Karakterisasi enzim hidrolase bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara

KARAKTERISASI ENZIM HIDROLASE BAKTERI DARI
MATA AIR SODA PARBUBU, TAPANULI UTARA

SRI ASIH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
SRI ASIH. Karakterisasi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda Parbubu,
Tapanuli Utara. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan RASTI SARASWATI.
Tapanuli Utara memiliki sumber mata air soda yang potensial sebagai
sumber keanekaragaman biota Indonesia, salah satunya adalah bakteri hidrolitik.

Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi bakteri dari mata air soda Parbubu dan
menguji aktivitas enzim hidrolasenya, yaitu lipase, protease, dan selulase serta
mengkarakterisasi enzim hidrolase terbaik pada kondisi suhu dan pH tertentu.
Isolasi bakteri dari mata air soda Parbubu menggunakan metode cawan tuang
menghasilkan 23 isolat bakteri. Uji semikualitatif enzim hidrolase menggunakan
metode indeks hidrolitik enzim pada media menunjukkan bahwa isolat bakteri P9
memiliki aktivitas enzim lipase tertinggi. Waktu panen enzim lipase bakteri P9
berdasarkan kurva tumbuh dan kurva produksi enzim, yaitu pada jam ketujuh
inkubasi. Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan metode titrimetri
menunjukkan bahwa fraksi enzim dengan pengendapan (60-80)% ammonium
sulfat memiliki aktivitas tertinggi, yaitu sebesar 3.5245 U/mL atau 5.992 kali
dibandingkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Enzim lipase memiliki aktivitas
optimum pada pH 7, yaitu sebesar 5.9593 U/mL dan pada suhu 90ºC dengan
aktivitas sebesar 4.9019 U/mL.

ABSTRACT
SRI ASIH. Characterization of Enzymes from Bacteria Hidrolase Parbubu Soda
Springs, North Tapanuli. Under the direction of I MADE A RTIKA and RASTI
SARASWATI.
North Tapanuli has a soda fountain as a source of potential biotic diversity of

Indonesia, one of which is the hydrolytic bacteria. The purpose of this study was
to isolate bacteria from the soda fountain and test Parbubu hidrolasenya enzyme
activities, ie lipase, protease, and cellulase enzyme hidrolase and characterize the
best in certain conditions of temperature and pH. Isolation of bacteria from the
soda fountain Parbubu using pour plate method produced 23 isolates of bacteria.
Test semikualitatif hidrolase enzyme using hydrolytic enzymes in media index
showed that the bacterial isolates P9 has the highest lipase activity. Harvest time
P9 bacterial lipase based on the growth curve and enzyme production curves, ie
on the seventh hour of incubation. Lipase activity determined with titrimetric
method shows that the fraction of the enzyme by precipitation (60-80)% of
ammonium sulfate has the highest activity, that is equal to 3.5245 U / mL or 5992
times the activity of crude extract. Lipase enzyme has optimum activity at pH 7, at
5.9593 U / mL and at a temperature of 90 º C with the activity of 4.9019 U / mL.

Judul Skripsi
Nama
NIM

: Karakterisasi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda
Parbubu, Tapanuli Utara

: Sri Asih
: G84062071

Disetujui,
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc.
Ketua

Dr. Rasti Saraswati
Anggota

Diketahui
Ketua Departemen Biokimia

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, yang telah
melimpahkan karunia-Nya, sholawat serta salam semoga tercurahkan kepada
Rasulullah Muhammad SAW beserta keluarga dan orang-orang yang berjuang
menegakkan ajaran agama-Nya. Penelitian yang dilakukan berjudul Karakterisasi
Potensi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda Parbubu, Tapanuli Utara.
Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan di
Laboratorium Mikrobiolgi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor
pada bulan Maret sampai dengan Juli 2010.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyusunan karya ilmah ini. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan terutama kepada Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc. Selaku
pembimbing dan Dr. Rasti Saraswati selaku pembimbing sekaligus mendanai
penelitian ini. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis ucapkan kepada
orang tua dan keluarga atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang yang telah
diberikan. Terima kasih penulis sampaikan pula kepada teman-teman Al Iffah, Al
Hurriyyah, ISC, dan Biokimia 43 atas motivasi dan dukungannya.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari berbagai
pihak sebagai bahan masukan di kemudian hari. Semoga karya tulis ini dapat
berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak yang membutuhkannya demi

perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.

Bogor, Februari 2011
Sri Asih

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Malang pada tanggal 25 Desember 1989 dari bapak
Tukiran dan ibu Lisiati. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara.
Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Gondanglegi Kabupaten
Malang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada program mayor minor. Penulis
memilih Mayor Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan
Minor Teknologi Pangan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten mata kuliah
Pendidikan Agama Islam pada tahun ajaran 2007/2008, 2008/2009, dan
2009/2010, serta pernah menjadi asisten mata kuliah Biokimia Umum pada tahun
ajaran 2009/2010. Penulis juga pernah aktif dalam organisasi kemahasiswaan,
yaitu sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa Forum for Scientifict Studies
(FORCES) pada tahun 2006-2008, anggota Ikatan Keluarga Muslim TPB (IKMT)
pada tahun 2006-2007, dan pengurus LDK Al Hurriyyah IPB pada tahun 20062010. Penulis pernah mendapatkan dana Program Kreativitas Mahasiswa bidang

Kewirausahaan (PKMK) dari DIKTI pada tahun 2009. Pada periode bulan Juli
sampai Agustus tahun 2009 penulis melakukan Praktik Lapangan di Laboratorium
Mikrobiologi, bagian Quality Control PT. Frissian Flag Indonesia dan menulis
karya ilmiah berjudul Pengendalian Mutu Susu Bubuk Formula dari Bakteri
Salmonella spp.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ vii
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Mata Air Soda Parbubu...................................................................................
Enzim Hidrolase .............................................................................................
Kurva Pertumbuhan Bakteri ..........................................................................
Aktivitas Enzim .............................................................................................

2
2
4

5

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ............................................................................................... 5
Metode ........................................................................................................... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi bakteri dari Mata Air Soda Parbubu.................................................... 8
Aktivitas Enzim Hidrolase secara Semikuantitatif ........................................ 8
Waktu Optimum Produksi Enzim Lipase ....................................................... 9
Aktivitas Enzim Lipase................................................................................... 10
Karakterisasi Enzim Lipase ............................................................................ 12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ......................................................................................................... 13
Saran ............................................................................................................... 13
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 13
LAMPIRAN ......................................................................................................... 16

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sumber mata air soda Parbubu ........................................................................ 2

2 Struktur enzim selulase .................................................................................... 3
3 Struktur enzim protease ................................................................................... 3
4 Struktur enzim lipase ....................................................................................... 4
5 Pola pertumbuhan bakteri ................................................................................ 5
6 Hasil uji semikuantitatif selulase pada isolat P10............................................ 8
7 Hasil uji semikuantitatif protease pada isolat P9 ............................................. 9
8

Hasil uji semikuantitatif lipase pada (a) isolat P3, (b) isolat P9, dan (c)
isolat P23.......................................................................................................... 9

