Deteksi dan Keragaman Molekuler Virus Newcastle Disease yang Bersirkulasi di Beberapa Wilayah Aceh
DETEKSI DAN KERAGAMAN MOLEKULER VIRUS
NEWCASTLE DISEASE YANG BERSIRKULASI DI
BEBERAPA WILAYAH ACEH
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Deteksi dan keragaman
molekuler virus Newcastle Disease yang bersirkulasi di beberapa wilayah Aceh
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Muhammad Daud Aiyub Kadir
NIM B253124011
RINGKASAN
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR. Deteksi dan keragaman molekuler virus
Newcastle Disease yang bersirkulasi di beberapa wilayah Aceh. Dibimbing oleh
SURACHMI SETIYANINGSIH dan IDWAN SUDIRMAN.
Newcastle Disease (ND) adalah penyakit menular yang sangat merugikan
bagi industri peternakan unggas. Penyakit ND masih endemik di Indonesia
termasuk Aceh. Diagnosis ND di Aceh umumnya masih berdasarkan gejala klinik,
patologik maupun secara serologik. Kajian virologik yang dilakukan pada
penelitian terdahulu membuktikan tingginya prevalensi infeksi virus ND pada
ayam kampung di Aceh sedangkan kajian infeksi ND pada unggas lain masih
belum dilakukan.
Tujuan penelitian ini adalah 1) melihat keragaman isolat virus, 2)
mendeteksi dan mengisolasi virus pada ayam buras dan unggas air, 3)
mengidentifikasi dan mengkarakterisasi virus secara serologi dan molekuler.
Pengambilan sampel dilakukan di penampungan maupun pasar unggas yang
tersebar di 12 kecamatan dalam wilayah Kabupaten Aceh Besar dan Kota Banda
Aceh. Sampel usap orofaring dan kloaka dikoleksi dari 35 ekor bebek dan 106
ekor ayam peternakan (broiler, layer dan ayam Arab). Real-time Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR) dengan target gen matrix
dari virus ND digunakan untuk uji skrining terhadap sampel pool yang terdiri dari
5-6 sampel. Sampel-sampel individu yang terpilih berdasarkan jenis unggas,
sampel dan lokasi di inokulasi pada telur ayam embrio (SPF) untuk isolasi virus.
Keanekaragaman genetik isolat-isolat virus ND di uji dengan menggunakan realtime dan konvensional gel-elektroforesis RT-PCR terhadap gen fusion; 69 isolat
VND asal ayam kampung yang diperoleh dari hasil penelitian terdahulu dalam
waktu dan area studi yang sama juga dikutsertakan dalam analisis ini.
Infeksi virus ND dideteksi pada 15 (54%) pool sampel usap orofaring dan
21 usap kloaka sebanyak 15 pool (54%) dan swab kloaka sebanyak 21 pool
(75%). Hasil inokulasi masing-masing sampel individu dari pool positif
menghasilkan 15 isolat VND. Sebelas dari 15 isolat tersebut digolongkan sebagai
virus virulen dan empat virus avirulent berdasarkan identifikasi dengan rRT-PCR
gen fusion. Seekor bebek yang nampak sehat mampu mekskresikan virus ND
virulen melalui orofaring dan kloaka, sementara sebagian besar ayam umumnya
mengeluarkan virus virulen melalui orofaring. RT-PCR konvensional dengan
target gen fusion berhasil mengamplifikasi ke 15 isolat tersebut. Penentuan
patotipe menggunakan rRT-PCR terhadap 69 isolat VND ayam kampung
menggolongkan 57 isolat sebagai VND virulen dan 12 isolat avirulent. VND.
Enam isolat dari masing-masing patotipe VND tersebut tidak bisa dideteksi oleh
RT-PCR konvensional. Hal ini menunjukkan adanya keragaman genetik dari
VND yang bersirkulasi pada ayam kampung.
Penelitian ini secara umum mengkonfirmasi adanya infeksi VND pada
bebek dan beberapa ayam ras di beberapa wilayah Aceh dan infeksinya bisa
bersifat subklinik. Metode RT-PCR konvensional maupun realtime dapat
digunakan untuk tujuan deteksi dan identifikasi virus ND; tetapi, adanya
keragaman genom VND bisa mengakibatkan perlunya pengembangan uji
diagnostik berbasis PCR yang lain. Virus ND yang bersirkulasi pada ayam
kampung pada umumnya lebih beragam secara genetik dari pada virus ND yang
diisolasi dari jenis unggas lain. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
membuktikan keanekaragaman VND yang bersirkulasi di Aceh.
Kata kunci: Newcastle disease, RT-PCR, rRT-PCR, virulensi, keragaman
antigenik.
SUMMARY
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR. Molecular Detection and
Characterization of Newcastle Disease Virus Isolates Circulating in Areas of
Banda Aceh and Aceh Besar. Under the direction of SURACHMI
SETIYANINGSIH and IDWAN SUDIRMAN.
Newcastle Disease is one of the most contagious and economically
devastating diseases to poultry industries. The disease is endemic in Indonesia,
including Aceh where diagnosis is mainly based on clinical symptoms,
pathological and serological findings. A recent virological study confirms the high
prevalence of NDV infection among kampong chicken in Aceh whereas ND
investigation in other types of birds is lacking.
The objectives of this study were: 1) to detect the presence of NDV in
waterfowls and commersial chickens; 2) to isolate and characterize NDV by
serological and molecular methods, and 3) to assess the diversity of the NDV
isolates.
Sampling was done in poultry collecting fascilities and live bird markets
located in 12 subdistricts within area of Aceh Besar and Banda Aceh. Swabs of
cloacal and oropharynx were collected from a total of 35 ducks and 106 farmed
chickens (broiler, layer, and arab breeds). A real-time reverse transcription
polymerase chain reaction (rRT-PCR) targeting the matrix gene of NDV was used
to screen pools of 5–-6 samples. Selected individual samples representing type of
birds, sample, and location were propagated in embryonated SPF chicken eggs for
virus isolation. The genetic diversity of NDV isolates was examined using realtime and gel-based RT-PCRs of fusion gene; 69 NDV isolates from kampong
chicken obtained in the earlier study at the same time and location were included
in this analysis.
NDV infection were detected in 15 (54%) pools of oropharingeal and 21
(75%) pools of cloacal swabs. Egg inoculation of individual samples from
positives pools yielded 15 NDV isolates. Of the 15 isolates, 11 were virulent
viruses and 4 were avirulent viruses identified by rRT-PCR fusion. An apparantly
healthy duck shed virulent virus from oropharinx and cloaca, while majority of
chickens shed virulent NDV from oropharinx.
The fusion gene fragment targeted by the conventional RT-PCR were
successfully amplified from all of the 15 isolates. On the other hand, the rRT-PCR
based pathotyping of 69 kampong chicken isolates identified 57 virulent and 12
avirulent NDVs. Six isolates from each of the two pathotypes were not recognized
by the conventional RT-PCR. This finding indicated genetic diversity existed
among NDVs circulating in kampong chicken.
In conclusion this study confirms the NDV infection in ducks and some
non-native chickens in Aceh areas and that the infection can be subclinical. The
conventional and real-time RT-PCR methods described could be used to detect
and identify NDVs; however, the diverse nature of NDV genome may lead to the
development of PCR based diagnostic test. In general, the NDVs circulating
among kampong chicken were more genetically diverse than the viruses isolated
from other type of birds. Further study is needed to elucidate the diversity of the
circulating NDV in Aceh.
Keywords: Newcastle Disease, RT-PCR, rRT-PCR, virulence, antigenic diversity.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI DAN KERAGAMAN MOLEKULER VIRUS
NEWCASTLE DISEASE YANG BERSIRKULASI DI
BEBERAPA WILAYAH ACEH
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi Medik
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi Ujian Tesis : Prof. Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Penelitian
Nama
NRP
Program studi
: Deteksi dan Keragaman Molekuler Virus Newcastle
Disease yang Bersirkulasi di Beberapa Wilayah Aceh
: Muhammad Daud Aiyub Kadir
: B 253124011
: Mikrobiologi Medik
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Drh. Surachmi Setiyaningsih, P.hD
Ketua
Dr. Drh. H. Idwan Sudirman
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi Medik
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Sekretaris Program Magister
Prof. Dr. Drh. Fachriyan H. Pasaribu
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian Tesis: 28 Agustus 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wata’ala atas
segala karunia dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan penyusunan tesis
penelitian yang berjudul “Deteksi dan Keragaman Molekuler Virus Newcastle
Disease yang Bersirkulasi di Beberapa Wilayah Aceh”, di susun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelan Magister Sains pada Program Studi
Mikrobiologi Medik (MKM), Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih sebesar-besarnya atas doa, bimbingan, dukungan dan
bantuan dalam penyelesaian tesis ini penulis sampaikan kepada:
1. Drh. Surachmi Setiyaningsih, P. hD. Ketua komisi pembimbing dan Dr. drh.
Idwan Sudirman. Anggota komisi pembimbing.
