Identifikasi Senyawa Antikanker Dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe Pentandra (L.) Miq.).
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
VIDA ELSYANA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Senyawa
Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Vida Elsyana
NIM G851130291
RINGKASAN
VIDA ELSYANA. Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas
Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) merupakan tanaman
semiparasit yang termasuk dalam famili Loranthaceae. Benalu cengkih telah
digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk pengobatan kanker.
Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi senyawa antikanker ekstrak daun
benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara in vitro pada sel
lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing
(MCM-B2).
Simplisia daun benalu cengkih diekstraksi dengan air menggunakan
metode refluks dan etanol 70% dengan metode maserasi. Ekstrak etanol
selanjutnya difraksinasi bertingkat menggunakan ekstraksi cair-cair dan diperoleh
3 fraksi, yaitu fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana. Hasil
penapisan fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih mengandung
flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid.
Sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih diuji menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol
memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi nheksana masing-masing memiliki nilai LC50 sebesar 649.12 μg/mL dan 55.32
μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi n-heksana sebelas kali lebih
berpotensi memiliki aktivitas antikanker dibandingkan fraksi etil asetat.
Pengujian lebih lanjut dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana
benalu cengkih.
Hasil analisis menggunakan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis
(Py-GC/MS) menunjukkan bahwa fraksi n-heksana daun benalu cengkih
mengandung fitol dan metileugenol. Kedua senyawa tersebut diketahui memiliki
aktivitas antikanker.
Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana daun benalu cengkih diuji
menggunakan metode pewarnaan Trypan Blue dan sel dihitung menggunakan
hemasitometer Improved Neubauer. Pengujian fraksi n-heksana daun benalu
cengkih dilakukan pada konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. Fraksi nheksana daun benalu cengkih mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada konsentrasi
125 μg/mL dengan persentase penghambatan sebesar 38.69% pada sel lestari
kanker K562 dan 41.5% pada MCM-B2. Benalu cengkih berpotensi menjadi
antikanker alami.
Kata kunci: antiproliferasi, benalu cengkih, senyawa antikanker, sitotoksisitas
SUMMARY
VIDA ELSYANA. Identification of anticancer compounds and antiproliferation
activity assay of clove mistletoe leaves extracts (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.). Supervised by MARIA BINTANG and BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Clove mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) is semi-parasitic plant
that belongs to Loranthaceae family. Clove mistletoe was used traditionally for
cancer treatment in Indonesia. The purpose of this study was to identified
anticancer compounds of clove mistletoe leaves extracts and to examine its
antiproliferation activity on human myelogenous leukemia (K562) and canine
benign mixed mamary (MCM-B2) cancer cell lines in vitro.
The leaves powder of clove mistletoe were extracted by water using reflux
method and by ethanol using maceration method. Ethanol extract of clove
mistletoe was then fractionated using liquid-liquid extraction and resulted ethanol
fraction, etyl acetate fraction, and n-hexane fraction. Phytochemical screening
showed the leaves powder of clove mistletoe contained flavonoids, saponins,
tannins, and triterpenoid.
Cytotoxicity of clove mistletoe leaves extract was conducted using Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Water extract, ethanol extract, and ethanol fraction
had LC50 greater than 1000 μg/mL. Etyl acetate fraction and n-hexane fraction had
LC50 649.12 μg/mL and 55.32 μg/mL, respectively. This results suggested that
etyl acetate and n-hexane fractions had potent of anticancer activity in cancer cell
lines. Nevertheless, n-hexane fraction eleven times more potent than etyl acetate
fraction. Therefore, only n-hexane fractions was then considered for further
examinations.
Analysis of active compounds using Pyrolysis Gas Chromatography/Mass
Spectrometry (Py-GC/MS) revealed that n-hexane fraction contained
methyleugenol and phytol. These compounds was known acts as anticancer.
Antiproliferation activity of n-hexane fraction of clove mistletoe was
conducted using Trypan Blue Dye Exclusion Method and cells were counted
using Improved Neubauer haemacytometer. The n-hexane fraction of clove
mistletoe was tested at concentration 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. The results
showed that n-hexane fraction could inhibited growth of K562 and MCM-B2
cancer cell line. The highest inhibition activity of K562 cell lines was 38.69%,
while on MCM-B2 was 41.5%, this activity was achieved at concentration 125
μg/mL. Therefore, it was suggested that clove mistletoe had potential for natural
anticancer.
Keywords : anticancer compounds, antiproliferative, clove mistletoe,
cytotoxicity
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
VIDA ELSYANA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Syamsul Falah, SHut MSi
Judul Tesis : Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi
Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.)
Nama
: Vida Elsyana
NIM
: G851130291
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua
Prof drh Bambang Pontjo P, MS PhD APVet
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 17 Desember 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian ini ialah identifikasi senyawa antikanker dan uji aktivitas
antiproliferasi ekstrak daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang,
MS selaku ketua komisi pembimbing sekaligus ketua Program Studi Biokimia dan
Bapak Prof drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, PhD.APVet selaku anggota
komisi pembimbing atas saran dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan
karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Syamsul
Falah, SHut, MSi selaku penguji luar komisi dan Ibu Dr Suryani, SP, MSc selaku
moderator pada ujian tesis atas saran untuk perbaikan karya ilmiah ini. Terima
kasih penulis ucapkan kepada seluruh staf Sekolah Pascasarjana (SPs) dan
Fakultas MIPA IPB, khususnya Departemen Biokimia serta pranata laboratorium
Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB dan laboratorium kultur jaringan
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi FKH IPB. Penghargaan penulis
ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Dirjen Dikti) atas
pemberian Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN) Tahun
2013.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua penulis,
yaitu Bapak Maryoto dan Ibu Rukidah serta Kakak (Dedi Pramono dan Misgiyati)
atas segala doa, motivasi, dan kasih sayangnya.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua rekan pascasarjana
Biokimia 50, khususnya Tiana Fitrilia dan Sri Asih serta rekan-rekan kerja di
Laboratorium Bioanalisis dan Laboratorium Kultur Jaringan, khususnya Nita
Shinta Sari, Fitri Hardiani Fathonah, dan Ansenora Bekris. Penghargaan penulis
juga sampaikan kepada Saudari Lailan Sahrina Hasibuan, MKom atas saran dan
bantuannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2015
Vida Elsyana
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
3
3
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
4
4
3 HASIL
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
8
8
8
8
9
9
10
4 PEMBAHASAN
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
11
11
12
13
13
15
15
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
18
18
18
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
22
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut
2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih fraksi n-heksana daun benalu
cengkih
4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih
5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah
pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih
8
8
9
10
11
DAFTAR GAMBAR
1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih
2 Penurunan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian
fraksi n-heksana daun benalu cengkih
3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis
9
11
17
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Diagram alur penelitian
Surat pernyataan hasil determinasi jenis benalu cengkih
Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk
menentukan nilai LC50
5 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0
22
23
24
26
33
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit paling mematikan di dunia. Tahun
2012, terdapat sekitar 14.1 juta kasus baru dan 8.2 juta kematian terkait kanker di
seluruh dunia (WHO 2015). Kanker disebabkan oleh abnormalitas sel akibat
adanya mutasi pada DNA (Garret 2001). Penyakit ini ditandai dengan perubahan
sifat normal sel, yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh, dan membelah tanpa
terkendali karena mampu memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut
selanjutnya memiliki kemampuan menyusup dan merusak jaringan di dekatnya
lalu menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan limpa
(metastasis) (Haryanti & Katno 2011).