9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas lipase bakteri P9 ........................................ 10
10 Reaksi hidrolisis enzimatis spesifik pada minyak zaitun............................... 11
11 Aktivitas lipase pada beberapa fraksi enzim.................................................... 12
12 Penentuan pH optimum ................................................................................... 12
13 Penentuan suhu optimum................................................................................. 13

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan alir penelitian Sumber mata air soda Parbubu ........................................ 17
2 Isolasi bakteri dari sumber mata air soda Parbubu ............................................ 18
3 Uji potensi enzim hidrolase bakteri ................................................................... 19
4 Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri lipolitik................................................ 20
5 Uji aktivitas enzim lipase dengan metode titrimetrik (Paskevicius 2001)......... 21
6 Karakterisasi enzim hidrolitik (Sari 2008)......................................................... 22
7 Isolat bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara ................................ 23
8 Perhitungan Aktivitas Lipase............................................................................. 26
9 Hasil uji kuantitatif aktivitas lipase pada ekstrak kasar lipase........................... 27
10 Aktivitas lipase pada fraksi lipase dengan pengendapan ammonium sulfat.... 28
11 Aktivitas lipase pada suhu 37°C dan berbagai pH........................................... 29
12 Aktivitas lipase pada pH 7 dan berbagai suhu................................................. 30

PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara
dengan sumber biodiversitas dunia karena
memiliki 42 ekosistem daratan alami dan
lima ekosistem lautan. Keragaman ekosistem
tersebut membuat Indonesia menjadi tempat
yang sangat potensial untuk eksplorasi

berbagai jenis organisme. Salah satu bidang
yang belum mendapat perhatian serius adalah
keanekaragaman hayati mikrob. Pendekatan
yang
mungkin
dilakukan
adalah
mengeksplorasi
sebanyak-banyaknya
mikroorganisme.
Pulau Sumatera merupakan pulau
dengan dominasi batuan vulkanik, berupa
batuan beku, piroklastik, dan breksi vulkanik.
Dominasi batuan ini menjadi salah satu
penyebab terdapatnya sumber panas bumi di
Pulau Sumatera (Hasan et al. 2006).
Morfologi Pulau Sumatera, terutama daerah
Tapanuli Utara, sebagai daerah vulkanik ini
mengakibatkan adanya berbagai macam
sumber mata air tanah yang berasal dari

daerah dataran rendah. Mata air tanah yang
muncul antara lain mata air panas dan mata
air soda. Mata air soda terdapat pada sumber
mata air soda Parbubu. Mata air soda dengan
kondisi lingkungan yang ekstrim ini
menjadikannya tempat yang potensial untuk
mengeksplorasi berbagai jenis mikrob.
Kondisi lingkungan yang beraneka ragam
pada daerah vulkanik tersebut menyebabkan
terdapat beragam mikroorganisme yang
mampu tumbuh pada kondisi ekstrim seperti
suhu, pH, dan konsentrasi garam yang tinggi
(Madigan & Mars 1997).
Sumber mata air soda yang memiliki
kandungan karbonat tinggi ini menjadi
pelengkap
keanekaragaman
biota.
Keragaman mikrob yang terdapat pada
sumber mata air soda sangat menarik untuk
dikaji karena mikrob, terutama bakteri
mampu bertahan hidup pada kondisi air yang
mengandung karbonat.
Potensi yang dimiliki oleh mata air soda
Parbubu
ini
belum
dikaji,
bahkan
pemanfaatannya hanya sebagai pemandian
saja. Oleh karena itu, diperlukan kajian yang
lebih mendalam terhadap potensi yang
dimiliki oleh mata air soda ini agar dapat
dimanfaatkan secara tepat. Untuk dapat
memanfaatkan potensi yang tersimpan
tersebut diperlukan upaya-upaya untuk
mengeksplorasi kekayaan mikrob yang
terdapat di dalamnya. Upaya untuk
mendapatkan mikrob, terutama bakteri yang
terdapat di mata air soda tersebut dilakukan

dengan cara mengisolasi, memurnikan, dan
mengidentifikasi potensi enzimatik yang
dimiliki isolat, serta optimasi potensi bakteri.
Analisis ini menjadi sangat penting untuk
mengetahui besarnya potensi yang dimiliki
oleh bakteri dalam air soda.
Keistimewaan isolat bakteri ini adalah
dapat hidup pada kondisi lingkungan dengan
kadar
karbonat
yang
tinggi,
yang
mengakibatkan air menjadi sadah dan
turunnya pH air menjadi asam (DITA 2003).
Kesadahan air yang tinggi dan pH yang
relatif rendah dapat menghambat organisme
untuk hidup. Kondisi ekstrim air soda ini
memungkinkan hidupnya bakteri yang
memiliki ketahanan yang tinggi pula pada
kondisi ekstrim yang dibutuhkan saat proses
industri.
Pengkajian terhadap potensi enzimatik
bakteri
ini
juga
diperlukan
untuk
memanfaatkan bakteri sebagai pabrik
biologis. Bakteri yang dapat tumbuh pada
lingkungan ekstrim dapat menghasilkan
metabolit, salah satunya enzim, yang
memiliki ketahanan terhadap kondisi ekstrim
pula. Enzim-enzim yang mampu bertahan
dan aktif pada kondisi ekstrim sangat
diperlukan dalam dunia industri berbasis
enzim. Penggunaan enzim yang mampu
bertahan pada suhu tinggi dalam bidang
bioteknologi dapat menurunkan biaya operasi
dan meningkatkan kecepatan reaksi
Enzim yang diujikan aktivitasnya antara
lain protease, lipase, dan selulase. Pemilihan
ketiga jenis enzim dimaksudkan untuk
mendegradasi makromolekul utama yang
terdapat banyak di alam, sehingga cakupan
aplikasi enzim yang diproduksi bakteri ini
dapat lebih luas. Aplikasi penggunaan enzim
dalam industri selanjutnya disesuaikan
dengan potensi mikrob yang diperoleh saat
analisis.
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi
bakteri dari mata air soda Parbubu dan
menguji aktivitas enzim hidrolasenya, yaitu
lipase, protease, dan selulase serta
mengkarakterisasi enzim hidrolase terbaik
pada kondisi suhu dan pH tertentu.
Penelitian
ini
diharapkan
dapat
memberikan informasi tentang potensi
enzimatik dari isolat-isolat bakteri asal mata
air
soda
Parbubu
sehingga
dapat
dimanfaatkan secara luas pada bidang-bidang
yang sesuai. Selain itu diharapkan dapat
memberikan informasi tentang kondisi
keasaman dan suhu optimum yang diperlukan
enzim lipase dari salah satu isolat dalam
mendegradasi substrat.

