Pengembangan metode organogenesis dan embriogenesis somatik pada nenas Serta deteksi dini untuk mereduksi keragaman somaklonal
PENGEMBANGAN METODE ORGANOGENESIS DAN
EMBRIOGENESIS SOMATIK PADA NENAS (Ananas comosus
(L.) Merr.) SERTA DETEKSI DINI UNTUK MEREDUKSI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Pengembangan Metode
Organogenesis dan Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.)
serta Deteksi Dini untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal adalah karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, 26 Juli 2012
Ika Roostika Tambunan
NRP A263090111
ABSTRACT
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN. Development of Organogenesis and Somatic
Embryogenesis Regeneration of Pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.) and Early
Detection to Reduce Somaclonal Variation. Supervised by NURUL KHUMAIDA,
GUSTAAF ADOLF WATTIMENA, and IKA MARISKA SOEDHARMA.
Pineapple is a unique plant belongs to facultative CAM (Crassulacean Acid
Metabolism) photosynthesis. It is highly potential to be planted on suboptimal land.
Conventionally, it can be propagated from many propagules but their reproductive
time is not uniform and this availability is commonly limited in cultivar Smooth
Cayenne. Today micropropagation is being used commercially in the pineapple
industry abroad but in Indonesia, the industries survive with conventional vegetative
propagation because of somaclonal variation. The main goal of the study was to
obtain the effective regeneration method of pineapple with high level of seedling
production and low level of somaclonal variation, included the artificial seed
formation method, the early detection method of somaclonal variation for eliminating
undesirable traits during micropropagation, and the method to reduce the level of
somaclonal variation during micropropagation. This study was devided into six
chapters, included the study of morhogenetic system (with solid and liquid media);
direct organogenesis induced by auxin and cytokinin (IAA, IBA, NAA, and BA);
indirect organogenesis and somatic embryogenesis induced by 2,4-D, picloram,
adenine sulfate, and N-organic compounds; encapsulation and minimal growth
induced by paclobutrazol, mannitol, and reduced temperature; morphological and
molecular characterization by using RAPD markers; and early detection to reduce of
somaclonal variation. Generally, this study has some novelities in the in vitro
characterization, the information of the non dead-end mechanism of rooted pineapple
explants, the information of the complete events of somatic embryogenesis, the
conservation method by minimal growth, and the large number of variants. The
result showed that the direct and indirect organogenesis generated high shoot
multiplication level. The use of mannitol (4%) was better than paclobutrazol for
storing the encapsulated explants for 4 months. The morphological characterization
could easily differentiate the normal and the abnormal variants (off-types). The direct
organogenesis showed the lower level of variation (1.6%) compare to the indirect
organogenesis (2%) and somatic embryogenesis (31.1%). The RAPD analysis
strengthened the occurence of somaclonal variation. The use of the new in vitro
cultures could reduce somaclonal variation. In conclusion, the direct organogenesis
was the effective regeneration method for mass propagation. The morphological
characterization of in vitro cultures can be applied as guidance for early detection
and elimination of undesirable variants in mass propagation. The in vitro
conservation method by mannitol can be applied to store pineapple cultures for
medium-term period. The use of the new in vitro population could reduce the level of
somaclonal variation.
Keywords: Organogenesis, somatic embryogenesis, synthetic seed, in vitro
conservation, somaclonal variation.
RINGKASAN
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN. Pengembangan Metode Organogenesis dan
Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta Deteksi Dini
untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal. Dibimbing oleh NURUL KHUMAIDA,
GUSTAAF ADOLF WATTIMENA, dan IKA MARISKA SOEDHARMA.
Nenas (Ananas comosus L. Merr.) merupakan tanaman yang unik karena
memiliki tipe fotosintesis CAM (Crassulacean Acid Metabolism) fakultatif sehingga
tergolong sebagai tanaman masa depan yang prospektif untuk dikembangkan secara
luas dalam rangka revitalisasi tanaman pertanian untuk mendukung era Revolusi
Hijau Lestari, terutama pada lahan marginal. Tanaman nenas memiliki propagul yang
beraneka ragam, tetapi umur panennya bervariasi sehingga kurang ideal sebagai
bahan perbanyakan tanaman secara masal. Kultivar Smooth Cayenne bahkan hanya
memiliki jenis dan jumlah propagul yang terbatas, yaitu berupa mahkota dan sucker.
Oleh karena itu, teknologi kultur in vitro dipandang sebagai solusi yang terbaik untuk
diterapkan. Sayangnya, isu keragaman somaklonal masih menjadi kendala utama
sehingga pengguna, khususnya pihak industri masih enggan menerapkan teknologi
tersebut. Tujuan utama penelitian ini adalah untuk memperoleh metode regenerasi
yang efektif (dengan tingkat multiplikasi tinggi dan tingkat keragaman rendah),
termasuk metode pembentukan benih sintetik, deteksi dini dan reduksi keragaman
somaklonal. Penelitian terbagi atas enam bagian, mencakup (1) studi morfogenesis
eksplan secara organogenesis langsung yang diinduksi oleh auksin dan sitokinin
(IAA, IBA, NAA, dan BA), (2) studi organogenesis dan embriogenesis tidak
langsung yang diinduksi oleh 2,4-D, (3) studi embriogenesis somatik tidak langsung
yang diinduksi oleh pikloram, (4) studi pembentukan benih sintetik dan konservasi in
vitro secara pertumbuhan minimal yang diinduksi oleh paklobutrazol atau manitol
dan modifikasi suhu penyimpanann, (5) studi karakterisasi morfologi dan molekuler
dengan penanda RAPD (10 primer) terhadap biakan dan bibit nenas, serta (6) studi
evaluasi keragaman bibit, deteksi dini, dan reduksi keragaman somaklonal. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa metode organogenesis langsung dan tidak langsung
mempunyai tingkat multiplikasi tunas yang lebih tinggi daripada embriogenesis
somatik tidak langsung. Pikloram lebih baik dalam menginduksi embriogenesis
somatik daripada NAA dan 2,4-D dengan tingkat multiplikasi 17 embrio/eksplan
selama 2 bulan dari struktur ETs (embryogenic tissues) atau 14 embrio/eksplan
selama 2.5 bulan dari struktur FETs (friable embryogenic tissues). Penggunaan
manitol (4%) lebih baik daripada penggunaan paklobutrazol maupun penurunan suhu
dalam menyimpan eksplan nenas dalam kondisi terenkapsulasi, dengan periode
simpan hingga 4 bulan. Terdapat 21 varian yang terdeteksi dari populasi biakan
induk, di mana 8 varian menunjukkan fenomena epigenetik, 8 varian menunjukkan
fenomena khimera, dan 7 varian menunjukkan kestabilan fenotipe di rumah kaca.
