Burkholderia sp. bB24,16S rRNA PCR
technique.
IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT ISOLAT BIOGEN
CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA
RIZKI MUHAMMAD PERCEKA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik
16S rRNA
Nama
: Rizki Muhammad Perceka
NIM
: G84090039
Disetujui oleh
Dr Suryani, SP, MSc
Pembimbing I
Dr Tri Puji Priyatno, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmaanirrahiim
Puji serta syukur penulis ucapkan pada Allah, Tuhan semesta alam yang
telah mencurahkan nikmat dan kemudahan dalam hidup, hingga penulis mampu
menyelesaikan penelitian ini dengan lancar. Tak lupa pula shalawat serta salam
kepada Nabi besar penyampai risalah Allah, penerus ajaran Ibrahim dan penutup
para nabi yaitu Nabi Muhammad Sallallahu ‘Alaih Wasallam, yang berkat jasa
beliau manusia bisa mengenal Allah lewat Islam.
Terima kasih juga penulis ucapkan pada Ibu Dr Suryani, SP, MSc dan
Bapak Dr Tri Puji Priyatno, MSc atas bimbingan, arahan berikut kritik dan
sarannya dalam penulisan hasil penelitian ini. Secara khusus juga penulis ucapkan
terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak Dadang Djatnika Sukandar
dan Ibu Ika Kartarineka atas doa dan dorongan semangat untuk kesuksesan,
kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada Kakak Rida Nurbanida Hayyinuriah dan Adik penulis Rifan
Muhammad Furqon, peneliti dari biogen Bu Ifa dan Mba Pipit serta teman-teman
dari biokimia khususnya Ka Faris, Mba Titi, Nasruddin, Solikers, Jarvis dan
teman-teman BEM KM IPB yang dengan kepedulian mereka penulis dapat
menyelesaikan penelitian ini.
Semoga hasil penelitian ini berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya
dalam pengembangan dan penerapan ilmu biokimia dalam bidang pertanian.
Bogor, Februari 2014
Rizki Muhammad Perceka
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Lokasi Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
6
6
10
12
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
Elektroforegram gel isolat DNATotal
Elektroforesis agarosa gel produk PCR 16S rRNA
Kromatogram hasil sequencing isolat Biogen CC-E76
Hasil blast sekuen isolat Biogen CC-E76
Pohon filogeni sekuen 16S rRNA
6
7
8
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Alur Penelitian
2 Sekuen 16S rDNA B. Cepacia
15
16
PENDAHULUAN
Bakteri endofit adalah bakteri yang bersimbiosis dengan tanaman secara
mutualisme. Interaksi ini berperan dalam proses penyediaan bahan baku
metabolisme seluler dan peningkatan pertahanan tanaman setelah berintegrasi
dengan bakteri endofit. Bakteri endofit memperoleh komponen esensial dari
tanaman untuk menghasilkan senyawa organik yang dibutuhkan (Eyberger 2006).
Pengetahuan tentang bakteri endofit, sifat, karakteristik dan interaksi yang
terbentuk dengan inang berperan penting dalam bidang pertanian. Hal ini dapat
digunakan untuk meningkatkan produktivitas dan kualitas komoditi pertanian,
seperti sifat resistensi terhadap hama tanaman dan kemampuan pemeliharaan
tanaman. Bakteri endofit yang bersifat antogonis berpotensi untuk digunakan
sebagai agen biokontrol karena relung ekologinya sama dengan patogen tanaman,
sehingga aplikasinya dapat mengenai sasaran yang tepat (Strobel et al. 2004).
Bakteri endofit juga dapat menghasilkan fitohormon yang mampu menstimulasi
perkecambahan dan pertumbuhan tanaman serta meningkatkan serapan hara
(Bacon et al. 2000). Peran menguntungkan lain dari bakteri endofit adalah fiksasi
nitrogen, peningkatan ketahanan kekeringan, perlindungan termal, kelangsungan
hidup dibawah tekanan osmotik dan potensi mendegradasi beberapa polutan (Ezra
et al. 2004).
