Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor
DETEKSI KEBERADAAN DAN KERAGAMAN BAKTERI
ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO
SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Deteksi Keberadaan
dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di
Bogor adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2013
Mahardika Gama Pradana
NIM A34090024
ABSTRAK
MAHARDIKA GAMA PRADANA. Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri
Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor. Dibimbing oleh
GIYANTO dan DAMAYANTI BUCHORI.
Genus Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang diperkirakan
menginfeksi 70% dari spesies serangga. Infeksi Wolbachia pada serangga dapat
mempengaruhi perubahan sistem reproduksi inang. Studi mengenai keberadaan
Wolbachia dilakukan dengan melakukan koleksi lapang serangga uji di sekitar
Bogor. Deteksi keberadaan Wolbachia dilakukan dengan teknik PCR. Hasil deteksi
menunjukkan Wolbachia supergrup A ditemukan pada sampel Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis,
Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan
pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria,
dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada
sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila
merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar
100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum
(GQ924887) sedangkan isolat Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus
merupakan supergrup B mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar
100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae (JN315982).
Keywords: endosimbion, PCR, wsp.
ABSTRACT
MAHARDIKA GAMA PRADANA. Detection of The Presence and Variation of
Wolbachia Endosymbiont in Several Insect Orders from Bogor. Supervised by
GIYANTO and DAMAYANTI BUCHORI.
The genus Wolbachia is a bacterial group that infects up to 70% of insect
species. Wolbachia infections are usually associated with changes in host
reproduction on insect. Studies on the presence of Wolbachia was done by field
collection of insect samples around Bogor. Detection of the presence of Wolbachia
performed by polymerase chain reaction (PCR). This study have been detected
Wolbachia supergroup A infection on Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres,
Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis, Scelionidae, and
Trichogramma, while Wolbachia supergrup B infection have been detected on
Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and
Trichogramma. Wolbachia double infection (AB) were also found on Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and Trichogramma. Based on sequnce
analysis, obtained similiarity level of wsp gene at 100% between Drosophila
sample with Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) and
also between Sitophilus sample with Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae
(JN315982).
Keywords: endosymbiont, PCR, wsp.
©
Hak Cipta Milik IPB, tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipa hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI KEBERADAAN DAN KERAGAMAN BAKTERI
ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO
SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion
Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor
Nama
: Mahardika Gama Pradana
NIM
: A34090024
Disetujui oleh
Dr. Ir. Giyanto, MSi.
Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc.
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, MSi.
Ketua Departemen Proteksi Tanaman
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Deteksi
Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo
Serangga di Bogor”, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor.
Banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan
tugas akhir ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada: Dr. Ir. Giyanto,
MSi. Dan Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc. selaku dosen pembimbing tugas
akhir yang telah banyak memberikan berbagai macam bantuan kepada penulis baik
berupa pikiran, materi, waktu, dan hal lainnya. Dra. Endang Sri Ratna, Ph.D selaku
dosen penguji tamu yang telah memberikan kritik dan saran untuk penyempurnaan
penulisan skripsi. Seluruh Dosen dan Staff Departemen Proteksi Tanaman IPB,
keluarga tercinta Papa, Mama, Ibuk, Kakak, Adik untuk kasih sayang, dukungan
serta doa yang selalu diberikan. Teman-teman Laboratorium Bakteri Tumbuhan
(Kak Tatit, Kak Syaiful, Auzan, Nadzir, Arfi, Elok, Eka) dan Laboratorium
Pengendalian Hayati (Mbak Laras, Mbak Nita, Bayu, Winda) atas bantuan dan
motivasi yang telah diberikan selama penelitian. Teman-teman Iyoeh House (Yan,
Arifin, Kautsar) atas pertemanan selama kuliah di IPB dan segala macam dukungan
yang selalu diberikan kepada penulis. Suci Regita dan Ihsan Nurkomar atas bantuan
dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis ketika menempuh studi maupun
selama penelitian. Teman-teman seperjuangan di Departemen Proteksi Tanaman,
serta pihak lain yang turut membantu dalam pelaksanaan tugas akhir ini.
Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, November 2013
Mahardika Gama Pradana
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Metode Penelitian
Pengambilan Serangga Uji
Deteksi Wolbachia
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis dan Visualisasi
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika
Analisis Sekuen Nukleotida
Analisis Filogenetika
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis-Jenis Serangga Uji
Deteksi Keberadaan Wolbachia
Hasil Ekstraksi DNA
Amplifikasi Gen wsp
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida
Analisis Filogenetika
SMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
1
1
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
7
7
8
9
10
10
11
12
12
12
13
15
DAFTAR TABEL
1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian
2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup
Wolbachia yang menginfeksi beberapa inang
3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup
A dan Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah
dideposit di GeneBank
6
9
10
DAFTAR GAMBAR
1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji
2 Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan
Wolbachia
3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup B
4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan
sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai outgroup
7
8
9
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Jenis serangga yang diuji dan jumlah setiap jenis yang diekstraksi
2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor
dengan isolat di Genbank
3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor
dengan isolat di Genbank
15
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang berasal dari ordo
Rickettsiales, famili Anaplasmataceae. Wolbachia merupakan bakteri intraseluler
yang ditemukan di arthropoda dan nematoda. Beberapa penelitian menyebutkan
bahwa infeksi Wolbachia pada serangga dan sebagian besar arthropoda lainnya
serta nematoda filarial diperkirakan mencapai 70% (Werren et al. 1995). Wolbachia
memperbanyak diri dengan pembelahan biner dalam vakuola sel inang dan
dikelilingi oleh membran asal inang. Pada arthropoda, sebagian besar bakteri
berada di dalam sitoplasma sel yang terdapat di sistem organ reproduksi, selain itu
juga terdapat di dalam jaringan lain, termasuk jaringan saraf dan hemosit (Louis
dan Nigro 1989). Baik pada arthropoda maupun nematoda, Wolbachia
ditransmisikan secara transovarial kepada keturunannya (Werren 1997).
Wolbachia pipientis saat ini dianggap sebagai satu-satunya spesies dari genus
Wolbachia (Dumler et al. 2001). Studi berdasarkan karakter molekuler telah
menerangkan bahwa terdapat bermacam-macam strain dari W. pipientis secara
filogenetik (Lo et al. 2007). Berdasarkan variasi di dalam 16S rRNA yang diperoleh
dari berbagai arthropoda dan nematoda filarial, spesies W. pipientis dapat dibagi
menjadi delapan supergrup yaitu supergrup A sampai dengan H. Supergrup A dan
B paling umum ditemukan pada arthropoda, supergrup C dan D secara khas
ditemukan pada nematoda filarial, supergrup E ditemukan pada ordo Collembola,
supergrup F dan H ditemukan pada rayap (ordo Isoptera), dan supergrup G
ditemukan pada beberapa laba-laba Australia (Babec 2012).
Pada arthropoda, infeksi Wolbachia berhubungan dengan perubahan dalam
sistem reproduksi inang, yang meliputi: a) kematian keturunan jantan selama proses
embriogenesis pada bakteri betina yang terinfeksi, b) induksi partenogenesis,
menghasilkan keturunan diploid akibat ketiadaan reproduksi seksual, c) feminisasi
genetik jantan, perubahan genetik jantan menjadi betina, dan d) inkompatibilitas
sitoplasma-cytoplasmic incompatibility, ketidakmampuan jantan terinfeksi untuk
melakukan fertilisasi sel telur dari betina yang tidak terinfeksi maupun betina
terinfeksi dengan tipe Wolbachia yang berbeda (Stouthamer et al. 1999). Masingmasing fenotipe ini meningkatkan proporsi betina yang terinfeksi dalam populasi
inang dan sebagai bentuk adaptasi bakteri untuk meningkatkan transmisi
mikroorganisme. Efek parasit seperti pada inang ini umumnya disebut sebagai
reproductive parasitism (Bandi et al. 2001). Keberadaan Wolbachia pada beberapa
spesies serangga sangat diperlukan untuk reproduksi inang (Hurst dan Jiggins 2000).
Dampak dari Wolbachia terhadap sistem reproduksi serangga berpotensi sebagai
salah satu strategi pengendalian hama dan vektor penyakit tanaman.
Distribusi Wolbachia yang luas sekaligus peran sebagai manipulator sistem
reproduksi inang menjadikan bakteri ini berpeluang sebagai agen hayati yang
ramah lingkungan. Beberapa strategi pengendalian memanfaatkan induksi
inkompatibilitas sitoplasma di dalam pengendalian hama. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa Wolbachia dapat ditransfer dan dapat bertahan di dalam inang
yang berbeda jenis (introduksi) serta di dalam inang tersebut Wolbachia dapat
mengekspresikan fenotip reproduksi seperti yang diharapkan (Xie et al. 2005).
2
Salah satu contoh aplikasi yang berhasil di bidang pertanian yang pernah dilaporkan
yaitu strain Wolbachia dari inang Rhagoletis cerasi (Diptera: Tephritidae) telah
digunakan untuk menginfeksi lalat buah Mediterania melalui injeksi embrionik.
Persilangan di antara betina tidak terinfeksi dengan jantan terinfeksi menghasilkan
kematian telur sebesar 100%. Persilangan di antara lalat buah yang terinfeksi strain
Wolbachia berbeda menghasilkan inkompatibilitas sebesar 100% (Bourtzis dan
Robinson 2006).
Umur merupakan faktor penting yang mempengaruhi kemampuan suatu
vektor untuk mentransmisikan patogen manusia. Hal ini berdasarkan fakta bahwa
hampir semua patogen membutuhkan periode inkubasi ekstrinsik di dalam serangga
inang sebelum transmisi patogen terjadi. Transmisi ini hanya dilakukan sebagian
kecil dari populasi serangg inang yaitu serangga inang yang sudah tua atau
mendekati akhir siklus dewasa, sehingga muncul sebuah pemikiran mengenai
strategi untuk mempersingkat siklus hidup (umur) serangga inang yang berperan
sebagi vektor tersebut. McMeniman et al. (2009) melaporkan telah berhasil
mentransfer wMelpop yaitu strain Wolbachia dengan fenotip mempersingkat siklus
hidup inang. Wolbachia tersebut ditransfer ke dalam nyamuk Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) yang merupakan vektor utama penyakit demam berdarah.
Strategi dengan mempersingkat siklus hidup merupakan sebuah strategi baru untuk
mengendalikan penyakit terbawa vektor.
Indonesia dengan kekayaan mega biodiversitas hayati khususnya serangga,
memungkinkan penggunaan Wolbachia sebagai salah satu strategi pengendalian
hama penyakit khususnya pada bidang pertanian. Perlu dilakukan sebuah penelitian
mengenai penyebaran atau distribusi Wolbachia di seluruh Indonesia sehingga data
mengenai distribusi inang maupun fenotip tersedia. Di Indonesia, studi mengenai
keberadaan Wolbachia masih jarang dilakukan. Tercatat pada tahun 2008 penelitian
mengenai hubungan kepadatan spesies Drosophila melanogaster dan penularan
secara horizontal Wolbachia (Kusmintarsih 2008). Penelitian lebih lanjut perlu
dilakukan sehingga potensi Wolbachia sebagai agen hayati dalam pengendalian
hama penyakit dapat diaplikasikan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mempelajari keberadaan Wolbachia pada beberapa
serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera serta keragaman supergrup
Wolbachia yang menginfeksi serangga tersebut serta identifikasi dengan teknik
molekuler.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah mengetahui keberadaan dan keragaman bakteri
endosimbon Wolbachia pada beberapa serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan
Hymenoptera di Bogor. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia menjadikan
bakteri endosimbion ini sebagai agens dalam mengendalikan hama atau penyakit
berdasarkan kemampuannya dalam memanipulasi sistem reproduksi inang.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Kegiatan penelitian dimulai dari bulan Februari 2013 sampai Juni 2013.