Karakterisasi secara morfologi membedakan varian dan tanaman kontrol dengan
koefisien kemiripan 0.49-0.91 (r=0.83). Karakterisasi molekuler memperkuat dugaan
terjadinya keragaman somaklonal. Berdasarkan karakterisasi tersebut, tanaman
kontrol dan varian memiliki koefisien kemiripan sebesar 0.32-0.61 (r=0.97). Ketidakstabilan fenotipe pada karakter duri pada daun diduga kuat disebabkan oleh
retrotransposon karena pola terbentuknya duri sama sekali tidak beraturan, bahkan
pada bibit yang dihasilkan dari metode embriogenesis somatik yang terbukti bersifat
unicellular origin. Metode embriogenesis somatik tidak langsung menghasilkan
keragaman fenotipe yang tertinggi (31.1%), diikuti dengan metode organogenesis
tidak langsung (2%) dan organogenesis langsung (1.6%). Populasi biakan in vitro
yang baru memiliki koefisien kemiripan genetik yang lebih tinggi (0.65-0.85)
daripada populasi lama, baik sebelum (0.32-0.61) maupun sesudah diekstraksi
dengan
menggunakan
mengindikasikan
3
bahwa
macam
metode
keragaman
regenerasi
somaklonal
(0.34-0.63).
dapat
direduksi
Hal
ini
dengan
menggunakan bahan tanaman yang baru. Disimpulkan bahwa organogenesis
langsung merupakan metode terbaik untuk mikropropagasi tanaman nenas.
Penggunaan manitol lebih baik daripada paklobutrazol untuk penyimpanan in vitro
dengan periode simpan 4 bulan. Metode karakterisasi morfologi dapat diterapkan
pada biakan in vitro untuk eliminasi varian yang tidak diharapkan selama proses
mikropropagasi secara dini. Teknik RAPD mengkonfirmasi dugaan terjadinya variasi
somaklonal pada kultur in vitro nenas.
Kata kunci: Organogenesis, embriogenesis somatik, benih sintetik, konservasi in
vitro, karakterisasi morfologi, karakterisasi molekuler, keragaman
somaklonal.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi oleh Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang
wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
PENGEMBANGAN METODE ORGANOGENESIS DAN
EMBRIOGENESIS SOMATIK PADA NENAS (Ananas comosus
(L.) Merr.) SERTA DETEKSI DINI UNTUK MEREDUKSI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Pemuliaan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul
:
Pengembangan Metode Organogenesis dan Embriogenesis
Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta
Deteksi Dini untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal
Nama
:
Ika Roostika Tambunan
NRP
:
A263090111
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.S.
Ketua
Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena, M.Sc.
Anggota
Prof. (R) Dr. Ika Mariska, APU
Anggota
Diketahui,
Ketua Mayor
Pemuliaan Bioteknologi Tanaman
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Tri Koesoemaningtyas, M.Sc.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Agr.
Tanggal Ujian: 26 Juli 2012
Tanggal lulus: 9 Agustus 2012
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof. Dr. Ir. Slamet Susanto, MAgr
Dr. Ir. Darda Efendi, MSi
Penguji pada Ujian Terbuka: Dr. Ir. Sobir, MS
Dr. Ir. Yusdar Hilman, MSc
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala
petunjuk dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Disertasi
ini mengangkat topik tentang Pengembangan Metode Organogenesis dan
Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta Deteksi Dini
untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal. Penelitian tersebut dilaksanakan sejak
Februari 2010 hingga April 2012.
Disertasi ini memuat enam bab yang merupakan pengembangan dari naskah
artikel yang diajukan ke jurnal dan pertemuan ilmiah. Bab 2 telah diterbitkan pada
Jurnal Agrobiogen Vol.8 No.1 Th. 2012 dengan judul Indirect organogenesis and
somatic embryogenesis of pineapple induced by dichlorophenoxy acetic acid. Bab 3
sedang dalam proses penerbitan pada Indonesian Journal of Agricultural Science
dengan judul The effect of picloram and light on somatic embryogenesis
regeneration of pineapple. Bab 4 sedang diajukan ke Jurnal Hortikultura dengan
judul Pembentukan Benih Sintetik Nenas dan Konservasi In Vitro secara
Pertumbuhan Minimal. Bab 5 masih dalam proses pendampingan publikasi pada
jurnal internasional (Plant Cell Tissue and Organ Culture) dengan judul
Morphological characterization of pineapple in vitro cultures and acclimated
seedlings. Bab 6 akan disampaikan pada International Seminar on Agriculture
Adaptation in The Tropics dengan judul Molecular characterization of pineapple in
vitro cultures for detecting plant off-types during micropropagation.
Penghargaan yang setinggi-tingginya disampaikan kepada Badan Litbang
Pertanian yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan
studi S3 dan atas dukungan dana penelitian melalui Program KKP3T 2011. Terima
kasih yang tidak terhingga penulis ucapkan kepada Dr. Nurul Khumaida, Prof. Dr.
G.A. Wattimena dan Prof. (R) Dr. Ika Mariska sebagai komisi pembimbing. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Sutrisno, Dr. Karden Mulya (Kepala BBBiogen), Dr. Sobir, Dr. Wicaksono, Prof. Dr. Sudarsono, Prof. Dr. Wasmen Manalu,
Dr. Tri Koesoemaningtyas, Dr. Endah Retno Palupi, Prof. Dr. Bambang S. Purwoko,
dan Dr. Made Tasma yang telah memberikan dukungan sebelum dan semasa
penelitian serta pemahaman, saran dan masukan dalam penelitian maupun
penyusunan naskah publikasi ilmiah. Kepada penguji luar komisi, Dr. Agus Purwito
dan Dr. Sintho W. Ardie (pada ujian Prakualifikasi Doktor), Prof. Dr. Slamet Susanto
dan Dr. Darda Efendi (pada Ujian Tertutup) serta Dr. Yusdar Hilman, APU dan Dr.
Sobir (pada Ujian Terbuka), disampaikan terima kasih. Terima kasih juga ditujukan
kepada teman-teman sejawat dan rekan-rekan teknisi di Kelti BSJ BB-Biogen serta
rekan-rekan mahasiswa pascasarjana IPB. Rasa cinta dan terima kasih juga
disampaikan kepada Ibunda dan Ayahanda (Ibu Suhaesih dan Alm. Djamian
Tambunan), suami (Faleh Setia Budi, MT.), ananda (Furaida Alya Muna) serta
keluarga besar dan seluruh pihak yang telah memberikan dukungan moril, dan
spirituil. Besar harapan penulis akan seluas-luasnya manfaat dari hasil karya ini.
Bogor, Juli 2012
Ika Roostika Tambunan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Magelang pada tanggal 12 September 1972 sebagai
anak kedua dari pasangan Djamian Tambunan dan Suhaesih. Pendidikan sarjana
ditempuh pada Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Program Studi Fitopatologi,
Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, lulus pada tahun 1997. Pada tahun
1999, penulis diterima sebagai mahasiswa pascasarjana pada Program Studi
Agronomi dengan peminatan Pemuliaan Non Konvensional Institut Pertanian Bogor,
lulus pada tahun 2003. Kesempatan untuk melanjutkan studi ke program doktor pada
Program Studi Pemuliaan Bioteknologi Tanaman IPB diperoleh pada tahun 2009,
dengan beasiswa dari Badan Litbang Pertanian.