Pengobatan kanker secara konvensional dilakukan dengan pembedahan,
radiasi, kemoterapi, dan terapi hormon (Dashora et al. 2011). Pengobatan kanker
secara konvensional memiliki beberapa kelemahan. Pembedahan tidak dapat
dilakukan untuk sel yang telah mengalami metastasis, radiasi seringkali berbahaya
bagi sel-sel normal, dan kemoterapi belum memberi hasil optimal karena
ketidakspesifikan kerja obat dan relatif mahal (Dashora et al. 2011; Fadhli et al.
2012; Gamal & Septananda 2013; Wicaksono dan Permana 2013). Hal ini
mendorong peningkatan penggunaan herbal untuk pengobatan alternatif kanker,
karena obat herbal memiliki efek samping kecil, aman, dan tidak menyebabkan
ketergantungan (Olaku & White 2011). Herbal tidak hanya bermanfaat untuk
pengobatan kanker pada manusia dan hewan, tetapi juga sebagai titik awal
penemuan senyawa aktif untuk pengembangan obat baru (Wahyuni et al. 2009).
Indonesia yang kaya akan keanekaragaman hayati memiliki berbagai jenis
tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai sumber antikanker baru (Artanti
et al. 2012).
Salah satu tumbuhan yang telah digunakan secara tradisional oleh
masyarakat Indonesia sebagai antikanker adalah benalu (Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.) (Artanti et al. 2012). D. pentandra termasuk famili Loranthaceae.
Benalu umumnya dinamai berdasarkan tanaman inangnya, misalnya benalu teh,
benalu mangga, dan benalu cengkih (Suryanto & Wehantouw 2008). Benalu
bersifat merugikan bagi tumbuhan inangnya namun berpotensi sebagai tanaman
obat (Fajriah et al. 2007; Artanti et al. 2012; Anita et al. 2014). Benalu termasuk
tanaman semiparasit maka bioaktivitas benalu diduga bergantung pada tanaman
inangnya (Xiou et al. 2008).
Benalu yang hidup pada berbagai tanaman inang diketahui memiliki
aktivitas sitotoksik dan antikanker. Benalu teh mampu menginduksi terjadinya
apoptosis pada sel Jurkat T (Hashimoto et al. 2007). Daniel et al. (2012)
melaporkan bahwa fraksi etil asetat benalu sirsak memiliki aktivitas sitotoksik
terhadap larva udang. Ekstrak batang benalu kapuk mampu menekan ekspresi
protein mutan p53 pada kultur sel HeLa (Gamal & Septananda 2013). Ekstrak
etanol benalu jeruk bersifat toksik terhadap Artemia salina L. dengan nilai LC50
sebesar 648.15 μg/mL (Ramadhan 2013). Daun benalu langsat mengandung
flavonoid dan pemberian ekstrak etanol terbukti memberikan efek hepatoprotektor
pada tikus putih jantan yang diinduksi CCl4 (Tristanti et al. 2013). Ekstrak etanol
2
benalu mangga mampu memperbaiki struktur jaringan kanker kolon (Wicaksono
dan Permana 2013).
Salah satu benalu yang belum banyak diungkap potensinya adalah benalu
cengkih. Terapi dengan meminum air rebusan daun benalu cengkih dilaporkan
dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara (Puro 2012). Daun benalu
cengkih juga memiliki aktivitas antiradikal bebas DPPH (Suryanto & Wehantouw
2008) dan mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus dan
Escherichia coli (Puro 2012). Penapisan kandungan kimia pada daun benalu
cengkih menunjukkan adanya komponen senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan
triterpenoid (Fitrilia et al. 2015). Komponen flavonoid telah diketahui berperan
penting dalam pencegahan kanker (Ren et al. 2003). Belum ada penelitian terkait
identifikasi senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi secara in vitro pada
benalu cengkih.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa antikanker dari ekstrak
daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari
kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCMB2) secara in vitro. Ekstrak benalu cengkih diharapkan mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi
bahan alam untuk pengobatan kanker.
Perumusan Masalah
Potensi dari benalu cengkih belum banyak diungkap dibandingkan jenis
benalu lainnya. Penapisan komponen fitokimia pada akar, batang, daun, dan
bunga benalu cengkih menunjukkan adanya komponen fenolik, flavonoid, saponin,
dan tanin (Suryanto & Wehantouw 2008). Kandungan senyawa antikanker dan
aktivitas antiproliferasi dari ekstrak benalu cengkih secara in vitro belum
diketahui.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi kandungan senyawa antikanker
dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara
in vitro pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai kandungan
senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih serta aktivitas
antiproliferasinya sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi bahan
alam untuk pengobatan kanker.
3
Hipotesis
Ekstrak daun benalu cengkih mengandung senyawa antikanker. Ekstrak
daun benalu cengkih juga menghambat pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan
MCM-B2.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian ini meliputi pengambilan sampel daun benalu
cengkih (D. pentandra (L.) Miq.), pembuatan simplisia, penentuan kadar air,
penapisan komponen fitokimia, dan ekstraksi dengan metode refluks dan maserasi.
Tahap selanjutnya ialah uji sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih dengan
metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak yang paling aktif dianalisis
senyawa aktifnya dengan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (PyGC/MS). Ekstrak juga diuji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2 dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna
trypan blue.
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia
FMIPA IPB, Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor, dan
Laboratorium Kultur Jaringan Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi,
dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) IPB. Penelitian dilaksanakan
dari Desember 2014 hingga Agustus 2015.
Bahan
Bahan yang diuji dalam penelitian ini adalah daun benalu cengkih yang
diperoleh dari daerah Batanghari, Lampung Timur pada bulan Januari 2015.
Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian antara lain etanol 70%, etil asetat,
n-heksana, akuades, amil alkohol, KOH, HCN 2N, pereaksi Wegner, Meyer, dan
Dragendorff, FeCl3 10%, asam sulfat, asam asetat, Liebermann-Burchard, kista
Artemia salina Leach, air laut, Tween80, akuabides steril, Dulbecco’s Modified
Eagle’s medium (DMEM), Fetal Calf Serum (FCS) 10%, antibiotik PenisilinStreptomisin 1%, Fungizon, dan pewarna Trypan blue.
Sel yang digunakan pada penelitian ini adalah sel lestari kanker leukimia
manusia (K562) dan sel kanker payudara anjing (MCM-B2) koleksi Laboratorium
Kultur Jaringan, Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patotogi
FKH IPB.
4
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah grinder, desikator,
cawan porselen, oven, evaporator vakum, corong pisah, vorteks, lampu TL 14
watt, plat BSLT, aerator, shaker orbital, inkubator CO2, autoklaf, mikroplat 24sumuran, mikroplat 96-sumuran, hemositometer Improved Neubauer, mikroskop
cahaya, dan mesin GC/MS pirolisis (Shimadzu GCMS-QP2010).
Prosedur
Determinasi Jenis Sampel Benalu Cengkih
Sampel daun benalu cengkih dideterminasi di Herbarium Bogoriense,
Pusat Penelitian Biologi – LIPI, Cibinong Bogor untuk menentukan identitas
spesies sampel.