2. Prof. Dr. Drh. Fachriyan Hasmi Pasaribu. Ketua program studi pascasarjana
Mikrobiologi Medik dan Dr. drh. Agustin Indrawati, M. Biomed. Sekretaris
program studi pascasarjana Mikrobiologi Medik.
3. Prof. Dr. Drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS. Penguji luar komisi
pembimbing.
4. Prof. Dr. Drh. Retno D. Soejoedono, MS. Ketua laboratorium terpadu
program studi Mikrobiologi Medik FKH IPB. Dr. Drh. Sri Murtini, M. Si,
Drh. Ni Luh P. Ika M. P. hD, Dr. Drh. Okti Nadia Poetri, M. Si. M. Sc, drh.
Titiek Sunartatie, MS, Mba Adeh Isnawati, SE, Mba Roselyn Syaferina,
Amd, Mas Wahyu, Pak Nur dan Pak Ujang. Staff laboratorium terpadu
Mikrobiologi FKH IPB.
5. Drh. Darniati, M.Si, Drh. Aprizal Panus, M. Si, Pupimadita Tizar Audora,
S.Si, M.Si, Drh. Maya Shofa, teman-teman MKM 2012, 2013, 2014, dan
Ikatan Mahasiswa Pascasarjana Aceh (IKAMAPA) Bogor.
6. Ibunda tercinta Rosdiana, Ayahanda Aiyub AK, Kakanda M. Ya’kub,
Zulkifli, Adinda Munadhillah dan M. Rifqi.
Semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Muhammad Daud Aiyub Kadir
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
v
DAFTAR GAMBAR
v
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
7
7
2
TINJAUAN PUSTAKA
Newcastle Disease (ND)
Perubahan Patologis Infeksi Newcastle Disease
Epidemiologi dan Transmisi Virus
Etiologi dan Sifat Virus
Patogenisitas dan Virulensi
Keragaman Antigenik virus ND
Keragaman Genetik virus ND
Teknik Diagnostik
Real time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
4
4
4
5
6
8
9
9
10
11
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan alat
Metode Penelitian
12
12
12
13
ANALISIS DATA
15
HASIL DAN PEMBAHASAN
16
Deteksi dan Isolasi Virus ND dengan real time RT-PCR
16
Deteksi virus ND dengan RT-PCR konvensional
18
SIMPULAN DAN SARAN
24
DAFTAR PUSTAKA
25
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL
Table 1 Sampel virus ND pada usap kloaka dan orofaring ................................ 3
Table 2 Hasil deteksi dan isolasi dengan realtime RT-PCR ............................. 16
Table 3 Pengelompokan virus berdasarkan RT-PCR dan rRT-PCR ................ 21
DAFTAR GAMBAR
Perubahan PA yang terinfeksi virus ND. ............................................................ 5
Susunan Genom NDV ........................................................................................ 8
Hasil amplifikasi gen matrix sampel positif real time PCR ............................. 17
Hasil amplifikasi RT-PCR produk 991 bp (marker 100 bp) ............................. 19
Uji HI menggunakan serum B1 dan Komarov menunjukkan variasi
afinitas titer antibodi antara dua serum 4 Log2 dan 5 Log2 ............................. 22
Penyebaran VND di beberapa wilayah di Aceh pada ayam kampung dan
unggas lain ........................................................................................................ 23
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Newcastle disease (ND) atau di Indonesia dikenal sebagai penyakit tetelo
merupakan penyakit yang bersifat menular dan sangat penting di industri
peternakan. Secara ekonomi, penyakit ini sangat merugikan karena dapat
menyebabkan kematian mencapai 100% pada semua jenis unggas terutama ayam,
baik ayam ras maupun buras (Tabbu 2003) sehingga Organisasi Kesehatan Hewan
Dunia (OIE) memasukkan penyakit ini dalam kategori notifiable diseases
(Epidemiological Major Disease) (Alexander 2000).
Virus merupakan virus RNA beramplop yang dengan asam inti berutas
tunggal, berpolaritas negatif dan tidak bersegmen. Panjang genomnya berkisar
15.186-15.192 nukleotida yang menyandi enam polipeptida yakni Nukleokapsid
Protein (Fazel et al.), Phospoprotein (P), Matrix (M), Fusion (F), HemaglutininNeuraminidase (HN) dan RNA polymerase (L) dengan susunan 3'-NP-P-M-FHN-L-5' (De Leeuw et al. 1999). Amplop virus ND terdiri atas dua glikoprotein,
yakni HN dan F yang berperan amat penting dalam proses infeksi. Protein HN
memediasi terjadinya perlekatan virus dengan sel inang, sedangkan protein F
berfungsi untuk penetrasi virus ke dalam sel inang dan berperan dalam
pembentukan sinsitia pada sel yang terinfeksi (Wakamatsu et al. 2006).
Secara genetik maupun antigenitas, virus ND masih sangat beragam.
Analisis secara filogenetik (kekerabatan), virus ND diklasifikasikan menjadi 2
divisi; yaitu kelas 1 (yang menyerang unggas air dan terdiri dari golongan virus
bervirulensi rendah) terdiri dari 9 genotipe, dan Kelas 2 (yang menyerang unggas
darat dan terdiri dari virus bervirulensi tinggi/ganas) yang terdiri 10 genotipe (Xie
et al. 2012). Sedangkan klasifikasi berdasar serotipe mengacu pada protein HN
dengan melakukan HA/HI test, di mana ND hanya punya 1 serotipe. Sementara
berdasar patotipe mengacu pada virulensi atau tingkat keganasan (Tabbu
2003). Dari 10 genotipe virus ND kelas 2 (1-10), genotipe yang paling awal
ditemukan adalah genotipe 1, 2, 3, 4 dan 9 pada tahun 1930-1960. Setelah tahun
1960, genotipe 5, 6, 7, 8, dan 10 ditemukan. Dan pada tahun 2011
ditemukankanlah isolat baru NDV dari Madagaskar, yaitu genotipe 11
(Maminiaina et al. 2010). Genotipe 2 termasuk virus ND virulensi rendah yang
digunakan sebagai galur vaksin, yaitu virus LaSota, B1 dan VG/GA. Kemudian,
muncul pendapat bahwa vaksin yang banyak beredar di Indonesia umumnya
dibuat dengan isolat virus La Sota dan Hitchner B1 asal Amerika yang tergolong
ke dalam genotipe 2 tersebut. Sementara itu, isu yang berkembang menyebutkan
bahwa dari kasus ND sepanjang tahun 2009-2011 yang dominan terjadi di
Indonesia saat ini, disebabkan oleh virus ND genotipe 7 (Lomniczi et al. 1998).
Di Indonesia, wabah ND pertama sekali dilaporkan terjadi di Jawa oleh
Kraneveld pada tahun 1926 dan Newcastle Upon-Tyne oleh Doyle tahun 1927,
sekarang menjadi penyakit endemik di berbagai daerah dan menyebar dengan
cepat ke belahan dunia (Saepulloh et al. 2005). Di Aceh, ND masih merupakan
penyakit klasik diantara penyakit pernafasan lain yang sering menyerang unggas
2
seperti Chronic Respiratory Disease Infectious bursal disease (IBD), Pullorum,
Kolera, dan beberapa kasus Avian influenza (AI). Dan pada beberapa lokasi
peternakan rakyat di Kecamatan dalam wilayah Aceh Besar, dilaporkan terjadi
kasus very virulent ND (vvND) sekitar 100 kasus di tiap kecamatannya (DISNAK
2012).