Sejak lulus sebagai sarjan hingga saat ini, penulis bekerja di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
Bogor. Bidang keahlian adalah Bioteknologi Pertanian dengan spesifikasi kultur in
vitro, terutama pada aspek konservasi in vitro (pertumbuhan minimal dan
kriopreservasi) serta variasi somaklonal.
Selama mengikuti program S3, penulis mengikuti beberapa macam pelatihan,
yaitu penulisan publikasi pada jurnal internasional, perancangan percobaan, dan
bahasa Inggris. Karya ilmiah yang berjudul Indirect organogenesis and somatic
embryogenesis of pineapple induced by dichlorophenoxy acetic acid telah
diterbitkan pada Jurnal Agrobiogen Vol.8 No.1 Th. 2012. Artikel lainnya yang
berjudul The effect of picloram and light on somatic embryogenesis regeneration
of pineapple menunggu penerbitannya pada Indonesian Journal of Agricultural
Science (Jurnal IJAS), sedangkan naskah yang berjudul Morphological
characterization of pineapple in vitro cultures and acclimated seedlings masih
dalam proses pendampingan publikasi pada jurnal internasional (Plant Cell Tissue
and Organ Culture). Naskah yang berjudul Pembentukan Benih Sintetik Nenas
dan Konservasi In Vitro secara Pertumbuhan Minimal sedang diajukan ke Jurnal
Hortikultura dan naskah yang berjudul Molecular characterization of pineapple in
vitro cultures for detecting plant off-types during micropropagation akan
disampaikan pada International Seminar on Agriculture Adaptation in The Tropics.
Karya-karya tersebut merupakan bagian dari program S3 penulis.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ………………………………………………………..
Halaman
viii
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………….
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang ……………………………………………………
Tujuan Penelitian …………………………………………………
Manfaat Penelitian ………………………………………………..
Ruang Lingkup Penelitian ………………………………………..
1
3
4
5
TINJAUAN PUSTAKA
Taksonomi, Morfologi, Anatomi, dan Nilai Penting Nenas ……………..
Perbanyakan In Vitro ……………………………………………………..
Konservasi In Vitro ………………………………………………...........
Fenomena Keragaman Somaklonal ………………………………………
Deteksi Keragaman Somaklonal ………………………………………….
6
9
12
13
14
STUDI MORFOGENESIS EKSPLAN NENAS YANG DIINDUKSI
OLEH AUKSIN DAN SITOKININ
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
16
16
17
19
20
29
30
ORGANOGENESIS DAN EMBRIOGENESIS SOMATIK TIDAK
LANGSUNG PADA NENAS YANG DIINDUKSI OLEH 2,4-D
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
32
32
33
35
38
48
48
INDUKSI EMBRIOGENESIS SOMATIK TIDAK LANGSUNG PADA
NENAS MELALUI PENGGUNAAN PIKLORAM
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
51
52
52
54
57
70
71
PEMBENTUKAN BENIH SINTETIK NENAS DAN KONSERVASI
IN VITRO SECARA PERTUMBUHAN MINIMAL
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
74
74
75
76
79
90
90
KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN MOLEKULER BIAKAN
IN VITRO DAN BIBIT NENAS
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
93
94
94
96
99
112
113
EVALUASI KERAGAMAN BIBIT NENAS DARI POPULASI LAMA
DAN PEMBENTUKAN POPULASI BARU SERTA DETEKSI DINI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
116
116
117
119
122
133
134
PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………..
136
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………
149
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….
150
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Status penelitian kultur in vitro nenas di mancanegara ........................
10
2
Status penelitian kultur in vitro nenas di Indonesia dan peluang
risetnya ……………………………………………………….............
11
3
Data produksi buah-buahan di Indonesia tahun 1995-2009 ………….
18
4
Penampilan kalus embriogenik nenas kultivar Smooth Cayenne pada
beberapa macam formulasi media, 2 bulan setelah subkultur ..............
45
Pengaruh media dasar dan adenin sulfat terhadap pertumbuhan FETs
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………………………...
45
Respon kalus nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap media induksi
kalus embriogenik pada dua macam kondisi inkubasi yang berbeda,
1 bulan setelah subkultur ……………………………………………..
61
Perkembangan ETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media MS
yang mengandung Kn 1 mg l-1, 2 bulan setelah subkultur
65
Pengaruh pencahayaan dan formulasi media terhadap pembentukan
suspensi sel nenas kultivar Smooth Cayenne .......................................
68
Tingkat pencoklatan FETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada
media regenerasi, 1 bulan setelah subkultur ………………………….
69
Tingkat regenerasi FETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media
regenerasi, 1 bulan setelah subkultur ………………………….
69
Jumlah embrio somatik dewasa yang terbentuk dari FETs nenas
kultivar Smooth Cayenne, 1 bulan setelah subkultur ………………...
70
Pengaruh suhu penyimpanan terhadap pertumbuhan biakan tunas
nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dalam Naalginat 3% ……………………………………………………….........
83
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Pengaruh suhu penyimpanan dan taraf manitol terhadap daya tembus
biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dengan
Na-alginat 3% ………………………………………………………...
88
Pengaruh suhu penyimpanan dan taraf manitol terhadap daya hidup
biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dengan
Na-alginat 3% ………………………………………………………...
89
Karakter dan sub karakter yang diamati pada fenotipe normal dan
varian dari biakan in vitro nenas kultivar smooth Cayenne (umur 4
tahun) ………………………………………………………................
98
Ciri-ciri spesifik dari varian yang muncul dari populasi biakan
in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun ........................
103
Proporsi varian yang muncul dalam populasi biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun ……………………………...
104
Stabilitas fenotipe setiap individu varian nenas kultivar Smooth
Cayenne dan regenerannya selama subkultur dan aklimatisasi ............
107
Jumlah pita DNA yang teramplifikasi dan yang bersifat polimorfik
dalam analisis RAPD populasi biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 4 tahun ……………………………………………....
109
Proporsi variasi fenotipe dari populasi biakan in vitro nenas kultivar
Smooth Cayenne yang dihasilkan dari metode organogenesis
(langsung dan tidak langsung serta embriogenesis somatik tidak
langsung................................................................................................
125
Rekapitulasi tingkat variasi dari biakan in vitro yang dihasilkan dari
tiga macam metode regenerasi dibandingkan dengan populasi biakan
induk.....……………………………………………………….............
126
Proporsi bibit yang tidak berduri, berduri khimera, dan berduri
lengkap yang dihasilkan dari metode organogenesis langsung yang
diinduksi oleh BA dan NAA................................................................
126
Proporsi bibit nenas kultivar Smooth Cayenne dengan daun tidak
berduri, berduri khimera, dan berduri lengkap yang dihasilkan dari
metode organogenesis tidak langsung yang diinduksi oleh
2,4-D......................................................................................................