Pembuatan Simplisia dan Penentuan Kadar Air Sampel
Bagian benalu cengkih yang digunakan ialah daun. Daun benalu cengkih
yang diambil mulai daun keempat dari pucuk ke arah yang lebih tua.
Pembuatan Simplisia Daun benalu cengkih dicuci menggunakan air mengalir.
Daun dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dan ditutup kain
berwarna gelap. Pengeringan dilakukan selama 3x7 jam (hari ke 1,2,3) dengan
cuaca normal. Pengeringan disempurnakan dengan oven pada suhu 40-45oC. Daun
dibuat serbuk berukuran 40 mesh menggunakan grinder.
Penentuan Kadar Air Sampel Kadar air ditentukan berdasarkan metode SNI
01-2891-1992. Cawan kosong dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105°C
selama 1 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Cawan ditimbang
dan dicatat massanya. Sebanyak 1 gram sampel ditimbang di dalam cawan
tersebut. Sampel dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam atau sampai
massanya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0.003 gram). Cawan berisi
sampel kering lalu didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang massa
akhirnya. Kadar air sampel dihitung berdasarkan persamaan (1) sebagai berikut.
adar air % b
y
a
Keterangan:
x = massa cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g)
y = massa cawan dan sampel setelah dikeringkan (g)
a = massa cawan kosong (g)
Ekstraksi Sampel
Simplisia benalu cengkih diekstraksi dengan pelarut air dengan cara
direbus menggunakan refluks dan pelarut etanol 70% dengan metode maserasi.
5
Pembuatan Ekstrak Ekstrak air dibuat dengan cara merebus 40 g simplisia
dengan 400 mL akuades selama 2 jam menggunakan refluks. Ekstrak etanol
dibuat dengan cara merendam 40 g simplisia dengan 400 mL etanol 70% teknis
dan diaduk menggunakan shaker orbital kecepatan 125 rpm selama 24 jam.
Ekstraksi sampel dengan air dan etanol masing-masing dilakukan pengulangan
tiga kali dengan pelarut baru. Ekstrak yang dihasilkan dipisahkan dari residunya
menggunakan sentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Ekstrak
diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC.
Fraksinasi Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol difraksinasi dengan pelarut nheksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan etanol (polar) menggunakan
corong pisah. Sebanyak 15 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 100 mL air hangat
lalu dimasukkan dalam corong pisah. Ekstrak etanol difraksinasi dengan 100 mL
n-heksana. Campuran dikocok perlahan setiap 10 menit dan diulang tiga kali
kemudian didiamkan selama 30 menit hingga terbentuk fraksi n-heksana (atas)
dan air (bawah). Fraksi n-heksana dipisahkan dan fasa air difraksinasi lanjut
dengan 100 mL etil asetat. Fraksi etil asetat yang dihasilkan kemudian dipisahkan
dan fraksi air ditambah 100 mL etanol sehingga diperoleh fraksi etanol. Ekstraksi
setiap fraksi menggunakan 100 mL pelarut baru dan diulang hingga pelarut
hampir tak berwarna. Ketiga fraksi diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator
vakum pada suhu 60oC. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dan dihitung
berdasarkan persamaan (2) sebagai berikut.
endemen e stra
%
assa e stra yang dihasil an
assa simplisia yang die stra si
100%
Uji Kualitatif Kandungan Fitokimia Sampel
Penentuan kandungan fitokimia sampel dilakukan berdasarkan metode
Windarini et al. (2013) yang dimodifikasi.
Uji Alkaloid Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 mL HCl 2 N dan 9 mL
akuades. Larutan dipanaskan selama 2 menit lalu didinginkan dan disaring. Filtrat
diuji dengan tiga pereaksi alkaloid (Wagner, Meyer, dan Dragendorff). Adanya
alkaloid ditandai dengan endapan coklat pada pereksi Wagner, endapan putih
kekuningan pada pereaksi Meyer dan endapan merah hingga jingga pada pereaksi
Dragendorff.
Uji Flavonoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 0.05 g serbuk
magnesium dan 0.2 mL asam alkohol (campuran HCl 37% dan etanol 95%
dengan volum sama). Campuran tersebut ditambahkan 2 mL amil alkohol
kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah
atau kuning pada lapisan amil alkohol.
Uji Saponin Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 10 mL air panas
dalam tabung reaksi lalu didinginkan. Larutan dikocok secara vertikal selama 10
detik. Adanya saponin ditandai dengan terbentuknya busa setinggi 1-10 cm yang
stabil sekitar 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan setetes HCN 2N.
6
Uji Tanin Sebanyak 10 mg ekstrak dididihkan dalam 50 mL akuades selama 5
menit kemudian disaring. Larutan uji diambil 5 mL dan direaksikan dengan 3-5
tetes FeCl3 dalam tabung reaksi. Adanya tanin ditandai dengan warna biru tua
atau hitam kehijauan.
Uji Triterpenoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 5 mL larutan
eter dalam cawan porselen kemudian diuapkan. Residu ditambahkan dengan asam
asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Adanya triterpenoid ditandai dengan
warna merah hingga hijau.
Pengujian Sitotoksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Pengujian sitotoksisitas dilakukan berdasarkan metode McLaughlin et al.
(1998) yang dimodifikasi.
Penyiapan Larva Udang Penetasan larva dilakukan dengan cara merendam 10
mg kista udang dalam toples kaca berisi 1 L air laut yang telah disaring. Penetasan
dilakukan pada suhu kamar dengan diterangi sinar lampu TL 14 watt dan diaerasi
selama 24 jam. Larva udang digunakan untuk uji setelah 48 jam.
Pembuatan Larutan Uji Larutan uji terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi
n-heksana, fraksi etil asetat, dan fra si etanol. Larutan sto 2000 μg/mL masingmasing e stra dibuat dengan menambah an 20 mg e stra dengan 50 μL
Tween80 lalu ditambahkan air laut hingga volumnya 10 mL. Ekstrak disonikasi
hingga larut. Pengujian dilakukan dengan konsentrasi 1000, 500, 100, dan 10
μg/mL.
Pengujian Sitotoksisitas Sebanyak 1 mL air laut yang berisi 10 ekor larva
udang dimasukkan ke dalam mikroplat 12 sumuran dan ditambahkan 1000, 500,
100, dan 10 μL larutan sto e stra 2000 μg/mL . Volume setiap sumuran
dicukupkan hingga 2 mL dengan penambahan air laut. Setiap konsentrasi ekstrak
diuji sebanyak tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar di bawah
sinar lampu TL 14 watt selama 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang
hidup. Kontrol dilakukan dengan prosedur yang sama tanpa penambahan ekstrak.
Analisis Senyawa Antikanker
Senyawa aktif sampel dianalisis menggunakan GC/MS pirolisis
(Shimadzu GCMS-QP2010). Helium digunakan sebagai carrier gas (0.85
mL/menit) dalam kolom kapiler Rtx-5 S 60 mm 0.25 mm 0.25 μm dan
dioperasikan dengan mode electron impact (EI) pada 70 eV serta suhu sumber ion
pada 200oC. Kondisi kromatografi diatur pada 50oC untuk suhu oven kolom dan
280oC untuk suhu injeksi. Injeksi dilakukan dengan mode split, yaitu isotermal
pada 50oC selama 5 menit lalu ditingkatkan suhunya menjadi 280oC selama 30
menit kemudian dipertahankan pada suhu ini hingga menit ke-60. Komponen
senyawa aktif diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan analisis MS.