Sikuen dari gen penyandi genome virus dari berbagai negara sudah banyak
dilaporkan, namun sangat terbatas informasi tentang sikuen gen isolat asal
Indonesia (Adi et al. 2011). Laporan terakhir mengenai isolasi virus ND di
Indonesia adalah tahun 2009, yang di kenal sebagai isolat NDV/Bali-1/07 dan
tergolong strain velogenik. Sedangkan yang terbaru adalah strain
Banjarmasin/010/10 dan Sukorejo/019/10 dan merupakan isolat Indonesia asal
ayam mempunyai sekuen genom yang lengkap (Xiou et al. 2012).
Seringnya terjadi kasus tersebut disebabkan oleh sistem pemasaran melalui
pengepul dan sistem pemeliharaan yang masih tradisional, dimana unggas yang
diumbar mempermudah terjadinya penularan penyakit karena tingginya kontak
langsung atau tidak langsung antar unggas. Meskipun upaya vaksinasi dan
pengawasan lalu lintas unggas telah dilakukan, namun kasus ND masih
dilaporkan terjadi akibat antigenitas vaksin yang digunakan tidak protektif pada
unggas (Sa'idu et al. 2008). Untuk itu diperlukan pemilihan galur vaksin dan
metode vaksinasi yang tepat untuk menanggulangi infeksi ND dengan mengetahui
tingkat virulensi antigenitas dan genesitas virus lapangan.
Belakangan ini, metode diagnosis yang berbasis pendekatan biologi
molekuler telah menjadi alternatif yang dapat diandalkan. Salah satu metode
diagnosis berbasis molekuler yang dapat dikembangkan untuk melacak infeksi
virus ND pada unggas terinfeksi adalah teknik reverse transcriptase-polymerase
chain reaction (rRT-PCR) dan sequencing (Sinkovics et al. 2000). Penggunaan
teknologi sequencing ini berhasil menunjukkan variasi genetik virus ND
dilapangan sehingga dapat dibuat phylogenetic tree untuk melihat kekerabatan
isolat virus tersebut (Alexander et al. 2008).
Perumusan Masalah
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya diketahui isolat VND asal ayam
kampung yang bersikulasi di Aceh mengindikasikan adanya keragaman, baik
antigenik maupun genetik, karenanya perlu dilakukan pengujian lanjutan untuk
memastikan keragaman tersebut, serta melengkapinya dengan menambahkan
isolat dari unggas lain.
3
Table 1 Sampel virus ND pada usap kloaka dan orofaring
Kabupaten
Aceh Besar
Kecamatan
Ingin Jaya
Suka
makmur
Darul Imarah
Ulee Kareng
Indrapuri
Montasik
Blang Bintang
Banda Aceh
Kuta Alam
Lokasi
Pengepul
Pengepul
Jenis
Bebek
Entok
Jumlah
5
5
Pasar
Pasar
Pengepul
Pengepul
Peternakan
Peternakan
Peternakan
Pengepul
Pengepul
RPU
RPU
RPU
Layer
Broiler
Entok
Bebek
Layer
Layer
Broiler
Bebek
Entok
Layer
Broiler
Ayam
Arab
5
15
5
5
21
15
20
10
5
5
15
10
Total
141
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman VND
yang bersirkulasi di Aceh pada unggas hidup. Secara khusus meliputi: deteksi dan
isolasi VND (ayam buras dan unggas air), identifikasi dan karakterisasi virus
berdasarkan sifat fisik, serologik, dan molekuler.
Manfaat Penelitian
1.
2.
Memberikan informasi tentang karakter dan keragaman virus ND yang
bersirkulasi di wilayah Aceh.
Masukan untuk pengendalian ND di Aceh.
Ruang Lingkup Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan serangkaian kegiatan berupa koleksi sampel
usapan orofaring dan kloaka dari ayam kampung, ayam ras (ayam Arab, broiler,
layer), dan unggas air (itik, entok) di kabupaten Aceh Besar dan kota Banda Aceh,
menggabungkan (pooling) sampel, mengekstraksi RNA virus, mendeteksi dengan
rRT-PCR matriks, mengisolasi virus pada telur ayam berembrio specific pathogen
free (SPF), mengidentifikasi pertumbuhan VND dengan uji haemaglutinasi (HA)
dan rRT-PCR, serta mengkarakterisasi virus dengan uji haemaglutination
inhibition (HI), rRT-PCR Fusion, dan RT-PCR.
4
Hipotesis Penelitian
Virus ND yang di beredar wilayah Aceh beragam, baik secara antigenik dan
genetik.
TINJAUAN PUSTAKA
Newcastle Disease (ND)
Berdasarkan keparahan penyakit secara klinis strain NDV diklasifikasikan
menjadi 5 tipe (OIE 2012): Viscerotropic velogenic; sebuah bentuk yang sangat
patogen dimana lesi perdarahan usus sering terlihat, Neurotropic velogenic;
memperlihatkan kematian tinggi, biasanya diikuti gejala pernapasan dan saraf
Mesogenic: bentuk yang memperlihatkan gejala pernafasan, kadang-kadang gejala
saraf tetapi tingkat kematian yang rendah. Lentogenic; bentuk yang
memperlihatkan infeksi ringan dan subklinis. Asymptomatic; bentuk yang
biasanya terdiri dari infeksi enterik subklinis. Gejala klinis yang muncul pada
penyakit ND bervariasi tergantung dari strain virus dan spesies unggas yang
diinfeksi. Virus ND galur lentogenik memiliki gejala klinis yang bersifat ringan,
tidak menimbulkan kematian pada unggas dewasa dan biasanya banyak digunakan
sebagai vaksin (Alexander 2000).
Perubahan Patologis Infeksi Newcastle Disease
Lesi yang signifikan sering ditemukan pada unggas yang terinfeksi oleh
strain velogenik. kepala atau daerah periorbital membengkak, dan jaringan
interstisial pada leher mengalami edematous, terutama didekat toraks. Kongesti/
hemoragi terlihat pada faring bagian bawah dan mukosa trakeal, dan dipteritis
membran pada oroparing, trakea dan esophagus. Pada mukosa proventrikulus
dapat ditemukan Ptechie dan echimosa kecil. Hemoragi, ulcer, edema dan/atau
nekrosis sering terjadi di seka tonsil dan jaringan limfoid di usus (termasuk
peyer’s patches). Perubahan patologi anatomi ditandai dengan adanya ptechie
pada proventrikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, trakea, dan paru-paru
merupakan perubahan patognomonis pada penyakit ND (Kencana et al. 2012).
Limpa membengkak, rapuh dan berwarna merah kehitaman atau belangbelang. Kerusakan limposit dapat terlihat pada daerah kortikal dan germinal limpa
dan timus.Nekrosis pada pankreas dan edema pada paru-paru dapat ditemukan
pada beberapa unggas. Edematous pada ovarium atau atau atropi dan hemoragi,
beberapa burung, terutama yang mati mendadak biasanya lesi yang terlihat hanya
sedikit atau tidak ada lesi sama sekali(Piacenti et al. 2006, Alexander, Senne
2008). Pada ayam yang terinfeksi dengan strain tidak virulen, lesi yang muncul
hanya kongesti dan ada eksudat pada organ pernafasan, kantung hawa yang
menebal dan kehitaman. Gejala yang lebih parah dapat terlihat jika disertai infeksi
sekunder. Gejala infeksi awal biasanya terjadi gangguan pernapasan dan 1 atau 2
hari berikutnya terjadi kelumpuhan kaki, sayap dan tortikolis leher (Kommers
2001).
5
A
B
Gambar 1 Perubahan PA yang terinfeksi virus ND.
A. Hemoragi pada proventikulus (VVND)
B. Hemoragi dan nekrosis pada saluran gastrointestinal (VVND)
(Cattoli et al. 2011)
A
B
Gambar 2 Gejala klinis ayam yang yang terinfeksi virus ND.
A. Cairan eksudat dari saluran pernafasan (VVND).
B. Konjuntivitis dan udema pada kelopak mata (VVND)
(Cattoli et al. 2011)
Nama lain untuk New Castle Disease (ND) adalah tetelo, pseudovogolpest,
sampar ayam, Rhaniket, Pneumoencephalitis dan Tontaor furrens. Newcastle
Disease dipandang sebagai salah satu penyakit penting di bidang perunggasan.