127
Proporsi bibit nenas kultivar Smootha Cayenne dengan daun tidak
berduri, berduri khimera, dan berduri lengkap yang dihasilkan dari
metode embriogenesis somatik yang diinduksi oleh pikloram ........….
128
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Diagram alir tahapan penelitian dalam studi pengembangan metode
organogenesis dan embriogenesis somatik pada nenas serta deteksi
dini untuk mereduksi keragaman somaklonal ………………………....
6
2
Berbagai macam organ vegetatif tanaman nenas………………………
8
3
Keragaan kultur nenas kultivar Smooth Cayenne yang berasal dari
eksplan basal daun (1 bulan setelah tanam) …………………………...
21
Pengaruh tipe eksplan dan ZPT serta pengaruh interaksi antara tipe
eksplan dan ZPT terhadap morfogenesis eksplan basal daun nenas
kultivar Smooth Cayenne pada media padat.............................………..
23
Penampilan kalus nenas pasca-perlakuan NAA dan tipe sel yang
menyusunnya …………………………………………………………..
25
Pembelahan sel secara asimetris dari sel embriogenik yang diiduksi
oleh NAA ………………………………………………………….......
25
Pengaruh kombinasi sitokinin dan auksin pada media cair terhadap
pembentukan tunas, nodul, dan akar kultur in vitro nenas kultivar
Smooth Cayenne yang berasal dari eksplan daun utuh dan potongan
basal daun, umur 1.5 bulan ……………………………………………
27
4
5
6
7
8
9
Pengaruh kombinasi sitokinin dan auksin pada media cair terhadap
jumlah tunas kultur in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne yang
berasal dari eksplan daun utuh dan potongan basal daun ...... ................
28
Tahapan morfogenesis dari eksplan daun nenas kultivar Smooth
Cayenne pada media cair ……………………………………………....
29
Tahapan analisis histologi kalus embriogenik nenas, modifikasi
metode Kiernan (1990) ………………………………………………...
37
11
Tahapan induksi kalus dari basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne
38
12
Pengaruh 2,4-D terhadap pembentukan kalus dan bobot basah kalus
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………………………….
39
Respon basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap
perlakuan 2,4-D ..................................................... ……………………
40
10
13
14
Penampilan tunas in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne hasil
perlakuan 2,4-D pada tahap regenerasi dan elongasi .............................
41
Pengaruh 2,4 terhadap persentase pembentukan tunas normal, tunas
abnormal, dan konversi dari tunas abnormal ke tunas
normal.....……………………………………………….........................
42
Penampilan jaringan embriogenik nenas kultivar Smooth Cayenne
pada berbagai macam media …………………………………………..
43
17
Tahapan embriogenesis somatik nenas kultivar Smooth Cayenne ........
44
18
Pengaruh faktor tunggal dan pengaruh interaksi antara media induksi
kalus embriogenik dan media regenerasi terhadap regenerasi FETs
nenas kultivar Smooth Cayenne .............................................................
46
Perbedaan perkembangan embrio somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 8 bulan pada media regenerasi ………………………...
47
Pengaruh pikloram terhadap pembentukan kalus dan bobot basah dari
eksplan basal daun nenas kultivar Smooth cayenne …………………...
58
Respon basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap
perlakuan pikloram dan pengamatan mikroskopisnya ………………...
59
Pengamatan mikroskopis dari ECCs nenas kultivar Smooth Cayenne
setelah ditanam pada media induksi kalus embriogenik ………………
60
23
Penampilan ETs dan FETs nenas kultivar Smooth Cayenne ...………..
62
24
Pengaruh faktor tunggal (media dan pencahayaan) terhadap tingkat
pencoklatan, persentase pembentukan nodul, persentase pembentukan
embrio, dan jumlah embrio prematur (2 bulan setelah subkultur) .........
64
Regenerasi ETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media MS
dengan penambahan Kn 1 mg l-1 ………………………………………
66
Pengaruh faktor pencahayaan dan media induksi kalus embriogenik
serta pengaruh interaksinya terhadap pembentukan embrio somatik
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………..……………...…
66
Tahapan perkembangan embrio somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne dari struktur FETs yang diinduksi oleh pikloram ....................
67
Analisis histologi embrio somatik dari kultur suspensi sel nenas
kultivar Smooth Cayenne .......................................................................
68
15
16
19
20
21
22
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Pengaruh BA dan NAA terhadap pertumbuhan eksplan batang semu
nenas kultivar Smooth Cayenne yang dienkapsulasi dalam Na-alginat
3%, 1 bulan masa inkubasi ……………………………………………
80
Keragaan eksplan batang semu nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dienkapsulasi dengan Na-alginat 3% (1 bulan masa inkubasi) ..............
81
Proporsi pembentukan planlet, akar, dan nodul dari eksplan basal daun
nenas kultivar Smooth Cayenne yang diinduksi oleh BA 0.5 mg l-1 dan
NAA 0.5 mg l-1, 2 bulan periode inkubasi .............................................
82
Pengaruh kombinasi BA dan NAA terhadap pertumbuhan eksplan
basal daun nenas kultivar Smootha Cayenne yang terenkapsulasi
dalam Na-alginat 3% …………………………………………………..
82
Penampilan tunas nenas kultivar Smooth Cayenne yang dienkapsulasi
dengan alginat 3% yang mengandung paklobutrazol dan disimpan
pada suhu yang berbeda ……………………………………………….
84
Daya hidup, daya regenerasi dan jumlah tunas nenas kultivar Smooth
Cayenne pada tahap pemulihan pasca penyimpanan dengan
paklobutrazol ..........................................................................................
86
Penampilan tunas nenas kultivar Smooth Cayenne pada tahap
pemulihan (1 bulan) pasca-penyimpanan dengan paklobutrazol ...........
86
Penampilan kapsul embrio somatik nenas kultivar Smooth Cayenne
(4 bulan periode simpan) yang disimpan dengan menggunakan
manitol pada suhu penyimpanan yang berbeda ......................................
89
Keragaan varian dari populasi biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 4 tahun …………………………………………………
100
Dendogram hasil karakterisasi morfologi biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun, berdasarkan metode (SAHN)UPGMA (r=0.83) …………………………………………...................
102
Kualitas DNA hasil isolasi sampel daun nenas kultivar Smooth
Cayenne dengan metode CTAB ……………………………………….
107
Profil DNA varian nenas kultivar Smooth Cayenne, hasil amplifikasi
PCR dengan penanda RAPD …………………………………………..
111
Dendogram hasil karakterisasi molekuler biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun, menggunakan metode RAPD,
berdasarkan analisis (SAHN)-UPGMA (r=0.97) …………….
112
42
43
44
45
46
47
48
Tingkat keragaman bibit nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dihasilkan dari tiga metode regenerasi ………………………………...
123
Profil DNA biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang diekstraksi
dari populasi biakan induk ………………………... .............................