7
Uji Aktivitas Antiproliferasi
Uji aktivitas antikanker dilakukan berdasarkan metode Priosoeryanto et al.
(1995a).
Persiapan Media dan Ekstrak Sel lestari kanker dikultur menggunakan media
pertumbuhan DMEM sebanyak 850 μL dalam mikroplat 24 sumuran. Media di
setiap sumuran ditambahkan antibiotik (penisilin-streptomisin) 10 μL, fungizon
10 μL dan serum (FCS) 30 μL serta ekstrak sebanyak 50 μL. Ekstrak yang
digunakan adalah ekstrak yang bersifat toksik berdasarkan uji toksisitas dengan
BSLT. Variasi konsentrasi ekstrak ditentukan berdasarkan nilai LC50 dan diuji
sebanyak tiga kali ulangan.
Penanaman Sel Suspensi sel lestari kanker dalam ampul (cryovial) dicairkan
(thawing) lalu dihomogenkan dengan vorteks. Sebanyak 50 μL sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2 (kepadatan 7x106 sel/mL) ditanam ke dalam masing-masing
sumuran yang telah berisi media bersuplemen dan ekstrak. Kontrol negatif
dilakukan dengan medium DMEM dan kontrol positif menggunakan doksorubisin
100 μg/mL dengan prosedur yang sama. Volume total setiap sumuran adalah 1
mL. Semua perlakuan dilakukan dalam tiga kali ulangan. Sel lestari kanker
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Pemanenan dan Penghitungan Sel Sel dipanen setelah 3-4 hari yaitu ketika
pertumbuhan sel dikontrol negatif telah menutupi sekitar 70% permukaan
sumuran (konfluen). Sebanyak 100 μL sel lestari kanker dimasukkan ke dalam
sumuran mikroplat ELISA yang telah berisi 5 μL pewarna trypan blue kemudian
dihomogenkan. Sel sebanyak 5 μL ditetes an pada chamber hemasitometer lalu
ditutup dengan cover slip. Sel dihitung menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah
kamar hitung baik sel yang mati (biru) maupun sel hidup (bening). Hasil
penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per mL suspensi dengan
persamaan (3) berikut.
Jumlah sel/mL = Jumlah sel yang dihitung x Faktor volume x Faktor pengenceran
Persentase aktivitas pertumbuhan dan penghambatan sel kanker dihitung dengan
persamaan (4) dan (5) berikut.
%
tivitas pertumbuhan
umlah rataan sel dengan perla uan
umlah rataan sel di ontrol negatif
100%
% Aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)
Analisis Statistika
Data dianalisis menggunakan analisis varian
NOV
satu arah α
0.05 . Hasil uji berma na ji a diperoleh harga p≤0.05 dan ji a terdapat perbedaan
yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui signifikansi
perbedaan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.
8
3 HASIL
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Determinasi dilakukan oleh Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian
Biologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor
berdasarkan sampel daun benalu cengkih. Hasil determinasi menunjukkan bahwa
spesies benalu yang diteliti adalah Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. dan
termasuk ke dalam famili Loranthaceae.
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Analisis gravimetri menunjukkan bahwa simplisia daun benalu cengkih
memiliki kadar air sebesar 9.14%. Rendemen ekstrak daun benalu cengkih dengan
beberapa pelarut dapat dilihat pada Tabel 1. Ekstraksi sampel dengan pelarut air
menghasilkan rendemen ekstrak yang lebih tinggi dibandingkan etanol 70%.
Rendemen fraksinasi paling tinggi diperoleh melalui penggunaan pelarut etanol.
Tabel 1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih
dengan beberapa pelarut
Sampel
Rendemen (%)
Ekstrak air
Ekstrak etanol
Fraksi etanol
Fraksi etil asetat
Fraksi n-heksana
17.83
16.14
4.65
2.45
0.44
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih dapat
dilihat pada Tabel 2. Semua sampel menunjukkan hasil uji negatif terhadap
alkaloid dan positif terhadap flavonoid dan triterpenoid. Saponin tidak dijumpai
dalam fraksi etil asetat dan n-heksana. Hanya fraksi n-heksana yang tidak
mengandung tanin.
Tabel 2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
Kandungan
fitokimia
Ekstrak
air
Ekstrak
etanol
Fraksi
etanol
Fraksi etil
asetat
Fraksi
n-heksana
Alkaloid
Dragendrof
Meyer
Wagner
Flavonoid
Saponin
Tanin
Triterpenoid
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
9
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang
dapat dilihat pada Tabel 3. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki
nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana
mampu mematikan 50% populasi larva udang pada konsentrasi lebih kecil dari
1000 μg/mL.
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih
Sampel
Ekstrak air
Ekstrak etanol
Fraksi etanol
Fraksi etil asetat
Fraksi n-heksana
Nilai LC50 μg/mL
1572.43
1673.72
2157.16
649.13
55.32
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (GC/MS pirolisis)
digunakan untuk menganalisis kandungan senyawa aktif dalam sampel fraksi nheksana benalu cengkih. Kromatogram dari hasil analisis GC/MS pirolisis fraksi
n-heksana benalu cengkih ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncakpuncak spektrum yang menunjukkan kandungan senyawa dalam sampel fraksi nheksana (Tabel 4). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan terbesar dalam sampel
fraksi n-heksana benalu cengkih diikuti dengan asam palmitat dan metil linolenat.
Gambar 1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih
10
Tabel 4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih
Waktu
Konsentrasi
Puncak
Nama senyawa
retensi
(%)
(menit)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1.975
2.626
13.919
14.293
15.226
15.580
16.708
17.540
18.134
18.456
19.272
19.368
19.615
19.684
19.792
20.436
22.117
22.315
2.94
3.28
1.31
0.33
2.31
1.56
0.33
0.35
1.02
19.00
8.77
5.45
18.04
10.77
0.92
0.83
19.56
0.67
19
20
22.606
26.050
0.52
2.03
Etanol
Kloroform
2,6-Dimetoksifenol
Metileugenol
2,4-Di-tert-butilfenol
Asam laurat
Palmitat aldehida
Neofitadiena
Metil palmitat
Asam palmitat
Metil oleat
Fitol
Metil linolenat
Asam stearat
Etil n-heptadecanoat
Methyl trans-9,10-e
Dioktil ftalat
1H-Naftol[2,1-b]piran-8(4aH)one,3-etenildekahidro3,4a,7,7,10a-penta
Albikanol
Gliseril trioktanoat
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Pengaruh pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih sel lestari
kanker K562 dan MCM-B2 disajikan pada Gambar 2. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara
umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2
secara in vitro. Jumlah sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tampak menurun
seiring peningkatan konsentrasi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu
cengkih yang diberikan.