Kegiatan identifikasi serangga dilakukan di Laboratorium Pengendalian Hayati,
Departemen Proteksi Tanaman, IPB sedangkan deteksi molekuler Wolbachia
dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman,
IPB.
Metode Penelitian
Pengambilan Serangga Uji
Serangga uji yang digunakan merupakan serangga ordo Coleoptera, Diptera,
dan Hymenoptera. Lokasi pengambilan serangga ordo Diptera dan Hymenoptera
dilakukan di sekitar Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat sedangkan
serangga uji Hymenoptera diperoleh dari SEAMEO BIOTROP, Bogor.
Pengambilan serangga uji dari ordo Hymenoptera yang termasuk parasitoid
dilakukan dengan mengambil inang terparasit dan dipelihara di laboratorium.
Serangga yang telah diperoleh kemudian dilakukan identifikasi sampai tingkat
famili dan genus. Serangga yang telah diperoleh kemudian disimpan di dalam
lemari pendingin (freezer) pada suhu -20 ⁰C dengan tujuan untuk mematikan
serangga dan menghentikan proses metabolisme bakteri endosimbion yang berada
di dalam tubuh serangga. Jumlah serangga yang diuji setiap genus atau famili tidak
dibatasi, ditentukan sesuai ukuran serangga (Lampiran 1). Berdasarkan protokol
yang ditulis oleh Babec (2012), ukuran serangga yang dipakai pada penelitian ini
kurang dari batas 0.1 ml pada tabung Eppendorf ukuran 1.5 ml.
Deteksi Wolbachia
Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA serangga dilakukan menurut metode Babec
(2012) dengan modifikasi. Untuk mendapatkan DNA Wolbachia dari genom
serangga diperoleh dengan cara menghancurkan secara fisik serangga pada bagian
alat reproduksi, abdomen, atau seluruh tubuh serangga sesuai dengan ukurannya.
Serangga betina lebih baik digunakan dalam ekstraksi apabila tersedia (Kikuchi dan
Fukatsu 2003). Seluruh serangga uji dihancurkan sampai halus menggunakan
micropestle di dalam tabung eppendorf kurang lebih selama 1 menit dengan terlebih
dahulu ditambah bufer CTAB sebanyak 200 μl kemudian diinkubasi pada suhu 65
⁰C selama 15 menit. Sebanyak 200 μL klorofom isoamil alkohol (24:1)
ditambahkan kemudian tabung dibolak-balik selama 30 menit. Tabung kemudian
disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10 000 rpm sehingga dihasilkan
supernatan. Supernatan yang telah diperoleh dipindah ke tabung Eppendorf baru
sebanyak 150 μL. RNAse ditambahkan sebanyak 2 μL kemudian diinkubasi pada
suhu 37 ⁰C selama satu jam. Sebanyak 15.2 μL NaCl ditambahkan diikuti dengan
penambahan 480 μL etanol absolut kemudian diinkubasi di lemari pendingin pada
suhu -20 ⁰C selama 3 jam. Tabung kemudian disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan
kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan
tersisa pelet yang mengandung DNA total. Pelet kemudian dicuci dengan
4
penambahan etanol 70% dan disntrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000
rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang, pelet kemudian
disuspensikan dengan larutan TE sebanyak 50 μL.
Amplifikasi DNA. Deteksi keberadaan Wolbachia menggunakan primer
spesifik 81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 691R (5’AAA
AAT TAA ACG CA 3’). Pasangan primer tersebut akan menghasilkan fragmen
DNA sebesar 632 pb (Zhou et al. 1998). Sebanyak 1 μL DNA hasil isolasi
ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf baru, dicampur dengan 12.5 μL Master
Mix, 1.5 μL Primer Mix, dan ddH2O 7.5 μL. Amplifikasi ini dilakukan pada mesin
PCR (Gene Amp PCR system 9700, PE Applied Biosystems, USA). Amplifikasi
tersebut didahului dengan denaturasi awal selama 7 menit pada suhu 94 ⁰C.
Kemudian dilanjutkan dengan siklus amplifikasi yang dalam satu siklus amplifikasi
adalah denaturasi satu menit pada 94 ⁰C, penempelan primer (annealing) selama
setengah menit pada 50.7 ⁰C, sintesis selama 1 menit pada 72 ⁰C dan diulang
sebanyak 30 kali, diakhiri untuk tahapan penyempurnaan sintesis selama 10 menit
pada 72 ⁰C (Pourali et al. 2009).
Elektroforesis dan Visualisasi. Visualisasi DNA hasil amplifikasi dilakukan
dengan gel agarosa 1% dalam TAE 2X. Gel agarosa dibuat dengan mencampurkan
0.4 g gel agarosa dengan 40 mL bufer Tris-asetat EDTA (TAE) 2X (0.045 M Trisasetat, 0.01 M EDTA) dan dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 mL.
Campuran dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut sempurna dan
ditambahkan 2.5 μL larutan ethidium bromida pada konsentrasi 10 mg/mL.
Sebelumnya aparatus pencetak gel dibersihkan, dikeringkan, kemudian diletakkan
pada permukaan yang datar. “Sisir” gel kemudian diletakkan di bagian atas
aparatus pencetak gel (± 0.5-1.0 mm dari atas). Selanjutnya larutan agarosa
dimasukkan ke dalam cetakan gel hingga keras kemudian dipindahkan ke bak
elektroforesis (Bio-Rad Power PAC 300, USA) dan ditambahkan 1X TAE bufer
elektroforesis hingga gel agarosa terendam. Sebanyak 5 µl DNA hasil amplifikasi
bersama 1 µl bufer loading dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam
sumuran gel dengan pipet mikro. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 75 volt
selama 30 menit. Hasil elektroforesis tersebut divisualisasikan dengan
Transilluminator ultra violet (Sambrook et al. 1989). Pita DNA yang terbentuk
pada hasil elektroforesis tersebut diamati dan dipotret dengan menggunakan kamera
digital.
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia diuji lebih lanjut untuk
mengetahui kelompok Wolbachia supergrup A dan B. Zhou et al. (1998)
menyebutkan bahwa untuk membedakan keragaman supergrup Wolbachia
menggunakan pasangan primer 136F (5’ TG AAA TTT TAC CTC TTT TC 3’) dan
691R (5’AAA AAT TAA ACG CA 3’) yang akan menghasilkan fragmen DNA
sebesar 556 pb sebagai Wolbachia dari supergrup A, sedangkan pasangan primer
81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 522R (5’ ACC AGC
TTT TGC TTG ATA 3’) akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb sebagai
Wolbachia dari supergrup B. Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan metode
elektroforesis seperti metode yang sudah dijelaskan sebelumnya.
5
Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika
Analisis Sekuen Nukleotida. Produk PCR yang menunjukkan hasil positif
dari masing-masing supergrup (A dan B) diambil satu sampel sebanyak 40 µl
dikirim ke PT. Genetika Sains (First-Base Asia, Malaysia) untuk dilakukan sekuen
nukleotida.
Analisis Filogenetika. Hasil sekuen gen wsp dianalisis untuk mengetahui
tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen wsp dari Wolbachia yang
telah didepositkan pada GenBank dengan program Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) yang tersedia pada alamat http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sebelum
dilakukan pensejajaran dengan program BLAST, hasil sekuen diedit dengan
program Chromaspro. Data sekuen nukleotida dianalisis menggunakan program
ClustalW multiple alignment dengan perangkat lunak BioEdit V7.2.5 kemudian
dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan perangkat lunak Mega 5.2.2.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis-Jenis Serangga Uji
Serangga yang diuji untuk keperluan penelitian ini terdiri dari tiga ordo yaitu
Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera (Tabel 1). Latar belakang pengambilan tiga
ordo ini yaitu sebagian besar literatur mengenai studi tentang Wolbachia
menggunakan serangga uji yang sama dengan penelitian ini. Serangga uji
Trichogramma yang diperoleh dari lapang selanjutnya dilakukan perbanyakan
(rearing) di Laboratorium Pengendalian Hayati, Departemen Proteksi Tanaman,
IPB untuk mendapatkan jumLah yang cukup untuk ekstraksi. Sementara itu
serangga uji yang lainnya tidak dilakukan rearing karena jumLah yang diperoleh
dari lapang sudah cukup untuk ekstraksi.
Tabel 1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian
Ordo
Coleoptera
Diptera
Hymenoptera
Famili
Bruchidae
Curculionidae
Tephritidae
Tephritidae
Culicidae
Drosophilidae
Braconidae
Chalcididae
Formicidae
Scelionidae
Trichogrammatidae
Genus
Callosobruchus
Sitophilus
Bactrocera 1
Bactrocera 2
Armigeres
Drosophila
Apanteles
Brachymeria
Anoplolepis
Scelionidae
Trichogramma
Beberapa literatur menunjukkan bahwa kajian bio-assessment Wolbachia
pada famili Drosophilidae menjadi model dasar dalam perkembangan penelitian ini.
Drosophila simulans merupakan salah satu sistem permodelan yang sangat baik
untuk meneliti populasi genetik inang dan simbionnya. D. simulans merupakan
spesies kosmopolitan yang mengandung lima strain Wolbachia (wHa, wNo, wRi,
wAu, dan wMa). Strain keenam diketahui berasal dari Tanzania (James et al. 2002).
Lalat buah dari genus Bactrocera merupakan hama penting pada beberapa
komoditas pertanaman khususnya di Indonesia. Salah satu pendekatan
pengendalian yang cukup populer dan ramah lingkungan yaitu dengan
menggunakan perangkap feromon atraktan seperti metil eugenol. Penggunaan dari
Wolbachia dapat dijadikan sebagai sarana pengendalian di masa depan baik melalui
transfer horizontal Wolbachia dari jenis inang yang lain atau dari jenis ini sendiri
seperti yang telah berhasil diaplikasikan pada nyamuk Aedes aegepty. Pada
penelitian ini diambil sampel nyamuk dari genus Armigeres yang biasa disebut
dengan nyamuk hutan.
7
Dua genus dari ordo Coleoptera yaitu Callosobruchus dan Sitophilus
merupakan kelompok hama gudang yang kosmpolitan, menjadi masalah utama di
dalam gudang penyimpanan khususnya yang menyimpan bahan makanan. Di
Jepang, deteksi dan karakterisasi strain Wolbachia pada hama gudang dan
parasitoidnya telah dilakukan sebagai informasi dasar atas potensi Wolbachia
sebagai strategi pengendalian hama di masa depan (Kageyama et al. 2009).
Hubungan parasitoid dengan inang mengenai kejadian penularan horizontal
Wolbachia dari parasitoid ke inang atau sebaliknya merupakan penelitian yang
menarik dan sedang dikembangkan. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia
pada parasiotid (khususnya ordo Hymenoptera) sangat penting untuk mengetahui
interaksi antara Wolbachia dengan parasitoid maupun dengan inang parasitoid.
Deteksi Keberadaan Wolbachia
Hasil Ekstraksi DNA
Hasil ekstraksi yang didapat berupa pelet DNA yang disuspensikan di dalam
larutan bufer TE. Hasil ekstraksi kemudian dielektroforesis untuk mengetahui
secara visual kualitas DNA yang diperoleh. Hasil ekstraksi DNA yang berkualitas
baik ditunjukan dengan hasil visualisasi pada gel agarosa yaitu terbentuk satu pita
DNA pada bagian atas gel seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Hasil ektraksi DNA
yang diperoleh belum menunjukkan kualitas yang sempurna, karena masih terdapat
materi ikutan lain yang masih terbawa. Hasil elektroforesis menunjukkan smear
pada pita DNA nomor 8, hal ini menunjukkan bahwa DNA tidak utuh yang
disebabkan oleh faktor fisik maupun kimiawi pada saat proses ekstraksi. Sampel
nomor 5 dan 9 tampak tidak terbentuk pita DNA total yang terdapat pada bagian
ujung atas gel. Hal ini tidak berarti pada sampel nomor 5 dan 9 DNA total tidak
terekstraksi namun DNA total yang berhasil terekstraksi jumLahnya sangat sedikit
sehingga pada saat proses pewarnaa di dalam elektroforesis DNA total tidak
tervisualisasi dengan jelas.