Menurut
Komisi
Tata
Nama
International Union of Bioch
iochemist and
Molecular Biologist, protease
ase termasuk
dalam kelompok III subkelompo
pok IV enzim
(E.C.3.4), yaitu golongan hidrola
olase pemecah
eberapa cara
substrat protein. Terdapat beb
klasifikasi protease yang digunaka
akan para ahli.
Hartley (1960) (dalam Widya
yastuti 2000)
mengklasifikasikan protease berdasar
ber
sifatsifat kimia sisi aktif enzim, yaitu
yait protease
serin (memiliki asam amino serin
erin pada sisi
emiliki gugus
aktifnya), protease sulfhidril (mem
sulfhidril pada sisi aktifnya), protease
pro
metal
(memiliki ion logam pada sisii aktifnya),
ak
dan
protease asam (memiliki dua gugu
ugus karboksil
pada sisi aktifnya).
Enzim Lipase (EC 3.1)
lam hidrolisis
Enzim yang bekerja dalam
ikelompokkan
lemak dan minyak dapat dike
aitu lipase dan
menjadi dua kelompok besar, yait
ipase termasuk
esterase (Winarno 1985). Lipas
gsi hidrolase
golongan enzim dengan fungs
atan ester pada
karena dapat menghidrolisis ikata
bebas
lemak sehingga terbentuk asam lemak
le
suk kelompok
dan gliserol. Lipase juga termasu
enzim esterase, sebab dapat menghidrolisis
me
se merupakan
ikatan ester. Selain itu, lipase
n ikatan
rantai
enzim yang dapat memutuskan
i
nama
panjang asam lemak ester dan memiliki
me
lase (Tika et al
ilmiah triasilgliserol asilhidrolase
2007).
serol hidrolase
Enzim lipase atau asilgliser
upakan enzim
(E.C 3.1.1.3) (Gambar 4) merup
antai panjang
yang dapat menghidrolisis ran
untuk
trigliserida. Enzim ini memilikii potensi
po
yang
digunakan memproduksi asam lemak,
le
kimia.
merupakan prekursor berbagai industri
ind
cara industri
Produksi asam lemak secar
menggunakan katalis kimia menghasilkan
m
n. Selain itu,
efek samping bagi lingkungan.
enal memiliki
enzim lipase telah banyak diken
cakupan aplikasi yang amatt luas dalam
ti biomedikal,
bidang bioteknologi, seperti
ah, industri
pestisida, pengolahan limbah
ntuk industri
makanan, biosensor, deterjen, untu

Gambar 4 Struktur enzim lipase.
lip

kulit dan industri oleokimia (mempro
produksi
asam lemak dan turunannya) (Macra
crae AR
1983).
Kurva Pertumbuhan Bakteri
ri
Pertumbuhan merupakan penam
ambahan
secara teratur semua komponen sel
el suatu
jasad. Pertumbuhan dapat diartikan se
sebagai
penambahan jumlah sel. Penambahann ju
jumlah
sel pada jasad bersel banyak (multise
tiseluler)
tidak menghasilkan penambahan ju
jumlah
individunya,
melainkan
terbent
entuknya
jaringan baru atau peningkatan ukuran
ran suatu
jasad. Penambahan sel pada jasad berse
rsel satu
(uniseluler) berarti penambahan ju
jumlah
individu, seperti pertumbuhan yangg terjadi
pada suatu kultur mikrob.
Mikrob jika dimasukkan padaa media
baru yang sesuai akan tumbuh
uh dan
memperbanyak diri. Perbanyakan
an diri
dilakukan melalui pembelahan biner,
r, aartinya
satu sel akan membelah diri menjadii ddua sel
yang identik. Sel tersebut kemudian m
masingmasing membelah diri lagi menjadi du
dua, dan
seterusnya. Pertumbuhan seperti ini ter
termasuk
dalam tipe pertumbuhan ekspon
onensial
(Sokatch 1969). Pada kondisi yangg ssesuai,
beberapa jenis bakteri dapat mem
embelah
menjadi dua sel baru atau memb
mbentuk
generasi baru dalam 15 menit, seda
dangkan
pada kondisi yang tidak sesuai, dipe
iperlukan
waktu hingga 24 jam atau lebih. Waktu
ktu yang
diperlukan untuk membelah diri darii sa
satu sel
menjadi dua sel sempurna disebutt waktu
regenerasi (Foster et al. 1961).
Kurva pertumbuhan diperoleh m
melalui
perbandingan jumlah bakteri yang di
dihitung
pada
waktu-waktu
tertentu
seh
sehingga
menunjukkan pola pertumbuhan bbakteri
tersebut. Pola pertumbuhan bakteri
teri pada
umumnya memiliki empat fase pertumb
mbuhan,
yaitu fase permulaan atau adaptasi (fas
fase lag),
fase
pertumbuhan
eksponensiall
atau
logaritma (fase log), fase stasioner, da
dan fase
kematian.
Fase pertumbuhan awal atau fa
fase lag
merupakan awal pertumbuhan mikrobb ketika
bakteri baru menyesuaikan diri ddengan
lingkungannya. Fase ini ditandaii ddengan
perubahan
komposisi
kimiawii
sel,
penambahan ukuran, substansi seluler
ler, dan
waktu generasinya relatif panjang.
g. Fase
selanjutnya adalah fase pertum
tumbuhan
eksponensial atau fase log yang meru
erupakan
fase pertumbuhan sel paling cepat dan
an paling
aktif. Pada fase ini, metabolisme sel
el paling
aktif, sintesis bahan sel sangat cepatt ddengan

pertama/ 10-1). Pengenceran terus dilakukan
sampai pengenceran keenam atau diperoleh
konsentrasi 10-6). Hasil pengenceran diambil
sebanyak 0.1 mL dan dimasukkan ke dalam
cawan petri, lalu ditambah dengan media
hangat yang belum memadat sebanyak 20
mL. Media yang ditambahkan ada dua
macam, yaitu media peptone glucose agar
(PGA) dan potato dextrose agar (PDA),
sehingga diperoleh koloni yang berbeda.
Selanjutnya cawan digoyang perlahan untuk
homogenisasi, lalu dibiarkan memadat.
Cawan selanjutnya dimasukkan dalam plastik
dalam posisi terbalik dan disimpan dalam
inkubator suhu 37ºC selama dua sampai lima
hari (Nurkanto 2007; Ilyas 2007).
Setelah masa inkubasi, pertumbuhan
bakteri dalam cawan diamati. Bakteri yang
tumbuh dalam cawan tersebut bersifat
heterogen, sehingga dilakukan pemurnian
dengan cara memindahkan masing-masing
bakteri yang tumbuh dengan ciri morfologi
berbeda ke dalam media dalam cawan baru
dan selanjutnya dipindahkan pada agar
miring. Pemindahan dilakukan dengan cara
mengambil sebanyak satu ose biakan dari
cawan lalu dipindahkan ke agar miring
dengan goresan zig-zag dari arah pangkal
agar miring hingga ujung. Pemindahan ini
dilakukan secara aseptik. Isolat yang telah
murni selanjutnya disimpan pada media
penyimpanan dengan suhu 4ºC (Akhdiya
2003).
Uji Potensi Enzim Hidrolase Bakteri
Pengujian
Potensi
Selulolitik.
Pengujian potensi bakteri selulolitik secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi
selulosa. Metode yang digunakan adalah
modifikasi metode Miller (1959) pada
substrat selulosa murni, yaitu carboxy methyl
cellulose (CMC). Media CMC mengandung 1
g CMC, 0.02 g MgSO4, 7H2O, 0.075 g
KNO3, 0.05 g, K2HPO4, 0.002 g
FeSO4,7H2O, 0.004 g CaCl2, 2H2O, 0.2 g
ekstrak ragi, 1.5 g agar-agar bakto, dan 0.1 g
glukosa (Meryandini et al. 2009). Isolat yang
telah murni tersebut selanjutnya diambil
menggunakan lup dan ditotolkan pada media
CMC lalu diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37ºC (Syam 2008). Koloni yang sudah
tumbuh dicuci dengan larutan merah kongo
0.1% selama sepuluh menit dan dibilas
menggunakan NaCl 1%. Selanjutnya diukur
diameter koloni dan zona bening yang
dihasilkan oleh isolat. Aktivitas selulolitik

