Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe Pentandra (L.) Miq) Sebagai Agen Antioksidan Dan Antidiabetes Secara In Vitro.
EKSTRAK DAUN BENALU CENGKEH (Dendrophthoe
pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN
ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Ekstrak Daun Benalu
Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan
Antidiabetes secara In Vitro adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Tiana Fitrilia
NIM G851130341
RINGKASAN
TIANA FITRILIA. Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro. Dibimbing oleh
MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Benalu merupakan tumbuhan semi parasit yang memiliki banyak aktivitas
biologis seperti antioksidan, antikanker, antidiabetes dan hipertensi.
Dendrophthoe pentandra (L.) Miq merupakan salah satu spesies benalu di
Indonesia yang dapat tumbuh diberbagai tanaman inang. Penelitian ini bertujuan
mengetahui ekstrak paling aktif dari daun benalu cengkeh sebagai agen
antioksidan dan antidiabetes secara in vitro serta untuk mengidentifikasi senyawa
aktif menggunakan LC-MS/MS. Aktivitas antioksidan diukur menggunakan uji
penangkapan radikal bebas DPPH dan aktivitas antidiabetes diukur menggunakan
uji penghambatan enzim α-glukosidase. Sampel yang diuji meliputi ekstrak air,
ekstrak etanol 70 %, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol.
Kadar air yang diperoleh dari serbuk daun benalu cengkeh adalah 8 %. Hal
ini menunjukkan bahwa serbuk daun benalu cengkeh dapat disimpan dalam
jangka waktu lama. Serbuk daun kemudian diekstraksi dengan pelarut air dan
etanol 70 % menghasilkan rendemen sebesar 26.3 % dan 23.5 %. Ekstrak etanol
70 % yang diperoleh difraksinasi dengan pelarut yang berbeda kepolaran yaitu nheksana dan etil asetat. Rendemen hasil fraksinasi yang diperoleh untuk fraksi nheksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol secara berturut-turut adalah 0.9 %, 7.1
% dan 6.8 %. Uji fitokimia menunjukkan bahwa semua sampel positif
mengandung senyawa tanin dan flavonoid tetapi tidak mengandung alkaloid.
Kandungan total fenol paling tinggi terdapat pada fraksi etil asetat yaitu 358.4 mg
GAE/ g sampel. Semua sampel yang diuji memiliki aktivitas antioksidan dan
antidiabetes. Aktivitas antioksidan yang tinggi ditunjukkan oleh ekstrak air,
ekstrak etanol dan fraksi etil asetat sedangkan aktivitas antidiabetes paling tinggi
ditunjukkan oleh ekstrak etanol 70 % dengan IC50 129.7 µg/mL dan memiliki
jenis penghambatan nonkompetitif campuran. Analisis senyawa aktif
menggunakan LC-MS/MS menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70 % daun benalu
cengkeh mengandung tiga senyawa berdasarkan kelimpahan paling tinggi yaitu
dengan bobot molekul 700.73 (m/z), 678.59 (m/z) dan 58.08 (m/z).
Kata kunci: antidiabetes, antioksidan, daun benalu cengkeh, DPPH, LC-MS/MS
α-glukosidase
SUMMARY
TIANA FITRILIA. Clove Mistletoe Leaf Extracts (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) as an Antioxidant and Antidiabetes Agent In Vitro. Supervised by MARIA
BINTANG and MEGA SAFITHRI.
Mistletoe is a semi-parasitic plant that has many biological activities such
as antioxidant, anticancer, antidiabetes and hypertension. Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq is one of the mistletoe species in Indonesia that can grew in various host
plants. This study was conducted the most active extracts of clove mistletoe leaf
as an antioxidant and antidiabetes in vitro as well as to identified of active
compounds using LC-MS/MS. Antioxidant activity was measured using DPPH
free radical scavenging assay and antidiabetes activity was measured using
inhibition of α-glucosidase assay. Samples were tested include water and ethanol
70 % extracts as well as n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions.
The moisture content of clove mistletoe leaf powder in the test was 8 %.
This suggest that the clove mistletoe leaf powder can be stored for long periods.
Than, the leaf powder was extracted with solvent of water and ethanol 70 % has a
yield of 26.3 % and 23.5 %. The ethanol extract further fractionated with a
solvent which has a different polarity, i.e. n-hexane and ethyl acetate. The yield of
fractionation results for n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions were 0.9 %,
7.1 % and 6.8 %, respectively. Phytochemical test showed that all of the samples
containing tannins and flavonoids but not for alkaloids. The highest total phenolic
content was in ethyl acetate is 358.4 mg GAE/g sample. All samples tested had an
antioxidant and antidiabetes activities. The best antioxidant activity was in water
and ethanol extracts as well as ethyl acetate fraction while the highest antidiabetes
activity was shown by ethanol 70 % extract with IC50 129.7 µg/mL and exhibited
mixed-noncompetitive inhibition. Analysis of active compound using LC-MS/MS
showed that ethanol 70 % extract of clove mistletoe leaf was containing three
compounds based on the highest abundance with molecular weight 700.73 (m/z),
678.59 (m/z) and 58.08 (m/z).
Keywords: antidiabetes, antioxidant, clove mistletoe leaf, DPPH, LC-MS/MS,
α-glucosidase
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EKSTRAK DAUN BENALU CENGKEH (Dendrophthoe
pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN
ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Judul Tesis : Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq)
sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro
Nama
: Tiana Fitrilia
NIM
: G851130341
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua
Dr Mega Safithri, SSi MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 11 Agustus 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul
karya ilmiah dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Januari sampai dengan
Mei 2015 ini ialah Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro.
Ucapan terima kasih kepada Prof Dr drh Maria Bintang, MS dan Dr Mega
Safithri, S.Si M.Si selaku pembimbing atas ilmu, saran dan kesabaran yang telah
diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar Biokimia (Dosen, Staff TU,
Laboran dan teman-teman Biokimia 2013) yang telah memberikan motivasi dan
membantu penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
(DIKTI) sebagai sponsor Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri 2013.