Salah satu koleksi bakteri endofitik yang tersedia di Balai Penelitian Biogen
adalah isolat Biogen CC-E76. Isolat bakteri ini diperoleh dari tanaman padi yang
memiliki ketahanan yang baik terhadap hama. Penentuan strain isolat bakteri ini
belum dilakukan. Oleh karena itu, identifikasi bakteri isolat endofit perlu
dilakukan, agar identitasnya dapat diketahui dengan jelas. Cara memperoleh
informasi tentang strain bakteri endofit, sangat beragam, mulai dari pengamatan
bentuk sel, habitat, ukuran, sampai ke tingkat molekuler. Pengamatan di tingkat
molekuler, yaitu identifikasi materi genetiknya, berupa DNA. Perkembangan
teknologi informasi genetika memungkinkan penyediaan sarana identifikasi
mikroba mengalami perkembangan yang besar. Salah satunya adalah penemuan
asam nukleat sebagai materi genetika (Cole et al. 2013).
RNA ribosomal pada organisme prokariot terdiri dari dua subunit, yaitu
subunit besar yang berukuran 50S dan subunit kecil yang berukuran 30S. Subunit
kecil ini mengandung rRNA yang berukuran 16S. Sekuen nukleotida 16S
ribosomal DNA merupakan salah satu perangkat biologis yang dapat diterapkan
dalam pengidentifikasian strain bakteri isolat Biogen CC-E76. Sekuen 16S
ribosomal DNA merupakan materi genetika yang terletak pada ribosom subunit
kecil. Satuan S (Svedberg) menunjukan kemampuan DNA untuk mengalami
sedimentasi pada waktu 10-13 detik (Cole et al. 2013). Sekuen ini umumnya
digunakan dalam penentuan hubungan kekerabatan strain bakteri melalui proses
penyejajaran (Cole et al. 2013). Sekuen 16S digunakan karena bersifat spesifik
untuk prokariot, sehingga kesalahan (galat) yang terjadi selama proses
penyejajaran nukleotida dapat diminimalisir, yang membedakannya dengan
eukariot. Cara lain yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi strain bakteri
adalah pengamatan morfologi sel bakteri isolat Biogen CC-E76. Hasil
penyejajaran (blast) sekuen nukleotida 16S ribosomal DNA pada bakteri isolat
Biogen CC-E76 dengan sekuen nukleotida pada database, diharapkan dapat
2
mengidentifikasi strain bakteri dan hubungan kekerabatan dengan bakteri lain
berdasarkan tingkat homologi sekuen nukleotida.
Bakteri endofit mampu berinteraksi dengan tanaman secara mutualisme.
Salah satu jenis bakteri endofit telah berhasil dikoleksi, yaitu isolat Biogen CCE76. Isolat ini belum diketahui dengan jelas strainnya, sehingga perlu dilakukan
identifikasi. Identifikasi strain bakteri isolat Biogen CC-E76 dapat dilakukan
dengan membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA isolat tersebut dengan
sekuen nukleotida DNA yang tersedia pada database NCBI.
Penelitian ini bertujuan melakukan identifikasi bakteri isolat Biogen CCE76 melalui teknik PCR16S rRNA. Penelitian ini juga bermanfaat untuk
memperoleh informasi tentang strain bakteri endofit Biogen CC-E76, sehingga
kajian tentang karakteristiknya dapat diaplikasikan pada bidang pertanian, seperti
produksi protein rekombinan yang berperan dalam menginduksi ketahanan
tanaman terhadap hama.
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga bulan Desember 2013
di Laboratorium Biokimia, Balai Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Biogen CC-E76
yang berasal dari daun padi. 10 gL-1 tripton, 10 gL-1 NaCl, dan 5 gL-1 ekstrak
khamir, 100 µL-1larutan I (50 mM glukosa, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 8.0, 2
mgmL-1 lisozyme, 200 µL larutan II (0.2 M NaOH, 1% SDS), 150 µl larutan III
(3 M NaOAc pH 4.8), 300 µL phenol kloroform, etanol absolut 2 x volume, 800
µL etanol 70%, 30 µL buffer TE atau ddH2O,larutan PCI, 0.3 g agarosa, 30 mL
TBE 0.5x, 1 L EtBr, bufer TBE 0.5x, 1 L loading buffer,17.5 L MW
(Molecular Water), 2.5 L Bufer 10x, 0.75 L MgCl2, 1 L dNTPs, 1 L primer
forward, 1 L primer reverse dan 0.25 L Taq polymerase, 3.5 L DNA isolat
Biogen CC-E76,250 L larutan resuspensi yang mengandung RNAse, 30 L bufer
elusi, media LB, bufer lisis dan PCR mix.