Gambar 1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji. Anak panah
menunjukkan pita DNA total yang terbentuk. Keterangan: 1.
Callosobruchus, 2. Sitophilus, 3. Bactrocera 1, 4. Bactrocera 2, 5.
Armigeres, 6. Drosophila, 7. Apanteles, 8. Brachymeria, 9. Anoplolepis,
10. Scelionidae, 11. Trichogramma
8
Pita DNA yang smear menunjukkan bahwa DNA tidak utuh. Hal ini
disebabkan oleh faktor fisik dan faktor kimiawi yang terjadi saat ekstraksi. Faktor
fisik yang mempengaruhi hasil DNA total antara lain proses penggerusan serangga
uji tidak merata yang menyebabkan hasil gerusan kurang halus sehingga hasil lisis
kurang sempurna. Kurang teliti dalam menggunakan pipet mikro sehingga volume
larutan ekstraksi yang diambil tidak sesuai takaran juga dapat mempengaruhi hasil
ekstraksi. Faktor kimiawi yang mempengaruhi hasil ekstraksi antara lain terjadi
kontaminasi bahan kimia yang digunakan selama ekstraksi DNA. Namun demikian,
DNA yang terdapat smear (mempunyai kualitas kurang baik) masih dapat
digunakan untuk deteksi Wolbachia.
Amplifikasi Gen wsp
Berdasarkan hasil amplifikasi diketahui bahwa dari 11 jenis serangga yang
diuji, 10 di antaranya positif terinfeksi Wolbachia. Hasil positif ditunjukkan dengan
adanya pita DNA yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 632 pb (Gambar 2).
Zhou et al. (1998) menyebutkan bahwa pasangan primer spesifik akan
mengamplifikasi gen wsp yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 590 sampai
632 pb tergantung dari strain Wolbachia yang dideteksi. Serangga yang negatif
terinfeksi Wolbachia yaitu Bactrocera 1 yang telah diidentifikasi lanjut mempunyai
jenis Bactrocera dorsalis complex (Laras, komunikasi pribadi).
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
750 pb
500 pb
Gambar 2
Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan
Wolbachia. Sumuran M: DNA marker ladder 1-kpb, 1: Drosophila, 2:
Bactrocera 1, 3: Bactrocera 2, 4: Callosobruchus, 5: Sitophilus, 6:
Apanteles, 7: Anoplolepis, 8: Armigeres, 9: Brachymeria, 10:
Scelionidae, 11: Trichogramma
Protein permukaan membran merupakan protein yang diekspresikan oleh gen
pengkode utama protein permukaan membran Wolbachia (wsp). Protein permukaan
membran Wolbachia berpartisipasi dalam respon kekebalan inang, proliferasi sel,
patogenesitas, dan pengendali kematian sel (Uday dan Puttaraju 2012). Protein ini
menunjukkan kesamaan urutan yang erat dengan protein permukaan membran pada
famili Alphaprobacteria. Protein ini juga homolog dengan protein permukaan
membran yang telah terbukti memiliki fungsi antigenik dalam bakteri patogen
penting seperti Ehrlichia dan Neisseria (Werren et al. 2008). Wsp merupakan gen
yang paling bervariasi di antara gen lain yang umum digunakan untuk deteksi
Wolbachia, misalnya 16S rRNA atau ftsZ. Variasi yang terdapat pada gen wsp
9
menunjukkan perbedaan genetik relatif tinggi di antara strain Wolbachia (Baldo et
al. 2005). Gen ini menunjukkan karakter yang informatif untuk menentukan
hubungan evolusioner di dalam strain (Zhou et al. 1998).
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Tiap-tiap serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia kemudian dilakukan
amplifikasi untuk pengelompokan supergrup Wolbachia (A dan B) dengan
menggunakan pasangan primer 136F dan 691R untuk Wolbachia supergrup A
sedangkan pasangan primer 81F dan 522R untuk Wolbachia supergrup B (Zhou et
al. 1998). Hasil visualisasi pada gel agarosa menunjukkan bahwa isolat yang positif
terinfeksi Wolbachia supergrup A akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 556
pb, sedangkan isolat yang positif terinfeksi Wolbachia supergrup B akan
menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb (Gambar 3).
Berdasarkan hasil amplifikasi tercatat sebanyak 9 sampel serangga yang diuji
terinfeksi Wolbachia supergrup A dan 6 sampel serangga terinfeksi Wolbachia
supergrup B. Hasil amplifikasi juga menunjukkan adanya infeksi ganda oleh
Wolbachia, dimana terdapat dua supergrup Wolbachia (A dan B) yang menginfeksi
satu jenis inang yang sama yaitu pada sampel Calosobruchus, Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Pada penelitian ini,
tampak jelas bahwa Wolbachia dari supergrup A mempunyai tingkat infeksi yang
lebih tinggi daripada Wolbachia supergrup B (Tabel 2). Werren et al. (1995)
menemukan bahwa di antara spesies serangga neotropical infeksi ganda lebih
sering terjadi dan lebih mudah dibentuk atau dipertahankan. Werren dan Windsor
(2000) melaporkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata di antara ordo serangga
terhadap frekuensi infeksi dari supergrup A dan B, dimana tingkat infeksi supergrup
A lebih tinggi dibandingkan supergrup B.
750 pb
500 pb
Gambar 3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup
B. Keterangan A: amplifikasi dengan pasangan primer 136F dan 691R,
B: amplifikasi dengan pasangan primer 81F dan 522R, 1: Drosophila,
2: Calosobruchus, 3: Bactrocera 1, 4: Sithopilus, 5: Apanteles, 6:
Anoplolepis, 7: Armigeres, 8: Brachymeria, 9: Scelionide, 10:
Trichogramma
Perrot-Minnot et al. (1996) menjelaskan bahwa kejadian infeksi ganda
berpengaruh terhadap kompatibilitas sitoplasma pada inang. Telur yang terinfeksi
10
ganda akan kompatibel dengan sperma yang terinfeksi ganda maupun tunggal,
sedangkan telur yang terinfeksi tunggal tidak kompatibel dengan sperma yang
terinfeksi ganda. Penelitian yang telah dilakukan pada spesies Nasonia vitripennis
menunjukkan jantan yang terinfeksi ganda tidak kompatibel dengan betina yang
terinfeksi tunggal maupun ganda. Dengan demikian, infeksi ganda akan
meningkatkan infeksi tunggal pada populasi yang tidak terinfeksi.
Tabel 2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup Wolbachia
yang menginfeksi inang
Infeksi
Ordo
Famili
Genus
Supergrup
Wolbachia
Coleoptera
Bruchidae
Callosobruchus
+
B
Curculionidae
Sitophilus
+
A,B
Diptera
Tephritidae
Bactrocera 1
Tephritidae
Bactrocera 2
+
A,B
Culicidae
Armigeres
+
A,B
Drosophilidae
Drosophila
+
A
Hymenoptera
Braconidae
Apanteles
+
A
Chalcididae
Brachymeria
+
A,B
Formicidae
Anoplolepis
+
A
Scelionidae
Scelionidae
+
A
Trichogrammatidae Trichogramma
+
A,B
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida
Sepuluh serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia, diambil masingmasing satu sampel tiap supergrup untuk dilakukan sekuen nukleotida. Sampel
yang digunakan yaitu DNA Wolbachia yang berasal dari Drosophila untuk
mewakili sekuen supergrup A sedangkan DNA Wolbachia yang berasal dari
Sitophilus mewakili sekuen dari supergrup B. Hasil sekuen nukleotida kemudian
dianalisis menggunakan program BLAST untuk mengetahui spesies yang homolog
dengan isolat yang telah didepositkan di dalam GeneBank.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang merupakan supergrup
A dari Indonesia mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat
Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum yang mempunyai nomor
aksesi di GeneBank GQ924887 (Tabel 3). Isolat ini diketahui berasal dari Austria
(Miller et al. 2010). Isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Drosophila ini
tidak secara jelas merujuk pada strain Wolbachia yang spesifik pada hasil BLAST
di GeneBank. Hasil BLAST menunjukkan beberapa strain yang muncul seperti
wPol1 (AY596785), wWal1 (AY596783), dan wWal2 (AY596784). Dengan
demikian, hasil penelitian ini belum dapat menunjukkan strain Wolbachia dari
isolat yang diperoleh.
Isolat Wolbachia B yang merupakan supergrup B dari Indonesia mempunyai
tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of
Sitophilus oryzae yang mempunyai nomor aksesi di GeneBank JN315982. Isolat ini
diketahui berasal dari Prancis (Henri dan Mouton 2011). Berdasarkan hasil BLAST
11
menunjukkan bahwa isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Sitophilus secara
jelas merujuk pada Wolbachia strain wSito.
Tabel 3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup A dan
Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah dideposit di
GeneBank
Kemiripan
Isolat
Inang
Spesies yang homolog
No. Aksesi
(%)
Wolbachia A Drosophila
Wolbachia
GQ924887
100
endosymbiont of
Drosophila paulistorum
Wolbachia B
Sitophilus
Wolbachia
JN315982
100
endosymbiont of
Sitophilus oryzae strain
wSito
Analisis Filogenetika
Hubungan kekerabatan antara isolat Wolbachia dapat dilihat dengan analisis
pohon filogenetika. Pohon filogenetika yang dibangun berdasarkan sekuen
nukleotida gen wsp dari isolat-isolat Wolbachia yang berasal dari berbagai negara
serta berasal dari genus inang yang sama, yaitu genus Drosophila untuk supergrup
A dan genus Sitophilus untuk supergrup B. Hasil analisis filogenetika
mengindikasikan dua kelompok besar yang terpisah cukup jelas (Gambar 4).
Kelompok pertama dan kedua memiliki perbedaan pada tingkat taksonomi yaitu
supergrup. Kelompok pertama merupakan kelompok Wolbachia supergrup A dan
kelompok kedua merupakan kelompok Wolbachia supergrup B. Hal ini
membuktikan bahwa Wolbachia yang telah dideteksi mempunyai keragaman
supergrup A dan B. Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan yang jauh antara
isolat Wolbachia dengan Cardinium yang juga merupakan bakteri endosimbion
pada serangga yang digunakan sebai outgroup.
Supergrup A
Supergrup B
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan
sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai
outgrup
12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan deteksi molekuler telah ditemukan bakteri endosimbion
Wolbachia pada serangga yang diuji dan terdapat keragaman supergrup Wolbachia,
yaitu supergrup A dan B yang menginfeksi serangga tersebut. Hasil deteksi
menunjukkan telah ditemukan Wolbachia supergrup A pada sampel Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis,
Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan
pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria,
dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada
sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila
merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat
Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) sedangkan isolat
Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus merupakan supergrup B mempunyai
tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of
Sitophilus oryzae (JN315982).
Saran
Perlu dilakukan penelitian serupa dengan mengambil contoh serangga dari
ordo yang lebih luas. Identifikasi serangga inang yang diuji diharapkan dapat
sampai pada level spesies, sehingga diperoleh informasi tentang distribusi
Wolbachia. Perlu dilakukan identifikasi tingkat strain dan analisis dampak dari
keberadaan Wolbachia sehingga informasi yang tersedia dapat digunakan dalam
penerapannya sebagai agens hayati untuk mengendalikan hama dan penyakit di
bidang pertanian pada khususnya.