Ucapan spesial kepada kedua orang tua, adinda Bio, Gema dan Tirta yang selalu
memberikan do’a dan dukungannya serta kepada anggota BSL IPB 2013 terima
kasih atas persaudaraan yang telah diberikan kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Tiana Fitrilia
DAFTAR ISI
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian
Analisis Data
3
3
3
3
3
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
7
7
11
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
19
19
19
DAFTAR PUSTAKA
20
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
32
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase
Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh
Aktivitas antioksidan sampel daun benalu cengkeh
Inhibisi enzim α-glukosidase
6
7
9
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Perbandingan kandungan total fenol sampel
Plot Lineweaver-Burk pada uji kinetika enzim
Mekanisme efek biologis senyawa polifenol
Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antioksidan
Struktur dasar flavonoid
Mekanisme antioksidan dalam meredam radikal bebas
Reaksi hidrolisis substrat oleh α-glukosidase
8
10
13
14
15
15
16
DAFTAR LAMPIRAN
1. Diagram alir penelitian
2. Kurva standar asam galat
3. Kurva Michaelis-Menten
4. Spektrum LC-MS/MS ekstrak etanol 70 %
5. Hasil uji analisis statistik total fenol sampel
6. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 antioksidan sampel
7. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 inhibisi α-glukosidase
25
26
27
28
29
30
31
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) adalah sindrom metabolik yang ditandai dengan
tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) karena gangguan produksi, sekresi
atau resistensi insulin. Badan Kesehatan Dunia, World Health Organization
(WHO) memperkirakan 150 juta penduduk dunia menderita diabetes dan akan
mengalami kenaikan dua kali lipat pada tahun 2025 (WHO 2014). Jumlah
penderita diabetes didominasi oleh pasien penderita DM tipe II dan prevalensinya
tumbuh pada tingkat yang mengkhawatirkan (Perla dan Jayanty 2013). Data dari
International Diabetes Federation (IDF), Indonesia diketahui sebagai salah satu
negara dengan prevalensi DM tinggi menempati urutan ketujuh sebagai negara
penderita DM terbesar setelah Cina, India, USA, Brazil, Rusia dan Meksiko (IDF
2013). Prevalensi diabetes di Indonesia tahun 2013 yang terdiagnosis diabetes
sebesar 1.5 %. Prevalensinya meningkat sesuai dengan bertambahnya umur,
namun cenderung menurun pada usia ≥ 65 (Kemenkes RI 2013).
Hiperglikemia terlibat dalam pembentukan radikal bebas dengan
mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif (Patel et al. 2011). Senyawa
oksigen reaktif dapat merusak sel β-pankreas dan dapat meningkatkan modifikasi
lipid, DNA serta protein pada berbagai jaringan (Ueno et al. 2002; Patel et al.
2011). Adanya modifikasi molekuler menginisiasi terjadinya kerusakan oksidatif
yang dikenal sebagai stres oksidatif (Setiawan dan Suhartono 2005). Stres
oksidatif dapat menurunkan sekresi insulin oleh sel β-pankreas dan berperan
dalam perkembangan komplikasi seperti ginjal, mata, pembuluh darah dan
kerusakan saraf (Patel et al. 2011). Memperbaiki stres oksidatif adalah strategi
yang efektif untuk menurunkan kadar glukosa darah dan komplikasinya.
Kerusakan oksidatif tersebut dapat diredam dengan pemberian senyawa
antioksidan (Setiawan dan Suhartono 2005). Pemberian antioksidan pada hewan
uji dapat menghambat tahap awal nefropati dan neuropati (Ueno et al. 2002)
sedangkan pada manusia dapat menghambat komplikasi mikrovaskuler, perbaikan
sistem saraf otonom jantung dan perbaikan vasodilatasi (Beckman et al. 2001).
Berbagai pengobatan diabetes telah banyak dilakukan. Salah satunya dengan
pemberian obat sintetis, namun pengobatan ini dapat menimbulkan efek samping
seperti kembung, diare dan kejang perut (Lee et al. 2007). Oleh karena itu,
penggunaan tanaman herbal sebagai obat tradisional menjadi penting dalam
pengobatan penyakit diabetes. Menurut Wu et al. (2014), terapi diabetes dapat
dilakukan dengan pemberian senyawa antioksidan dan melalui mekanisme
inhibisi enzim penghidrolisis karbohidrat seperti α-glukosidase pada organ
pencernaan. Inhibisi α-glukosidase dapat menunda penyerapan glukosa sehingga
dapat menekan kadar glukosa postprandial (Ping et al. 2010; Lee et al. 2014).
Penggunaan tanaman herbal telah banyak dimanfaatkan oleh masyarakat
untuk berbagai keperluan sandang, pangan, kosmetik maupun obat. Tanaman
benalu merupakan salah satu tanaman herbal yang manfaatnya belum diketahui
secara luas. Menurut Artanti et al. (2003), benalu merupakan tumbuhan semi
parasit yang memiliki banyak spesies bergantung pada tumbuhan inang tempat
benalu itu tumbuh. Tumbuhan ini terdiri atas dua suku yaitu suku Loranthaceae
2
dan Viscaceae (Uji dan Samiran 2005). Benalu cengkeh adalah salah satu benalu
yang masuk ke dalam suku Loranthaceae.
Penelitian yang dilakukan oleh Suryanto dan Wehantouw (2008), ekstrak
etanol benalu cengkeh pada bagian akar, batang, daun dan bunga mengandung
komponen fenol, flavonoid dan tanin. Komponen tersebut merupakan metabolit
sekunder yang keberadaannya melimpah di tumbuhan, memiliki banyak efek
biologis termasuk aktivitas antioksidan dan dapat menghambat berbagai
perkembangan penyakit kronis (Yao et al. 2013; Lee et al. 2014).
Berdasarkan hal tersebut, adanya kandungan metabolit sekunder pada daun
benalu cengkeh diduga berperan sebagai agen antioksidan dan antidiabetes
melalui inhibisi enzim α-glukosidase. Sejauh ini belum dilaporkan adanya
pengaruh jenis pelarut dalam mengekstrak metabolit sekunder serta pengujian
terhadap senyawa aktif dari daun benalu cengkeh.
Perumusan Masalah
Diabetes melitus membutuhkan penanganan secara tepat untuk menurunkan
kadar glukosa darah dan mencegah terjadinya komplikasi. Hiperglikemia terlibat
dalam pembentukan senyawa oksigen reaktif yang dapat merusak sel β pankreas
dan mengganggu kesetimbangan antioksidan dalam tubuh. Selama ini,
penggunaan obat sintetik sering menimbulkan efek samping seperti kembung,
diare dan kejang perut. Oleh karena itu, pemanfaatan daun benalu cengkeh
menjadi alternatif untuk pengobatan diabetes melalui inhibisi α-glukosidase.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menentukan ekstrak daun benalu cengkeh paling
aktif sebagai agen antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak terpilih dari uji
antidiabetes digunakan untuk menentukan kinetika inhibisi enzim dan identifikasi
senyawa aktif menggunakan LC-MS/MS.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah
tentang pemanfaatan daun benalu cengkeh sebagai agen antioksidan dan
antidiabetes serta senyawa aktif yang terlibat didalamnya.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian meliputi ekstraksi daun benalu cengkeh dengan
pelarut air dan etanol 70 %. Ekstrak etanol 70 % difraksinasi menggunakan
pelarut n-heksana dan etil asetat. Sampel hasil ekstraksi dan fraksinasi dilakukan
pengujian secara in vitro terhadap aktivitas antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak
paling aktif dalam menginhibisi α-glukosidase dijadikan dasar untuk pengkajian
mekanisme inhibisi enzim dan identifikasi senyawa menggunakan LC-MS/MS.
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2014 sampai Mei 2015.