ditentukan berdasar indeks selulolitik (IS)
yang diperoleh dari perbandingan diameter
zona bening dan diameter koloni (Nurkanto
2007).
Pengujian
Potensi
Proteolitik.
Pengujian potensi bakteri proteolitik secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi protein.
Metode
pengujian
yang
dilakukan
berdasarkan metode Durham et al. (1987).
Isolat yang telah murni ditotol pada medium
agar susu skim. Agar susu skim dibuat
dengan mencampurkan 100 mL susu skim
pasteurisasi dicampur dalam kondisi hangat
dengan larutan lain yang berisi 7.5 g bakto
agar yang dilarutkan dalam 200 mL akuades
dan telah diautoklaf selama 15 menit pada
suhu 121ºC. Campuran tersebut lalu
dimasukkan dalam cawan dan dibiarkan
memadat (Amri 2004). Isolat yang telah
ditotolkan diinkubasi pada suhu 37ºC selama
48 jam. Setelah masa inkubasi, diukur
diameter koloni dan zona beningnya.
Aktivitas proteolitik ditentukan berdasar
indeks proteolitik (IP) yang diperoleh dari
perbandingan diameter zona bening dan
diameter koloni (Akhdiya 2003).
Pengujian Potensi Lipolitik. Pengujian
potensi bakteri lipolitik secara kualitatif
dilakukan dengan menguji aktivitas bakteri
dalam mendegradasi lipid. Pengujian
dilakukan menurut Sensitive Plate Assay
(Kouker & Jaeger 1987 dalam Tika dkk
2007). Koloni yang tumbuh pada media
diinokulasikan sebagai spot kecil pada media
Tween 80 agar (Gilbert et al.1991). Tween 80
atau disebut juga polisorbat 80 merupakan
surfaktan nonionik dan emulsifier yang
berasal dari sorbitan polietoksilat dan asam
oleat , dan sering digunakan dalam makanan.
Polisorbat 80 adalah cairan, kuning kental
larut dalam air. Tween 80 mengandung
Tween 80, NaCl 5 g, CaCl2.H2O 0.1 g, agar
20 g, dan Bromkresol ungu 25 mg.
Selanjutnya medium uji diinkubasi pada 37ºC
selama 48 jam. Aktivitas lipolitik ditentukan
berdasar zona yang terbentuk pada perubahan
warna media dari kuning menjadi ungu.
Penentuan Waktu Optimum Produksi
Enzim Lipase
Pengujian
selanjutnya
dilakukan
terhadap enzim yang dihasilkan oleh bakteri
dengan aktivitas tertinggi berdasarkan uji
aktivitas enzim secara semi kuantitatif. Pada
penelitian ini, digunakan enzim lipase
dihasilkan oleh isolat bakteri dengan aktivitas

tertinggi. Penentuan waktu optimum inkubasi
dilakukan dengan mengkaji hubungan antara
kurva pertumbuhan bakteri dan kurva
aktivitas enzim lipasenya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan.
Sebanyak satu lup isolat bakteri terpilih (data
nilai indeks lipolitik terbesar), diinokulasikan
ke dalam 50 mL media PGA sebagai starter
dan diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang.
Setiap jam diambil sebanyak 1 mL larutan
sampel, kemudian dilakukan pengenceran.
Selanjutnya, dilakukan pengukuran jumlah
sel dengan metode turbidimetri melalui
perhitungan
optical
density
(OD)
menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 600 nm sehingga diperoleh kurva
pertumbuhan (Martharina 2009).
Aktivitas Enzim Lipase. Sebanyak satu
lup isolat bakteri terpilih (data nilai indeks
lipolitik terbesar), diinokulasikan ke dalam
50 mL media PGA sebagai starter dan
diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang.
Pada saat bakteri mulai memasuki fase
pertumbuhan eksponensial, yaitu jam
keempat, dilakukan pengambilan sampel
setiap tiga jam sampai akhir fase
pertumbuhan untuk mendapatkan ekstrak
kasar enzim per tiga jam (Maranatha 2008).
Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan
sentrifugasi kultur sel pada 3500 rpm selama
15 menit pada suhu 4°C. Pengukuran
aktivitas enzim ekstrak kasar dilakukan
dengan metode titrimetri. Dicampurkan
sebanyak 2 mL minyak zaitun, 4 mL buffer
sitrat pH 6, dan 1 mL ekstrak kasar enzim
lipase. Campuran dikultivasi pada shaker
dengan suhu 37ºC selama 1 jam. Setelah
dikultivasi, campuran
substrat enzim
diinaktifkan dengan penambahan larutan
aseton:alkohol (1:1) sebanyak 10 mL
kemudian dititrasi dengan NaOH 0.05 N
dengan menambah 2-3 tetes fenolftalein 1%
sebagai indikator. Aktivitas enzim lipase
ditunjukkan dengan perubahan warna saat
titrasi dari tidak berwarna menjadi berwarna
merah muda. Perlakuan untuk kontrol
dilakukan setelah kultivasi selama 1 jam.
Aktivitas
lipase
ditentukan
berdasar
perhitungan volume NaOH terkoreksi, yaitu
volume terpakai sampel dikurangi volume
NaOH terpakai blanko. Volume NaOH
terpakai selanjutnya dikalikan dengan

konsentrasi NaOH dan dibagi dengan bobot
minyak dan masa inkubasi (Paskevicius
2001).
Pengukuran Aktivitas Enzim Lipase
Produksi Enzim Lipase. Produksi
enzim lipase dilakukan dengan cara
mengkultivasi satu isolat bakteri ke dalam 50
mL media PGA sebagai starter dan
diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang
selama waktu optimum panen berdasar data
pengamatan
sebelumnya.
Setelah
itu
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan
3500 rpm selama 15 menit. Filtrat hasil
sentrifugasi disebut ekstrak kasar enzim.
Semipurifikasi Enzim Lipase Melalui
Pengendapan dengan Ammonium Sulfat.
Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim
lipase dilakukan dengan fraksinasi bertingkat
menggunakan garam ammonium sulfat
dengan tingkat kejenuhan (0-20)%, (2040)%, (40-60)%, dan (60-80)%. Fraksinasi
dengan amonium sulfat dilakukan dengan
cara menambahkan amonium sulfat sedikit
demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim
sambil diaduk. Pengadukan diusahakan
sedemikian rupa sehingga tidak menimbulkan
busa selama kurang lebih 20 menit. Setiap
endapan protein enzim yang didapat
dipisahkan
dari
filtratnya
dengan
menggunakan sentrifugasi pada kecepatan
10.000 rpm selama 15 menit. Pellet yang
dihasilkan selanjutnya dilarutkan dalam
larutan buffer sitrat pH 6 untuk dilakukan
pengujian selanjutnya (Nurhasanah &
Herasari 2008).
Uji Aktivitas Enzim Lipase pada
Berbagai Fraksi. Pengujian aktivitas enzim
lipase dari fraksi-fraksi enzim yang
diproduksi menggunakan metode titrimetri
oleh Paskevicius (2001) seperti yang telah
dilakukan pada pengujian sebelumnya).
Pengujian dilakukan pada kondisi yang sama,
yaitu nilai keasaman dan suhu percobaan.
Karakterisasi Enzim
Aktivitas Terbaik