13
DAFTAR PUSTAKA
[Babec] Bay Area Biotechnology Education Consortium. 2012. Wolbachia PCR:
Student Guide. San Mateo (US): Babec.
Baldo L, Lo N, Werren JH. 2005. Mosaic nature of the Wolbachia surface protein.
Journal of Bacteriology. 187:5406-5418.
Bandi C, Dunn AM, Hurst GD, Rigaud T. 2001. Inherited microorganisms, sexspecific virulence and reproductive parasitism. Trends Parasitology. 17:8894.
Bourtzis K, Robinson AS. 2006. Insect pest control using Wolbachia and/or
radiation. Insect Symbiosis. 2:225-246.
Braig HR, Weiguo Z, Stephen LD, Scott O. 1998. Cloning and characterization of
a gene encoding the major surface protein of bacterial endosymbiont
Wolbachia pipientis. Journal of Bacteriology. 180(9):2373-2378.
Dumler JS, Anthony FB, Cornelis PJB, Gregory AD, Guy HP, Stuart CR, Yasuko
R, Fred RR. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae
and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species
of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with
Neorickettsia descriptions of six new species combinations and designation
of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichia
phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 51:2145-2165.
Henri H, Mouton L. 2011. High-resolution melting technology: a new tool for
studying the Wolbachia endosymbiont diversity in the field. Molecular
Ecology Resources. 12(1):75-81. DOI:10.1111/j.1755-0998.2011.03064.
Hurst GDD, Jiggins FM. 2000. Male-killing bacteria in insects: mechanisms,
incidence, and implication. Emerging Infectious Diseases. 6(4):329-336.
James AC, Dean MD, McMahon ME, Ballard JWO. 2002. Dynamics of double and
single Wolbachia infections in Drosophila simulans from New Caledonia.
Heredity. 88:182-189.
Kageyama D, Satoko N, Taro I, Akihiro M. 2009. Detection and identification of
Wolbachia endosymbionts from laboratory stocks of stored-product insect
pests and their parasitoids. Journal of Stored Products Research. 46:13-19.
Kikuchi Y, Fukatsu T. 2003. Diversity of Wolbachia endosymbionts in heteropteran
bugs. Applied and Environmental Microbiology. 69(10):6082–6090.
Kusmintarsih ES. 2008. Population density of Wolbachia bacteria and the induction
of the popcorn-effect in Drosophila melanogaster. Microbiology Indonesia.
2(2):89-94.
Lo N, Paraskevopoulos C, Bourtzis K, O’Neill L, Werren JH, Bordenstein SR,
Bandi C. 2007. Taxonomic status of the intracellular bacterium Wolbachia
pipientis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.
57:654-657.
Louis C, Nigro L. 1989. Ultrastructural evidence of Wolbachia Rickettsiales in
Drosophila simulans and their relationships with unidirectional cross
incompatibility. Journal of Invertebrate Pathology. 54:39–44.
14
McMeniman CJ, Lane RV, Cass BN, Fong AW, Sidhu M, Wang YF, O'Neill SL.
2009. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the
mosquito Aedes aegypti. Science. 323:141-144.
Miller WJ, Lee H, Daniela S. 2010. Infectious speciation revisited: impact of
symbiont depletion on female fitness and mating behavior of Drosophila
paulistorum. PLOS Pathogens. 6(12):1-17. DOI:10.1371/j.ppat.1001214.
Perrot-Minnot MJ, Guo LR, Werren JH. 1996. Single and double infections with
Wolbachia in the parasitic Nasonia vitripennis: effects on compatibility.
Genetics Society of America. 143:961-972.
Pourali P, Roayaei AM, Jolodar A, Razi JMH. 2009. PCR screening of the
Wolbachia in some arthropods and nematodes in Khuzestan province. Iranian
Journal of Veterinary Research. 10(3):216-222.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. New York (US):
Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Saridaki A, Bourtzis K. 2009. Wolbachia-induced reproductive parasitism and
applications. Entomologia Hellenica. 18(2009):3-16.
Stouthamer, R, Breeuwer JAJ, Hurst GDD. 1999.Wolbachia pipientis: Microbial
manipulator of arthropod reproduction. Annual Review of Microbiology.
53:71–102.
Uday J, Puttaraju HP. 2012. Comparative analysis of Wolbachia surface protein in
D. melanogaster, A. tabida, and B. malayi. Biomedical Informatics. 8(15)711715.
Werren JH. 1997. Biology of Wolbachia. Annual Review of Entomology. 42:587609.
Werren JH, Baldo L, Clark ME. 2008. Wolbachia: master manipulators of
invertebrate biology. Nature Review Microbiology. 6:741-751.
Werren JH, Windsor D. 2000. Wolbachia infection frequency in insects: evidence
of a global equilibrium? Proceedings of the Royal Society of London B.
267:1277-1285.
Werren JH, Windsor D, Guo L. 1995. Distribution of Wolbachia among neotropical
arthropods. Proceedings of the Royal Society of London B. 262:197–204.
Xie Z, Khoo CC, Dobson SL. 2005. Wolbachia establishment and invasion in an
Aedes aegypti laboratory population. Science. 310:326–328.
Zhou W, Rousset F, O’Neill S. 1998. Phylogeny and PCR-based classification of
Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proceedings of the Royal
Society of London B. 265:509-515.
15
LAMPIRAN
Lampiran 1 Jenis serangga yang diuji, jumLah setiap jenis yang diekstraksi, dan
bagian tubuh yang diekstraksi
Ordo
Coleoptera
Diptera
Hymenoptera
Famili
Genus
JumLah
individu yang
diekstraksi
Bruchidae
Callosobruchus
5
Curculionidae
Sitophilus
5
Tephritidae
Tephritidae
Bactrocera 1
Bactrocera 2
3
3
Culicidae
Armigeres
3
Drosophilidae
Drosophila
7
Braconidae
Apanteles
36
Chalcididae
Brachymeria
3
Formicidae
Anoplolepis
6
Scelionidae
Scelionidae
20
Trichogrammatidae
Trichogramma
3 000
Bagian yang
diekstraksi
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Abdomen
Abdomen
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Abdomen
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Lampiran 2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor dengan
isolat di Genbank
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
---------------------------------------------------------AAA
GGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTACGTTCGTTTGCAATACAACGGTGAAATT
*
TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT
TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT
************************************************************
CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC
CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC
************************************************************
AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA
AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA
************************************************************
TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT
TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT
************************************************************
TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA
TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA
************************************************************
GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT
GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT
************************************************************
GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT
GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT
3
60
63
120
123
180
183
240
243
300
303
360
363
420
423
480
16
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
************************************************************
GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC
GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC
************************************************************
AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG
AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG
************************************************************
TTTAATTTTTA 554
TTTAATTTTT- 610
**********
483
540
543
600
Lampiran 3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor dengan
isolat di Genbank
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
TTGGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG
----------------TGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG
********************************************
TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA
TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA
************************************************************
GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA
GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA
************************************************************
TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA
TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA
************************************************************
CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG
CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG
************************************************************
ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT
ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT
************************************************************
ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG
ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG
************************************************************
CTTATCAAGCAAAAGCTGGTA--------------------------------------CTTATCAAGCAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAATCAAGCTTTATGCTG
********************
-----------------------------------------------------------GTGCTCGTTATTTTGGTTCTTATGGTGCTAATTTTGGTAAGACAGCTAAAGATGATGGCG
----------------------------------------GAATCAAAGTTCTTTACAGCACTGTCGGTGCAGAAGCTGGA 565
60
44
120
104
180
164
240
224
300
284
360
344
420
404
441
464
524
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 14 Maret 1991, sebagai putra
kedua dari empat bersaudara dari pasangan Tri Warsono dan Sri Wahyuningsih.
Penulis memiliki seorang kakak laki-laki dan dua orang adik perempuan bernama
Septian Ady Nugraha, Malinda Wahyu Rahmawati, dan Malinda Wahyu Utami.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Sragen,
Jawa Tengah pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama setelah lulus diterima di
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Seleksi Mandiri IPB (USMI).
Selama menjadi mahasiswa penulis aktif mengikuti berbagai lembaga
kemahasiswaan seperti Klub Cybertron Asrama TPB sebgai staff tahun 2010, Uni
Konservasi Fauna sebagai staff Divisi Konservasi Serangga tahun 2011. Wakil
Ketua Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman tahun kepengurusan 2011/2012
dan sebagai Kepala Divisi Keprofesian tahun kepengurusan 2012/2013. Anggota
Entomologi Club pada tahun 2012, anggota Organic Farming Club tahun 2012, dan
Ketua Paguyuban Mahasiswa Sragen di Bogor tahun kepengurusan 2011/2012.
Prestasi yang sempat diraih penulis selama masa studi yaitu menjadi wakil
Departemen Proteksi Tanaman pada acara Syngenta Conection Program bersama
mahasiswa Australia di Malang pada tahun 2011, penerima besiswa Tanoto
National Champion Scholarship pada tahun 2011, ketua Program Kreatifitas
mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat didanai Dikti tahun 2012, juara I lomba
cerdas cermat Entomologi tingkat nasional pada tahun 2012, berkesempatan
mengikuti Training in Biological Control di Universitas Tsukuba Jepang dan
Training in Rapid Biodiversity Assessment bersama Universitas Vienna di
Kepulauan Kraktau pada tahun 2013.
Penulis juga aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Biologi Patogen
pada semester genap tahun ajaran 2010/2011, Entomolgi Umum pada semester
ganjil tahun ajaran 2011/2012, dan Dasar-Dasar Proteksi Tanaman pada semester
genap tahun ajaran 2011/2012.
ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO
SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Deteksi Keberadaan
dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di
Bogor adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2013
Mahardika Gama Pradana
NIM A34090024
ABSTRAK
MAHARDIKA GAMA PRADANA. Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri
Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor. Dibimbing oleh
GIYANTO dan DAMAYANTI BUCHORI.
Genus Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang diperkirakan
menginfeksi 70% dari spesies serangga. Infeksi Wolbachia pada serangga dapat
mempengaruhi perubahan sistem reproduksi inang. Studi mengenai keberadaan
Wolbachia dilakukan dengan melakukan koleksi lapang serangga uji di sekitar
Bogor. Deteksi keberadaan Wolbachia dilakukan dengan teknik PCR. Hasil deteksi
menunjukkan Wolbachia supergrup A ditemukan pada sampel Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis,
Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan
pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria,
dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada
sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila
merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar
100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum
(GQ924887) sedangkan isolat Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus
merupakan supergrup B mempunyai tingkat kemiripan sekuen gen wsp sebesar
100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae (JN315982).
Keywords: endosimbion, PCR, wsp.
ABSTRACT
MAHARDIKA GAMA PRADANA. Detection of The Presence and Variation of
Wolbachia Endosymbiont in Several Insect Orders from Bogor. Supervised by
GIYANTO and DAMAYANTI BUCHORI.
The genus Wolbachia is a bacterial group that infects up to 70% of insect
species. Wolbachia infections are usually associated with changes in host
reproduction on insect. Studies on the presence of Wolbachia was done by field
collection of insect samples around Bogor. Detection of the presence of Wolbachia
performed by polymerase chain reaction (PCR). This study have been detected
Wolbachia supergroup A infection on Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres,
Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis, Scelionidae, and
Trichogramma, while Wolbachia supergrup B infection have been detected on
Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and
Trichogramma. Wolbachia double infection (AB) were also found on Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, and Trichogramma. Based on sequnce
analysis, obtained similiarity level of wsp gene at 100% between Drosophila
sample with Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) and
also between Sitophilus sample with Wolbachia endosymbiont of Sitophilus oryzae
(JN315982).
Keywords: endosymbiont, PCR, wsp.