Aktivitas penghambatan ekstrak tampak berbeda pada kedua sel lestari
kanker namun meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak yang
digunakan (Tabel 5). Perlakuan dengan pemberian fraksi n-heksana secara nyata
(p
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
VIDA ELSYANA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Senyawa
Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Vida Elsyana
NIM G851130291
RINGKASAN
VIDA ELSYANA. Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas
Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) merupakan tanaman
semiparasit yang termasuk dalam famili Loranthaceae. Benalu cengkih telah
digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk pengobatan kanker.
Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi senyawa antikanker ekstrak daun
benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara in vitro pada sel
lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing
(MCM-B2).
Simplisia daun benalu cengkih diekstraksi dengan air menggunakan
metode refluks dan etanol 70% dengan metode maserasi. Ekstrak etanol
selanjutnya difraksinasi bertingkat menggunakan ekstraksi cair-cair dan diperoleh
3 fraksi, yaitu fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana. Hasil
penapisan fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih mengandung
flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid.
Sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih diuji menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol
memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi nheksana masing-masing memiliki nilai LC50 sebesar 649.12 μg/mL dan 55.32
μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi n-heksana sebelas kali lebih
berpotensi memiliki aktivitas antikanker dibandingkan fraksi etil asetat.
Pengujian lebih lanjut dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana
benalu cengkih.
Hasil analisis menggunakan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis
(Py-GC/MS) menunjukkan bahwa fraksi n-heksana daun benalu cengkih
mengandung fitol dan metileugenol. Kedua senyawa tersebut diketahui memiliki
aktivitas antikanker.
Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana daun benalu cengkih diuji
menggunakan metode pewarnaan Trypan Blue dan sel dihitung menggunakan
hemasitometer Improved Neubauer. Pengujian fraksi n-heksana daun benalu
cengkih dilakukan pada konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. Fraksi nheksana daun benalu cengkih mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada konsentrasi
125 μg/mL dengan persentase penghambatan sebesar 38.69% pada sel lestari
kanker K562 dan 41.5% pada MCM-B2. Benalu cengkih berpotensi menjadi
antikanker alami.
Kata kunci: antiproliferasi, benalu cengkih, senyawa antikanker, sitotoksisitas
SUMMARY
VIDA ELSYANA. Identification of anticancer compounds and antiproliferation
activity assay of clove mistletoe leaves extracts (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.). Supervised by MARIA BINTANG and BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Clove mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) is semi-parasitic plant
that belongs to Loranthaceae family. Clove mistletoe was used traditionally for
cancer treatment in Indonesia. The purpose of this study was to identified
anticancer compounds of clove mistletoe leaves extracts and to examine its
antiproliferation activity on human myelogenous leukemia (K562) and canine
benign mixed mamary (MCM-B2) cancer cell lines in vitro.
The leaves powder of clove mistletoe were extracted by water using reflux
method and by ethanol using maceration method. Ethanol extract of clove
mistletoe was then fractionated using liquid-liquid extraction and resulted ethanol
fraction, etyl acetate fraction, and n-hexane fraction. Phytochemical screening
showed the leaves powder of clove mistletoe contained flavonoids, saponins,
tannins, and triterpenoid.
Cytotoxicity of clove mistletoe leaves extract was conducted using Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Water extract, ethanol extract, and ethanol fraction
had LC50 greater than 1000 μg/mL. Etyl acetate fraction and n-hexane fraction had
LC50 649.12 μg/mL and 55.32 μg/mL, respectively. This results suggested that
etyl acetate and n-hexane fractions had potent of anticancer activity in cancer cell
lines. Nevertheless, n-hexane fraction eleven times more potent than etyl acetate
fraction. Therefore, only n-hexane fractions was then considered for further
examinations.
Analysis of active compounds using Pyrolysis Gas Chromatography/Mass
Spectrometry (Py-GC/MS) revealed that n-hexane fraction contained
methyleugenol and phytol. These compounds was known acts as anticancer.
Antiproliferation activity of n-hexane fraction of clove mistletoe was
conducted using Trypan Blue Dye Exclusion Method and cells were counted
using Improved Neubauer haemacytometer. The n-hexane fraction of clove
mistletoe was tested at concentration 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. The results
showed that n-hexane fraction could inhibited growth of K562 and MCM-B2
cancer cell line. The highest inhibition activity of K562 cell lines was 38.69%,
while on MCM-B2 was 41.5%, this activity was achieved at concentration 125
μg/mL. Therefore, it was suggested that clove mistletoe had potential for natural
anticancer.
Keywords : anticancer compounds, antiproliferative, clove mistletoe,
cytotoxicity
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
VIDA ELSYANA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Syamsul Falah, SHut MSi
Judul Tesis : Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi
Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq.)
Nama
: Vida Elsyana
NIM
: G851130291
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua
Prof drh Bambang Pontjo P, MS PhD APVet
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 17 Desember 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian ini ialah identifikasi senyawa antikanker dan uji aktivitas
antiproliferasi ekstrak daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang,
MS selaku ketua komisi pembimbing sekaligus ketua Program Studi Biokimia dan
Bapak Prof drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, PhD.APVet selaku anggota
komisi pembimbing atas saran dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan
karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Syamsul
Falah, SHut, MSi selaku penguji luar komisi dan Ibu Dr Suryani, SP, MSc selaku
moderator pada ujian tesis atas saran untuk perbaikan karya ilmiah ini. Terima
kasih penulis ucapkan kepada seluruh staf Sekolah Pascasarjana (SPs) dan
Fakultas MIPA IPB, khususnya Departemen Biokimia serta pranata laboratorium
Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB dan laboratorium kultur jaringan
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi FKH IPB. Penghargaan penulis
ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Dirjen Dikti) atas
pemberian Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN) Tahun
2013.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua penulis,
yaitu Bapak Maryoto dan Ibu Rukidah serta Kakak (Dedi Pramono dan Misgiyati)
atas segala doa, motivasi, dan kasih sayangnya.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua rekan pascasarjana
Biokimia 50, khususnya Tiana Fitrilia dan Sri Asih serta rekan-rekan kerja di
Laboratorium Bioanalisis dan Laboratorium Kultur Jaringan, khususnya Nita
Shinta Sari, Fitri Hardiani Fathonah, dan Ansenora Bekris. Penghargaan penulis
juga sampaikan kepada Saudari Lailan Sahrina Hasibuan, MKom atas saran dan
bantuannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2015
Vida Elsyana
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
3
3
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
4
4
3 HASIL
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
8
8
8
8
9
9
10
4 PEMBAHASAN
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
11
11
12
13
13
15
15
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
18
18
18
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
22
RIWAYAT HIDUP
34
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut
2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih fraksi n-heksana daun benalu
cengkih
4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih
5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah
pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih
8
8
9
10
11
DAFTAR GAMBAR
1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih
2 Penurunan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian
fraksi n-heksana daun benalu cengkih
3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis
9
11
17
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Diagram alur penelitian
Surat pernyataan hasil determinasi jenis benalu cengkih
Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk
menentukan nilai LC50
5 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0
22
23
24
26
33
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit paling mematikan di dunia. Tahun
2012, terdapat sekitar 14.1 juta kasus baru dan 8.2 juta kematian terkait kanker di
seluruh dunia (WHO 2015). Kanker disebabkan oleh abnormalitas sel akibat
adanya mutasi pada DNA (Garret 2001). Penyakit ini ditandai dengan perubahan
sifat normal sel, yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh, dan membelah tanpa
terkendali karena mampu memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut
selanjutnya memiliki kemampuan menyusup dan merusak jaringan di dekatnya
lalu menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan limpa
(metastasis) (Haryanti & Katno 2011).