129
Dendogram hasil evaluasi keragaman genetik (dengan penanda
RAPD, r=0.98) bibit nenas kultivar Smooth Cayenne populasi lama
yang diperbanyak secara organogenesis langsung, organogenesis tak
langsung, dan embriogenesis somatik ………………………………..
130
Profil DNA dari populasi baru biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne ………………………………………………………………..
132
Dendogram hasil deteksi dini keragaman somaklonal biakan in vitro
nenas kultivar Smooth Cayenne dari populasi baru dengan penanda
RAPD (r=0.96) ………………………………………………………...
133
Tahapan lengkap embriogenesis somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne ………………………………………………………………
140
Tahapan lengkap organogenesis nenas kultivar Smooth Cayenne …...
141
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
Tanaman CAM fakultatif
: tanaman yang berfotosintesis tipe CAM ketika
lingkungan tumbuhnya suboptimal dan
berfotosintesis tipe C3 atau C4 ketika lingkungan
tumbuhnya optimal (nenas bertipe C3-CAM)
Propagul
: bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai
bahan perbanyakan
Mikropropagasi
: teknik perbanyakan mikro untuk produksi bibit
Aklimatisasi
: proses penyesuaian fisiologi bibit tanaman dari
kondisi in vitro ke kondisi ex vitro
Multiplikasi
: tingkat penggandaan tunas atau bibit
Proliferasi tunas
: teknik perbanyakan in vitro melalui penggandaan
tunas aksilar
Organogenesis
: proses pembentukan organ yang bersifat unipolar
(satu kutub) berupa tunas atau akar
Embriogenesis somatik
: proses pembentukan embrio yang bersifat bipolar
(dua kutub), diregenerasikan dari sel-sel somatik
Suspensi sel
: kultur sel yang terdispersi di dalam media cair
yang selalu digoyang
Pertumbuhan minimal
: suatu teknik konservasi in vitro untuk
penyimpanan jangka menengah melalui modifikasi
unsur hara, sumber karbon, suhu penyimpanan,
penggunaan zat penghambat tumbuh dan retardan
Keragaman somaklonal
: keragaman yang terjadi pada sel-sel somatik,
disebabkan oleh mutasi atau perubahan sekuens
DNA, aktivasi atau pembungkaman gen
Syncarp
: sejumlah bakal buah yang membentuk satu ruang,
daun fertil pendukung makrospora berupa bakal biji
(ovulum) yang secara kolektif membentuk putik
Eksplan
: bahan tanaman yang digunakan dalam penanaman
secara in vitro
BA
: benzyl adenine, sitokinin turunan purin
Kn
: kinetin, sitokinin turunan purin
TDZ
: thidiazuron, secara fisiologis fungsinya sama
dengan sitokinin, turunan fenilurea
IAA
: indole acetic acid, auksin alami
NAA
: naphthalene acetic acid
IBA
: indole butyric acid
Gln
: glutamine, asam amino
Arg
: arginine, asam amino
Gly
: glycine, asam amino
CH
: casein hydrolysate, senyawa organik kompleks
AdS
: adenine sulfate, senyawa organik sumber nitrogen
2,4-D
: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
Pikloram
: 4-amino 3,5,6-trichloropicolinic acid
Sel embriogenik
: sel yang akan berdiferensiasi membentuk embrio melalui
pembelahan yang bersifat asimetris
Pro-embrio
: calon embrio yang terbentuk dari sel embriogenik
PEM
: pre-embryogenic mass, kumpulan atau massa proembrio
ETs
: embryogenic tissues
FETs
: friable embryogenic tissues
Planlet
: tanaman utuh yang telah lengkap mempunyai tunas dan
akar, dihasilkan dari regenerasi secara in vitro
Nekrosis
: gejala matinya sel dan berasosiasi dengan degradasi
klorofil yang disebabkan oleh oksidasi fenol
Paklobutrazol
: senyawa sintetik golongan triazol yang berfungsi sebagai
retardan
Manitol
: gula alkohol yang dapat berfungsi sebagai regulator
osmotik (pengatur tekanan osmotikum) media
Amplifikasi
: proses penggandaan molekul DNA
EtBr
: ethidium bromide
CTAB
: cetyl trimethyl amonium bromide
PCR
: polymerase chain reaction, proses polimerisasi DNA
secara in vitro
Denaturasi
: proses pemisahan DNA dari ikatan ganda menjadi utas
tunggal
Elektroforesis
: teknik pemisahan molekul berdasarkan gerakan yang
berbeda pada medan listrik
RAPD
: randomly amplified polymorphism DNA
Epigenetik
: perubahan sifat yang tidak disebabkan oleh perubahan
sekuens DNA, bersifat dapat balik
Monomorfik
: pola pita DNA yang sama antar individu
Polimorfik
: pola pita DNA yang berbeda antar individu
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nenas (Ananas comosus L. Merr.) merupakan tanaman penting di daerah
tropis, termasuk di Indonesia. Berdasarkan data produksi buah-buahan, komoditas
nenas menempati peringkat ketiga atau keempat setelah pisang, mangga, dan jeruk
(BPS 2009). Tanaman ini bersifat toleran terhadap cekaman kekeringan dan
kemasaman sehingga berpeluang besar dikembangkan di lahan-lahan marginal,
termasuk lahan gambut (Sagiman 2007).
Menurut Ochse et al. (1961) serta Coppens d’Eeckenbrugge dan Leal (2003),
tanaman nenas pada umumnya diperbanyak secara vegetatif dengan menggunakan
butt atau stump, ratoon, sucker, basal slips, hapas, crown slips, dan crown atau
mahkota. Sayangnya, jenis dan jumlah propagul tersebut sangat terbatas pada
kultivar Smooth Cayenne (sucker dan mahkota) sehingga perbanyakan secara
konvensional perlu dukungan teknologi lainnya, terutama ketika diperlukan bibit
dalam jumlah yang besar. Penerapan teknologi kultur in vitro akan berguna bagi
penyediaan materi genetik calon varietas unggul maupun perbanyakan varietas
unggul yang baru saja dilepas, serta pembukaan lahan baru untuk pengembangan
komoditas tersebut secara luas.
Di mancanegara, beberapa kultivar nenas telah dikembangkan secara
komersial, antara lain Cayenne (Champaka, Giant Kew, Sarawak, Maipuri,
Esmeralda, Claire, dan Typhon), Queen, Spanish (Red Spanish dan Singapore
Spanish), Perola (Pernambuco atau Abacaxi), Manzana, dan Perolera (atau Motilana)
(IBPGR 1991; Chan et al. 2003). Di antara beberapa kultivar tersebut, Queen dan
Smooth Cayene merupakan kultivar yang banyak dikembangkan di Indonesia.