©
Hak Cipta Milik IPB, tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipa hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI KEBERADAAN DAN KERAGAMAN BAKTERI
ENDOSIMBION Wolbachia PADA BEBERAPA ORDO
SERANGGA DI BOGOR
MAHARDIKA GAMA PRADANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Deteksi Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion
Wolbachia pada Beberapa Ordo Serangga di Bogor
Nama
: Mahardika Gama Pradana
NIM
: A34090024
Disetujui oleh
Dr. Ir. Giyanto, MSi.
Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc.
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, MSi.
Ketua Departemen Proteksi Tanaman
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Deteksi
Keberadaan dan Keragaman Bakteri Endosimbion Wolbachia pada Beberapa Ordo
Serangga di Bogor”, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor.
Banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan
tugas akhir ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada: Dr. Ir. Giyanto,
MSi. Dan Prof. Dr. Ir. Damayanti Buchori, MSc. selaku dosen pembimbing tugas
akhir yang telah banyak memberikan berbagai macam bantuan kepada penulis baik
berupa pikiran, materi, waktu, dan hal lainnya. Dra. Endang Sri Ratna, Ph.D selaku
dosen penguji tamu yang telah memberikan kritik dan saran untuk penyempurnaan
penulisan skripsi. Seluruh Dosen dan Staff Departemen Proteksi Tanaman IPB,
keluarga tercinta Papa, Mama, Ibuk, Kakak, Adik untuk kasih sayang, dukungan
serta doa yang selalu diberikan. Teman-teman Laboratorium Bakteri Tumbuhan
(Kak Tatit, Kak Syaiful, Auzan, Nadzir, Arfi, Elok, Eka) dan Laboratorium
Pengendalian Hayati (Mbak Laras, Mbak Nita, Bayu, Winda) atas bantuan dan
motivasi yang telah diberikan selama penelitian. Teman-teman Iyoeh House (Yan,
Arifin, Kautsar) atas pertemanan selama kuliah di IPB dan segala macam dukungan
yang selalu diberikan kepada penulis. Suci Regita dan Ihsan Nurkomar atas bantuan
dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis ketika menempuh studi maupun
selama penelitian. Teman-teman seperjuangan di Departemen Proteksi Tanaman,
serta pihak lain yang turut membantu dalam pelaksanaan tugas akhir ini.
Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, November 2013
Mahardika Gama Pradana
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Metode Penelitian
Pengambilan Serangga Uji
Deteksi Wolbachia
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis dan Visualisasi
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika
Analisis Sekuen Nukleotida
Analisis Filogenetika
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis-Jenis Serangga Uji
Deteksi Keberadaan Wolbachia
Hasil Ekstraksi DNA
Amplifikasi Gen wsp
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida
Analisis Filogenetika
SMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
1
1
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
7
7
8
9
10
10
11
12
12
12
13
15
DAFTAR TABEL
1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian
2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup
Wolbachia yang menginfeksi beberapa inang
3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup
A dan Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah
dideposit di GeneBank
6
9
10
DAFTAR GAMBAR
1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji
2 Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan
Wolbachia
3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup B
4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan
sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai outgroup
7
8
9
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Jenis serangga yang diuji dan jumlah setiap jenis yang diekstraksi
2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor
dengan isolat di Genbank
3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor
dengan isolat di Genbank
15
15
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wolbachia merupakan bakteri endosimbion yang berasal dari ordo
Rickettsiales, famili Anaplasmataceae. Wolbachia merupakan bakteri intraseluler
yang ditemukan di arthropoda dan nematoda. Beberapa penelitian menyebutkan
bahwa infeksi Wolbachia pada serangga dan sebagian besar arthropoda lainnya
serta nematoda filarial diperkirakan mencapai 70% (Werren et al. 1995). Wolbachia
memperbanyak diri dengan pembelahan biner dalam vakuola sel inang dan
dikelilingi oleh membran asal inang. Pada arthropoda, sebagian besar bakteri
berada di dalam sitoplasma sel yang terdapat di sistem organ reproduksi, selain itu
juga terdapat di dalam jaringan lain, termasuk jaringan saraf dan hemosit (Louis
dan Nigro 1989). Baik pada arthropoda maupun nematoda, Wolbachia
ditransmisikan secara transovarial kepada keturunannya (Werren 1997).
Wolbachia pipientis saat ini dianggap sebagai satu-satunya spesies dari genus
Wolbachia (Dumler et al. 2001). Studi berdasarkan karakter molekuler telah
menerangkan bahwa terdapat bermacam-macam strain dari W. pipientis secara
filogenetik (Lo et al. 2007). Berdasarkan variasi di dalam 16S rRNA yang diperoleh
dari berbagai arthropoda dan nematoda filarial, spesies W. pipientis dapat dibagi
menjadi delapan supergrup yaitu supergrup A sampai dengan H. Supergrup A dan
B paling umum ditemukan pada arthropoda, supergrup C dan D secara khas
ditemukan pada nematoda filarial, supergrup E ditemukan pada ordo Collembola,
supergrup F dan H ditemukan pada rayap (ordo Isoptera), dan supergrup G
ditemukan pada beberapa laba-laba Australia (Babec 2012).
Pada arthropoda, infeksi Wolbachia berhubungan dengan perubahan dalam
sistem reproduksi inang, yang meliputi: a) kematian keturunan jantan selama proses
embriogenesis pada bakteri betina yang terinfeksi, b) induksi partenogenesis,
menghasilkan keturunan diploid akibat ketiadaan reproduksi seksual, c) feminisasi
genetik jantan, perubahan genetik jantan menjadi betina, dan d) inkompatibilitas
sitoplasma-cytoplasmic incompatibility, ketidakmampuan jantan terinfeksi untuk
melakukan fertilisasi sel telur dari betina yang tidak terinfeksi maupun betina
terinfeksi dengan tipe Wolbachia yang berbeda (Stouthamer et al. 1999). Masingmasing fenotipe ini meningkatkan proporsi betina yang terinfeksi dalam populasi
inang dan sebagai bentuk adaptasi bakteri untuk meningkatkan transmisi
mikroorganisme. Efek parasit seperti pada inang ini umumnya disebut sebagai
reproductive parasitism (Bandi et al. 2001). Keberadaan Wolbachia pada beberapa
spesies serangga sangat diperlukan untuk reproduksi inang (Hurst dan Jiggins 2000).
Dampak dari Wolbachia terhadap sistem reproduksi serangga berpotensi sebagai
salah satu strategi pengendalian hama dan vektor penyakit tanaman.
Distribusi Wolbachia yang luas sekaligus peran sebagai manipulator sistem
reproduksi inang menjadikan bakteri ini berpeluang sebagai agen hayati yang
ramah lingkungan. Beberapa strategi pengendalian memanfaatkan induksi
inkompatibilitas sitoplasma di dalam pengendalian hama. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa Wolbachia dapat ditransfer dan dapat bertahan di dalam inang
yang berbeda jenis (introduksi) serta di dalam inang tersebut Wolbachia dapat
mengekspresikan fenotip reproduksi seperti yang diharapkan (Xie et al. 2005).
2
Salah satu contoh aplikasi yang berhasil di bidang pertanian yang pernah dilaporkan
yaitu strain Wolbachia dari inang Rhagoletis cerasi (Diptera: Tephritidae) telah
digunakan untuk menginfeksi lalat buah Mediterania melalui injeksi embrionik.
Persilangan di antara betina tidak terinfeksi dengan jantan terinfeksi menghasilkan
kematian telur sebesar 100%. Persilangan di antara lalat buah yang terinfeksi strain
Wolbachia berbeda menghasilkan inkompatibilitas sebesar 100% (Bourtzis dan
Robinson 2006).
Umur merupakan faktor penting yang mempengaruhi kemampuan suatu
vektor untuk mentransmisikan patogen manusia. Hal ini berdasarkan fakta bahwa
hampir semua patogen membutuhkan periode inkubasi ekstrinsik di dalam serangga
inang sebelum transmisi patogen terjadi. Transmisi ini hanya dilakukan sebagian
kecil dari populasi serangg inang yaitu serangga inang yang sudah tua atau
mendekati akhir siklus dewasa, sehingga muncul sebuah pemikiran mengenai
strategi untuk mempersingkat siklus hidup (umur) serangga inang yang berperan
sebagi vektor tersebut. McMeniman et al. (2009) melaporkan telah berhasil
mentransfer wMelpop yaitu strain Wolbachia dengan fenotip mempersingkat siklus
hidup inang. Wolbachia tersebut ditransfer ke dalam nyamuk Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) yang merupakan vektor utama penyakit demam berdarah.
Strategi dengan mempersingkat siklus hidup merupakan sebuah strategi baru untuk
mengendalikan penyakit terbawa vektor.
Indonesia dengan kekayaan mega biodiversitas hayati khususnya serangga,
memungkinkan penggunaan Wolbachia sebagai salah satu strategi pengendalian
hama penyakit khususnya pada bidang pertanian. Perlu dilakukan sebuah penelitian
mengenai penyebaran atau distribusi Wolbachia di seluruh Indonesia sehingga data
mengenai distribusi inang maupun fenotip tersedia. Di Indonesia, studi mengenai
keberadaan Wolbachia masih jarang dilakukan. Tercatat pada tahun 2008 penelitian
mengenai hubungan kepadatan spesies Drosophila melanogaster dan penularan
secara horizontal Wolbachia (Kusmintarsih 2008). Penelitian lebih lanjut perlu
dilakukan sehingga potensi Wolbachia sebagai agen hayati dalam pengendalian
hama penyakit dapat diaplikasikan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mempelajari keberadaan Wolbachia pada beberapa
serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera serta keragaman supergrup
Wolbachia yang menginfeksi serangga tersebut serta identifikasi dengan teknik
molekuler.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah mengetahui keberadaan dan keragaman bakteri
endosimbon Wolbachia pada beberapa serangga ordo Coleoptera, Diptera, dan
Hymenoptera di Bogor. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia menjadikan
bakteri endosimbion ini sebagai agens dalam mengendalikan hama atau penyakit
berdasarkan kemampuannya dalam memanipulasi sistem reproduksi inang.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Kegiatan penelitian dimulai dari bulan Februari 2013 sampai Juni 2013.
Kegiatan identifikasi serangga dilakukan di Laboratorium Pengendalian Hayati,
Departemen Proteksi Tanaman, IPB sedangkan deteksi molekuler Wolbachia
dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman,
IPB.
Metode Penelitian
Pengambilan Serangga Uji
Serangga uji yang digunakan merupakan serangga ordo Coleoptera, Diptera,
dan Hymenoptera. Lokasi pengambilan serangga ordo Diptera dan Hymenoptera
dilakukan di sekitar Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat sedangkan
serangga uji Hymenoptera diperoleh dari SEAMEO BIOTROP, Bogor.
Pengambilan serangga uji dari ordo Hymenoptera yang termasuk parasitoid
dilakukan dengan mengambil inang terparasit dan dipelihara di laboratorium.
Serangga yang telah diperoleh kemudian dilakukan identifikasi sampai tingkat
famili dan genus. Serangga yang telah diperoleh kemudian disimpan di dalam
lemari pendingin (freezer) pada suhu -20 ⁰C dengan tujuan untuk mematikan
serangga dan menghentikan proses metabolisme bakteri endosimbion yang berada
di dalam tubuh serangga. Jumlah serangga yang diuji setiap genus atau famili tidak
dibatasi, ditentukan sesuai ukuran serangga (Lampiran 1). Berdasarkan protokol
yang ditulis oleh Babec (2012), ukuran serangga yang dipakai pada penelitian ini
kurang dari batas 0.1 ml pada tabung Eppendorf ukuran 1.5 ml.