Lipase

dengan

Fraksi enzim lipase yang memiliki
aktivitas terbaik berdasarkan pengukuran
aktivitas enzim pada variasi pH dan suhu.
Penentuan pH optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas enzim lipase pada
substrat minyak zaitun dalam berbagai pH.
Variasi pH media yang digunakan adalah 3,

5, 7, dan 9 menggunakan buffer sitrat, buffer
fosfat, dan buffer bórax-borat. Pengujian pH
optimum dilakukan pada suhu 37°C.
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas enzim hidrolase pada
berbagai suhu dalam buffer pH optimum dan
diinkubasi 30 menit. Variasi suhu yang
digunakan adalah 30ºC, 50ºC, 70ºC, dan 90ºC
(Sari 2008).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri dari Mata Air Soda
Parbubu
Bakteri
yang
digunakan
dalam
penelitian ini merupakan bakteri yang
diisolasi dari mata air soda Parbubu, Tapanuli
Utara. Berdasarkan hasil isolasi yang
dilakukan, diperoleh 23 isolat bakteri dari
mata air soda Parbubu. Isolat-isolat yang
diperoleh dibedakan berdasarkan ciri
morfologisnya, yaitu warna, bentuk tepian,
ukuran, dan kecembungan. Isolasi bakteri
dilakukan dengan menggunakan sampel air
dari
mata air soda Parbubu, Tarutung,
Tapanuli Utara diisolasi dengan metode
cawan sebar. Media yang digunakan adalah
media peptone glucose agar (PGA) dan
potato dextrose agar (PDA), sehingga
diperoleh koloni yang berbeda (Nurkanto
2007; Ilyas 2007).
Aktivitas Enzim Hidrolase secara
Semikuantitatif
Pengujian potensi bakteri dalam
menghasilkan enzim hidrolase dilakukan
terhadap tiga enzim, yaitu enzim selulase,
protease, dan lipase. Pemilihan tiga jenis
enzim ini dimaksudkan karena enzim ini
merupakan enzim yang dapat mendegradasi
makromolekul utama yang ada di alam, yaitu
selulosa, protein, dan lipid. Pengujian potensi
enzim dilakukan secara semikuantitatif, yaitu
dengan mengukur indeks hidrolitik dari
bakteri. Pengujian ini digunakan sebagai
informasi awal dalam menentukan enzim
yang memiliki aktivitas terbesar dalam
mendegradasi substrat.
Aktivitas
Enzim Selulase secara
Semikuantitatif
Berdasarkan
pengujiian
secara
semikuantitatif terhadap 23 isolat bakteri
Parbubu, sebanyak tiga belas isolat memiliki
aktivitas selulase. Isolat P10 merupakan
isolat bakteri yang memiliki aktivitas selulase

terbaik dengan nilai indeks selulolitik (IS)
sebesar 3,789.
Pengujian enzim selulase secara
semikuantitatif dilakukan menggunakan
modifikasi metode Miller (1959) pada
substrat selulosa murni, yaitu carboxy methyl
cellulose (CMC). Menurut Nurkanto (2007)
pengujian dilakukan dengan mengukur
indeks selulolitik berdasarkan zona bening
yang terlihat disekitar koloni bakteri yang
ditotolkan pada media CMC. Senyawa CMC
merupakan turunan selulosa yang mudah
larut dalam air. Oleh karena itu CMC mudah
dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana oleh
enzim selulase dan selanjutnya difermentasi
menjadi etanol oleh bakteri. Hal itu yang
mendasari pemilihan CMC sebagai substrat
untuk pengujian enzim lipase. Pengujian ini
berdasarkan proses enzimatik yang dilakukan
oleh koloni bakteri yang dapat menghasilkan
enzim selulase dan mendegradasi selulosa
menjadi glukosa. Hasil degradasi media oleh
enzim selulase terlihat sebagai zona bening,
sedangkan media agar yang masih
mengandung selulosa terlihat berwarna
merah karna adanya ikatan dengan pewarna
merah kongo.
Koloni bakteri

Zona bening

Gambar 6 Hasil uji semikuantitatif selulase
rpada isolat P10.
Aktivitas
Enzim
Semikuantitatif

Protease

secara

Pengujian
enzim protease secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi protein.
Berdasarkan
pengujiian
secara
semikuantitatif terhadap 23 isolat bakteri
Parbubu, sebanyak lima belas isolat memiliki
aktivitas protease. Isolat yang memiliki
indeks proteolitik terbaik adalah isolat P9
dengan nilai indeks proteolitik (IP) sebesar
2,230. Metode pengujian yang dilakukan
berdasarkan metode Durham et al. (1987),
yaitu pengamatan zona bening yang
dihasilkan dari penguraian protein menjadi
asam amino oleh enzim protease yang
dihasilkan bakteri pada media susu skim.
Aktivitas proteolitik dalam mendegradasi
protein menghasilkan zona bening menurut

yang dilaporkan Akhdiya (2003) disebut
sebagai
indeks proteolitik (IP) yang
diperoleh dari perbandingan diameter zona
bening dan diameter koloni.
Koloni bakteri

tertinggi merupakan enzim lipase. Ketiga
koloni bakteri yang memiliki nilai IL
tertinggi, yaitu P3, P9, dan P23 dipilih koloni
P9 untuk diuji lanjut secara kuantitatif.
Dipilih koloni P9 karena koloni bakteri ini
juga memiliki aktivitas yang tertinggi pada
uji semikuantitatif enzim protease.

Zona bening

Gambar 7 Hasil uji semikuantitatif protease
pada isolat P9.
Aktivitas
Enzim
Lipase
secara
Semikuantitatif
Pengujian
enzim lipase secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi lipid
menggunakan metode Sensitive Plate Assay
(Kouker & Jaeger 1987 dalam Tika et al.
2007). Aktivitas lipase ditentukan berdasar
zona yang terbentuk pada perubahan warna
media yang mengandung bromkresol ungu
dari kuning menjadi ungu. Bromkresol ungu
merupakan indikator pH dengan rentang pH
5.2 berwarna ungu. Pada pengujian ini,
terdapat perubahan pH dari asam menjadi
basa dengan dihasilkannya asam lemak dan
gliserol dari polimer lipid sehingga dapat
diamati secara semikuantitatif banyaknya
enzim yang dihasilkan oleh sel untuk
mendegradasi polimer lipid. Berdasarkan
pengujiian secara semikuantitatif terhadap 23
isolat bakteri Parbubu, sebanyak dua belas
isolat memiliki aktivitas lipase. Isolat bakteri
yang memiliki indeks lipolitik (IL) besar
adalah isolat P3, P9, dan P23 dengan nilai
indeks lipolitik berturut-turut sebesar 11,640;
10,80; 16,700.
Uji kualitatif tidak selalu menjadi dasar
yang baik untuk melihat aktivitas enzim,
sehingga perlu dilakukan uji lanjutan
terhadap aktivitas proteasenya. Menurut
Ward (1985) tidak selalu terdapat korelasi
yang baik antara daerah jernih di sekitar
koloni pada media padat dengan kemampuan
organisme tersebut. Beberapa faktor yang
diduga
menjadi
penyebab
tidak
terkorelasinya nilai aktivitas hidrolisis secara
kualitatif dengan nilai aktivitas enzim secara
kuantitatif adalah kecepatan pertumbuhan
setiap isolat pada medium padat atau cair dan
jumlah inokulum yang diberikan pada kedua
medium.
Berdasarkan seluruh pengujian terhadap
ketiga enzim hidrolase, aktivitas enzim