Teknik mikropropagasi nenas telah diterapkan secara komersial oleh pihak
industri di mancanegara (Smith et al. 2003), tetapi industri di Indonesia masih
bertahan pada teknik perbanyakan konvensional. Teknik mikropropagasi masih
dipandang perlu diterapkan untuk menyediakan bibit dalam jumlah besar, terutama
untuk varietas baru hasil persilangan, seleksi, mutasi, dan rekayasa genetika
(Firoozabady dan Moy 2004; Nursandi et al. 2005). Secara praktis, mikropropagasi
digunakan untuk memantapkan blok multiplikasi bagi penyediaan bahan tanaman
perbanyakan konvensional dalam skala yang lebih luas. Selain itu, teknik
mikropapagasi dapat diterapkan untuk skrining varian sebelum diterapkannya
metode perbanyakan secara konvensional (Smith et al 2003). Dalam rangka
peningkatan produksi, populasi tanaman akan ditingkatkan dari 40.000 tanaman/ha
menjadi 100.000 tanaman/ha sehingga keperluan penyediaan bibit akan semakin
tinggi (Suminar 2010).
Dalam teknik kultur in vitro, terjadinya keragaman genetik atau keragaman
somaklonal (off-type) kadang-kadang tidak dapat dihindari. Keragaman somaklonal
merupakan kejadian abnormalitas yang terjadi oleh karena mutasi atau perubahan
sekuens, aktivasi gen, dan pembungkaman gen (Kaeppler et al. 2000). Keragaman
tersebut dapat dideteksi melalui karakterisasi morfologi (Noor et al. 2009; Somsri et
al. 2009; Zhao et al. 2005; Podwyszyńska 2005), sitologi (Al-Zahim et al. 1999),
biokimia, fisiologi (Perez et al. 2011), dan molekuler (Chen et al. 1998; Al-Zahim et
al. 1999; Soniya et al. 2001; Perez et al. 2011).
Wakasa (1979) telah melakukan pengamatan bibit nenas hasil kultur in vitro
1.5 tahun dalam periode in vitro, 14-22 bulan pada tahap aklimatisasi, dan 1 tahun
periode pertumbuhan tanaman melalui pengamatan karakter morfologi, yaitu duri
pada daun, warna daun, sekresi lilin pada permukaan daun bawah, dan corak daun.
Diperlukan waktu sekitar 4 tahun untuk mendeteksi keragaman yang terjadi pada
bibit hasil perbanyakan secara in vitro tersebut. Nursandi (2006) melaporkan bahwa
perlakuan in vitro dapat menimbulkan keragaman tanaman nenas hingga 88% untuk
karakter daun varigata, roset, dan kerdil, namun sebagian besar tanaman tersebut
mampu berubah menjadi normal setelah umur tertentu (25 minggu setelah tanam),
yang diduga sebagai epigenetik.
Untuk efisiensi waktu, biaya, dan area maka evaluasi stabilitas sifat tersebut
sebaiknya dilakukan secara dini, sejak biakan masih di dalam botol sebelum tanaman
tersebut ditanam di lapang. Selain itu, penggunaan penanda molekuler menjadi
sangat penting dalam membantu upaya mendeteksi keragaman somaklonal secara
dini.
Pada tanaman nenas, deteksi penyimpangan secara molekuler banyak
diterapkan dengan menggunakan penanda RAPD (Random Amplified Polymorphism
DNA). Soneji et al. (2002) telah mengkarakterisasi bibit nenas kultivar Queen untuk
sifat daun berduri dan tidak berduri dengan penanda RAPD. Feuser et al. (2003) juga
menganalisis ketepatan genetik planlet nenas kultivar Amarelinho (grup Perola) dan
Santos et al. (2008) melakukan evaluasi keragaman genetik dari biakan in vitro nenas
hias (Ananas comosus var. bracteatus) dengan menggunakan penanda RAPD.
Hingga saat ini, belum terdapat laporan tentang analisis keragaman somaklonal
terhadap biakan dan bibit nenas hasil perbanyakan in vitro yang dikulturkan dalam
periode yang panjang.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk memperoleh metode regenerasi yang
efektif (tingkat multiplikasi tinggi dan tingkat keragaman rendah), termasuk metode
pembentukan benih sintetik tanaman nenas, metode deteksi dini keragaman
somaklonal untuk eliminasi varian yang tak diharapkan, dan metode reduksi
keragaman somaklonal. Tujuan khusus penelitian ini adalah:
1. Mempelajari morfogenesis eksplan nenas kultivar Smooth Cayenne dalam
merespon zat pengatur tumbuh (ZPT) dan konsistensi media
2. Memperoleh informasi tentang pengaruh kombinasi sitokinin (benzyl adenine/
BA) dan auksin (naphthalene acetic acid/NAA, indole acetic acid/IAA, indole
butiric acid/IBA) terhadap regenerasi nenas kultivar Smooth Cayenne secara
organogenesis langsung
3. Mempelajari pengaruh auksin non herbisida NAA dan auksin herbisida 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) atau 4-amino 3,5,6-trichloropicolinic acid
(pikloram) terhadap induksi organogenesis dan embriogenesis somatik tidak
langsung pada nenas kultivar Smooth Cayenne
4. Mempelajari pengaruh suhu dan paklobutrazol atau manitol terhadap daya hidup,
daya simpan, dan daya regenerasi eksplan nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dienkapsulasi dengan natrium alginat 3%
5. Mempelajari karakter morfologi dan molekuler biakan in vitro dan bibit nenas
kultivar Smooth Cayenne
6. Mengetahui tingkat keragaman biakan dan bibit nenas kultivar Smooth Cayenne
yang dihasilkan dari metode organogenesis langsung dan tidak langsung, serta
embriogenesis somatik tidak langsung
7. Mendeteksi keragaman molekuler biakan in vitro dari populasi yang baru dibentuk
untuk menentukan metode perbanyakan yang paling efektif.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini tidak hanya bermanfaat bagi perkembangan ilmu dasar,
namun juga bagi perkembangan ilmu terapan. Pada aspek ilmu dasar, penelitian ini
berhasil mengantisipasi fenomena dead-end pada eksplan yang berakar sehingga
mampu meregenerasikan tunas. Penelitian ini juga berhasil menjelaskan proses
embriogenesis somatik tanaman monokotil (khususnya tanaman nenas) secara
lengkap serta asal-usul pembentukan embrio somatik. Beberapa tahapan penting
dalam teori embriogenesis somatik berhasil terekam atau tervisualisasi (mulai dari
sel tunggal hingga terbentuknya planlet yang siap diaklimatisasi) sehingga akan
memudahkan pengguna dalam memahami proses tersebut maupun dalam menyusun
strategi penelitian yang berkaitan dengan proses tersebut. Penelitian ini juga
berkontribusi dalam upaya menguak misteri asal-usul terjadinya keragaman
somaklonal pada tanaman nenas. Pada aspek ilmu terapan, hasil penelitian ini
bermanfaat bagi upaya penyediaan metode perbanyakan bibit yang efektif untuk
perbanyakan materi pemuliaan (calon varietas baru) maupun produksi bibit secara
masal setelah pelepasan varietas baru serta untuk penyediaan bibit yang memadai
bagi pembukaan lahan-lahan baru. Metode embriogenesis somatik yang telah
dihasilkan dapat dimanfaatkan untuk melakukan rekayasa seluler (berbasis pada
teknik kultur in vitro) dan molekuler (berbasis pada teknik transformasi genetik)
untuk mendukung program pemuliaan tanaman nenas. Metode pembentukan benih
sintetik akan berguna bagi penyediaan benih yang aplikatif dan untuk konservasi in
vitro (secara pertumbuhan minimal) dalam upaya pelestarian koleksi plasma nutfah
dan nomor-nomor hasil persilangan sehingga terhindar dari resiko hilangnya
genotipe oleh cekaman lingkungan biotik dan abiotik di lapang serta dapat
menghemat tempat, waktu, biaya, dan tenaga. Manfaat lainnya adalah mendapatkan
metode deteksi keragaman somaklonal tanaman nenas secara dini untuk eliminasi
varian yang tidak diharapkan, sebelum bibit ditanam di lapang sehingga dapat
meningkatkan efisiensi produksi bibit. Selain itu, varian-varian yang dihasilkan
dalam penelitian ini juga dapat dimanfaatkan sebagai bahan pemuliaan tanaman atau
bahkan sebagai kandidat klon superior. Secara umum, hasil penelitian ini akan
bermanfaat bagi pengembangan komoditas nenas di Indonesia.