Alat yang digunakan diantaranya adalah autoklaf, laminar air flow cabinet
Hitachi Clear Bench, inkubator, sentrifus Hitachi CR-21F, gel elektroforesis
Biorad Mini Protean, dan peralatan gelas, spektrofotometer UV-Vis Hitachi U
2000 untuk analisis spektrofotometri. Selain itu, dibutuhkan juga mikropipet
Gilson Pipetman, magnetic stirrer, dan pH meter Thermo Orion 410 A+.
3
Metode Penelitian
Identifikasi Bakteri Isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan
membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA dari isolat tersebut dengan sekuen
nukleotida yang tersedia pada database. Tahapan awal yang dilakukan adalah
isolasi dan purifikasi bakteri isolat Biogen CC-E76 dari akar tanaman padi.
Selanjutnya akar padi dihomogenisasi, kemudian homogenat tersebut diinokulasi
ke media Luria Bertani (LB) padat. Selanjutnya bakteri isolat Biogen CC-E76
diregenerasi kembali ke media cair Luria Bertani (LB). DNA total bakteri isolat
Biogen CC-E76 diisolasi dengan metode alkalin lisis. Hasil isolasi DNA total
bakteri isolat Biogen CC-E76 diamati tingkat kemurniannya menggunakan teknik
elektroforesis dan spektrofotometri. Setelah diperoleh DNA total murni, kemudian
amplifikasi gen 16S rRNA bakteri isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan teknik
PCR. Produk amplifikasi gen 16S rRNA selanjutnya dikonfirmasi melalui
elektroforesis. Fragmen DNA atau pita yang terbentuk pada gel agarosa
diekstraksi kembali untuk keperluan analisis sekuen DNA. Kemudian hasil
purifikasi digunakan untuk analisis sekuen DNA melalui proses pengurutan DNA.
Sekuen DNA yang telah diperoleh selanjutnya disejajarkan (blast) dengan sekuen
DNA yang terdapat pada database. Hasil blast ini digunakan untuk membuat
pohon filogenetik, yang menyatakan hubungan kekerabatan berdasarkan tingkat
homologi.
Penyegaran Bakteri
Media Luria-Bertani (LB) dibuat sebanyak 100 mL dengan komposisi 10
g/L tripton, 10 g/L NaCl, dan 5 g/L ekstrak khamir. Campuran komposisi media
dilarutkan dengan akuades sampai 100 mL. Media dibagi ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15
menit pada tekanan 1.5 atm dan suhu 121oC. Satu tabung media diinokulasi
dengan satu ose isolat Biogen CC-E76 dari stok agar miring. Kultur diinkubasi
dalam suhu ruang selama 16 jam sambil digoyang dengan kecepatan 75 rpm
(Gozan 2007).
Isolasi DNA Total Bakteri dengan Metode Alkalin Lisis
Satu koloni bakteri diinokulasi ke dalam 10 ml LB dan diinkubasi semalam
pada suhu 37 °C, kemudian dipindahkan ke tabung Eppendorf 1.5 mL dan
disentrifugasi 12.000 rpm pada 4 °C selama 2 menit. Setelah itu supernatan
dibuang. Lalu pelet diresuspensi dengan 100 µL larutan I dan dikocok dengan
menggunakan vortex. Selanjutnya campuran tersebut ditambahkan 200 µL larutan
II dan dikocok dengan menggunakan vortex. Suspensi tersebut kemudian
ditambahkan 150 µL larutan III (3 M NaOAc pH 4.8), tabungnya dibolak-balik
agar bercampur dan diinkubasi 15-30 menit pada suhu ruang. Campuran tersebut
lalu disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung
Eppendorf baru dan ditambahkan 300 µL fenol kloroform. Selanjutnya suspensi
tersebut dikocok dengan menggunakan vortex lalu sentrifus 12.000 rpm 5 menit.
Larutan yang paling atas dipindahkan ke tabung yang baru dan ditambahkan
etanol absolut 2x volume dan disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit.
Supernatannya lalu dibuang dan dicuci dengan 800 µL etanol 70%. Selanjutnya
suspensi dikocok dengan menggunakan vortex dan disentrifus 12.000 rpm selama
4
5 menit. Supernatannya kemudian dibuang, pelet dikering-anginkan lalu
diresuspensi dengan 30 µL buffer TE atau ddH2O (Adams 2004).