Kejadian wabah penyakit ND seringkali terjadi pada kelompok ayam yang tidak
memiliki kekebalan atau kekebalan rendah akibat terlambat divaksin atau karena
kegagalan program vaksinasi.
Epidemiologi dan Transmisi Virus
Pada umumnya virus ND menyerang unggas seperti ayam, itik, angsa,
merpati, betet, dan beberapa jenis burung lainnya. Sekitar 236 spesies burung
memiliki catatan dapat diisolasi virus ND dan ayam dianggapspesies unggas yang
paling rentan terhadap infeksi. Burung air dianggap paling tahan terhadap infeksi,
umumnya virus yang terisolasi dari burung air memiliki patogenisitas sangat
rendah terhadap unggas domestik. Beberapa virulensi rendah isolat dari unggas air
6
yang bermigrasi di Amerika Serikat digunakan komersial vaksin strain B1 dan La
Sota (EFSA 2007).
Transmisi virus ND dapat terjadi melalui inhalasi dan ingesti. Virus dapat
disebarkan oleh hewan atau media yang berkontak langsung dengan unggas yang
sensitif. Penularan virus ND dapat terjadi secara langsung antar ayam dalam satu
kelompok ternak. Sumber virus berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik melalui
pakan, air minum, lendir, feses, maupun udara yang tercemar virus, peralatan dan
pekerja kandang. Virus ND dapat ditularkan melalui pernafasan atau pencernaan.
Unggas Gallinaceous mengeluarkan virus 1-2 minggu setelah terinfeksi. Pada
suhu diatas 1-2o C virus masih bertahan pada kulit ayam selama 60 hari dan dalam
sum-sum tulang dapat bertahan hingga 200 hari .
Penularan virus dari ayam terinfeksi tergantung pada tempat replikasi dari
virus. Ayam yang menunjukkan gejala pernafasan mengeluarkan udara yang
mengandung virus dan menginfeksi ayam lain melalui inhalasi. Virus ND yang
bereplikasi dalan saluran pencernaan mengeluarkan virus melalui feses. Penularan
virus dapat terjadi melalui oral akibat ingesti dari feses yang mengandung virus,
makanan dan minuman yang tercemar atau melalui inhalasi karena terhirup virus
dari feses yang telah kering (Tabbu 2003).
Etiologi dan Sifat Virus
Newcastle Disease (ND) adalah penyakit viral yang disebabkan oleh
Paramyxovirus tipe A, genus Avulavirus, ordo Mononegaverales dan tergolong
virus ssRNA, total genom mengandung 16.000 nukleotida dan replikasinya di
dalam sitoplasma sel hospes.Virus ini dapat diinaktifkan dengan pemanasan 56 oC
selama 3 jam dan 60 oC selama 30 menit, pada pH asam, sensitif terhadap eter,
formalin dan fenol, namun virus ND dapat bertahan hidup pada temperatur
lembab terutama di dalam feses ayam (Aldous dan Alexander 2001). ND adalah
penyakit viral bersifat menular dan fatal menyerang semua spesies unggas. Gejala
klinis sangat bervariasi tergantung pada strain virus, spesies, umur burung,
penyakit sekunder dan imunitas tubuh. Berdasarkan gejala klinik ND terbagi
dalam 5 golongan utama yaitu Velogenik Viserotropik, Velogenik Neurotropik,
Mesogenik, Lentogenik, dan Asimtomatik (OIE 2012).
Di Indonesia ND menyebar ke berbagai daerah baik di Jawa maupun diluar
Jawa. Saat ini hampir seluruh wilayah Indonesia merupakan daerah tertular dan
belum ada satu daerah yang bebas dari penyakit ND (Tarmudji 2005). Serangan
penyakit ND umumnya mulai meningkat pada awal musim hujan dan mencapai
puncaknya pada pertengahan musim atau pada saat peralihan dari musim hujan
ke musim kemarau.
Virus ND mampu menggumpalkan eritrosit, mudah mati di bawah sinar
ultraviolet dan dalam keadaan sekitar yang tidak stabil, rentan terhadap zat-zat
kimia, seperti kaporit, besi, klor dan lain-lain. Desinfektan yang peka untuk ND,
antara lain NaOH 2%, Formalin (1- 2%), Phenol-lisol 3%, alkohol 95 dan 70%,
fumigasi dengan Kalium permanganat (PK) 1 : 5000. Aktivitas ND hilang pada
suhu 100 oC selama satu menit dan mati pada suhu 56 oC selama lima menit
sampai lima jam, pada suhu 37 oC selama berbulan-bulan. Virus ND stabil pada
pH 3 - 11. Masa inkubasi penyakit ND adalah 2-15 hari, dengan rata-rata 6 hari.
Ayam yang tertular virus ND mulai mengeluarkan virus melalui alat pernapasan
7
antara 1 sampai dengan 2 hari setelah infeksi. Infeksi oleh virus ND alami yang
tidak menyebabkan kematian menimbulkan kekebalan selama 6-12 bulan,
demikian juga halnya kekebalan yang diperoleh dari vaksinasi (Jestin dan Jestin
1991).
Genom virus ND mempunyai enam “Open Reading Frames” yang
mengkode nucleocapsid protein, beberapa molekul fospoprotein (P), matrix
protein (M), fusion protein (F), tiga protein inti dan tiga protein amplop termasuk
dua glikoprotein besar hemaglutinin-neuraminidase (HN) dan large RNA-directed
RNA polymerase (L). Selain itu terdapat non-structural protein (V) dan second
protein (W) yang dihasilkan pada saat pengubahan RNA pada proses transkripsi
gen P (Oberdorfer dan Werner 1998). Dari ke enam protein tersebut hanya dua
jenis protein yang mempunyai peranan dalam proses kekebalan yaitu protein F
dan HN karena dapat merangsang pembentukan antibodi protektif (Cho et al.
2008). Fusion protein (precursor F glycoprotein) berperan penting pada saat virus
menginfeksi sel inang, karena protein ini dapat terpecah menjadi ‘trypsin-like
enzyme’ yang dapat memperantarai fusi antara virus dengan membran sel inang
target sehingga enzim ini dapat membantu virus masuk ke dalam sel inang (Rout
2007). Pembelahan protein F secara langsung dikaitkan dengan virulensi virus
secara in vivo. Kandungan residu tinggi asam amino pada F0 cleavage site
dikaitkan dengan virulensi (Huang 2004). Hemaglutinin-neuraminidase (HN)
adalah immunoprotective glycoprotein (immunogenic determinant) yang berperan
sebagai antigen permukaan amplop partikel virus ND. Protein M, F dan HN
berada pada amplop virus. F dan HN memperantarai masuk dan keluarnya virus
dari sel dan M berperan pada morphogenesis dan budding virus ND. NP
memperantarai enkapsidasi genom RNA membentuk nukleokapsid yang menjadi
template untuk transkripsi dan replikasi virus. Protein P penting untuk sintesis
RNA virus dan membentuk komplek terpisah dengan NP dan L protein dan
nukleokapsid (EFSA 2007).
8
Gambar 3 Susunan Genom NDV
NP=nukleoprotein, P=phosphoprotein, M=protein matriks, F=protein fusi,
HN=hemagglutinin-neuraminidase, L=RNA dependent RNA polymerase, V
dan W = protein non struktural (Yusoff et al. 2001, Panda 2003)
Patogenisitas dan Virulensi
Patogenisitas virus ND dapat diketahui dengan beberapa uji : 1). mean
death time (MDT) pada embrio ayam, 2) intracerebral pathogenicity index (ICPI)
pada anak ayam umur 1 hari, 3). intravenous pathogenicity index (IVPI) pada
anak ayam umur 6 minggu. Virus ND dari telur berembrio dan spesimen lapangan
dapat diidentifikasi menggunakan Reverse Trancription Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR), gene sequencing, analisis enzim restriksi (restriction enzyme
analysis) (OIE 2012).