a
b
c
Gambar 8 Hasil uji semikuantitatif lipase
wpada (a) isolat P3, (b) isolat P9,
wdan (c) isolat P23.
Tabel 1 Hasil uji aktivitas enzim hidrolase
secara semikuantitatif
Kode
bakteri
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23

IS

IP

IL

2
2.579
3.789
1.100
1.200
1.690
3.150
1.760
2.600
1.980
2.200
1.060
1.870

1.178
1.880
1.220
2.230
1.569
1.590
1.240
1.200
1.650
1.140
1.460
1.530
1.180
1.050
1.790

2.140
11,640
6.940
3.500
10.800
2.700
2.800
2.500
3.600
1.700
3.900
16.700

Waktu Optimum Produksi Enzim Lipase
Hasil pembuatan kurva pertumbuhan
dan kurva produksi dapat dilihat pada
Gambar 9. Kurva tersebut menunjukkan
bahwa aktivitas enzim optimum terjadi pada
jam ketujuh yang merupakan fase bagian
awal dari fase pertumbuhan eksponensial atau
fase log. Hal ini berarti isolat bakteri P9 dapat
dilakukan pemanenan enzim lipase pada jam
ketujuh setelah masa kultivasi.

Kurva pertumbuhan
bakteri P9

Kurva produksi
enzim lipase

Gambar 9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas lipase isolat bakteri P9.
Pengujian aktivitas enzim untuk
pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan
pada titik-titik kurva pertumbuhan. Pada
pengujian ini dilakukan pengukuran aktivitas
enzim setiap tiga titik (jam) diawali pada
awal fase pertumbuhan eksponensial.
Menurut Martharina (2010), penentuan waktu
inkubasi optimum dimaksudkan untuk
memperoleh waktu yang tepat disaat aktivitas
enzim berada paling tinggi sehingga dapat
dilakukan pemanenan enzim dengan hasil
terbaik. Waktu inkubasi optimum ditentukan
berdasarkan kurva pertumbuhan bakteri dan
kurva produksi dari bakteri. Selain itu, kurva
ini
juga
dapat
digunakan
untuk
memperkirakan penggolongan jenis metabolit
dari enzim yang dihasilkan. Berdasarkan
hasil
pengujan,
isolat
bakteri
P9
menghasilkan enzim dengan aktivitas
optimum pada jam ketujuh yang merupakan
awal fase pertumbuhan eksponensial. Hal ini
menunjukkan bahwa isolat bakteri P9
menghasilkan enzim yang merupakan
metabolit primer. Menurut Poedjiadi (1994),
metabolit primer merupakan suatu zat yang
dihasilkan pada fase pertumbuhan karena
digunakan sebagai zat yang menopang
pertumbuhan suatu makhluk hidup.
Aktivitas Enzim Lipase
Pengukuran aktivitas enzim lipase
dilakukan pada beberapa fraksi enzim lipase,
yaitu fraksi ekstrak kasar enzim (crude
enzyme), fraksi enzim dengan pengendapan
(0-20)%, fraksi (20-40)%, fraksi (40-60)%,
dan fraksi (60-80)% ammonium sulfat.
Pengukuran aktivitas enzim lipase pada fraksi
ekstrak kasar enzim ini menunjukkan bahwa
aktivitas rata-rata enzim hasil pengukuran
duplo adalah 0.5882 U/mL. Hasil pengukuran
terhadap fraksi enzim dengan pengendapan
ammonium sulfat menunjukkan nilai aktivitas

rata-rata enzim hasil pengukuran duplo pada
fraksi (0-20)% adalah 1.3627 U/mL, fraksi
(20-40)% adalah 2.3235 U/mL, fraksi (4060)% adalah 2.4410 U/mL, dan fraksi (6080)% adalah 3.5245 U/mL.
Produksi ekstrak kasar enzim diperoleh
dengan mengkultivasi satu isolat bakteri P9
sebagai isolat terpilih ke dalam media yang
yang mengandung minyak zaitun sebagai
penginduksi. Menurut Rajendran dan
Tangavelu (2007), minyak zaitun merupakan
salah satu minyak nabati terbaik setelah
minyak kacang tanah untuk digunakan
sebagai penginduksi enzim lipase. Selain itu,
minyak zaitun juga telah banyak digunakan
dalam berbagai pengujian enzim lipase.
Media tersebut selanjutnya diinkubasi pada
inkubator bergoyang dengan suhu ruang
selama tujuh jam sesuai dengan hasil
pengamatan waktu produksi optimum enzim.
Inkubasi pada kondisi optimum pertumbuhan
dimaksudkan untuk memperoleh enzim lipase
dalam jumlah cukup besar. Setelah itu
dilakukan pemisahan antara media dengan sel
menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan
3500 rpm selama 15 menit suhu 4°C. Filtrat
hasil sentrifugasi merupakan campuran antara
media dan enzim yang selanjutnya disebut
ekstrak kasar enzim (Paskevicius 2001).
Sedangkan sel yang memiliki massa yang
yang lebih besar tertarik ke pusat sentrifugal
sehingga menjadi pellet yang menempel pada
dinding tabung sentrifus.
Ekstrak kasar enzim selanjutnya diuji
aktivitas lipasenya menggunakan metode
titrimetri. Pengujian menggunakan minyak
zaitun sebagai substrat, buffer sitrat pH 6, dan
fraksi enzim. Campuran dikultivasi pada
inkubator bergoyang dengan suhu 37ºC
selama 1 jam. Minyak zaitun terdiri atas
trigliserida (trioleogliserol). Setiap 2 mL
minyak zaitun memiliki massa 1.7 gram.
Trioleogliserol dengan rumus molekul