Penelitian dikerjakan di laboratorium Biokimia IPB dan Pusat Studi Biofarmaka.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu
cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) yang diperoleh dari daerah CurupBengkulu, etanol p.a, etanol 70 %, n-heksana, etil asetat, asam galat, metanol,
reagen Folin-Ciocalteu, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), enzim α-glukosidase
yang berasal dari rekombinan Bacillus stearothermophilus (Sigma G3651-250UN,
Jerman), substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) (Sigma Aldrich, USA),
dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), akarbose dan α-tokoferol.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven, corong
pisah, evaporator, spektrofotometer (Hitachi tipe U-2800), pH meter (Eutech
Instruments), vortex mixer (BI type 37600 mixer), microplate reader (Biotek
Epoch) dan LC-MS/MS (QMicro QAA 842).
Prosedur Penelitian
Preparasi Sampel
Daun benalu cengkeh dideterminasi di Herbarium Bogoriense-LIPI, Bogor,
Indonesia. Daun yang digunakan dimulai dari daun yang terletak pada lembar
keempat dari pucuk ke arah daun yang lebih tua. Selanjutnya daun benalu cengkeh
dikeringkan dan dihaluskan sampai berbentuk serbuk berukuran 40 mesh.
Penentuan Kadar Air Daun Benalu Cengkeh (SNI 01-3182-1992)
Kadar air serbuk daun benalu cengkeh ditentukan dengan cara pengeringan
di dalam oven. Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C selama 15 menit
lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang dengan neraca analitik. Sebanyak
1 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 °C
selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit kemudian
ditimbang. Pemanasan diulang sampai diperoleh bobot konstan. Kadar air
dihitung dengan persamaan :
Kadar air (%) =
4
Dengan : a = bobot contoh sebelum pemanasan (g)
b = bobot contoh setelah pemanasan (g)
Ekstraksi Daun Benalu Cengkeh (Harjadi 1993; Puro 2012)
Ekstraksi daun benalu cengkeh dilakukan dengan metode perebusan dan
maserasi. Perbandingan serbuk daun benalu cengkeh dengan pelarut adalah 1:10.
Ekstraksi melalui perebusan dilakukan dengan cara merebus simplisia ke dalam
pelarut air selama 2 jam sedangkan maserasi dilakukan dengan cara merendam
simplisia ke dalam pelarut etanol 70 %. Maserasi dilakukan selama 24 jam dengan
shaker pada kecepatan 150 rpm di suhu ruang. Campuran dipisahkan dan filtrat
yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator sehingga diperoleh ekstrak
air dan ekstrak etanol 70 %. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dihitung
dengan menggunakan persamaan sebagai berikut :
Rendemen ekstrak (%) =
Fraksinasi Ekstrak secara Ekstraksi Cair-cair (Kim et al. 2008)
Ekstrak etanol 70 % selajutnya difraksinasi secara ekstraksi cair-cair
menggunakan pelarut dengan kepolaran yang semakin meningkat, yaitu pelarut nheksana (non polar) dan etil asetat (semi polar). Sebanyak 20 gram ekstrak etanol
70 % daun benalu cengkeh dilarutkan dalam air hangat 100 mL, dilakukan
pengadukan sampai encer dan homogen kemudian dimasukkan ke dalam corong
pisah. Mula-mula difraksinasi dengan pelarut n-heksana sebanyak 100 mL.
Campuran dikocok setiap 10 menit sekali sebanyak 3 kali, lalu didiamkan lebih
kurang 30 menit untuk mencapai kondisi jenuh, sehingga diperoleh lapisan nheksana dan air. Lapisan n-heksana dipisahkan, kemudian lapisan air difraksinasi
dengan etil asetat sebanyak 100 mL, diperoleh lapisan etil asetat dan air. Setelah
lapisan etil asetat dipisahkan, lapisan air diuapkan dan ditambahkan pelarut etanol
sebanyak 100 mL. Lapisan yang terbentuk dari hasil fraksinasi dipekatkan dengan
evaporator.
Uji Fitokimia (Farnsworth 1966; Chugh et al. 2012)
Uji fitokimia dari ekstrak air, ekstrak etanol 70 % dan fraksi ekstrak etanol
meliputi analisis kualitatif tanin, alkaloid, flavonoid, saponin dan triterpenoid.
Uji Tanin. Larutan uji dibuat dengan mereaksikan 10 mg sampel dengan
50 mL air panas, kemudian dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit dan
filtrat disaring. Sebanyak 5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCL3. Terbentuknya warna hijau violet
menunjukkan adanya tanin.
Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 1 mL HCl 2N
dan 9 mL aquades, kemudian dipanaskan selama 2 menit dan didinginkan. Filtrat
disaring dan ditampung. Filtrat yang diperoleh merupakan larutan uji untuk
pereaksi Meyer, Bouchardart dan Dragendorf. Keberadaan alkaloid dalam sampel
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih atau kuning pada pereaksi Meyer,
endapan coklat sampai hitam pada pereaksi Bouchardart dan endapan jingga
coklat pada pereaksi Dragendorf.
Uji Flavonoid. Sebanyak 10 mg sampel direaksikan dengan 10 mL air
kemudian dipanaskan. Campuran dipisahkan dan filtrat diberi serbuk Mg, 1 mL
5
HCl pekat dan 1 mL amil alkohol. Uji positif ditandai dengan munculnya warna
pada lapisan amil alkohol.
Uji Saponin. Sebanyak 10 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan 10 mL air panas lalu didinginkan. Larutan uji dikocok
vertikal selama 10 detik, kemudian diamati selama 10 menit. Terbentuknya buih
setinggi 1 – 10 cm menunjukkan adanya saponin dalam sampel. Pada penambahan
1 tetes HCl 2N buih tidak hilang.
Uji Triterpenoid. Sebanyak 10 mg sampel ditambahkan dengan 5 mL
larutan eter, kemudian diuapkan dalam cawan penguap. Larutan uji ditambahkan
dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Terbentuknya warna
merah-hijau adanya triterpenoid.
Penentuan Kandungan Total Fenol (Lim dan Murtijaya 2007)
Sebanyak 300 μL sampel konsentrasi 200 µg/mL dimasukkan ke dalam
tabung reaksi kemudian ditambahkan 1.5 mL reagen Folin-Ciocalteau (1:10) dan
1.2 mL Na2CO3 7.5 %. Campuran diinkubasi di suhu kamar selama 30 menit
kemudian absorban diukur menggunakan spektrofotometer pada 765 nm. Asam
galat digunakan untuk pembuatan kurva standar.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Salazar et al. 2011)
Larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 5, 10, 30, 50, 100 dan
200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate sebanyak 100 μL,
ditambahkan dengan etanol p.a 100 μL dan larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH) hingga volume 300 μL. Campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu
ruang kemudian absorban diukur dengan microplate reader pada 517 nm. αtokoferol digunakan sebagai pembanding dalam menangkap radikal bebas DPPH.