Pengobatan kanker secara konvensional dilakukan dengan pembedahan,
radiasi, kemoterapi, dan terapi hormon (Dashora et al. 2011). Pengobatan kanker
secara konvensional memiliki beberapa kelemahan. Pembedahan tidak dapat
dilakukan untuk sel yang telah mengalami metastasis, radiasi seringkali berbahaya
bagi sel-sel normal, dan kemoterapi belum memberi hasil optimal karena
ketidakspesifikan kerja obat dan relatif mahal (Dashora et al. 2011; Fadhli et al.
2012; Gamal & Septananda 2013; Wicaksono dan Permana 2013). Hal ini
mendorong peningkatan penggunaan herbal untuk pengobatan alternatif kanker,
karena obat herbal memiliki efek samping kecil, aman, dan tidak menyebabkan
ketergantungan (Olaku & White 2011). Herbal tidak hanya bermanfaat untuk
pengobatan kanker pada manusia dan hewan, tetapi juga sebagai titik awal
penemuan senyawa aktif untuk pengembangan obat baru (Wahyuni et al. 2009).
Indonesia yang kaya akan keanekaragaman hayati memiliki berbagai jenis
tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai sumber antikanker baru (Artanti
et al. 2012).
Salah satu tumbuhan yang telah digunakan secara tradisional oleh
masyarakat Indonesia sebagai antikanker adalah benalu (Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.) (Artanti et al. 2012). D. pentandra termasuk famili Loranthaceae.
Benalu umumnya dinamai berdasarkan tanaman inangnya, misalnya benalu teh,
benalu mangga, dan benalu cengkih (Suryanto & Wehantouw 2008). Benalu
bersifat merugikan bagi tumbuhan inangnya namun berpotensi sebagai tanaman
obat (Fajriah et al. 2007; Artanti et al. 2012; Anita et al. 2014). Benalu termasuk
tanaman semiparasit maka bioaktivitas benalu diduga bergantung pada tanaman
inangnya (Xiou et al. 2008).
Benalu yang hidup pada berbagai tanaman inang diketahui memiliki
aktivitas sitotoksik dan antikanker. Benalu teh mampu menginduksi terjadinya
apoptosis pada sel Jurkat T (Hashimoto et al. 2007). Daniel et al. (2012)
melaporkan bahwa fraksi etil asetat benalu sirsak memiliki aktivitas sitotoksik
terhadap larva udang. Ekstrak batang benalu kapuk mampu menekan ekspresi
protein mutan p53 pada kultur sel HeLa (Gamal & Septananda 2013). Ekstrak
etanol benalu jeruk bersifat toksik terhadap Artemia salina L. dengan nilai LC50
sebesar 648.15 μg/mL (Ramadhan 2013). Daun benalu langsat mengandung
flavonoid dan pemberian ekstrak etanol terbukti memberikan efek hepatoprotektor
pada tikus putih jantan yang diinduksi CCl4 (Tristanti et al. 2013). Ekstrak etanol
2
benalu mangga mampu memperbaiki struktur jaringan kanker kolon (Wicaksono
dan Permana 2013).
Salah satu benalu yang belum banyak diungkap potensinya adalah benalu
cengkih. Terapi dengan meminum air rebusan daun benalu cengkih dilaporkan
dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara (Puro 2012). Daun benalu
cengkih juga memiliki aktivitas antiradikal bebas DPPH (Suryanto & Wehantouw
2008) dan mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus dan
Escherichia coli (Puro 2012). Penapisan kandungan kimia pada daun benalu
cengkih menunjukkan adanya komponen senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan
triterpenoid (Fitrilia et al. 2015). Komponen flavonoid telah diketahui berperan
penting dalam pencegahan kanker (Ren et al. 2003). Belum ada penelitian terkait
identifikasi senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi secara in vitro pada
benalu cengkih.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa antikanker dari ekstrak
daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari
kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCMB2) secara in vitro. Ekstrak benalu cengkih diharapkan mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi
bahan alam untuk pengobatan kanker.
Perumusan Masalah
Potensi dari benalu cengkih belum banyak diungkap dibandingkan jenis
benalu lainnya. Penapisan komponen fitokimia pada akar, batang, daun, dan
bunga benalu cengkih menunjukkan adanya komponen fenolik, flavonoid, saponin,
dan tanin (Suryanto & Wehantouw 2008). Kandungan senyawa antikanker dan
aktivitas antiproliferasi dari ekstrak benalu cengkih secara in vitro belum
diketahui.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi kandungan senyawa antikanker
dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara
in vitro pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai kandungan
senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih serta aktivitas
antiproliferasinya sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi bahan
alam untuk pengobatan kanker.
3
Hipotesis
Ekstrak daun benalu cengkih mengandung senyawa antikanker. Ekstrak
daun benalu cengkih juga menghambat pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan
MCM-B2.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian ini meliputi pengambilan sampel daun benalu
cengkih (D. pentandra (L.) Miq.), pembuatan simplisia, penentuan kadar air,
penapisan komponen fitokimia, dan ekstraksi dengan metode refluks dan maserasi.
Tahap selanjutnya ialah uji sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih dengan
metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak yang paling aktif dianalisis
senyawa aktifnya dengan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (PyGC/MS). Ekstrak juga diuji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2 dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna
trypan blue.
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia
FMIPA IPB, Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor, dan
Laboratorium Kultur Jaringan Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi,
dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) IPB. Penelitian dilaksanakan
dari Desember 2014 hingga Agustus 2015.
Bahan
Bahan yang diuji dalam penelitian ini adalah daun benalu cengkih yang
diperoleh dari daerah Batanghari, Lampung Timur pada bulan Januari 2015.
Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian antara lain etanol 70%, etil asetat,
n-heksana, akuades, amil alkohol, KOH, HCN 2N, pereaksi Wegner, Meyer, dan
Dragendorff, FeCl3 10%, asam sulfat, asam asetat, Liebermann-Burchard, kista
Artemia salina Leach, air laut, Tween80, akuabides steril, Dulbecco’s Modified
Eagle’s medium (DMEM), Fetal Calf Serum (FCS) 10%, antibiotik PenisilinStreptomisin 1%, Fungizon, dan pewarna Trypan blue.
Sel yang digunakan pada penelitian ini adalah sel lestari kanker leukimia
manusia (K562) dan sel kanker payudara anjing (MCM-B2) koleksi Laboratorium
Kultur Jaringan, Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patotogi
FKH IPB.
4
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah grinder, desikator,
cawan porselen, oven, evaporator vakum, corong pisah, vorteks, lampu TL 14
watt, plat BSLT, aerator, shaker orbital, inkubator CO2, autoklaf, mikroplat 24sumuran, mikroplat 96-sumuran, hemositometer Improved Neubauer, mikroskop
cahaya, dan mesin GC/MS pirolisis (Shimadzu GCMS-QP2010).
Prosedur
Determinasi Jenis Sampel Benalu Cengkih
Sampel daun benalu cengkih dideterminasi di Herbarium Bogoriense,
Pusat Penelitian Biologi – LIPI, Cibinong Bogor untuk menentukan identitas
spesies sampel.