Deteksi Wolbachia
Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA serangga dilakukan menurut metode Babec
(2012) dengan modifikasi. Untuk mendapatkan DNA Wolbachia dari genom
serangga diperoleh dengan cara menghancurkan secara fisik serangga pada bagian
alat reproduksi, abdomen, atau seluruh tubuh serangga sesuai dengan ukurannya.
Serangga betina lebih baik digunakan dalam ekstraksi apabila tersedia (Kikuchi dan
Fukatsu 2003). Seluruh serangga uji dihancurkan sampai halus menggunakan
micropestle di dalam tabung eppendorf kurang lebih selama 1 menit dengan terlebih
dahulu ditambah bufer CTAB sebanyak 200 μl kemudian diinkubasi pada suhu 65
⁰C selama 15 menit. Sebanyak 200 μL klorofom isoamil alkohol (24:1)
ditambahkan kemudian tabung dibolak-balik selama 30 menit. Tabung kemudian
disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10 000 rpm sehingga dihasilkan
supernatan. Supernatan yang telah diperoleh dipindah ke tabung Eppendorf baru
sebanyak 150 μL. RNAse ditambahkan sebanyak 2 μL kemudian diinkubasi pada
suhu 37 ⁰C selama satu jam. Sebanyak 15.2 μL NaCl ditambahkan diikuti dengan
penambahan 480 μL etanol absolut kemudian diinkubasi di lemari pendingin pada
suhu -20 ⁰C selama 3 jam. Tabung kemudian disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan
kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan
tersisa pelet yang mengandung DNA total. Pelet kemudian dicuci dengan
4
penambahan etanol 70% dan disntrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000
rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang, pelet kemudian
disuspensikan dengan larutan TE sebanyak 50 μL.
Amplifikasi DNA. Deteksi keberadaan Wolbachia menggunakan primer
spesifik 81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 691R (5’AAA
AAT TAA ACG CA 3’). Pasangan primer tersebut akan menghasilkan fragmen
DNA sebesar 632 pb (Zhou et al. 1998). Sebanyak 1 μL DNA hasil isolasi
ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf baru, dicampur dengan 12.5 μL Master
Mix, 1.5 μL Primer Mix, dan ddH2O 7.5 μL. Amplifikasi ini dilakukan pada mesin
PCR (Gene Amp PCR system 9700, PE Applied Biosystems, USA). Amplifikasi
tersebut didahului dengan denaturasi awal selama 7 menit pada suhu 94 ⁰C.
Kemudian dilanjutkan dengan siklus amplifikasi yang dalam satu siklus amplifikasi
adalah denaturasi satu menit pada 94 ⁰C, penempelan primer (annealing) selama
setengah menit pada 50.7 ⁰C, sintesis selama 1 menit pada 72 ⁰C dan diulang
sebanyak 30 kali, diakhiri untuk tahapan penyempurnaan sintesis selama 10 menit
pada 72 ⁰C (Pourali et al. 2009).
Elektroforesis dan Visualisasi. Visualisasi DNA hasil amplifikasi dilakukan
dengan gel agarosa 1% dalam TAE 2X. Gel agarosa dibuat dengan mencampurkan
0.4 g gel agarosa dengan 40 mL bufer Tris-asetat EDTA (TAE) 2X (0.045 M Trisasetat, 0.01 M EDTA) dan dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 mL.
Campuran dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut sempurna dan
ditambahkan 2.5 μL larutan ethidium bromida pada konsentrasi 10 mg/mL.
Sebelumnya aparatus pencetak gel dibersihkan, dikeringkan, kemudian diletakkan
pada permukaan yang datar. “Sisir” gel kemudian diletakkan di bagian atas
aparatus pencetak gel (± 0.5-1.0 mm dari atas). Selanjutnya larutan agarosa
dimasukkan ke dalam cetakan gel hingga keras kemudian dipindahkan ke bak
elektroforesis (Bio-Rad Power PAC 300, USA) dan ditambahkan 1X TAE bufer
elektroforesis hingga gel agarosa terendam. Sebanyak 5 µl DNA hasil amplifikasi
bersama 1 µl bufer loading dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam
sumuran gel dengan pipet mikro. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 75 volt
selama 30 menit. Hasil elektroforesis tersebut divisualisasikan dengan
Transilluminator ultra violet (Sambrook et al. 1989). Pita DNA yang terbentuk
pada hasil elektroforesis tersebut diamati dan dipotret dengan menggunakan kamera
digital.
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia diuji lebih lanjut untuk
mengetahui kelompok Wolbachia supergrup A dan B. Zhou et al. (1998)
menyebutkan bahwa untuk membedakan keragaman supergrup Wolbachia
menggunakan pasangan primer 136F (5’ TG AAA TTT TAC CTC TTT TC 3’) dan
691R (5’AAA AAT TAA ACG CA 3’) yang akan menghasilkan fragmen DNA
sebesar 556 pb sebagai Wolbachia dari supergrup A, sedangkan pasangan primer
81F (5’TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 3’) dan 522R (5’ ACC AGC
TTT TGC TTG ATA 3’) akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb sebagai
Wolbachia dari supergrup B. Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan metode
elektroforesis seperti metode yang sudah dijelaskan sebelumnya.
5
Analisis Sekuen Nukleotida dan Filogenetika
Analisis Sekuen Nukleotida. Produk PCR yang menunjukkan hasil positif
dari masing-masing supergrup (A dan B) diambil satu sampel sebanyak 40 µl
dikirim ke PT. Genetika Sains (First-Base Asia, Malaysia) untuk dilakukan sekuen
nukleotida.
Analisis Filogenetika. Hasil sekuen gen wsp dianalisis untuk mengetahui
tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen wsp dari Wolbachia yang
telah didepositkan pada GenBank dengan program Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) yang tersedia pada alamat http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sebelum
dilakukan pensejajaran dengan program BLAST, hasil sekuen diedit dengan
program Chromaspro. Data sekuen nukleotida dianalisis menggunakan program
ClustalW multiple alignment dengan perangkat lunak BioEdit V7.2.5 kemudian
dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan perangkat lunak Mega 5.2.2.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jenis-Jenis Serangga Uji
Serangga yang diuji untuk keperluan penelitian ini terdiri dari tiga ordo yaitu
Coleoptera, Diptera, dan Hymenoptera (Tabel 1). Latar belakang pengambilan tiga
ordo ini yaitu sebagian besar literatur mengenai studi tentang Wolbachia
menggunakan serangga uji yang sama dengan penelitian ini. Serangga uji
Trichogramma yang diperoleh dari lapang selanjutnya dilakukan perbanyakan
(rearing) di Laboratorium Pengendalian Hayati, Departemen Proteksi Tanaman,
IPB untuk mendapatkan jumLah yang cukup untuk ekstraksi. Sementara itu
serangga uji yang lainnya tidak dilakukan rearing karena jumLah yang diperoleh
dari lapang sudah cukup untuk ekstraksi.
Tabel 1 Jenis serangga yang digunakan dalam penelitian
Ordo
Coleoptera
Diptera
Hymenoptera
Famili
Bruchidae
Curculionidae
Tephritidae
Tephritidae
Culicidae
Drosophilidae
Braconidae
Chalcididae
Formicidae
Scelionidae
Trichogrammatidae
Genus
Callosobruchus
Sitophilus
Bactrocera 1
Bactrocera 2
Armigeres
Drosophila
Apanteles
Brachymeria
Anoplolepis
Scelionidae
Trichogramma
Beberapa literatur menunjukkan bahwa kajian bio-assessment Wolbachia
pada famili Drosophilidae menjadi model dasar dalam perkembangan penelitian ini.
Drosophila simulans merupakan salah satu sistem permodelan yang sangat baik
untuk meneliti populasi genetik inang dan simbionnya. D. simulans merupakan
spesies kosmopolitan yang mengandung lima strain Wolbachia (wHa, wNo, wRi,
wAu, dan wMa). Strain keenam diketahui berasal dari Tanzania (James et al. 2002).
Lalat buah dari genus Bactrocera merupakan hama penting pada beberapa
komoditas pertanaman khususnya di Indonesia. Salah satu pendekatan
pengendalian yang cukup populer dan ramah lingkungan yaitu dengan
menggunakan perangkap feromon atraktan seperti metil eugenol. Penggunaan dari
Wolbachia dapat dijadikan sebagai sarana pengendalian di masa depan baik melalui
transfer horizontal Wolbachia dari jenis inang yang lain atau dari jenis ini sendiri
seperti yang telah berhasil diaplikasikan pada nyamuk Aedes aegepty. Pada
penelitian ini diambil sampel nyamuk dari genus Armigeres yang biasa disebut
dengan nyamuk hutan.
7
Dua genus dari ordo Coleoptera yaitu Callosobruchus dan Sitophilus
merupakan kelompok hama gudang yang kosmpolitan, menjadi masalah utama di
dalam gudang penyimpanan khususnya yang menyimpan bahan makanan. Di
Jepang, deteksi dan karakterisasi strain Wolbachia pada hama gudang dan
parasitoidnya telah dilakukan sebagai informasi dasar atas potensi Wolbachia
sebagai strategi pengendalian hama di masa depan (Kageyama et al. 2009).
Hubungan parasitoid dengan inang mengenai kejadian penularan horizontal
Wolbachia dari parasitoid ke inang atau sebaliknya merupakan penelitian yang
menarik dan sedang dikembangkan. Informasi mengenai keberadaan Wolbachia
pada parasiotid (khususnya ordo Hymenoptera) sangat penting untuk mengetahui
interaksi antara Wolbachia dengan parasitoid maupun dengan inang parasitoid.
Deteksi Keberadaan Wolbachia
Hasil Ekstraksi DNA
Hasil ekstraksi yang didapat berupa pelet DNA yang disuspensikan di dalam
larutan bufer TE. Hasil ekstraksi kemudian dielektroforesis untuk mengetahui
secara visual kualitas DNA yang diperoleh. Hasil ekstraksi DNA yang berkualitas
baik ditunjukan dengan hasil visualisasi pada gel agarosa yaitu terbentuk satu pita
DNA pada bagian atas gel seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Hasil ektraksi DNA
yang diperoleh belum menunjukkan kualitas yang sempurna, karena masih terdapat
materi ikutan lain yang masih terbawa. Hasil elektroforesis menunjukkan smear
pada pita DNA nomor 8, hal ini menunjukkan bahwa DNA tidak utuh yang
disebabkan oleh faktor fisik maupun kimiawi pada saat proses ekstraksi. Sampel
nomor 5 dan 9 tampak tidak terbentuk pita DNA total yang terdapat pada bagian
ujung atas gel. Hal ini tidak berarti pada sampel nomor 5 dan 9 DNA total tidak
terekstraksi namun DNA total yang berhasil terekstraksi jumLahnya sangat sedikit
sehingga pada saat proses pewarnaa di dalam elektroforesis DNA total tidak
tervisualisasi dengan jelas.
Gambar 1 Visualisasi ekstraksi DNA total serangga yang diuji. Anak panah
menunjukkan pita DNA total yang terbentuk. Keterangan: 1.
Callosobruchus, 2. Sitophilus, 3. Bactrocera 1, 4. Bactrocera 2, 5.
Armigeres, 6. Drosophila, 7. Apanteles, 8. Brachymeria, 9. Anoplolepis,
10. Scelionidae, 11. Trichogramma
8
Pita DNA yang smear menunjukkan bahwa DNA tidak utuh. Hal ini
disebabkan oleh faktor fisik dan faktor kimiawi yang terjadi saat ekstraksi. Faktor
fisik yang mempengaruhi hasil DNA total antara lain proses penggerusan serangga
uji tidak merata yang menyebabkan hasil gerusan kurang halus sehingga hasil lisis
kurang sempurna. Kurang teliti dalam menggunakan pipet mikro sehingga volume
larutan ekstraksi yang diambil tidak sesuai takaran juga dapat mempengaruhi hasil
ekstraksi. Faktor kimiawi yang mempengaruhi hasil ekstraksi antara lain terjadi
kontaminasi bahan kimia yang digunakan selama ekstraksi DNA. Namun demikian,
DNA yang terdapat smear (mempunyai kualitas kurang baik) masih dapat
digunakan untuk deteksi Wolbachia.