Kapasitas penangkapan radikal bebas dihitung sebagai persentase inhibisi
terhadap DPPH (persentase “scavenging effect”), yaitu :
% inhibisi =
Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi sampel yang
diperlukan untuk memberikan % inhibisi sebesar 50%.
Uji Aktivitas α-Glukosidase (Sancheti et al. 2009; Sugiwati et al. 2009)
Sebanyak 10 μl larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 200, 500,
800 dan 1200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate reader dan
ditambahkan dengan 50 μL larutan bufer fosfat pH 7. Selanjutnya, sebanyak 25 μl
substrat berupa p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) 10 mM ditambahkan
tiga menit sebelum uji dimulai. Reaksi diinisiasi dengan penambahan 25 μl enzim
α-glukosidase dengan konsentrasi 0.04 U/mL dalam bufer fosfat (pH 7.0)
kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 100 μl Na2CO3 200 mM. Hasil reaksi diukur dengan microplate
reader pada panjang gelombang 410 nm. Larutan akarbose digunakan sebagai
kontrol positif dengan sistem reaksi sama seperti sampel. Percobaan dilakukan
sebanyak 3 kali pengulangan. Selanjutnya dilakukan perhitungan % inhibisi untuk
menentukan nilai IC50. Sistem reaksi dapat diketahui pada Tabel 1.
6
Tabel 1 Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase
Volume (μl)
Reagen
Blanko Kontrol blanko Sampel Kontrol sampel
Pelarut
10
10
Sampel
10
10
Bufer
50
50
50
50
Substrat
25
25
25
25
Enzim
25
25
Buffer
25
25
Inkubasi 37°C 30 menit
Na2CO3
100
100
100
100
Uji Kinetika Inhibisi α-Glukosidase (Alfarabi 2010)
Uji kinetika inhibisi α-glukosidase diukur dengan meningkatkan
konsentrasi p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida sebagai substrat yang diperoleh dari
kurva Michaelis-Menten. Ekstrak daun benalu cengkeh yang digunakan sebagai
penghambat aktivitas enzim merupakan ekstrak paling aktif pada uji inhibisi αglukosidase. Kinetika inhibisi α-glukosidase dipelajari dengan dua sistem reaksi,
yaitu sistem reaksi dengan inhibitor dan tanpa inhibitor. Campuran sistem reaksi
yang digunakan sama dengan campuran pada inhibisi α-glukosidase. Absorban
diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 410 nm. Percobaan
dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
Analisis Senyawa Aktif Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Blazics et al. 2011)
Sampel teraktif pada uji antioksidan dan inhibisi α-glukosidase dianalisis
menggunakan Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
dengan tipe QMicro QAA 842. Sampel berupa cairan dimasukkan ke fase gerak
yang ada pada kolom LC dengan laju alir 0.2 mL/menit. Temperatur kolom yang
digunakan adalah 40 ⁰C dan waktu akhir 35 menit. Pemisahan senyawa kimia
terjadi di dalam kolom dengan bantuan pompa. Hasil analisis dengan LC
dilanjutkan ke MS untuk mengidentifikasi komponen kimia. Jenis analisis massa
yang digunakan adalah quadrupole dengan modus scan selama 5 detik. Spektrum
yang diperoleh menunjukkan rasio massa dengan muatan (m/z).
Analisis Data (Mattjik 2002)
Data dianalisis menggunakan Analyses of Variance (ANOVA) dan diuji
lanjut dengan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) menggunakan program
Microsoft Excel 2007 dan SPSS Statistics 16.0.
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar Air Serbuk Daun Benalu Cengkeh dan Rendemen Ekstrak
Daun benalu cengkeh yang telah dikeringkan dilakukan pengujian
terhadap kadar air. Penentuan kadar air bertujuan mengetahui ketahanan simplisia
dalam masa penyimpanan. Kadar air yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 8
%. Persentase tersebut menunjukkan bahwa setiap 100 gram bahan mengandung 8
gram air.
Ekstrak daun benalu cengkeh diperoleh dengan cara perebusan
menggunakan air dan maserasi menggunakan etanol 70 %. Proses ekstraksi
diulangi sebanyak lima kali supaya senyawa yang terkandung dalam simplisia
dapat tersari lebih optimal. Larutan hasil ekstraksi dievaporasi sampai menjadi
ekstrak kering. Hasil ekstraksi berupa rendemen yang merupakan perbandingan
antara bobot sampel yang diperoleh dengan bobot awal sampel dikali 100.
Rendemen ekstrak yang dihasilkan adalah 26.3 % untuk ekstrak air dan 23.4 %
untuk ekstrak etanol 70 %.
Ekstrak etanol 70 % selanjutnya difraksinasi menggunakan pelarut dengan
kepolaran yang berbeda yaitu pelarut n-heksana (non polar) dan etil asetat (semi
polar). Dalam penelitian ini, fraksinasi dengan pelarut n-heksana memberikan
warna kuning pada larutan dan rendemen yang diperoleh sebesar 0.9 %. Berbeda
dengan pelarut n-heksana, hasil fraksinasi pelarut etil asetat menghasilkan warna
hijau kehitaman dengan rendemen sebesar 7.1 % sedangkan rendemen fraksi
etanol yang diperoleh sebesar 6.8 %.
Senyawa Fitokimia
Sampel uji yang merupakan hasil ekstraksi dan fraksinasi selanjutnya
dilakukan pengujian terhadap senyawa fitokimia. Analisis yang dilakukan terdiri
atas analisis alkaloid, tanin, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Hasil uji
fitokimia sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh
Kandungan
Ekstrak Ekstrak Fraksi
Fraksi
Fraksi
kimia
air
etanol n-heksana etil asetat etanol
Alkaloid
Mayer
Dragendorf
Bouchardat
Tanin
+
+
+
+
Flavonoid
+
+
+
+
+
Saponin
+
+
+
Triterpenoid
+
+
+
+
+
Keterangan : ( + ) = mengandung senyawa
( - ) = tidak mengandung senyawa
8
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua sampel yang diuji positif
mengandung flavonoid dan triterpenoid, namun semuanya negatif untuk alkaloid.
Analisis tannin terdapat pada semua sampel kecuali fraksi n-heksana sedangkan
analisis saponin tidak terdapat pada fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat.
Kandungan Total Fenol
Total fenol dievalusi menggunakan reagen Folin-Ciocalteau yang dapat
bereaksi dengan gugus OH pada sampel. Adanya fenol dalam sampel ditunjukkan
oleh terbentuknya kompleks berwarna biru yang dapat dibaca pada panjang
gelombang 765 nm. Total fenol dinyatakan dengan ekuivalen asam galat atau
Gallic Acid Equivalent (GAE). Persamaan regresi yang diperoleh dari pengukuran
standar asam galat adalah y= 0.018x +0.113 dengan R2= 0.990 (Lampiran 2).