Metode uji secara in vivo untuk menilai virulensi virus yaitu:
Biologis
1. Mean death time (MDT) pada telur ayam berembrio (Tabbu).Mean death
timeadalah waktu kematian embrio diukur dalam jam setelah TAB diinokulasi
virus (jika embrio mati kurang dari 60 jam diklasifikasi sebagai velogenik;
jika embrio hidup lebih dari 90 jam diklasifikasi sebagai lentogenik dan jika
embrio mati diantara 60
NEWCASTLE DISEASE YANG BERSIRKULASI DI
BEBERAPA WILAYAH ACEH
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Deteksi dan keragaman
molekuler virus Newcastle Disease yang bersirkulasi di beberapa wilayah Aceh
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Muhammad Daud Aiyub Kadir
NIM B253124011
RINGKASAN
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR. Deteksi dan keragaman molekuler virus
Newcastle Disease yang bersirkulasi di beberapa wilayah Aceh. Dibimbing oleh
SURACHMI SETIYANINGSIH dan IDWAN SUDIRMAN.
Newcastle Disease (ND) adalah penyakit menular yang sangat merugikan
bagi industri peternakan unggas. Penyakit ND masih endemik di Indonesia
termasuk Aceh. Diagnosis ND di Aceh umumnya masih berdasarkan gejala klinik,
patologik maupun secara serologik. Kajian virologik yang dilakukan pada
penelitian terdahulu membuktikan tingginya prevalensi infeksi virus ND pada
ayam kampung di Aceh sedangkan kajian infeksi ND pada unggas lain masih
belum dilakukan.
Tujuan penelitian ini adalah 1) melihat keragaman isolat virus, 2)
mendeteksi dan mengisolasi virus pada ayam buras dan unggas air, 3)
mengidentifikasi dan mengkarakterisasi virus secara serologi dan molekuler.
Pengambilan sampel dilakukan di penampungan maupun pasar unggas yang
tersebar di 12 kecamatan dalam wilayah Kabupaten Aceh Besar dan Kota Banda
Aceh. Sampel usap orofaring dan kloaka dikoleksi dari 35 ekor bebek dan 106
ekor ayam peternakan (broiler, layer dan ayam Arab). Real-time Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR) dengan target gen matrix
dari virus ND digunakan untuk uji skrining terhadap sampel pool yang terdiri dari
5-6 sampel. Sampel-sampel individu yang terpilih berdasarkan jenis unggas,
sampel dan lokasi di inokulasi pada telur ayam embrio (SPF) untuk isolasi virus.
Keanekaragaman genetik isolat-isolat virus ND di uji dengan menggunakan realtime dan konvensional gel-elektroforesis RT-PCR terhadap gen fusion; 69 isolat
VND asal ayam kampung yang diperoleh dari hasil penelitian terdahulu dalam
waktu dan area studi yang sama juga dikutsertakan dalam analisis ini.
Infeksi virus ND dideteksi pada 15 (54%) pool sampel usap orofaring dan
21 usap kloaka sebanyak 15 pool (54%) dan swab kloaka sebanyak 21 pool
(75%). Hasil inokulasi masing-masing sampel individu dari pool positif
menghasilkan 15 isolat VND. Sebelas dari 15 isolat tersebut digolongkan sebagai
virus virulen dan empat virus avirulent berdasarkan identifikasi dengan rRT-PCR
gen fusion. Seekor bebek yang nampak sehat mampu mekskresikan virus ND
virulen melalui orofaring dan kloaka, sementara sebagian besar ayam umumnya
mengeluarkan virus virulen melalui orofaring. RT-PCR konvensional dengan
target gen fusion berhasil mengamplifikasi ke 15 isolat tersebut. Penentuan
patotipe menggunakan rRT-PCR terhadap 69 isolat VND ayam kampung
menggolongkan 57 isolat sebagai VND virulen dan 12 isolat avirulent. VND.
Enam isolat dari masing-masing patotipe VND tersebut tidak bisa dideteksi oleh
RT-PCR konvensional. Hal ini menunjukkan adanya keragaman genetik dari
VND yang bersirkulasi pada ayam kampung.
Penelitian ini secara umum mengkonfirmasi adanya infeksi VND pada
bebek dan beberapa ayam ras di beberapa wilayah Aceh dan infeksinya bisa
bersifat subklinik. Metode RT-PCR konvensional maupun realtime dapat
digunakan untuk tujuan deteksi dan identifikasi virus ND; tetapi, adanya
keragaman genom VND bisa mengakibatkan perlunya pengembangan uji
diagnostik berbasis PCR yang lain. Virus ND yang bersirkulasi pada ayam
kampung pada umumnya lebih beragam secara genetik dari pada virus ND yang
diisolasi dari jenis unggas lain. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
membuktikan keanekaragaman VND yang bersirkulasi di Aceh.
Kata kunci: Newcastle disease, RT-PCR, rRT-PCR, virulensi, keragaman
antigenik.
SUMMARY
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR. Molecular Detection and
Characterization of Newcastle Disease Virus Isolates Circulating in Areas of
Banda Aceh and Aceh Besar. Under the direction of SURACHMI
SETIYANINGSIH and IDWAN SUDIRMAN.
Newcastle Disease is one of the most contagious and economically
devastating diseases to poultry industries. The disease is endemic in Indonesia,
including Aceh where diagnosis is mainly based on clinical symptoms,
pathological and serological findings. A recent virological study confirms the high
prevalence of NDV infection among kampong chicken in Aceh whereas ND
investigation in other types of birds is lacking.
The objectives of this study were: 1) to detect the presence of NDV in
waterfowls and commersial chickens; 2) to isolate and characterize NDV by
serological and molecular methods, and 3) to assess the diversity of the NDV
isolates.
Sampling was done in poultry collecting fascilities and live bird markets
located in 12 subdistricts within area of Aceh Besar and Banda Aceh. Swabs of
cloacal and oropharynx were collected from a total of 35 ducks and 106 farmed
chickens (broiler, layer, and arab breeds). A real-time reverse transcription
polymerase chain reaction (rRT-PCR) targeting the matrix gene of NDV was used
to screen pools of 5–-6 samples. Selected individual samples representing type of
birds, sample, and location were propagated in embryonated SPF chicken eggs for
virus isolation. The genetic diversity of NDV isolates was examined using realtime and gel-based RT-PCRs of fusion gene; 69 NDV isolates from kampong
chicken obtained in the earlier study at the same time and location were included
in this analysis.
NDV infection were detected in 15 (54%) pools of oropharingeal and 21
(75%) pools of cloacal swabs. Egg inoculation of individual samples from
positives pools yielded 15 NDV isolates. Of the 15 isolates, 11 were virulent
viruses and 4 were avirulent viruses identified by rRT-PCR fusion. An apparantly
healthy duck shed virulent virus from oropharinx and cloaca, while majority of
chickens shed virulent NDV from oropharinx.
The fusion gene fragment targeted by the conventional RT-PCR were
successfully amplified from all of the 15 isolates. On the other hand, the rRT-PCR
based pathotyping of 69 kampong chicken isolates identified 57 virulent and 12
avirulent NDVs. Six isolates from each of the two pathotypes were not recognized
by the conventional RT-PCR. This finding indicated genetic diversity existed
among NDVs circulating in kampong chicken.
In conclusion this study confirms the NDV infection in ducks and some
non-native chickens in Aceh areas and that the infection can be subclinical. The
conventional and real-time RT-PCR methods described could be used to detect
and identify NDVs; however, the diverse nature of NDV genome may lead to the
development of PCR based diagnostic test. In general, the NDVs circulating
among kampong chicken were more genetically diverse than the viruses isolated
from other type of birds. Further study is needed to elucidate the diversity of the
circulating NDV in Aceh.
Keywords: Newcastle Disease, RT-PCR, rRT-PCR, virulence, antigenic diversity.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI DAN KERAGAMAN MOLEKULER VIRUS
NEWCASTLE DISEASE YANG BERSIRKULASI DI
BEBERAPA WILAYAH ACEH
MUHAMMAD DAUD AIYUB KADIR
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi Medik
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi Ujian Tesis : Prof. Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Penelitian
Nama
NRP
Program studi
: Deteksi dan Keragaman Molekuler Virus Newcastle
Disease yang Bersirkulasi di Beberapa Wilayah Aceh
: Muhammad Daud Aiyub Kadir
: B 253124011
: Mikrobiologi Medik
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Drh. Surachmi Setiyaningsih, P.hD
Ketua
Dr. Drh. H. Idwan Sudirman
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi Medik
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Sekretaris Program Magister
Prof. Dr. Drh. Fachriyan H. Pasaribu
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian Tesis: 28 Agustus 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wata’ala atas
segala karunia dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan penyusunan tesis
penelitian yang berjudul “Deteksi dan Keragaman Molekuler Virus Newcastle
Disease yang Bersirkulasi di Beberapa Wilayah Aceh”, di susun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelan Magister Sains pada Program Studi
Mikrobiologi Medik (MKM), Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih sebesar-besarnya atas doa, bimbingan, dukungan dan
bantuan dalam penyelesaian tesis ini penulis sampaikan kepada:
1. Drh. Surachmi Setiyaningsih, P. hD. Ketua komisi pembimbing dan Dr. drh.
Idwan Sudirman. Anggota komisi pembimbing.