Ruang Lingkup Penelitian
Untuk mencapai tujuan penelitian tersebut maka dibuat suatu strategi dengan
serangkaian kegiatan penelitian secara komprehensif. Penelitian ini diawali dengan
studi karakterisasi morfologi dan molekuler dari populasi biakan in vitro lama
(berumur 4 tahun) yang selanjutnya digunakan sebagai biakan induk. Evaluasi
keragaman fenotipe bibit di rumah kaca juga dilakukan terhadap populasi tanaman
dari biakan induk tersebut. Penelitian dilanjutkan dengan melakukan studi
morfogenesis eksplan pada media padat dan cair secara organogenesis langsung
(yang diinduksi oleh auksin dan sitokinin), studi regenerasi secara organogenesis dan
embriogenesis somatik secara tidak langsung dengan menggunakan eksplan dari
biakan induk (yang diinduksi oleh auksin herbisida). Studi morfogenesis dilakukan
pula terhadap eksplan (batang semu, basal daun, tunas in vitro, dan embrio somatik)
yang dienkapsulasi dengan natrium alginat untuk pembentukan benih sintetik dan
konservasi in vitro secara pertumbuhan minimal melalui penerapan modifikasi suhu
penyimpanan dan penggunaan paklobutrazol atau manitol. Selain itu, juga dilakukan
evaluasi fenotipe dan stabilitas genetik biakan in vitro dan bibit aklimatisasi hasil
ekstraksi dari biakan induk menggunakan 3 macam metode regenerasi. Setelah itu,
dilakukan pembentukan populasi biakan in vitro yang baru (0 tahun) serta
pendeteksian keragaman somaklonal secara morfologi dan molekuler. Secara umum,
ruang lingkup kegiatan penelitian ini dijelaskan pada diagram alir penelitian
(Gambar 1).
Pembentukan populasi baru
biakan in vitro dan deteksi
dini keragaman somaklonal
Populasi lama biakan in vitro
(umur 4 tahun)
Studi morfogenesis
eksplan
Organogenesis
langsung pada media
cair
Studi organogenesis dan
embriogenesis tidak langsung
menggunakan 2,4-D
Organogenesis
langsung pada media
padat
Induksi kalus
Studi embriogenesis
somatik tidak langsung
menggunakan pikloram
Pembentukan benih
sintetik dan
pertumbuhan minimal
Karakterisasi morfologi
dan molekuler biakan
in vitro dan bibit nenas
Evaluasi keragaman bibit
dari 3 metode regenerasi
dari populasi lama (induk)
Sterilisasi dan inisiasi
tunas in vitro
Induksi kalus
embriogenik
Studi enkapsulasi:
pengaruh jenis eksplan
dan pra-perlakuan
Karakterisasi morfologi
biakan in vitro
Evaluasi keragaman bibit
hasil organogenesis
langsung
Isolasi eksplan basal
daun
Pemilihan metode
terbaik
Regenerasi kalus
menjadi tunas melalui
jalur organogenesis
Induksi kalus
embriogenik
Proliferasi kalus
embriogenik
Pertumbuhan minimal
dengan paklobutrazol
dan modifikasi suhu
Subkultur dan evaluasi
fenotipe individu varian
Evaluasi keragaman bibit
hasil organogenesis tidak
langsung
Regenerasi secara
organogenesis
langsung
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Regenerasi kalus
embriogenik menjadi
embrio somatik
Regenerasi kalus
embriogenik menjadi
embrio somatik
Pertumbuhan minimal
dengan manitol dan
modifikasi suhu
Evaluasi fenotipe bibit di
rumah kaca
Evaluasi keragaman bibit
hasil embriogenesis somatik
tidak langsung
Evaluasi fenotipe
biakan in vitro
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Aklimatisasi di rumah
kaca
Aklimatisasi di rumah
kaca
Pemulihan dan
regenerasi
Karakterisasi molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi ketepatan genetik
dengan metode RAPD
Deteksi dini secara
molekuler dengan
metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Gambar 1. Diagram alir tahapan penelitian dalam studi pengembangan metode organogenesis dan embriogenesis pada nenas serta deteksi dini untuk
mereduksi keragaman somaklonal.
TINJAUAN PUSTAKA
Taksonomi, Morfologi, Anatomi, dan Nilai Penting Nenas
Ananas comosus (L.) Merr. termasuk dalam monocotyledonae, ordo
Bromeliales, famili
Bromeliaceae, dan
subfamily
Bromeliadeae. Nenas
merupakan tanaman herbaseus perenial. Batangnya memiliki internodus yang
sangat pendek (1-10 mm tergantung pada posisinya) sehingga tampak kompak
dan roset. Jaringan pembuluh yang padat memisahkan korteks
EMBRIOGENESIS SOMATIK PADA NENAS (Ananas comosus
(L.) Merr.) SERTA DETEKSI DINI UNTUK MEREDUKSI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Pengembangan Metode
Organogenesis dan Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.)
serta Deteksi Dini untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal adalah karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, 26 Juli 2012
Ika Roostika Tambunan
NRP A263090111
ABSTRACT
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN. Development of Organogenesis and Somatic
Embryogenesis Regeneration of Pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.) and Early
Detection to Reduce Somaclonal Variation. Supervised by NURUL KHUMAIDA,
GUSTAAF ADOLF WATTIMENA, and IKA MARISKA SOEDHARMA.
Pineapple is a unique plant belongs to facultative CAM (Crassulacean Acid
Metabolism) photosynthesis. It is highly potential to be planted on suboptimal land.