Hasil uji statistika terhadap total fenol sampel diperoleh hasil jenis sampel
menunjukkan perbedaan yang nyata (p
pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN
ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Ekstrak Daun Benalu
Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan
Antidiabetes secara In Vitro adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Tiana Fitrilia
NIM G851130341
RINGKASAN
TIANA FITRILIA. Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro. Dibimbing oleh
MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Benalu merupakan tumbuhan semi parasit yang memiliki banyak aktivitas
biologis seperti antioksidan, antikanker, antidiabetes dan hipertensi.
Dendrophthoe pentandra (L.) Miq merupakan salah satu spesies benalu di
Indonesia yang dapat tumbuh diberbagai tanaman inang. Penelitian ini bertujuan
mengetahui ekstrak paling aktif dari daun benalu cengkeh sebagai agen
antioksidan dan antidiabetes secara in vitro serta untuk mengidentifikasi senyawa
aktif menggunakan LC-MS/MS. Aktivitas antioksidan diukur menggunakan uji
penangkapan radikal bebas DPPH dan aktivitas antidiabetes diukur menggunakan
uji penghambatan enzim α-glukosidase. Sampel yang diuji meliputi ekstrak air,
ekstrak etanol 70 %, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol.
Kadar air yang diperoleh dari serbuk daun benalu cengkeh adalah 8 %. Hal
ini menunjukkan bahwa serbuk daun benalu cengkeh dapat disimpan dalam
jangka waktu lama. Serbuk daun kemudian diekstraksi dengan pelarut air dan
etanol 70 % menghasilkan rendemen sebesar 26.3 % dan 23.5 %. Ekstrak etanol
70 % yang diperoleh difraksinasi dengan pelarut yang berbeda kepolaran yaitu nheksana dan etil asetat. Rendemen hasil fraksinasi yang diperoleh untuk fraksi nheksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol secara berturut-turut adalah 0.9 %, 7.1
% dan 6.8 %. Uji fitokimia menunjukkan bahwa semua sampel positif
mengandung senyawa tanin dan flavonoid tetapi tidak mengandung alkaloid.
Kandungan total fenol paling tinggi terdapat pada fraksi etil asetat yaitu 358.4 mg
GAE/ g sampel. Semua sampel yang diuji memiliki aktivitas antioksidan dan
antidiabetes. Aktivitas antioksidan yang tinggi ditunjukkan oleh ekstrak air,
ekstrak etanol dan fraksi etil asetat sedangkan aktivitas antidiabetes paling tinggi
ditunjukkan oleh ekstrak etanol 70 % dengan IC50 129.7 µg/mL dan memiliki
jenis penghambatan nonkompetitif campuran. Analisis senyawa aktif
menggunakan LC-MS/MS menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70 % daun benalu
cengkeh mengandung tiga senyawa berdasarkan kelimpahan paling tinggi yaitu
dengan bobot molekul 700.73 (m/z), 678.59 (m/z) dan 58.08 (m/z).
Kata kunci: antidiabetes, antioksidan, daun benalu cengkeh, DPPH, LC-MS/MS
α-glukosidase
SUMMARY
TIANA FITRILIA. Clove Mistletoe Leaf Extracts (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) as an Antioxidant and Antidiabetes Agent In Vitro. Supervised by MARIA
BINTANG and MEGA SAFITHRI.
Mistletoe is a semi-parasitic plant that has many biological activities such
as antioxidant, anticancer, antidiabetes and hypertension. Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq is one of the mistletoe species in Indonesia that can grew in various host
plants. This study was conducted the most active extracts of clove mistletoe leaf
as an antioxidant and antidiabetes in vitro as well as to identified of active
compounds using LC-MS/MS. Antioxidant activity was measured using DPPH
free radical scavenging assay and antidiabetes activity was measured using
inhibition of α-glucosidase assay. Samples were tested include water and ethanol
70 % extracts as well as n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions.
The moisture content of clove mistletoe leaf powder in the test was 8 %.
This suggest that the clove mistletoe leaf powder can be stored for long periods.
Than, the leaf powder was extracted with solvent of water and ethanol 70 % has a
yield of 26.3 % and 23.5 %. The ethanol extract further fractionated with a
solvent which has a different polarity, i.e. n-hexane and ethyl acetate. The yield of
fractionation results for n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions were 0.9 %,
7.1 % and 6.8 %, respectively. Phytochemical test showed that all of the samples
containing tannins and flavonoids but not for alkaloids. The highest total phenolic
content was in ethyl acetate is 358.4 mg GAE/g sample. All samples tested had an
antioxidant and antidiabetes activities. The best antioxidant activity was in water
and ethanol extracts as well as ethyl acetate fraction while the highest antidiabetes
activity was shown by ethanol 70 % extract with IC50 129.7 µg/mL and exhibited
mixed-noncompetitive inhibition. Analysis of active compound using LC-MS/MS
showed that ethanol 70 % extract of clove mistletoe leaf was containing three
compounds based on the highest abundance with molecular weight 700.73 (m/z),
678.59 (m/z) and 58.08 (m/z).
Keywords: antidiabetes, antioxidant, clove mistletoe leaf, DPPH, LC-MS/MS,
α-glucosidase
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EKSTRAK DAUN BENALU CENGKEH (Dendrophthoe
pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN
ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Judul Tesis : Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq)
sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro
Nama
: Tiana Fitrilia
NIM
: G851130341
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua
Dr Mega Safithri, SSi MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 11 Agustus 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul
karya ilmiah dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Januari sampai dengan
Mei 2015 ini ialah Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.)
Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro.
Ucapan terima kasih kepada Prof Dr drh Maria Bintang, MS dan Dr Mega
Safithri, S.Si M.Si selaku pembimbing atas ilmu, saran dan kesabaran yang telah
diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar Biokimia (Dosen, Staff TU,
Laboran dan teman-teman Biokimia 2013) yang telah memberikan motivasi dan
membantu penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
(DIKTI) sebagai sponsor Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri 2013.