2. Prof. Dr. Drh. Fachriyan Hasmi Pasaribu. Ketua program studi pascasarjana
Mikrobiologi Medik dan Dr. drh. Agustin Indrawati, M. Biomed. Sekretaris
program studi pascasarjana Mikrobiologi Medik.
3. Prof. Dr. Drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS. Penguji luar komisi
pembimbing.
4. Prof. Dr. Drh. Retno D. Soejoedono, MS. Ketua laboratorium terpadu
program studi Mikrobiologi Medik FKH IPB. Dr. Drh. Sri Murtini, M. Si,
Drh. Ni Luh P. Ika M. P. hD, Dr. Drh. Okti Nadia Poetri, M. Si. M. Sc, drh.
Titiek Sunartatie, MS, Mba Adeh Isnawati, SE, Mba Roselyn Syaferina,
Amd, Mas Wahyu, Pak Nur dan Pak Ujang. Staff laboratorium terpadu
Mikrobiologi FKH IPB.
5. Drh. Darniati, M.Si, Drh. Aprizal Panus, M. Si, Pupimadita Tizar Audora,
S.Si, M.Si, Drh. Maya Shofa, teman-teman MKM 2012, 2013, 2014, dan
Ikatan Mahasiswa Pascasarjana Aceh (IKAMAPA) Bogor.
6. Ibunda tercinta Rosdiana, Ayahanda Aiyub AK, Kakanda M. Ya’kub,
Zulkifli, Adinda Munadhillah dan M. Rifqi.
Semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Muhammad Daud Aiyub Kadir
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
v
DAFTAR GAMBAR
v
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
7
7
2
TINJAUAN PUSTAKA
Newcastle Disease (ND)
Perubahan Patologis Infeksi Newcastle Disease
Epidemiologi dan Transmisi Virus
Etiologi dan Sifat Virus
Patogenisitas dan Virulensi
Keragaman Antigenik virus ND
Keragaman Genetik virus ND
Teknik Diagnostik
Real time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
4
4
4
5
6
8
9
9
10
11
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan alat
Metode Penelitian
12
12
12
13
ANALISIS DATA
15
HASIL DAN PEMBAHASAN
16
Deteksi dan Isolasi Virus ND dengan real time RT-PCR
16
Deteksi virus ND dengan RT-PCR konvensional
18
SIMPULAN DAN SARAN
24
DAFTAR PUSTAKA
25
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL
Table 1 Sampel virus ND pada usap kloaka dan orofaring ................................ 3
Table 2 Hasil deteksi dan isolasi dengan realtime RT-PCR ............................. 16
Table 3 Pengelompokan virus berdasarkan RT-PCR dan rRT-PCR ................ 21
DAFTAR GAMBAR
Perubahan PA yang terinfeksi virus ND. ............................................................ 5
Susunan Genom NDV ........................................................................................ 8
Hasil amplifikasi gen matrix sampel positif real time PCR ............................. 17
Hasil amplifikasi RT-PCR produk 991 bp (marker 100 bp) ............................. 19
Uji HI menggunakan serum B1 dan Komarov menunjukkan variasi
afinitas titer antibodi antara dua serum 4 Log2 dan 5 Log2 ............................. 22
Penyebaran VND di beberapa wilayah di Aceh pada ayam kampung dan
unggas lain ........................................................................................................ 23
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Newcastle disease (ND) atau di Indonesia dikenal sebagai penyakit tetelo
merupakan penyakit yang bersifat menular dan sangat penting di industri
peternakan. Secara ekonomi, penyakit ini sangat merugikan karena dapat
menyebabkan kematian mencapai 100% pada semua jenis unggas terutama ayam,
baik ayam ras maupun buras (Tabbu 2003) sehingga Organisasi Kesehatan Hewan
Dunia (OIE) memasukkan penyakit ini dalam kategori notifiable diseases
(Epidemiological Major Disease) (Alexander 2000).
Virus merupakan virus RNA beramplop yang dengan asam inti berutas
tunggal, berpolaritas negatif dan tidak bersegmen. Panjang genomnya berkisar
15.186-15.192 nukleotida yang menyandi enam polipeptida yakni Nukleokapsid
Protein (Fazel et al.), Phospoprotein (P), Matrix (M), Fusion (F), HemaglutininNeuraminidase (HN) dan RNA polymerase (L) dengan susunan 3'-NP-P-M-FHN-L-5' (De Leeuw et al. 1999). Amplop virus ND terdiri atas dua glikoprotein,
yakni HN dan F yang berperan amat penting dalam proses infeksi. Protein HN
memediasi terjadinya perlekatan virus dengan sel inang, sedangkan protein F
berfungsi untuk penetrasi virus ke dalam sel inang dan berperan dalam
pembentukan sinsitia pada sel yang terinfeksi (Wakamatsu et al. 2006).
Secara genetik maupun antigenitas, virus ND masih sangat beragam.
Analisis secara filogenetik (kekerabatan), virus ND diklasifikasikan menjadi 2
divisi; yaitu kelas 1 (yang menyerang unggas air dan terdiri dari golongan virus
bervirulensi rendah) terdiri dari 9 genotipe, dan Kelas 2 (yang menyerang unggas
darat dan terdiri dari virus bervirulensi tinggi/ganas) yang terdiri 10 genotipe (Xie
et al. 2012). Sedangkan klasifikasi berdasar serotipe mengacu pada protein HN
dengan melakukan HA/HI test, di mana ND hanya punya 1 serotipe. Sementara
berdasar patotipe mengacu pada virulensi atau tingkat keganasan (Tabbu
2003). Dari 10 genotipe virus ND kelas 2 (1-10), genotipe yang paling awal
ditemukan adalah genotipe 1, 2, 3, 4 dan 9 pada tahun 1930-1960. Setelah tahun
1960, genotipe 5, 6, 7, 8, dan 10 ditemukan. Dan pada tahun 2011
ditemukankanlah isolat baru NDV dari Madagaskar, yaitu genotipe 11
(Maminiaina et al. 2010). Genotipe 2 termasuk virus ND virulensi rendah yang
digunakan sebagai galur vaksin, yaitu virus LaSota, B1 dan VG/GA. Kemudian,
muncul pendapat bahwa vaksin yang banyak beredar di Indonesia umumnya
dibuat dengan isolat virus La Sota dan Hitchner B1 asal Amerika yang tergolong
ke dalam genotipe 2 tersebut. Sementara itu, isu yang berkembang menyebutkan
bahwa dari kasus ND sepanjang tahun 2009-2011 yang dominan terjadi di
Indonesia saat ini, disebabkan oleh virus ND genotipe 7 (Lomniczi et al. 1998).
Di Indonesia, wabah ND pertama sekali dilaporkan terjadi di Jawa oleh
Kraneveld pada tahun 1926 dan Newcastle Upon-Tyne oleh Doyle tahun 1927,
sekarang menjadi penyakit endemik di berbagai daerah dan menyebar dengan
cepat ke belahan dunia (Saepulloh et al. 2005). Di Aceh, ND masih merupakan
penyakit klasik diantara penyakit pernafasan lain yang sering menyerang unggas
2
seperti Chronic Respiratory Disease Infectious bursal disease (IBD), Pullorum,
Kolera, dan beberapa kasus Avian influenza (AI). Dan pada beberapa lokasi
peternakan rakyat di Kecamatan dalam wilayah Aceh Besar, dilaporkan terjadi
kasus very virulent ND (vvND) sekitar 100 kasus di tiap kecamatannya (DISNAK
2012).