(C17H35COO)3C3H5 memiliki berat molekul
884 g/mol, sehingga dalam 2 mL sampel
minyak zaitun terdapat 1.923 mmol
trigliserida. Pada masa inkubasi, minyak
zaitun, (C17 H35 COO)3 C3H5, akan dihidrolisis
oleh
lipase
menjadi
asam
lemak
C17H34COOH
dan
gliserol
berdasarkan reaksi pada Gambar 10. Setelah
diinkubasi,
campuran
substrat
enzim
diinaktifkan dengan penambahan larutan
aseton:alkohol (1:1). Campuran aseton dan
alkohol mendenaturasi struktur enzim yang
merupakan protein dengan mengganggu
rantai ikatan hidrogen intramolekul samping.
Hal ini mengakibatkan rusaknya struktur
sekunder dan tersier dari enzim sehingga
enzim berhenti bekerja. Kemudian campuran
tersebut dititrasi dengan NaOH 0.05 N
dengan sebelumnya menambahkan 2-3 tetes
fenolftalein 1% sebagai indikator. Asam
lemak hasil hidrolisis bereaksi dengan NaOH
menjadi C17H34COONa dan H2O (Wulan et
al. 2007).
Aktivitas enzim lipase ditunjukkan dengan
perubahan warna saat titrasi dari tidak
berwarna menjadi berwarna merah muda
akibat terjadinya perubahan pH pada larutan.
Awal titrasi netralisasi, larutan tidak
menghasilkan warna karena NaOH yang
diteteskan berikatan dengan asam lemak,
sehingga tidak dapat mengubah pH larutan,
akibatnya fenolftalein sebagai indikator pH
tidak memberikan perubahan warna. Warna
merah muda muncul saat NaOH tidak lagi
dapat berikatan dengan asam lemak, sehingga
memberikan sifat basa pada larutan dan
menimbulkan warna merah muda sebagai
indikasi perubahan pH larutan. Banyaknya
NaOH yang dapat berikatan dengan asam
lemak menunjukkan banyaknya asam lemak
yang terdapat dalam larutan sebagai hasil
hidrolisis minyak zaitun. Perlakuan untuk
kontrol dilakukan setelah kultivasi selama 1
jam, yaitu berarti sebelum terjadi reaksi
degradasi lipid oleh lipase. Aktivitas lipase
ditentukan berdasar perhitungan volume
NaOH terkoreksi, yaitu volume terpakai
sampel dikurangi volume NaOH terpakai
blanko. Volume NaOH terpakai selanjutnya
dikalikan dengan konsentrasi NaOH dan
dibagi dengan bobot minyak dan masa
inkubasi (Paskevicius 2001).
Setelah diperoleh ekstrak kasar enzim,
dilanjutkan dengan purifikasi enzim secara
fraksinasi bertingkat menggunakan garam
ammonium
sulfat.
Pengendapan
menggunakan garam ammonium sulfat
merupakan salah satu cara yang mudah untuk

Gambar 10 Reaksi hidrolisis enzimatis spesifik
pada minyak zaitun.
mengendapkan
protein
enzim,
selain
denaturasi oleh panas atau pH, sentrifugasi
diferensial, filtrasi gel, dan elektroforesis
(Martin et al. 1995). Penggunaan ammonium
sulfat disebabkan karena ammonium sulfat
mudah didapatkan, harganya relatif murah,
bersifat menstabilkan enzim (Yurnaliza
2002). Penambahan garam ammonium sulfat
dilakukan secara perlahan dan dilakukan
pengadukan secara terus menerus. Saat
pengadukan,
ammonium
sulfat
akan
berikatan dengan gugus ionik yang berada
pada ujung-ujung protein enzim. Pada
kondisi tertentu, garam ammonium sulfat
berada pada kondisi jenuh dan tidak dapat
terlarut lagi. Pada kondisi ini, molekulmolekul enzim yang telah berikatan dengan
ammonium
sulfat
meningkat
bobot
molekulnya sehingga terendapkan menjadi
pellet ketika disentrifugasi. Ekstrak kasar
enzim dengan penambahan ammonium sulfat
secara bertingkat selanjutnya disebut sebagai
fraksi (0-20)%, fraksi (20-40)%, fraksi (4060)%, dan fraksi (60-80)% ammonium sulfat.
Setelah penambahan garam, dilakukan
pemisahan enzim dengan sentrifugasi 10.000
rpm selama 15 menit pada suhu 4°C.
sentrifuse dilakukan pada suhu 4°C agar
enzim yang merupakan protein tidak rusak
akibat panas yang ditimbulkan oleh
sentrifuse. Enzim yang sudah terendapkan
setelah mengalami sentrifus berda pada pusat
sentrifugal,yaitu
menjadi
pellet
yang
menempel pada dinding tabung sentrifuse,
sedangkan media terpisahkan berupa filtrat.
Pellet yang dihasilkan selanjutnya dilarutkan
dalam larutan buffer sitrat pH 6 untuk
dilakukan pengukuran aktivitas enzim lipase
(Nurhasanah & Herasari 2008).
Aktivitas enzim mengalami peningkatan
seiring dengan tingkat kemurnian enzim.
Hubungan antara fraksi enzim yang
menentukan kemurnian enzim dengan
aktivitas enzim lipase dapat dilihat pada
Gambar 11. Enzim pada fraksi (60-80)%
memiliki aktivitas tertinggi. Hasil ini
memperlihatkan bahwa terjadi kenaikan

Gambar 11 Aktivitas lipase pad
ada beberapa
wfraksi enzim.
Karakterisasi Enzim Lipase
Lip
ktivitas enzim
Berdasarkan pengujian akti
emurnian (60lipase, fraksi enzim dengan pem
iliki aktivitas
80)% ammonium sulfat memili
terbaik. Fraksi enzim inii selanjutnya
dilakukan karakterisasi enzim pada
pad beberapa
kondisi pH dan suhu untuk menentukan
timum reaksi
kondisi pH dan suhu optim
enzimatis.
pada
Hasil pengujian aktivitass enzim
e
Gambar 12)
beberapa kondisi pH (Ga
ipase memiliki
menunjukkan bahwa enzim lipas
sebesar
aktivitas optimum pada pH 7,, yaitu
y
tivitas enzim
5.9593 U/mL. Pengujian aktiv
suhu
lipase pada pH optimum pada beberapa
be
menunjukkan bahwa aktivitas lipase
lipa optimum
tivitas sebesar
pada suhu 90ºC dengan aktivita
4.9019 U/mL (Gambar 13).
m dilakukan
Penentuan pH optimum
im lipase pada
dengan mengukur aktivitas enzim
pH.
substrat minyak zaitun dalam berbagai
be
kan adalah pH
Variasi pH media yang digunakan
ffer sitrat pH 3
3, 5, 7, dan 9 menggunakan buffe
bóraxdan 5, buffer fosfat pH 7, serta buffer
b
um dilakukan
borat pH 9. Pengujian pH optimum
pada suhu 37°C dengan menggunakan
m
metode titrimetri.