Ucapan spesial kepada kedua orang tua, adinda Bio, Gema dan Tirta yang selalu
memberikan do’a dan dukungannya serta kepada anggota BSL IPB 2013 terima
kasih atas persaudaraan yang telah diberikan kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Tiana Fitrilia
DAFTAR ISI
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian
Analisis Data
3
3
3
3
3
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
7
7
11
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
19
19
19
DAFTAR PUSTAKA
20
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
32
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase
Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh
Aktivitas antioksidan sampel daun benalu cengkeh
Inhibisi enzim α-glukosidase
6
7
9
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Perbandingan kandungan total fenol sampel
Plot Lineweaver-Burk pada uji kinetika enzim
Mekanisme efek biologis senyawa polifenol
Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antioksidan
Struktur dasar flavonoid
Mekanisme antioksidan dalam meredam radikal bebas
Reaksi hidrolisis substrat oleh α-glukosidase
8
10
13
14
15
15
16
DAFTAR LAMPIRAN
1. Diagram alir penelitian
2. Kurva standar asam galat
3. Kurva Michaelis-Menten
4. Spektrum LC-MS/MS ekstrak etanol 70 %
5. Hasil uji analisis statistik total fenol sampel
6. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 antioksidan sampel
7. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 inhibisi α-glukosidase
25
26
27
28
29
30
31
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) adalah sindrom metabolik yang ditandai dengan
tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) karena gangguan produksi, sekresi
atau resistensi insulin. Badan Kesehatan Dunia, World Health Organization
(WHO) memperkirakan 150 juta penduduk dunia menderita diabetes dan akan
mengalami kenaikan dua kali lipat pada tahun 2025 (WHO 2014). Jumlah
penderita diabetes didominasi oleh pasien penderita DM tipe II dan prevalensinya
tumbuh pada tingkat yang mengkhawatirkan (Perla dan Jayanty 2013). Data dari
International Diabetes Federation (IDF), Indonesia diketahui sebagai salah satu
negara dengan prevalensi DM tinggi menempati urutan ketujuh sebagai negara
penderita DM terbesar setelah Cina, India, USA, Brazil, Rusia dan Meksiko (IDF
2013). Prevalensi diabetes di Indonesia tahun 2013 yang terdiagnosis diabetes
sebesar 1.5 %. Prevalensinya meningkat sesuai dengan bertambahnya umur,
namun cenderung menurun pada usia ≥ 65 (Kemenkes RI 2013).
Hiperglikemia terlibat dalam pembentukan radikal bebas dengan
mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif (Patel et al. 2011). Senyawa
oksigen reaktif dapat merusak sel β-pankreas dan dapat meningkatkan modifikasi
lipid, DNA serta protein pada berbagai jaringan (Ueno et al. 2002; Patel et al.
2011). Adanya modifikasi molekuler menginisiasi terjadinya kerusakan oksidatif
yang dikenal sebagai stres oksidatif (Setiawan dan Suhartono 2005). Stres
oksidatif dapat menurunkan sekresi insulin oleh sel β-pankreas dan berperan
dalam perkembangan komplikasi seperti ginjal, mata, pembuluh darah dan
kerusakan saraf (Patel et al. 2011). Memperbaiki stres oksidatif adalah strategi
yang efektif untuk menurunkan kadar glukosa darah dan komplikasinya.
Kerusakan oksidatif tersebut dapat diredam dengan pemberian senyawa
antioksidan (Setiawan dan Suhartono 2005). Pemberian antioksidan pada hewan
uji dapat menghambat tahap awal nefropati dan neuropati (Ueno et al. 2002)
sedangkan pada manusia dapat menghambat komplikasi mikrovaskuler, perbaikan
sistem saraf otonom jantung dan perbaikan vasodilatasi (Beckman et al. 2001).
Berbagai pengobatan diabetes telah banyak dilakukan. Salah satunya dengan
pemberian obat sintetis, namun pengobatan ini dapat menimbulkan efek samping
seperti kembung, diare dan kejang perut (Lee et al. 2007). Oleh karena itu,
penggunaan tanaman herbal sebagai obat tradisional menjadi penting dalam
pengobatan penyakit diabetes. Menurut Wu et al. (2014), terapi diabetes dapat
dilakukan dengan pemberian senyawa antioksidan dan melalui mekanisme
inhibisi enzim penghidrolisis karbohidrat seperti α-glukosidase pada organ
pencernaan. Inhibisi α-glukosidase dapat menunda penyerapan glukosa sehingga
dapat menekan kadar glukosa postprandial (Ping et al. 2010; Lee et al. 2014).
Penggunaan tanaman herbal telah banyak dimanfaatkan oleh masyarakat
untuk berbagai keperluan sandang, pangan, kosmetik maupun obat. Tanaman
benalu merupakan salah satu tanaman herbal yang manfaatnya belum diketahui
secara luas. Menurut Artanti et al. (2003), benalu merupakan tumbuhan semi
parasit yang memiliki banyak spesies bergantung pada tumbuhan inang tempat
benalu itu tumbuh. Tumbuhan ini terdiri atas dua suku yaitu suku Loranthaceae
2
dan Viscaceae (Uji dan Samiran 2005). Benalu cengkeh adalah salah satu benalu
yang masuk ke dalam suku Loranthaceae.
Penelitian yang dilakukan oleh Suryanto dan Wehantouw (2008), ekstrak
etanol benalu cengkeh pada bagian akar, batang, daun dan bunga mengandung
komponen fenol, flavonoid dan tanin. Komponen tersebut merupakan metabolit
sekunder yang keberadaannya melimpah di tumbuhan, memiliki banyak efek
biologis termasuk aktivitas antioksidan dan dapat menghambat berbagai
perkembangan penyakit kronis (Yao et al. 2013; Lee et al. 2014).
Berdasarkan hal tersebut, adanya kandungan metabolit sekunder pada daun
benalu cengkeh diduga berperan sebagai agen antioksidan dan antidiabetes
melalui inhibisi enzim α-glukosidase. Sejauh ini belum dilaporkan adanya
pengaruh jenis pelarut dalam mengekstrak metabolit sekunder serta pengujian
terhadap senyawa aktif dari daun benalu cengkeh.
Perumusan Masalah
Diabetes melitus membutuhkan penanganan secara tepat untuk menurunkan
kadar glukosa darah dan mencegah terjadinya komplikasi. Hiperglikemia terlibat
dalam pembentukan senyawa oksigen reaktif yang dapat merusak sel β pankreas
dan mengganggu kesetimbangan antioksidan dalam tubuh. Selama ini,
penggunaan obat sintetik sering menimbulkan efek samping seperti kembung,
diare dan kejang perut. Oleh karena itu, pemanfaatan daun benalu cengkeh
menjadi alternatif untuk pengobatan diabetes melalui inhibisi α-glukosidase.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menentukan ekstrak daun benalu cengkeh paling
aktif sebagai agen antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak terpilih dari uji
antidiabetes digunakan untuk menentukan kinetika inhibisi enzim dan identifikasi
senyawa aktif menggunakan LC-MS/MS.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah
tentang pemanfaatan daun benalu cengkeh sebagai agen antioksidan dan
antidiabetes serta senyawa aktif yang terlibat didalamnya.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian meliputi ekstraksi daun benalu cengkeh dengan
pelarut air dan etanol 70 %. Ekstrak etanol 70 % difraksinasi menggunakan
pelarut n-heksana dan etil asetat. Sampel hasil ekstraksi dan fraksinasi dilakukan
pengujian secara in vitro terhadap aktivitas antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak
paling aktif dalam menginhibisi α-glukosidase dijadikan dasar untuk pengkajian
mekanisme inhibisi enzim dan identifikasi senyawa menggunakan LC-MS/MS.
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2014 sampai Mei 2015.