Sikuen dari gen penyandi genome virus dari berbagai negara sudah banyak
dilaporkan, namun sangat terbatas informasi tentang sikuen gen isolat asal
Indonesia (Adi et al. 2011). Laporan terakhir mengenai isolasi virus ND di
Indonesia adalah tahun 2009, yang di kenal sebagai isolat NDV/Bali-1/07 dan
tergolong strain velogenik. Sedangkan yang terbaru adalah strain
Banjarmasin/010/10 dan Sukorejo/019/10 dan merupakan isolat Indonesia asal
ayam mempunyai sekuen genom yang lengkap (Xiou et al. 2012).
Seringnya terjadi kasus tersebut disebabkan oleh sistem pemasaran melalui
pengepul dan sistem pemeliharaan yang masih tradisional, dimana unggas yang
diumbar mempermudah terjadinya penularan penyakit karena tingginya kontak
langsung atau tidak langsung antar unggas. Meskipun upaya vaksinasi dan
pengawasan lalu lintas unggas telah dilakukan, namun kasus ND masih
dilaporkan terjadi akibat antigenitas vaksin yang digunakan tidak protektif pada
unggas (Sa'idu et al. 2008). Untuk itu diperlukan pemilihan galur vaksin dan
metode vaksinasi yang tepat untuk menanggulangi infeksi ND dengan mengetahui
tingkat virulensi antigenitas dan genesitas virus lapangan.
Belakangan ini, metode diagnosis yang berbasis pendekatan biologi
molekuler telah menjadi alternatif yang dapat diandalkan. Salah satu metode
diagnosis berbasis molekuler yang dapat dikembangkan untuk melacak infeksi
virus ND pada unggas terinfeksi adalah teknik reverse transcriptase-polymerase
chain reaction (rRT-PCR) dan sequencing (Sinkovics et al. 2000). Penggunaan
teknologi sequencing ini berhasil menunjukkan variasi genetik virus ND
dilapangan sehingga dapat dibuat phylogenetic tree untuk melihat kekerabatan
isolat virus tersebut (Alexander et al. 2008).
Perumusan Masalah
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya diketahui isolat VND asal ayam
kampung yang bersikulasi di Aceh mengindikasikan adanya keragaman, baik
antigenik maupun genetik, karenanya perlu dilakukan pengujian lanjutan untuk
memastikan keragaman tersebut, serta melengkapinya dengan menambahkan
isolat dari unggas lain.
3
Table 1 Sampel virus ND pada usap kloaka dan orofaring
Kabupaten
Aceh Besar
Kecamatan
Ingin Jaya
Suka
makmur
Darul Imarah
Ulee Kareng
Indrapuri
Montasik
Blang Bintang
Banda Aceh
Kuta Alam
Lokasi
Pengepul
Pengepul
Jenis
Bebek
Entok
Jumlah
5
5
Pasar
Pasar
Pengepul
Pengepul
Peternakan
Peternakan
Peternakan
Pengepul
Pengepul
RPU
RPU
RPU
Layer
Broiler
Entok
Bebek
Layer
Layer
Broiler
Bebek
Entok
Layer
Broiler
Ayam
Arab
5
15
5
5
21
15
20
10
5
5
15
10
Total
141
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman VND
yang bersirkulasi di Aceh pada unggas hidup. Secara khusus meliputi: deteksi dan
isolasi VND (ayam buras dan unggas air), identifikasi dan karakterisasi virus
berdasarkan sifat fisik, serologik, dan molekuler.
Manfaat Penelitian
1.
2.
Memberikan informasi tentang karakter dan keragaman virus ND yang
bersirkulasi di wilayah Aceh.
Masukan untuk pengendalian ND di Aceh.
Ruang Lingkup Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan serangkaian kegiatan berupa koleksi sampel
usapan orofaring dan kloaka dari ayam kampung, ayam ras (ayam Arab, broiler,
layer), dan unggas air (itik, entok) di kabupaten Aceh Besar dan kota Banda Aceh,
menggabungkan (pooling) sampel, mengekstraksi RNA virus, mendeteksi dengan
rRT-PCR matriks, mengisolasi virus pada telur ayam berembrio specific pathogen
free (SPF), mengidentifikasi pertumbuhan VND dengan uji haemaglutinasi (HA)
dan rRT-PCR, serta mengkarakterisasi virus dengan uji haemaglutination
inhibition (HI), rRT-PCR Fusion, dan RT-PCR.
4
Hipotesis Penelitian
Virus ND yang di beredar wilayah Aceh beragam, baik secara antigenik dan
genetik.
TINJAUAN PUSTAKA
Newcastle Disease (ND)
Berdasarkan keparahan penyakit secara klinis strain NDV diklasifikasikan
menjadi 5 tipe (OIE 2012): Viscerotropic velogenic; sebuah bentuk yang sangat
patogen dimana lesi perdarahan usus sering terlihat, Neurotropic velogenic;
memperlihatkan kematian tinggi, biasanya diikuti gejala pernapasan dan saraf
Mesogenic: bentuk yang memperlihatkan gejala pernafasan, kadang-kadang gejala
saraf tetapi tingkat kematian yang rendah. Lentogenic; bentuk yang
memperlihatkan infeksi ringan dan subklinis. Asymptomatic; bentuk yang
biasanya terdiri dari infeksi enterik subklinis. Gejala klinis yang muncul pada
penyakit ND bervariasi tergantung dari strain virus dan spesies unggas yang
diinfeksi. Virus ND galur lentogenik memiliki gejala klinis yang bersifat ringan,
tidak menimbulkan kematian pada unggas dewasa dan biasanya banyak digunakan
sebagai vaksin (Alexander 2000).
Perubahan Patologis Infeksi Newcastle Disease
Lesi yang signifikan sering ditemukan pada unggas yang terinfeksi oleh
strain velogenik. kepala atau daerah periorbital membengkak, dan jaringan
interstisial pada leher mengalami edematous, terutama didekat toraks. Kongesti/
hemoragi terlihat pada faring bagian bawah dan mukosa trakeal, dan dipteritis
membran pada oroparing, trakea dan esophagus. Pada mukosa proventrikulus
dapat ditemukan Ptechie dan echimosa kecil. Hemoragi, ulcer, edema dan/atau
nekrosis sering terjadi di seka tonsil dan jaringan limfoid di usus (termasuk
peyer’s patches). Perubahan patologi anatomi ditandai dengan adanya ptechie
pada proventrikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, trakea, dan paru-paru
merupakan perubahan patognomonis pada penyakit ND (Kencana et al. 2012).
Limpa membengkak, rapuh dan berwarna merah kehitaman atau belangbelang. Kerusakan limposit dapat terlihat pada daerah kortikal dan germinal limpa
dan timus.Nekrosis pada pankreas dan edema pada paru-paru dapat ditemukan
pada beberapa unggas. Edematous pada ovarium atau atau atropi dan hemoragi,
beberapa burung, terutama yang mati mendadak biasanya lesi yang terlihat hanya
sedikit atau tidak ada lesi sama sekali(Piacenti et al. 2006, Alexander, Senne
2008). Pada ayam yang terinfeksi dengan strain tidak virulen, lesi yang muncul
hanya kongesti dan ada eksudat pada organ pernafasan, kantung hawa yang
menebal dan kehitaman. Gejala yang lebih parah dapat terlihat jika disertai infeksi
sekunder. Gejala infeksi awal biasanya terjadi gangguan pernapasan dan 1 atau 2
hari berikutnya terjadi kelumpuhan kaki, sayap dan tortikolis leher (Kommers
2001).
5
A
B
Gambar 1 Perubahan PA yang terinfeksi virus ND.
A. Hemoragi pada proventikulus (VVND)
B. Hemoragi dan nekrosis pada saluran gastrointestinal (VVND)
(Cattoli et al. 2011)
A
B
Gambar 2 Gejala klinis ayam yang yang terinfeksi virus ND.
A. Cairan eksudat dari saluran pernafasan (VVND).
B. Konjuntivitis dan udema pada kelopak mata (VVND)
(Cattoli et al. 2011)
Nama lain untuk New Castle Disease (ND) adalah tetelo, pseudovogolpest,
sampar ayam, Rhaniket, Pneumoencephalitis dan Tontaor furrens. Newcastle
Disease dipandang sebagai salah satu penyakit penting di bidang perunggasan.