Elektroforesis Gel Agarosa
Pembuatan Gel Agarosa 1%. Sebanyak 0.3 gram agarosa ditambah
dengan 30 mL TBE 0.5x, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut dengan
sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian tambahkan 1 L
EtBr dan kocok perlahan hingga homogen, lalu dituang ke dalam cetakan yang
dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira 30 menit
sampai gel tersebut benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan dalam
alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TBE 0.5x (Boyer 2000).
Elektroforesis Gel Agarosa. Sebanyak 1 L sampel DNA dicampurkan
dengan 1 L loading buffer di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet
kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah elektroforesis
selesai, gel dikeluarkan dari alat elektroforesis kemudian dilihat dengan bantuan
sinar Ultraviolet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam
perangkat dokumentasi gel (gel-documentation) (Harisha 2007).
Amplifikasi 16S rRNA
Identifikasi bakteri endofit dari isolat Biogen CC-E76 dilakukan
berdasarkan sekuen nukleotida 16S rRNA. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan
dengan sepasang primer 63F (C A G G C C T A) dan 1387R (G G G C G G W G
T G T A C A A G G C) menggunakan mesin PCR. Komposisi 20 µL reaksi PCR
terdiri dari 2 µL 10x bufer PCR, 1.5 µL 50 mM MgCl2, 0.5 µL 4 mM dNTP, 1 µL
20 mM primer forward, 1 µL 20 mM primer reverse, 0.5 µLTaq Polymerase, dan
13.5 µL air destilasi steril. Reaksi PCR diletakan dalam tabung mikro berukuran
200 µL. DNA cetakan untuk PCR menggunakan koloni tunggal bakteri dari
biakan yang berumur 18 jam pada media LB agar. Mesin PCR dijalankan dengan
program sebagai berikut, yaitu denaturasi awal DNA pada suhu 94°C selama 10
menit, denaturasi kedua 94°C selama 1 menit, annealing 50°C selama 5 detik, dan
extension 72°C selama 1 menit 30 detik dengan siklus sebanyak 35 kali.
Penentuan suhu annealing dilakukan secara bertingkat pada interval suhu 50-60oC.
Hasil penentuan tersebut menunjukan bahwa suhu annealing yang memberikan
hasil amplikon terbaik yang dapat dilihat pada pita elektroforegram, yaitu pada
suhu 50oC. Produk PCR diidentifikasi pada gel agarosa yang dielektroforesis
dengan 90 volt selama 30 menit dalam bufer TAE (Harisha 2007).
Ekstraksi DNA dari Gel Agarosa
Pita DNA target hasil amplifikasi 16S rRNA yang sesuai dengan ukuran
panjang basanya (1.5 kb) dipotong dari gel agarosa dan dilakukan purifikasi DNA
menggunakan kit agarose gel extraction. Langkah awal dengan dilakukan
pemotongan gel agarosa yang mengandung fragmen DNA hingga halus di cawan
Petri. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung yang telah dilapisi membran
hybon+150µL larutan penyangga elusi, kemudian disentrifugasi pada 14.000 rpm
selama dua menit dan ditambahkan larutan PCI. Tahap selanjutnya sampel
dikocok selama satu menit dengan vortex, kemudian disentrifugasi pada 1.400
rpm selama lima menit. Setelah sentrifugasi tersebut akan terdapat endapan,
kemudian diambil sebanyak 500 µL sepernatan dan ditambahkan 2 µL etanol
5
absolut yang dilakukan dalam suhu rendah selama 15 menit. Tahap selanjutnya
sampel disentrifugasi pada 10.000 rpm selama dua puluh menit, lalu diambil
peletnya dan ditambahkan 500 µL etanol 70%. Kemudian sentrifugasi pada
10.000 rpm selama lima menit lalu divakum dan diresuspensi dengan 15 µL H2O
(Ali 2009).
Pengurutan (sequencing) dan Analisis Sekuen Basa Nukelotida
DNA produk hasil amplifikasi (amplikon) 16S rRNA Isolat Biogen CCE76 yang telah diperoleh lalu diurutkan basa nukleotidanya. Pengurutan basa
nuleotida (sequencing) dilakukan di PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta.
Hasil sekuen selanjutnya dianalisis dengan program bioinformatika yaitu dengan
program BLASTX (www.ncbi.nlm.nih.gov). Program BLASTX mentranslasi
sekuen nukleotida menjadi protein, kemudian membandingkannya dengan protein
yang terdapat pada pangkalan data (database). Homologi yang tinggi ditunjukkan
dengan nilai skor bits yang semakin besar (>150) dan E value yang kecil (