Penelitian dikerjakan di laboratorium Biokimia IPB dan Pusat Studi Biofarmaka.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu
cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) yang diperoleh dari daerah CurupBengkulu, etanol p.a, etanol 70 %, n-heksana, etil asetat, asam galat, metanol,
reagen Folin-Ciocalteu, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), enzim α-glukosidase
yang berasal dari rekombinan Bacillus stearothermophilus (Sigma G3651-250UN,
Jerman), substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) (Sigma Aldrich, USA),
dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), akarbose dan α-tokoferol.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven, corong
pisah, evaporator, spektrofotometer (Hitachi tipe U-2800), pH meter (Eutech
Instruments), vortex mixer (BI type 37600 mixer), microplate reader (Biotek
Epoch) dan LC-MS/MS (QMicro QAA 842).
Prosedur Penelitian
Preparasi Sampel
Daun benalu cengkeh dideterminasi di Herbarium Bogoriense-LIPI, Bogor,
Indonesia. Daun yang digunakan dimulai dari daun yang terletak pada lembar
keempat dari pucuk ke arah daun yang lebih tua. Selanjutnya daun benalu cengkeh
dikeringkan dan dihaluskan sampai berbentuk serbuk berukuran 40 mesh.
Penentuan Kadar Air Daun Benalu Cengkeh (SNI 01-3182-1992)
Kadar air serbuk daun benalu cengkeh ditentukan dengan cara pengeringan
di dalam oven. Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C selama 15 menit
lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang dengan neraca analitik. Sebanyak
1 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 °C
selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit kemudian
ditimbang. Pemanasan diulang sampai diperoleh bobot konstan. Kadar air
dihitung dengan persamaan :
Kadar air (%) =
4
Dengan : a = bobot contoh sebelum pemanasan (g)
b = bobot contoh setelah pemanasan (g)
Ekstraksi Daun Benalu Cengkeh (Harjadi 1993; Puro 2012)
Ekstraksi daun benalu cengkeh dilakukan dengan metode perebusan dan
maserasi. Perbandingan serbuk daun benalu cengkeh dengan pelarut adalah 1:10.
Ekstraksi melalui perebusan dilakukan dengan cara merebus simplisia ke dalam
pelarut air selama 2 jam sedangkan maserasi dilakukan dengan cara merendam
simplisia ke dalam pelarut etanol 70 %. Maserasi dilakukan selama 24 jam dengan
shaker pada kecepatan 150 rpm di suhu ruang. Campuran dipisahkan dan filtrat
yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator sehingga diperoleh ekstrak
air dan ekstrak etanol 70 %. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dihitung
dengan menggunakan persamaan sebagai berikut :
Rendemen ekstrak (%) =
Fraksinasi Ekstrak secara Ekstraksi Cair-cair (Kim et al. 2008)
Ekstrak etanol 70 % selajutnya difraksinasi secara ekstraksi cair-cair
menggunakan pelarut dengan kepolaran yang semakin meningkat, yaitu pelarut nheksana (non polar) dan etil asetat (semi polar). Sebanyak 20 gram ekstrak etanol
70 % daun benalu cengkeh dilarutkan dalam air hangat 100 mL, dilakukan
pengadukan sampai encer dan homogen kemudian dimasukkan ke dalam corong
pisah. Mula-mula difraksinasi dengan pelarut n-heksana sebanyak 100 mL.
Campuran dikocok setiap 10 menit sekali sebanyak 3 kali, lalu didiamkan lebih
kurang 30 menit untuk mencapai kondisi jenuh, sehingga diperoleh lapisan nheksana dan air. Lapisan n-heksana dipisahkan, kemudian lapisan air difraksinasi
dengan etil asetat sebanyak 100 mL, diperoleh lapisan etil asetat dan air. Setelah
lapisan etil asetat dipisahkan, lapisan air diuapkan dan ditambahkan pelarut etanol
sebanyak 100 mL. Lapisan yang terbentuk dari hasil fraksinasi dipekatkan dengan
evaporator.
Uji Fitokimia (Farnsworth 1966; Chugh et al. 2012)
Uji fitokimia dari ekstrak air, ekstrak etanol 70 % dan fraksi ekstrak etanol
meliputi analisis kualitatif tanin, alkaloid, flavonoid, saponin dan triterpenoid.
Uji Tanin. Larutan uji dibuat dengan mereaksikan 10 mg sampel dengan
50 mL air panas, kemudian dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit dan
filtrat disaring. Sebanyak 5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCL3. Terbentuknya warna hijau violet
menunjukkan adanya tanin.
Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 1 mL HCl 2N
dan 9 mL aquades, kemudian dipanaskan selama 2 menit dan didinginkan. Filtrat
disaring dan ditampung. Filtrat yang diperoleh merupakan larutan uji untuk
pereaksi Meyer, Bouchardart dan Dragendorf. Keberadaan alkaloid dalam sampel
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih atau kuning pada pereaksi Meyer,
endapan coklat sampai hitam pada pereaksi Bouchardart dan endapan jingga
coklat pada pereaksi Dragendorf.
Uji Flavonoid. Sebanyak 10 mg sampel direaksikan dengan 10 mL air
kemudian dipanaskan. Campuran dipisahkan dan filtrat diberi serbuk Mg, 1 mL
5
HCl pekat dan 1 mL amil alkohol. Uji positif ditandai dengan munculnya warna
pada lapisan amil alkohol.
Uji Saponin. Sebanyak 10 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan 10 mL air panas lalu didinginkan. Larutan uji dikocok
vertikal selama 10 detik, kemudian diamati selama 10 menit. Terbentuknya buih
setinggi 1 – 10 cm menunjukkan adanya saponin dalam sampel. Pada penambahan
1 tetes HCl 2N buih tidak hilang.
Uji Triterpenoid. Sebanyak 10 mg sampel ditambahkan dengan 5 mL
larutan eter, kemudian diuapkan dalam cawan penguap. Larutan uji ditambahkan
dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Terbentuknya warna
merah-hijau adanya triterpenoid.
Penentuan Kandungan Total Fenol (Lim dan Murtijaya 2007)
Sebanyak 300 μL sampel konsentrasi 200 µg/mL dimasukkan ke dalam
tabung reaksi kemudian ditambahkan 1.5 mL reagen Folin-Ciocalteau (1:10) dan
1.2 mL Na2CO3 7.5 %. Campuran diinkubasi di suhu kamar selama 30 menit
kemudian absorban diukur menggunakan spektrofotometer pada 765 nm. Asam
galat digunakan untuk pembuatan kurva standar.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Salazar et al. 2011)
Larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 5, 10, 30, 50, 100 dan
200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate sebanyak 100 μL,
ditambahkan dengan etanol p.a 100 μL dan larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH) hingga volume 300 μL. Campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu
ruang kemudian absorban diukur dengan microplate reader pada 517 nm. αtokoferol digunakan sebagai pembanding dalam menangkap radikal bebas DPPH.