Kejadian wabah penyakit ND seringkali terjadi pada kelompok ayam yang tidak
memiliki kekebalan atau kekebalan rendah akibat terlambat divaksin atau karena
kegagalan program vaksinasi.
Epidemiologi dan Transmisi Virus
Pada umumnya virus ND menyerang unggas seperti ayam, itik, angsa,
merpati, betet, dan beberapa jenis burung lainnya. Sekitar 236 spesies burung
memiliki catatan dapat diisolasi virus ND dan ayam dianggapspesies unggas yang
paling rentan terhadap infeksi. Burung air dianggap paling tahan terhadap infeksi,
umumnya virus yang terisolasi dari burung air memiliki patogenisitas sangat
rendah terhadap unggas domestik. Beberapa virulensi rendah isolat dari unggas air
6
yang bermigrasi di Amerika Serikat digunakan komersial vaksin strain B1 dan La
Sota (EFSA 2007).
Transmisi virus ND dapat terjadi melalui inhalasi dan ingesti. Virus dapat
disebarkan oleh hewan atau media yang berkontak langsung dengan unggas yang
sensitif. Penularan virus ND dapat terjadi secara langsung antar ayam dalam satu
kelompok ternak. Sumber virus berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik melalui
pakan, air minum, lendir, feses, maupun udara yang tercemar virus, peralatan dan
pekerja kandang. Virus ND dapat ditularkan melalui pernafasan atau pencernaan.
Unggas Gallinaceous mengeluarkan virus 1-2 minggu setelah terinfeksi. Pada
suhu diatas 1-2o C virus masih bertahan pada kulit ayam selama 60 hari dan dalam
sum-sum tulang dapat bertahan hingga 200 hari .
Penularan virus dari ayam terinfeksi tergantung pada tempat replikasi dari
virus. Ayam yang menunjukkan gejala pernafasan mengeluarkan udara yang
mengandung virus dan menginfeksi ayam lain melalui inhalasi. Virus ND yang
bereplikasi dalan saluran pencernaan mengeluarkan virus melalui feses. Penularan
virus dapat terjadi melalui oral akibat ingesti dari feses yang mengandung virus,
makanan dan minuman yang tercemar atau melalui inhalasi karena terhirup virus
dari feses yang telah kering (Tabbu 2003).
Etiologi dan Sifat Virus
Newcastle Disease (ND) adalah penyakit viral yang disebabkan oleh
Paramyxovirus tipe A, genus Avulavirus, ordo Mononegaverales dan tergolong
virus ssRNA, total genom mengandung 16.000 nukleotida dan replikasinya di
dalam sitoplasma sel hospes.Virus ini dapat diinaktifkan dengan pemanasan 56 oC
selama 3 jam dan 60 oC selama 30 menit, pada pH asam, sensitif terhadap eter,
formalin dan fenol, namun virus ND dapat bertahan hidup pada temperatur
lembab terutama di dalam feses ayam (Aldous dan Alexander 2001). ND adalah
penyakit viral bersifat menular dan fatal menyerang semua spesies unggas. Gejala
klinis sangat bervariasi tergantung pada strain virus, spesies, umur burung,
penyakit sekunder dan imunitas tubuh. Berdasarkan gejala klinik ND terbagi
dalam 5 golongan utama yaitu Velogenik Viserotropik, Velogenik Neurotropik,
Mesogenik, Lentogenik, dan Asimtomatik (OIE 2012).
Di Indonesia ND menyebar ke berbagai daerah baik di Jawa maupun diluar
Jawa. Saat ini hampir seluruh wilayah Indonesia merupakan daerah tertular dan
belum ada satu daerah yang bebas dari penyakit ND (Tarmudji 2005). Serangan
penyakit ND umumnya mulai meningkat pada awal musim hujan dan mencapai
puncaknya pada pertengahan musim atau pada saat peralihan dari musim hujan
ke musim kemarau.
Virus ND mampu menggumpalkan eritrosit, mudah mati di bawah sinar
ultraviolet dan dalam keadaan sekitar yang tidak stabil, rentan terhadap zat-zat
kimia, seperti kaporit, besi, klor dan lain-lain. Desinfektan yang peka untuk ND,
antara lain NaOH 2%, Formalin (1- 2%), Phenol-lisol 3%, alkohol 95 dan 70%,
fumigasi dengan Kalium permanganat (PK) 1 : 5000. Aktivitas ND hilang pada
suhu 100 oC selama satu menit dan mati pada suhu 56 oC selama lima menit
sampai lima jam, pada suhu 37 oC selama berbulan-bulan. Virus ND stabil pada
pH 3 - 11. Masa inkubasi penyakit ND adalah 2-15 hari, dengan rata-rata 6 hari.
Ayam yang tertular virus ND mulai mengeluarkan virus melalui alat pernapasan
7
antara 1 sampai dengan 2 hari setelah infeksi. Infeksi oleh virus ND alami yang
tidak menyebabkan kematian menimbulkan kekebalan selama 6-12 bulan,
demikian juga halnya kekebalan yang diperoleh dari vaksinasi (Jestin dan Jestin
1991).
Genom virus ND mempunyai enam “Open Reading Frames” yang
mengkode nucleocapsid protein, beberapa molekul fospoprotein (P), matrix
protein (M), fusion protein (F), tiga protein inti dan tiga protein amplop termasuk
dua glikoprotein besar hemaglutinin-neuraminidase (HN) dan large RNA-directed
RNA polymerase (L). Selain itu terdapat non-structural protein (V) dan second
protein (W) yang dihasilkan pada saat pengubahan RNA pada proses transkripsi
gen P (Oberdorfer dan Werner 1998). Dari ke enam protein tersebut hanya dua
jenis protein yang mempunyai peranan dalam proses kekebalan yaitu protein F
dan HN karena dapat merangsang pembentukan antibodi protektif (Cho et al.
2008). Fusion protein (precursor F glycoprotein) berperan penting pada saat virus
menginfeksi sel inang, karena protein ini dapat terpecah menjadi ‘trypsin-like
enzyme’ yang dapat memperantarai fusi antara virus dengan membran sel inang
target sehingga enzim ini dapat membantu virus masuk ke dalam sel inang (Rout
2007). Pembelahan protein F secara langsung dikaitkan dengan virulensi virus
secara in vivo. Kandungan residu tinggi asam amino pada F0 cleavage site
dikaitkan dengan virulensi (Huang 2004). Hemaglutinin-neuraminidase (HN)
adalah immunoprotective glycoprotein (immunogenic determinant) yang berperan
sebagai antigen permukaan amplop partikel virus ND. Protein M, F dan HN
berada pada amplop virus. F dan HN memperantarai masuk dan keluarnya virus
dari sel dan M berperan pada morphogenesis dan budding virus ND. NP
memperantarai enkapsidasi genom RNA membentuk nukleokapsid yang menjadi
template untuk transkripsi dan replikasi virus. Protein P penting untuk sintesis
RNA virus dan membentuk komplek terpisah dengan NP dan L protein dan
nukleokapsid (EFSA 2007).
8
Gambar 3 Susunan Genom NDV
NP=nukleoprotein, P=phosphoprotein, M=protein matriks, F=protein fusi,
HN=hemagglutinin-neuraminidase, L=RNA dependent RNA polymerase, V
dan W = protein non struktural (Yusoff et al. 2001, Panda 2003)
Patogenisitas dan Virulensi
Patogenisitas virus ND dapat diketahui dengan beberapa uji : 1). mean
death time (MDT) pada embrio ayam, 2) intracerebral pathogenicity index (ICPI)
pada anak ayam umur 1 hari, 3). intravenous pathogenicity index (IVPI) pada
anak ayam umur 6 minggu. Virus ND dari telur berembrio dan spesimen lapangan
dapat diidentifikasi menggunakan Reverse Trancription Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR), gene sequencing, analisis enzim restriksi (restriction enzyme
analysis) (OIE 2012).
Metode uji secara in vivo untuk menilai virulensi virus yaitu:
Biologis
1. Mean death time (MDT) pada telur ayam berembrio (Tabbu).Mean death
timeadalah waktu kematian embrio diukur dalam jam setelah TAB diinokulasi
virus (jika embrio mati kurang dari 60 jam diklasifikasi sebagai velogenik;
jika embrio hidup lebih dari 90 jam diklasifikasi sebagai lentogenik dan jika
embrio mati diantara 60