Gambar 12 menunjukkan bahwa
terdapat variasi aktivitas enzim padaa kkondisi
keasaman yang berbeda-beda. Ha
Hal ini
umumnya terjadi karena adanya peru
erubahan
struktur sekunder dan tersier dari enzim
im. Pada
pH yang optimum muatan gugus sa
samping
asam amino berada pada keadaan yang
ng sesuai
sehingga enzim sangat efisien dalam
mempercepat reaksi biokimia yangg sangat
spesifik. Aktivitas optimum lipase ddicapai
pada pH 7. Hal ini disebabkan karena
ena pada
kondisi pH 7 gugus pemberi dan pen
penerima
proton yang penting pada sisi katalitik
litik enzim
berada pada keadaan yang diing
iinginkan
sehingga aktivitas katalitiknya
tinggi
(Nurhasanah & Herasari 2008).
Penentuan suhu optimum dila
ilakukan
dengan cara menguji aktivitas enzim
m lipase
pada beberapa suhu dalam bufferr pH 7
sebagai kondisi pH optimum lipase
ase dan
diinkubasi 30 menit. Variasi suhu
hu yang
digunakan adalah 30ºC, 50ºC, 70ºC, dan 90ºC
(Sari 2008).
Hasil pengujian aktivitas lipase
se pada
beberapa pH tertera pada Gambar 13. Pada
temperatur kurang dari 50°C enzim
m cukup
stabil, tetapi hidrolisis substrat minyak
ak zaitun
oleh enzim tidak berjalan secara mak
aksimal.
Dengan meningkatnya temperatur,, energi
kinetik molekul-molekul yang be
bereaksi
bertambah sehingga molekul yang be
bereaksi
semakin banyak dan produk yang diha
ihasilkan
semakin besar. Enzim terus meng
engalami
peningkatan aktivitas sampai pada
da suhu
90°C. Di atas temperatur optimum, ak
aktivitas
enzim menurun tajam hal ini terjadii kkarena
enzim mengalami denaturasi protein
in yang
dapat merubah konformasi struktur m
molekul
sehingga enzim kehilangan sifat alamia
miahnya.
Pada temperatur tinggi, substrat juga
ga dapat
mengalami perubahan konformasi seh
sehingga
gugus reaktifnya mengalami hambatan
tan dalam
memasuki sisi aktif enzim (Suhartonoo 11989).
8

aktifitas lipase U/mL

sebesar 5.992 kali dibandingkan
n ekstrak
e
kasar
enzim. Aktivitas spesifik enzim
im dipengaruhi
oleh kadar protein, semakin tinggi
ting aktivitas
spesifik suatu enzim maka sem
emakin tinggi
kemurnian enzim tersebut.
t. Hal ini
isahan protein
menunjukkan terjadinya pemisah
lain yang bukan enzim. Meningkatnya
M
aktivitas spesifik pada tiap tahap
ap pemurnian
menunjukkan bahwa purifikasii enzim
e
yang
dilakukan cukup baik (Nurh
urhasanah &
Herasari 2008). Enzim deng
ngan tingkat
gi selanjutnya
kemurnian dan aktivitas tertinggi
dilakukan tahap karakterisasii enzim
e
pada
perlakuan pH dan suhu.

6

5,38725,9593
4,8039
4,7598

4
2
0

0

5
pH

10

Gambar 12 Penentuan pH optimum en
enzim
sssssssssssslipase.

Aktifitas Lipase (U/mL)

Sedangkan pada suhu yang lebih
ih rendah dari
suhu optimum, aktivitas enzim juga
ju rendah.
Hal ini disebabkan karena renda
dahnya energi
aktivasi yang tersedia. Energ
ergi tersebut
dibutuhkan untuk menciptaka
takan kondisi
tingkat kompleks aktif, baik dari
da molekul
enzim atau molekul substrat (Nu
Nurhasanah &
Herasari 2008).
6
5
4
3
2
1
0

3,9657

0

3,8294

4,4509

4,9019

50

Suhu

Amri E. Aktivitas amilase dan protease
ase yang
dihasilkan oleh isolat aktinom
omisetes
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matem
tematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam,, IInstitut
Pertanian Bogor.
Choughlan MP. 1985. The propertie
erties of
fungal and bacterial cellulose
se with
comment on their production
tion and
application. Biotechnology and G
Genetic
Engineering 3:39-109.
Crueger W, Crueger A, Brock TD,, editor.
1984. Biotechnology: A text bo
book of
industrial Microbiology. Sunde
nderland:
Minuaer Associates.

100

Gambar 13 Penentuan suhu optimum
optim
ssssssssssssenzim lipase.

ARAN
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
apanuli Utara
Mata air soda Parbubu, Tap
23
memiliki potensi mikrobial. Sebanyak
Se
isolat bakteri diperoleh dari mata
ma air soda
iliki aktivitas
tersebut. Isolat tersebut memili
lulase dengan
enzim lipase, protease, dan selula
ngan aktivitas
enzim lipase sebagai enzim deng
terbaik. Enzim lipase dengan pengendapan
p
lfat memiliki
(60-80)% ammonium sulfat
an fraksi lain,
aktivitas tertinggi dibandingkan
lipase
yaitu sebesar 3.5245 U/mL. Enzim
En
ada pH netral,
memiliki aktivitas optimum pada
an pada suhu
yaitu sebesar 5.9593 U/mL dan
.9019 U/mL.
90ºC dengan aktivitas sebesar 4.90

[DITA] Direktori Ikan dan Tanaman
an Air.
2003. Kesadahan air. Ornamenta
ntal Fish
Information Service Highligh
lights. .
[terhubung
berkala].
htt
http://ofish.com/direktori.php [22 fe
februari
2010].
Durham DR, Stewart DB, Stellwag EJ.
J. 1987.
Novel alkaline and heat stable
le serine
proteases from alkalaphilic Bacill
cillus sp.
strain GX6638. J. Bacterial 169:
69:27622768.
Foster EM, Nelson FE, ML Speck
eck, RN
Doetsch, Olson JCJr. 1961.. Dairy
Microbiology. New Jersey: Pr
Prentice
Hall.
Gilbert EJ, Cornish A, Jones C.. 1991.
Purification
and
properties
ties
of
extracellulear lipase from Pseudo
domonas
aeruginosa EF2. Journal of G
General
Microbiology 137:2223-2229.

Saran
n lebih lanjut
Perlu dilakukan penelitian
untuk identifikasi bakteri P9,, karakterisasi
k
sesuai,
enzim lipase pada substrat yang
ya
logam-logam inhibitor, nilai Km dan Vm.
an pengkajian
Selain itu juga perlu dilakukan
n karakterisasi
lebih lanjut tentang aktivitas dan
k
ri isolat-isolat
enzim protease dan selulase dari
yang diperoleh dari mata air soda
so Parbubu
lainnya.

AKA
DAFTAR PUSTAK
Akhdiya A. 2003. Isolasi bakter
teri penghasil
enzim protease alkalin termostabil.
Buletin Plasma Nutfah 9: 98-102.
98-

Hardjoko S, Indrati NS, T Bantacut.
ut. 1989.
Biokonversi: Pemanfaatan Li
Limbah
Industri Pertanian. Bogor:PAU IP
IPB.
Hasan R, Setiadama, Risdianto D, Supa
pardi K.
2007. Geologi daerah panass bumi
Sipoholon-Tarutung,
kabu
abupaten
Tapanuli Utara, Sumatera Utara.
ra. Pusat
Sumber Daya Geologi. [terh
terhubung
berkala].
http://www.bgl.esdm
m.go.id/
[20 Februari 2010].
Ilyas M. 2007.
Isolasi dan ident
entifikasi
mikoflora kapang pada sampell sserasah
daun tumbuhan di Kawasan G
Gunung
Lawu, Surakarta, Jawa
Te
Tengah.
Biodiversitas