Kapasitas penangkapan radikal bebas dihitung sebagai persentase inhibisi
terhadap DPPH (persentase “scavenging effect”), yaitu :
% inhibisi =
Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi sampel yang
diperlukan untuk memberikan % inhibisi sebesar 50%.
Uji Aktivitas α-Glukosidase (Sancheti et al. 2009; Sugiwati et al. 2009)
Sebanyak 10 μl larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 200, 500,
800 dan 1200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate reader dan
ditambahkan dengan 50 μL larutan bufer fosfat pH 7. Selanjutnya, sebanyak 25 μl
substrat berupa p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) 10 mM ditambahkan
tiga menit sebelum uji dimulai. Reaksi diinisiasi dengan penambahan 25 μl enzim
α-glukosidase dengan konsentrasi 0.04 U/mL dalam bufer fosfat (pH 7.0)
kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 100 μl Na2CO3 200 mM. Hasil reaksi diukur dengan microplate
reader pada panjang gelombang 410 nm. Larutan akarbose digunakan sebagai
kontrol positif dengan sistem reaksi sama seperti sampel. Percobaan dilakukan
sebanyak 3 kali pengulangan. Selanjutnya dilakukan perhitungan % inhibisi untuk
menentukan nilai IC50. Sistem reaksi dapat diketahui pada Tabel 1.
6
Tabel 1 Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase
Volume (μl)
Reagen
Blanko Kontrol blanko Sampel Kontrol sampel
Pelarut
10
10
Sampel
10
10
Bufer
50
50
50
50
Substrat
25
25
25
25
Enzim
25
25
Buffer
25
25
Inkubasi 37°C 30 menit
Na2CO3
100
100
100
100
Uji Kinetika Inhibisi α-Glukosidase (Alfarabi 2010)
Uji kinetika inhibisi α-glukosidase diukur dengan meningkatkan
konsentrasi p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida sebagai substrat yang diperoleh dari
kurva Michaelis-Menten. Ekstrak daun benalu cengkeh yang digunakan sebagai
penghambat aktivitas enzim merupakan ekstrak paling aktif pada uji inhibisi αglukosidase. Kinetika inhibisi α-glukosidase dipelajari dengan dua sistem reaksi,
yaitu sistem reaksi dengan inhibitor dan tanpa inhibitor. Campuran sistem reaksi
yang digunakan sama dengan campuran pada inhibisi α-glukosidase. Absorban
diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 410 nm. Percobaan
dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
Analisis Senyawa Aktif Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Blazics et al. 2011)
Sampel teraktif pada uji antioksidan dan inhibisi α-glukosidase dianalisis
menggunakan Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
dengan tipe QMicro QAA 842. Sampel berupa cairan dimasukkan ke fase gerak
yang ada pada kolom LC dengan laju alir 0.2 mL/menit. Temperatur kolom yang
digunakan adalah 40 ⁰C dan waktu akhir 35 menit. Pemisahan senyawa kimia
terjadi di dalam kolom dengan bantuan pompa. Hasil analisis dengan LC
dilanjutkan ke MS untuk mengidentifikasi komponen kimia. Jenis analisis massa
yang digunakan adalah quadrupole dengan modus scan selama 5 detik. Spektrum
yang diperoleh menunjukkan rasio massa dengan muatan (m/z).
Analisis Data (Mattjik 2002)
Data dianalisis menggunakan Analyses of Variance (ANOVA) dan diuji
lanjut dengan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) menggunakan program
Microsoft Excel 2007 dan SPSS Statistics 16.0.
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar Air Serbuk Daun Benalu Cengkeh dan Rendemen Ekstrak
Daun benalu cengkeh yang telah dikeringkan dilakukan pengujian
terhadap kadar air. Penentuan kadar air bertujuan mengetahui ketahanan simplisia
dalam masa penyimpanan. Kadar air yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 8
%. Persentase tersebut menunjukkan bahwa setiap 100 gram bahan mengandung 8
gram air.
Ekstrak daun benalu cengkeh diperoleh dengan cara perebusan
menggunakan air dan maserasi menggunakan etanol 70 %. Proses ekstraksi
diulangi sebanyak lima kali supaya senyawa yang terkandung dalam simplisia
dapat tersari lebih optimal. Larutan hasil ekstraksi dievaporasi sampai menjadi
ekstrak kering. Hasil ekstraksi berupa rendemen yang merupakan perbandingan
antara bobot sampel yang diperoleh dengan bobot awal sampel dikali 100.
Rendemen ekstrak yang dihasilkan adalah 26.3 % untuk ekstrak air dan 23.4 %
untuk ekstrak etanol 70 %.
Ekstrak etanol 70 % selanjutnya difraksinasi menggunakan pelarut dengan
kepolaran yang berbeda yaitu pelarut n-heksana (non polar) dan etil asetat (semi
polar). Dalam penelitian ini, fraksinasi dengan pelarut n-heksana memberikan
warna kuning pada larutan dan rendemen yang diperoleh sebesar 0.9 %. Berbeda
dengan pelarut n-heksana, hasil fraksinasi pelarut etil asetat menghasilkan warna
hijau kehitaman dengan rendemen sebesar 7.1 % sedangkan rendemen fraksi
etanol yang diperoleh sebesar 6.8 %.
Senyawa Fitokimia
Sampel uji yang merupakan hasil ekstraksi dan fraksinasi selanjutnya
dilakukan pengujian terhadap senyawa fitokimia. Analisis yang dilakukan terdiri
atas analisis alkaloid, tanin, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Hasil uji
fitokimia sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh
Kandungan
Ekstrak Ekstrak Fraksi
Fraksi
Fraksi
kimia
air
etanol n-heksana etil asetat etanol
Alkaloid
Mayer
Dragendorf
Bouchardat
Tanin
+
+
+
+
Flavonoid
+
+
+
+
+
Saponin
+
+
+
Triterpenoid
+
+
+
+
+
Keterangan : ( + ) = mengandung senyawa
( - ) = tidak mengandung senyawa
8
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua sampel yang diuji positif
mengandung flavonoid dan triterpenoid, namun semuanya negatif untuk alkaloid.
Analisis tannin terdapat pada semua sampel kecuali fraksi n-heksana sedangkan
analisis saponin tidak terdapat pada fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat.
Kandungan Total Fenol
Total fenol dievalusi menggunakan reagen Folin-Ciocalteau yang dapat
bereaksi dengan gugus OH pada sampel. Adanya fenol dalam sampel ditunjukkan
oleh terbentuknya kompleks berwarna biru yang dapat dibaca pada panjang
gelombang 765 nm. Total fenol dinyatakan dengan ekuivalen asam galat atau
Gallic Acid Equivalent (GAE). Persamaan regresi yang diperoleh dari pengukuran
standar asam galat adalah y= 0.018x +0.113 dengan R2= 0.990 (Lampiran 2).
Hasil uji statistika terhadap total fenol sampel diperoleh hasil jenis sampel
menunjukkan perbedaan yang nyata (p