Amplifikasi Gen wsp
Berdasarkan hasil amplifikasi diketahui bahwa dari 11 jenis serangga yang
diuji, 10 di antaranya positif terinfeksi Wolbachia. Hasil positif ditunjukkan dengan
adanya pita DNA yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 632 pb (Gambar 2).
Zhou et al. (1998) menyebutkan bahwa pasangan primer spesifik akan
mengamplifikasi gen wsp yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 590 sampai
632 pb tergantung dari strain Wolbachia yang dideteksi. Serangga yang negatif
terinfeksi Wolbachia yaitu Bactrocera 1 yang telah diidentifikasi lanjut mempunyai
jenis Bactrocera dorsalis complex (Laras, komunikasi pribadi).
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
750 pb
500 pb
Gambar 2
Visualisasi hasil amplifikasi gen wsp sebagai deteksi keberadaan
Wolbachia. Sumuran M: DNA marker ladder 1-kpb, 1: Drosophila, 2:
Bactrocera 1, 3: Bactrocera 2, 4: Callosobruchus, 5: Sitophilus, 6:
Apanteles, 7: Anoplolepis, 8: Armigeres, 9: Brachymeria, 10:
Scelionidae, 11: Trichogramma
Protein permukaan membran merupakan protein yang diekspresikan oleh gen
pengkode utama protein permukaan membran Wolbachia (wsp). Protein permukaan
membran Wolbachia berpartisipasi dalam respon kekebalan inang, proliferasi sel,
patogenesitas, dan pengendali kematian sel (Uday dan Puttaraju 2012). Protein ini
menunjukkan kesamaan urutan yang erat dengan protein permukaan membran pada
famili Alphaprobacteria. Protein ini juga homolog dengan protein permukaan
membran yang telah terbukti memiliki fungsi antigenik dalam bakteri patogen
penting seperti Ehrlichia dan Neisseria (Werren et al. 2008). Wsp merupakan gen
yang paling bervariasi di antara gen lain yang umum digunakan untuk deteksi
Wolbachia, misalnya 16S rRNA atau ftsZ. Variasi yang terdapat pada gen wsp
9
menunjukkan perbedaan genetik relatif tinggi di antara strain Wolbachia (Baldo et
al. 2005). Gen ini menunjukkan karakter yang informatif untuk menentukan
hubungan evolusioner di dalam strain (Zhou et al. 1998).
Analisis Keragaman Supergrup Wolbachia
Tiap-tiap serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia kemudian dilakukan
amplifikasi untuk pengelompokan supergrup Wolbachia (A dan B) dengan
menggunakan pasangan primer 136F dan 691R untuk Wolbachia supergrup A
sedangkan pasangan primer 81F dan 522R untuk Wolbachia supergrup B (Zhou et
al. 1998). Hasil visualisasi pada gel agarosa menunjukkan bahwa isolat yang positif
terinfeksi Wolbachia supergrup A akan menghasilkan fragmen DNA sebesar 556
pb, sedangkan isolat yang positif terinfeksi Wolbachia supergrup B akan
menghasilkan fragmen DNA sebesar 442 pb (Gambar 3).
Berdasarkan hasil amplifikasi tercatat sebanyak 9 sampel serangga yang diuji
terinfeksi Wolbachia supergrup A dan 6 sampel serangga terinfeksi Wolbachia
supergrup B. Hasil amplifikasi juga menunjukkan adanya infeksi ganda oleh
Wolbachia, dimana terdapat dua supergrup Wolbachia (A dan B) yang menginfeksi
satu jenis inang yang sama yaitu pada sampel Calosobruchus, Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma. Pada penelitian ini,
tampak jelas bahwa Wolbachia dari supergrup A mempunyai tingkat infeksi yang
lebih tinggi daripada Wolbachia supergrup B (Tabel 2). Werren et al. (1995)
menemukan bahwa di antara spesies serangga neotropical infeksi ganda lebih
sering terjadi dan lebih mudah dibentuk atau dipertahankan. Werren dan Windsor
(2000) melaporkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata di antara ordo serangga
terhadap frekuensi infeksi dari supergrup A dan B, dimana tingkat infeksi supergrup
A lebih tinggi dibandingkan supergrup B.
750 pb
500 pb
Gambar 3 Visualisasi amplifikasi gen wsp Wolbachia supergrup A dan supergrup
B. Keterangan A: amplifikasi dengan pasangan primer 136F dan 691R,
B: amplifikasi dengan pasangan primer 81F dan 522R, 1: Drosophila,
2: Calosobruchus, 3: Bactrocera 1, 4: Sithopilus, 5: Apanteles, 6:
Anoplolepis, 7: Armigeres, 8: Brachymeria, 9: Scelionide, 10:
Trichogramma
Perrot-Minnot et al. (1996) menjelaskan bahwa kejadian infeksi ganda
berpengaruh terhadap kompatibilitas sitoplasma pada inang. Telur yang terinfeksi
10
ganda akan kompatibel dengan sperma yang terinfeksi ganda maupun tunggal,
sedangkan telur yang terinfeksi tunggal tidak kompatibel dengan sperma yang
terinfeksi ganda. Penelitian yang telah dilakukan pada spesies Nasonia vitripennis
menunjukkan jantan yang terinfeksi ganda tidak kompatibel dengan betina yang
terinfeksi tunggal maupun ganda. Dengan demikian, infeksi ganda akan
meningkatkan infeksi tunggal pada populasi yang tidak terinfeksi.
Tabel 2 Hasil deteksi keberadaan Wolbachia dan keragaman supergrup Wolbachia
yang menginfeksi inang
Infeksi
Ordo
Famili
Genus
Supergrup
Wolbachia
Coleoptera
Bruchidae
Callosobruchus
+
B
Curculionidae
Sitophilus
+
A,B
Diptera
Tephritidae
Bactrocera 1
Tephritidae
Bactrocera 2
+
A,B
Culicidae
Armigeres
+
A,B
Drosophilidae
Drosophila
+
A
Hymenoptera
Braconidae
Apanteles
+
A
Chalcididae
Brachymeria
+
A,B
Formicidae
Anoplolepis
+
A
Scelionidae
Scelionidae
+
A
Trichogrammatidae Trichogramma
+
A,B
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
Tingkat Kemiripan Sekuen Nukleotida
Sepuluh serangga uji yang positif terinfeksi Wolbachia, diambil masingmasing satu sampel tiap supergrup untuk dilakukan sekuen nukleotida. Sampel
yang digunakan yaitu DNA Wolbachia yang berasal dari Drosophila untuk
mewakili sekuen supergrup A sedangkan DNA Wolbachia yang berasal dari
Sitophilus mewakili sekuen dari supergrup B. Hasil sekuen nukleotida kemudian
dianalisis menggunakan program BLAST untuk mengetahui spesies yang homolog
dengan isolat yang telah didepositkan di dalam GeneBank.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang merupakan supergrup
A dari Indonesia mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat
Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum yang mempunyai nomor
aksesi di GeneBank GQ924887 (Tabel 3). Isolat ini diketahui berasal dari Austria
(Miller et al. 2010). Isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Drosophila ini
tidak secara jelas merujuk pada strain Wolbachia yang spesifik pada hasil BLAST
di GeneBank. Hasil BLAST menunjukkan beberapa strain yang muncul seperti
wPol1 (AY596785), wWal1 (AY596783), dan wWal2 (AY596784). Dengan
demikian, hasil penelitian ini belum dapat menunjukkan strain Wolbachia dari
isolat yang diperoleh.
Isolat Wolbachia B yang merupakan supergrup B dari Indonesia mempunyai
tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of
Sitophilus oryzae yang mempunyai nomor aksesi di GeneBank JN315982. Isolat ini
diketahui berasal dari Prancis (Henri dan Mouton 2011). Berdasarkan hasil BLAST
11
menunjukkan bahwa isolat uji Wolbachia yang berasal dari genus Sitophilus secara
jelas merujuk pada Wolbachia strain wSito.
Tabel 3 Tingkat kemiripan sekuen nukleotida isolat Wolbachia supergrup A dan
Wolbachia supergrup B dengan spesies homolog yang telah dideposit di
GeneBank
Kemiripan
Isolat
Inang
Spesies yang homolog
No. Aksesi
(%)
Wolbachia A Drosophila
Wolbachia
GQ924887
100
endosymbiont of
Drosophila paulistorum
Wolbachia B
Sitophilus
Wolbachia
JN315982
100
endosymbiont of
Sitophilus oryzae strain
wSito
Analisis Filogenetika
Hubungan kekerabatan antara isolat Wolbachia dapat dilihat dengan analisis
pohon filogenetika. Pohon filogenetika yang dibangun berdasarkan sekuen
nukleotida gen wsp dari isolat-isolat Wolbachia yang berasal dari berbagai negara
serta berasal dari genus inang yang sama, yaitu genus Drosophila untuk supergrup
A dan genus Sitophilus untuk supergrup B. Hasil analisis filogenetika
mengindikasikan dua kelompok besar yang terpisah cukup jelas (Gambar 4).
Kelompok pertama dan kedua memiliki perbedaan pada tingkat taksonomi yaitu
supergrup. Kelompok pertama merupakan kelompok Wolbachia supergrup A dan
kelompok kedua merupakan kelompok Wolbachia supergrup B. Hal ini
membuktikan bahwa Wolbachia yang telah dideteksi mempunyai keragaman
supergrup A dan B. Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan yang jauh antara
isolat Wolbachia dengan Cardinium yang juga merupakan bakteri endosimbion
pada serangga yang digunakan sebai outgroup.
Supergrup A
Supergrup B
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat-isolat Wolbachia yang dibangun berdasarkan
sekuen nukleotida sebagian gen wsp dengan Cardinium sebagai
outgrup
12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan deteksi molekuler telah ditemukan bakteri endosimbion
Wolbachia pada serangga yang diuji dan terdapat keragaman supergrup Wolbachia,
yaitu supergrup A dan B yang menginfeksi serangga tersebut. Hasil deteksi
menunjukkan telah ditemukan Wolbachia supergrup A pada sampel Sitophilus,
Bactrocera 2, Armigeres, Drosophila, Apanteles, Brachymeria, Anoplolepis,
Scelionidae, dan Trichogramma, sedangkan Wolbachia supergrup B ditemukan
pada sampel Callosobruchus, Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria,
dan Trichogramma. Terjadi infeksi ganda oleh dua supergrup yang berbeda pada
sampel Sitophilus, Bactrocera 2, Armigeres, Brachymeria, dan Trichogramma.
Hasil analisis menunjukkan isolat Wolbachia A yang diperoleh dari Drosophila
merupakan supergrup A mempunyai tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat
Wolbachia endosymbiont of Drosophila paulistorum (GQ924887) sedangkan isolat
Wolbachia B yang diperoleh dari Sitophilus merupakan supergrup B mempunyai
tingkat kemiripan sebesar 100% dengan isolat Wolbachia endosymbiont of
Sitophilus oryzae (JN315982).
Saran
Perlu dilakukan penelitian serupa dengan mengambil contoh serangga dari
ordo yang lebih luas. Identifikasi serangga inang yang diuji diharapkan dapat
sampai pada level spesies, sehingga diperoleh informasi tentang distribusi
Wolbachia. Perlu dilakukan identifikasi tingkat strain dan analisis dampak dari
keberadaan Wolbachia sehingga informasi yang tersedia dapat digunakan dalam
penerapannya sebagai agens hayati untuk mengendalikan hama dan penyakit di
bidang pertanian pada khususnya.