Pembuatan Simplisia dan Penentuan Kadar Air Sampel
Bagian benalu cengkih yang digunakan ialah daun. Daun benalu cengkih
yang diambil mulai daun keempat dari pucuk ke arah yang lebih tua.
Pembuatan Simplisia Daun benalu cengkih dicuci menggunakan air mengalir.
Daun dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dan ditutup kain
berwarna gelap. Pengeringan dilakukan selama 3x7 jam (hari ke 1,2,3) dengan
cuaca normal. Pengeringan disempurnakan dengan oven pada suhu 40-45oC. Daun
dibuat serbuk berukuran 40 mesh menggunakan grinder.
Penentuan Kadar Air Sampel Kadar air ditentukan berdasarkan metode SNI
01-2891-1992. Cawan kosong dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105°C
selama 1 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Cawan ditimbang
dan dicatat massanya. Sebanyak 1 gram sampel ditimbang di dalam cawan
tersebut. Sampel dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam atau sampai
massanya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0.003 gram). Cawan berisi
sampel kering lalu didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang massa
akhirnya. Kadar air sampel dihitung berdasarkan persamaan (1) sebagai berikut.
adar air % b
y
a
Keterangan:
x = massa cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g)
y = massa cawan dan sampel setelah dikeringkan (g)
a = massa cawan kosong (g)
Ekstraksi Sampel
Simplisia benalu cengkih diekstraksi dengan pelarut air dengan cara
direbus menggunakan refluks dan pelarut etanol 70% dengan metode maserasi.
5
Pembuatan Ekstrak Ekstrak air dibuat dengan cara merebus 40 g simplisia
dengan 400 mL akuades selama 2 jam menggunakan refluks. Ekstrak etanol
dibuat dengan cara merendam 40 g simplisia dengan 400 mL etanol 70% teknis
dan diaduk menggunakan shaker orbital kecepatan 125 rpm selama 24 jam.
Ekstraksi sampel dengan air dan etanol masing-masing dilakukan pengulangan
tiga kali dengan pelarut baru. Ekstrak yang dihasilkan dipisahkan dari residunya
menggunakan sentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Ekstrak
diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC.
Fraksinasi Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol difraksinasi dengan pelarut nheksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan etanol (polar) menggunakan
corong pisah. Sebanyak 15 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 100 mL air hangat
lalu dimasukkan dalam corong pisah. Ekstrak etanol difraksinasi dengan 100 mL
n-heksana. Campuran dikocok perlahan setiap 10 menit dan diulang tiga kali
kemudian didiamkan selama 30 menit hingga terbentuk fraksi n-heksana (atas)
dan air (bawah). Fraksi n-heksana dipisahkan dan fasa air difraksinasi lanjut
dengan 100 mL etil asetat. Fraksi etil asetat yang dihasilkan kemudian dipisahkan
dan fraksi air ditambah 100 mL etanol sehingga diperoleh fraksi etanol. Ekstraksi
setiap fraksi menggunakan 100 mL pelarut baru dan diulang hingga pelarut
hampir tak berwarna. Ketiga fraksi diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator
vakum pada suhu 60oC. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dan dihitung
berdasarkan persamaan (2) sebagai berikut.
endemen e stra
%
assa e stra yang dihasil an
assa simplisia yang die stra si
100%
Uji Kualitatif Kandungan Fitokimia Sampel
Penentuan kandungan fitokimia sampel dilakukan berdasarkan metode
Windarini et al. (2013) yang dimodifikasi.
Uji Alkaloid Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 mL HCl 2 N dan 9 mL
akuades. Larutan dipanaskan selama 2 menit lalu didinginkan dan disaring. Filtrat
diuji dengan tiga pereaksi alkaloid (Wagner, Meyer, dan Dragendorff). Adanya
alkaloid ditandai dengan endapan coklat pada pereksi Wagner, endapan putih
kekuningan pada pereaksi Meyer dan endapan merah hingga jingga pada pereaksi
Dragendorff.
Uji Flavonoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 0.05 g serbuk
magnesium dan 0.2 mL asam alkohol (campuran HCl 37% dan etanol 95%
dengan volum sama). Campuran tersebut ditambahkan 2 mL amil alkohol
kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah
atau kuning pada lapisan amil alkohol.
Uji Saponin Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 10 mL air panas
dalam tabung reaksi lalu didinginkan. Larutan dikocok secara vertikal selama 10
detik. Adanya saponin ditandai dengan terbentuknya busa setinggi 1-10 cm yang
stabil sekitar 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan setetes HCN 2N.
6
Uji Tanin Sebanyak 10 mg ekstrak dididihkan dalam 50 mL akuades selama 5
menit kemudian disaring. Larutan uji diambil 5 mL dan direaksikan dengan 3-5
tetes FeCl3 dalam tabung reaksi. Adanya tanin ditandai dengan warna biru tua
atau hitam kehijauan.
Uji Triterpenoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 5 mL larutan
eter dalam cawan porselen kemudian diuapkan. Residu ditambahkan dengan asam
asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Adanya triterpenoid ditandai dengan
warna merah hingga hijau.
Pengujian Sitotoksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Pengujian sitotoksisitas dilakukan berdasarkan metode McLaughlin et al.
(1998) yang dimodifikasi.
Penyiapan Larva Udang Penetasan larva dilakukan dengan cara merendam 10
mg kista udang dalam toples kaca berisi 1 L air laut yang telah disaring. Penetasan
dilakukan pada suhu kamar dengan diterangi sinar lampu TL 14 watt dan diaerasi
selama 24 jam. Larva udang digunakan untuk uji setelah 48 jam.
Pembuatan Larutan Uji Larutan uji terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi
n-heksana, fraksi etil asetat, dan fra si etanol. Larutan sto 2000 μg/mL masingmasing e stra dibuat dengan menambah an 20 mg e stra dengan 50 μL
Tween80 lalu ditambahkan air laut hingga volumnya 10 mL. Ekstrak disonikasi
hingga larut. Pengujian dilakukan dengan konsentrasi 1000, 500, 100, dan 10
μg/mL.
Pengujian Sitotoksisitas Sebanyak 1 mL air laut yang berisi 10 ekor larva
udang dimasukkan ke dalam mikroplat 12 sumuran dan ditambahkan 1000, 500,
100, dan 10 μL larutan sto e stra 2000 μg/mL . Volume setiap sumuran
dicukupkan hingga 2 mL dengan penambahan air laut. Setiap konsentrasi ekstrak
diuji sebanyak tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar di bawah
sinar lampu TL 14 watt selama 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang
hidup. Kontrol dilakukan dengan prosedur yang sama tanpa penambahan ekstrak.
Analisis Senyawa Antikanker
Senyawa aktif sampel dianalisis menggunakan GC/MS pirolisis
(Shimadzu GCMS-QP2010). Helium digunakan sebagai carrier gas (0.85
mL/menit) dalam kolom kapiler Rtx-5 S 60 mm 0.25 mm 0.25 μm dan
dioperasikan dengan mode electron impact (EI) pada 70 eV serta suhu sumber ion
pada 200oC. Kondisi kromatografi diatur pada 50oC untuk suhu oven kolom dan
280oC untuk suhu injeksi. Injeksi dilakukan dengan mode split, yaitu isotermal
pada 50oC selama 5 menit lalu ditingkatkan suhunya menjadi 280oC selama 30
menit kemudian dipertahankan pada suhu ini hingga menit ke-60. Komponen
senyawa aktif diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan analisis MS.