13
DAFTAR PUSTAKA
[Babec] Bay Area Biotechnology Education Consortium. 2012. Wolbachia PCR:
Student Guide. San Mateo (US): Babec.
Baldo L, Lo N, Werren JH. 2005. Mosaic nature of the Wolbachia surface protein.
Journal of Bacteriology. 187:5406-5418.
Bandi C, Dunn AM, Hurst GD, Rigaud T. 2001. Inherited microorganisms, sexspecific virulence and reproductive parasitism. Trends Parasitology. 17:8894.
Bourtzis K, Robinson AS. 2006. Insect pest control using Wolbachia and/or
radiation. Insect Symbiosis. 2:225-246.
Braig HR, Weiguo Z, Stephen LD, Scott O. 1998. Cloning and characterization of
a gene encoding the major surface protein of bacterial endosymbiont
Wolbachia pipientis. Journal of Bacteriology. 180(9):2373-2378.
Dumler JS, Anthony FB, Cornelis PJB, Gregory AD, Guy HP, Stuart CR, Yasuko
R, Fred RR. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae
and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species
of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with
Neorickettsia descriptions of six new species combinations and designation
of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichia
phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 51:2145-2165.
Henri H, Mouton L. 2011. High-resolution melting technology: a new tool for
studying the Wolbachia endosymbiont diversity in the field. Molecular
Ecology Resources. 12(1):75-81. DOI:10.1111/j.1755-0998.2011.03064.
Hurst GDD, Jiggins FM. 2000. Male-killing bacteria in insects: mechanisms,
incidence, and implication. Emerging Infectious Diseases. 6(4):329-336.
James AC, Dean MD, McMahon ME, Ballard JWO. 2002. Dynamics of double and
single Wolbachia infections in Drosophila simulans from New Caledonia.
Heredity. 88:182-189.
Kageyama D, Satoko N, Taro I, Akihiro M. 2009. Detection and identification of
Wolbachia endosymbionts from laboratory stocks of stored-product insect
pests and their parasitoids. Journal of Stored Products Research. 46:13-19.
Kikuchi Y, Fukatsu T. 2003. Diversity of Wolbachia endosymbionts in heteropteran
bugs. Applied and Environmental Microbiology. 69(10):6082–6090.
Kusmintarsih ES. 2008. Population density of Wolbachia bacteria and the induction
of the popcorn-effect in Drosophila melanogaster. Microbiology Indonesia.
2(2):89-94.
Lo N, Paraskevopoulos C, Bourtzis K, O’Neill L, Werren JH, Bordenstein SR,
Bandi C. 2007. Taxonomic status of the intracellular bacterium Wolbachia
pipientis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.
57:654-657.
Louis C, Nigro L. 1989. Ultrastructural evidence of Wolbachia Rickettsiales in
Drosophila simulans and their relationships with unidirectional cross
incompatibility. Journal of Invertebrate Pathology. 54:39–44.
14
McMeniman CJ, Lane RV, Cass BN, Fong AW, Sidhu M, Wang YF, O'Neill SL.
2009. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the
mosquito Aedes aegypti. Science. 323:141-144.
Miller WJ, Lee H, Daniela S. 2010. Infectious speciation revisited: impact of
symbiont depletion on female fitness and mating behavior of Drosophila
paulistorum. PLOS Pathogens. 6(12):1-17. DOI:10.1371/j.ppat.1001214.
Perrot-Minnot MJ, Guo LR, Werren JH. 1996. Single and double infections with
Wolbachia in the parasitic Nasonia vitripennis: effects on compatibility.
Genetics Society of America. 143:961-972.
Pourali P, Roayaei AM, Jolodar A, Razi JMH. 2009. PCR screening of the
Wolbachia in some arthropods and nematodes in Khuzestan province. Iranian
Journal of Veterinary Research. 10(3):216-222.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. New York (US):
Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Saridaki A, Bourtzis K. 2009. Wolbachia-induced reproductive parasitism and
applications. Entomologia Hellenica. 18(2009):3-16.
Stouthamer, R, Breeuwer JAJ, Hurst GDD. 1999.Wolbachia pipientis: Microbial
manipulator of arthropod reproduction. Annual Review of Microbiology.
53:71–102.
Uday J, Puttaraju HP. 2012. Comparative analysis of Wolbachia surface protein in
D. melanogaster, A. tabida, and B. malayi. Biomedical Informatics. 8(15)711715.
Werren JH. 1997. Biology of Wolbachia. Annual Review of Entomology. 42:587609.
Werren JH, Baldo L, Clark ME. 2008. Wolbachia: master manipulators of
invertebrate biology. Nature Review Microbiology. 6:741-751.
Werren JH, Windsor D. 2000. Wolbachia infection frequency in insects: evidence
of a global equilibrium? Proceedings of the Royal Society of London B.
267:1277-1285.
Werren JH, Windsor D, Guo L. 1995. Distribution of Wolbachia among neotropical
arthropods. Proceedings of the Royal Society of London B. 262:197–204.
Xie Z, Khoo CC, Dobson SL. 2005. Wolbachia establishment and invasion in an
Aedes aegypti laboratory population. Science. 310:326–328.
Zhou W, Rousset F, O’Neill S. 1998. Phylogeny and PCR-based classification of
Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proceedings of the Royal
Society of London B. 265:509-515.
15
LAMPIRAN
Lampiran 1 Jenis serangga yang diuji, jumLah setiap jenis yang diekstraksi, dan
bagian tubuh yang diekstraksi
Ordo
Coleoptera
Diptera
Hymenoptera
Famili
Genus
JumLah
individu yang
diekstraksi
Bruchidae
Callosobruchus
5
Curculionidae
Sitophilus
5
Tephritidae
Tephritidae
Bactrocera 1
Bactrocera 2
3
3
Culicidae
Armigeres
3
Drosophilidae
Drosophila
7
Braconidae
Apanteles
36
Chalcididae
Brachymeria
3
Formicidae
Anoplolepis
6
Scelionidae
Scelionidae
20
Trichogrammatidae
Trichogramma
3 000
Bagian yang
diekstraksi
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Abdomen
Abdomen
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Abdomen
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Seluruh
tubuh
Lampiran 2 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup A isolat Bogor dengan
isolat di Genbank
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
---------------------------------------------------------AAA
GGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTACGTTCGTTTGCAATACAACGGTGAAATT
*
TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT
TTACCTCTTTTCACAAAAATTGAAGGTATTGAATATAAAAAGGCCACAGACATTCATAAT
************************************************************
CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC
CCATTAAAAGCATCTTTTATAGCTGGTGGTGGTGCATTTGGTTACAAAATGGACGACATC
************************************************************
AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA
AGGGTTGATGTTGAAGGGCTTTATTCACAGCTAAACAAAAATGATGTTACAGGTGCAGCA
************************************************************
TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT
TTTAACCCAGATACTGTTGCAGACAGTTTAACAGCAATTTCAGGGCTAGTTAACGTTTAT
************************************************************
TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA
TACGATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCA
************************************************************
GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT
GCGTATATTAGCACTCCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATCAAAAAAGTAAATTTGGTTTT
************************************************************
GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT
GCTGGTCAAGTAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAGTCAAACTTTATGCT
3
60
63
120
123
180
183
240
243
300
303
360
363
420
423
480
16
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
Wo_A_Bogor_wsp
Wo_GQ924887_wsp
************************************************************
GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC
GGAGCTCGTTATTTCGGTTCTTTTGGTGCTCATTTTGATAAAGATACTGCTGCAGCAAGC
************************************************************
AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG
AAAGACAAGGGGGAACTCAAAGTTCTTTACAGCACTGTTGGTGCAGAAGCTGGAGTAGCG
************************************************************
TTTAATTTTTA 554
TTTAATTTTT- 610
**********
483
540
543
600
Lampiran 3 Hasil pensejajaran sekuen Wolbachia supergrup B isolat Bogor dengan
isolat di Genbank
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
Wo_B_Bogor_wsp
Wo_JN315982_wsp
TTGGTCCAATAAGTGATGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG
----------------TGAAGAAACTAGCTACTATGTTCGTTTGCAATATAATGGTGAAG
********************************************
TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA
TTTTACCTTTTAAAACAAGGATTGATGGTGTTACATATAAATCAGGTAAGGACAGCAATA
************************************************************
GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA
GTCCCTTAAAAGCATCTTTTCTAGCTGGAGGTGGTGCATTTGGTTATAAAATGGATGATA
************************************************************
TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA
TCAGGGTTGATGTTGAAGGACTTTACTCACAATTGAGTAAAGATGCAGATGTAGTAGATA
************************************************************
CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG
CTTCTCCAGCAGTTGTAGAAAGTTTAACAGCATTTTCAGGACTAGTTAATGTTTATTACG
************************************************************
ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT
ATATAGCAATTGAAGATATGCCTATCACTCCATATGTTGGTGTTGGTGTTGGTGCAGCGT
************************************************************
ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG
ATGTAAGCAATCCTTTAGTAACAGAGGTTACTGGTGATAAAAAATCTGGATTTGGTTTTG
************************************************************
CTTATCAAGCAAAAGCTGGTA--------------------------------------CTTATCAAGCAAAAGCTGGTGTTAGTTATGATGTAACTCCAGAAATCAAGCTTTATGCTG
********************
-----------------------------------------------------------GTGCTCGTTATTTTGGTTCTTATGGTGCTAATTTTGGTAAGACAGCTAAAGATGATGGCG
----------------------------------------GAATCAAAGTTCTTTACAGCACTGTCGGTGCAGAAGCTGGA 565
60
44
120
104
180
164
240
224
300
284
360
344
420
404
441
464
524
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 14 Maret 1991, sebagai putra
kedua dari empat bersaudara dari pasangan Tri Warsono dan Sri Wahyuningsih.
Penulis memiliki seorang kakak laki-laki dan dua orang adik perempuan bernama
Septian Ady Nugraha, Malinda Wahyu Rahmawati, dan Malinda Wahyu Utami.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Sragen,
Jawa Tengah pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama setelah lulus diterima di
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Seleksi Mandiri IPB (USMI).
Selama menjadi mahasiswa penulis aktif mengikuti berbagai lembaga
kemahasiswaan seperti Klub Cybertron Asrama TPB sebgai staff tahun 2010, Uni
Konservasi Fauna sebagai staff Divisi Konservasi Serangga tahun 2011. Wakil
Ketua Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman tahun kepengurusan 2011/2012
dan sebagai Kepala Divisi Keprofesian tahun kepengurusan 2012/2013. Anggota
Entomologi Club pada tahun 2012, anggota Organic Farming Club tahun 2012, dan
Ketua Paguyuban Mahasiswa Sragen di Bogor tahun kepengurusan 2011/2012.
Prestasi yang sempat diraih penulis selama masa studi yaitu menjadi wakil
Departemen Proteksi Tanaman pada acara Syngenta Conection Program bersama
mahasiswa Australia di Malang pada tahun 2011, penerima besiswa Tanoto
National Champion Scholarship pada tahun 2011, ketua Program Kreatifitas
mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat didanai Dikti tahun 2012, juara I lomba
cerdas cermat Entomologi tingkat nasional pada tahun 2012, berkesempatan
mengikuti Training in Biological Control di Universitas Tsukuba Jepang dan
Training in Rapid Biodiversity Assessment bersama Universitas Vienna di
Kepulauan Kraktau pada tahun 2013.
Penulis juga aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Biologi Patogen
pada semester genap tahun ajaran 2010/2011, Entomolgi Umum pada semester
ganjil tahun ajaran 2011/2012, dan Dasar-Dasar Proteksi Tanaman pada semester
genap tahun ajaran 2011/2012.