7
Uji Aktivitas Antiproliferasi
Uji aktivitas antikanker dilakukan berdasarkan metode Priosoeryanto et al.
(1995a).
Persiapan Media dan Ekstrak Sel lestari kanker dikultur menggunakan media
pertumbuhan DMEM sebanyak 850 μL dalam mikroplat 24 sumuran. Media di
setiap sumuran ditambahkan antibiotik (penisilin-streptomisin) 10 μL, fungizon
10 μL dan serum (FCS) 30 μL serta ekstrak sebanyak 50 μL. Ekstrak yang
digunakan adalah ekstrak yang bersifat toksik berdasarkan uji toksisitas dengan
BSLT. Variasi konsentrasi ekstrak ditentukan berdasarkan nilai LC50 dan diuji
sebanyak tiga kali ulangan.
Penanaman Sel Suspensi sel lestari kanker dalam ampul (cryovial) dicairkan
(thawing) lalu dihomogenkan dengan vorteks. Sebanyak 50 μL sel lestari kanker
K562 dan MCM-B2 (kepadatan 7x106 sel/mL) ditanam ke dalam masing-masing
sumuran yang telah berisi media bersuplemen dan ekstrak. Kontrol negatif
dilakukan dengan medium DMEM dan kontrol positif menggunakan doksorubisin
100 μg/mL dengan prosedur yang sama. Volume total setiap sumuran adalah 1
mL. Semua perlakuan dilakukan dalam tiga kali ulangan. Sel lestari kanker
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Pemanenan dan Penghitungan Sel Sel dipanen setelah 3-4 hari yaitu ketika
pertumbuhan sel dikontrol negatif telah menutupi sekitar 70% permukaan
sumuran (konfluen). Sebanyak 100 μL sel lestari kanker dimasukkan ke dalam
sumuran mikroplat ELISA yang telah berisi 5 μL pewarna trypan blue kemudian
dihomogenkan. Sel sebanyak 5 μL ditetes an pada chamber hemasitometer lalu
ditutup dengan cover slip. Sel dihitung menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah
kamar hitung baik sel yang mati (biru) maupun sel hidup (bening). Hasil
penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per mL suspensi dengan
persamaan (3) berikut.
Jumlah sel/mL = Jumlah sel yang dihitung x Faktor volume x Faktor pengenceran
Persentase aktivitas pertumbuhan dan penghambatan sel kanker dihitung dengan
persamaan (4) dan (5) berikut.
%
tivitas pertumbuhan
umlah rataan sel dengan perla uan
umlah rataan sel di ontrol negatif
100%
% Aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)
Analisis Statistika
Data dianalisis menggunakan analisis varian
NOV
satu arah α
0.05 . Hasil uji berma na ji a diperoleh harga p≤0.05 dan ji a terdapat perbedaan
yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui signifikansi
perbedaan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.
8
3 HASIL
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Determinasi dilakukan oleh Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian
Biologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor
berdasarkan sampel daun benalu cengkih. Hasil determinasi menunjukkan bahwa
spesies benalu yang diteliti adalah Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. dan
termasuk ke dalam famili Loranthaceae.
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Analisis gravimetri menunjukkan bahwa simplisia daun benalu cengkih
memiliki kadar air sebesar 9.14%. Rendemen ekstrak daun benalu cengkih dengan
beberapa pelarut dapat dilihat pada Tabel 1. Ekstraksi sampel dengan pelarut air
menghasilkan rendemen ekstrak yang lebih tinggi dibandingkan etanol 70%.
Rendemen fraksinasi paling tinggi diperoleh melalui penggunaan pelarut etanol.
Tabel 1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih
dengan beberapa pelarut
Sampel
Rendemen (%)
Ekstrak air
Ekstrak etanol
Fraksi etanol
Fraksi etil asetat
Fraksi n-heksana
17.83
16.14
4.65
2.45
0.44
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih dapat
dilihat pada Tabel 2. Semua sampel menunjukkan hasil uji negatif terhadap
alkaloid dan positif terhadap flavonoid dan triterpenoid. Saponin tidak dijumpai
dalam fraksi etil asetat dan n-heksana. Hanya fraksi n-heksana yang tidak
mengandung tanin.
Tabel 2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
Kandungan
fitokimia
Ekstrak
air
Ekstrak
etanol
Fraksi
etanol
Fraksi etil
asetat
Fraksi
n-heksana
Alkaloid
Dragendrof
Meyer
Wagner
Flavonoid
Saponin
Tanin
Triterpenoid
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
9
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang
dapat dilihat pada Tabel 3. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki
nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana
mampu mematikan 50% populasi larva udang pada konsentrasi lebih kecil dari
1000 μg/mL.
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih
Sampel
Ekstrak air
Ekstrak etanol
Fraksi etanol
Fraksi etil asetat
Fraksi n-heksana
Nilai LC50 μg/mL
1572.43
1673.72
2157.16
649.13
55.32
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (GC/MS pirolisis)
digunakan untuk menganalisis kandungan senyawa aktif dalam sampel fraksi nheksana benalu cengkih. Kromatogram dari hasil analisis GC/MS pirolisis fraksi
n-heksana benalu cengkih ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncakpuncak spektrum yang menunjukkan kandungan senyawa dalam sampel fraksi nheksana (Tabel 4). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan terbesar dalam sampel
fraksi n-heksana benalu cengkih diikuti dengan asam palmitat dan metil linolenat.
Gambar 1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih
10
Tabel 4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih
Waktu
Konsentrasi
Puncak
Nama senyawa
retensi
(%)
(menit)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1.975
2.626
13.919
14.293
15.226
15.580
16.708
17.540
18.134
18.456
19.272
19.368
19.615
19.684
19.792
20.436
22.117
22.315
2.94
3.28
1.31
0.33
2.31
1.56
0.33
0.35
1.02
19.00
8.77
5.45
18.04
10.77
0.92
0.83
19.56
0.67
19
20
22.606
26.050
0.52
2.03
Etanol
Kloroform
2,6-Dimetoksifenol
Metileugenol
2,4-Di-tert-butilfenol
Asam laurat
Palmitat aldehida
Neofitadiena
Metil palmitat
Asam palmitat
Metil oleat
Fitol
Metil linolenat
Asam stearat
Etil n-heptadecanoat
Methyl trans-9,10-e
Dioktil ftalat
1H-Naftol[2,1-b]piran-8(4aH)one,3-etenildekahidro3,4a,7,7,10a-penta
Albikanol
Gliseril trioktanoat
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Pengaruh pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih sel lestari
kanker K562 dan MCM-B2 disajikan pada Gambar 2. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara
umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2
secara in vitro. Jumlah sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tampak menurun
seiring peningkatan konsentrasi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu
cengkih yang diberikan.
Aktivitas penghambatan ekstrak tampak berbeda pada kedua sel lestari
kanker namun meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak yang
digunakan (Tabel 5). Perlakuan dengan pemberian fraksi n-heksana secara nyata
(p