Conventionally, it can be propagated from many propagules but their reproductive
time is not uniform and this availability is commonly limited in cultivar Smooth
Cayenne. Today micropropagation is being used commercially in the pineapple
industry abroad but in Indonesia, the industries survive with conventional vegetative
propagation because of somaclonal variation. The main goal of the study was to
obtain the effective regeneration method of pineapple with high level of seedling
production and low level of somaclonal variation, included the artificial seed
formation method, the early detection method of somaclonal variation for eliminating
undesirable traits during micropropagation, and the method to reduce the level of
somaclonal variation during micropropagation. This study was devided into six
chapters, included the study of morhogenetic system (with solid and liquid media);
direct organogenesis induced by auxin and cytokinin (IAA, IBA, NAA, and BA);
indirect organogenesis and somatic embryogenesis induced by 2,4-D, picloram,
adenine sulfate, and N-organic compounds; encapsulation and minimal growth
induced by paclobutrazol, mannitol, and reduced temperature; morphological and
molecular characterization by using RAPD markers; and early detection to reduce of
somaclonal variation. Generally, this study has some novelities in the in vitro
characterization, the information of the non dead-end mechanism of rooted pineapple
explants, the information of the complete events of somatic embryogenesis, the
conservation method by minimal growth, and the large number of variants. The
result showed that the direct and indirect organogenesis generated high shoot
multiplication level. The use of mannitol (4%) was better than paclobutrazol for
storing the encapsulated explants for 4 months. The morphological characterization
could easily differentiate the normal and the abnormal variants (off-types). The direct
organogenesis showed the lower level of variation (1.6%) compare to the indirect
organogenesis (2%) and somatic embryogenesis (31.1%). The RAPD analysis
strengthened the occurence of somaclonal variation. The use of the new in vitro
cultures could reduce somaclonal variation. In conclusion, the direct organogenesis
was the effective regeneration method for mass propagation. The morphological
characterization of in vitro cultures can be applied as guidance for early detection
and elimination of undesirable variants in mass propagation. The in vitro
conservation method by mannitol can be applied to store pineapple cultures for
medium-term period. The use of the new in vitro population could reduce the level of
somaclonal variation.
Keywords: Organogenesis, somatic embryogenesis, synthetic seed, in vitro
conservation, somaclonal variation.
RINGKASAN
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN. Pengembangan Metode Organogenesis dan
Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta Deteksi Dini
untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal. Dibimbing oleh NURUL KHUMAIDA,
GUSTAAF ADOLF WATTIMENA, dan IKA MARISKA SOEDHARMA.
Nenas (Ananas comosus L. Merr.) merupakan tanaman yang unik karena
memiliki tipe fotosintesis CAM (Crassulacean Acid Metabolism) fakultatif sehingga
tergolong sebagai tanaman masa depan yang prospektif untuk dikembangkan secara
luas dalam rangka revitalisasi tanaman pertanian untuk mendukung era Revolusi
Hijau Lestari, terutama pada lahan marginal. Tanaman nenas memiliki propagul yang
beraneka ragam, tetapi umur panennya bervariasi sehingga kurang ideal sebagai
bahan perbanyakan tanaman secara masal. Kultivar Smooth Cayenne bahkan hanya
memiliki jenis dan jumlah propagul yang terbatas, yaitu berupa mahkota dan sucker.
Oleh karena itu, teknologi kultur in vitro dipandang sebagai solusi yang terbaik untuk
diterapkan. Sayangnya, isu keragaman somaklonal masih menjadi kendala utama
sehingga pengguna, khususnya pihak industri masih enggan menerapkan teknologi
tersebut. Tujuan utama penelitian ini adalah untuk memperoleh metode regenerasi
yang efektif (dengan tingkat multiplikasi tinggi dan tingkat keragaman rendah),
termasuk metode pembentukan benih sintetik, deteksi dini dan reduksi keragaman
somaklonal. Penelitian terbagi atas enam bagian, mencakup (1) studi morfogenesis
eksplan secara organogenesis langsung yang diinduksi oleh auksin dan sitokinin
(IAA, IBA, NAA, dan BA), (2) studi organogenesis dan embriogenesis tidak
langsung yang diinduksi oleh 2,4-D, (3) studi embriogenesis somatik tidak langsung
yang diinduksi oleh pikloram, (4) studi pembentukan benih sintetik dan konservasi in
vitro secara pertumbuhan minimal yang diinduksi oleh paklobutrazol atau manitol
dan modifikasi suhu penyimpanann, (5) studi karakterisasi morfologi dan molekuler
dengan penanda RAPD (10 primer) terhadap biakan dan bibit nenas, serta (6) studi
evaluasi keragaman bibit, deteksi dini, dan reduksi keragaman somaklonal. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa metode organogenesis langsung dan tidak langsung
mempunyai tingkat multiplikasi tunas yang lebih tinggi daripada embriogenesis
somatik tidak langsung. Pikloram lebih baik dalam menginduksi embriogenesis
somatik daripada NAA dan 2,4-D dengan tingkat multiplikasi 17 embrio/eksplan
selama 2 bulan dari struktur ETs (embryogenic tissues) atau 14 embrio/eksplan
selama 2.5 bulan dari struktur FETs (friable embryogenic tissues). Penggunaan
manitol (4%) lebih baik daripada penggunaan paklobutrazol maupun penurunan suhu
dalam menyimpan eksplan nenas dalam kondisi terenkapsulasi, dengan periode
simpan hingga 4 bulan. Terdapat 21 varian yang terdeteksi dari populasi biakan
induk, di mana 8 varian menunjukkan fenomena epigenetik, 8 varian menunjukkan
fenomena khimera, dan 7 varian menunjukkan kestabilan fenotipe di rumah kaca.
Karakterisasi secara morfologi membedakan varian dan tanaman kontrol dengan
koefisien kemiripan 0.49-0.91 (r=0.83). Karakterisasi molekuler memperkuat dugaan
terjadinya keragaman somaklonal. Berdasarkan karakterisasi tersebut, tanaman
kontrol dan varian memiliki koefisien kemiripan sebesar 0.32-0.61 (r=0.97). Ketidakstabilan fenotipe pada karakter duri pada daun diduga kuat disebabkan oleh
retrotransposon karena pola terbentuknya duri sama sekali tidak beraturan, bahkan
pada bibit yang dihasilkan dari metode embriogenesis somatik yang terbukti bersifat
unicellular origin. Metode embriogenesis somatik tidak langsung menghasilkan
keragaman fenotipe yang tertinggi (31.1%), diikuti dengan metode organogenesis
tidak langsung (2%) dan organogenesis langsung (1.6%). Populasi biakan in vitro
yang baru memiliki koefisien kemiripan genetik yang lebih tinggi (0.65-0.85)
daripada populasi lama, baik sebelum (0.32-0.61) maupun sesudah diekstraksi
dengan
menggunakan
mengindikasikan
3
bahwa
macam
metode
keragaman
regenerasi
somaklonal
(0.34-0.63).
dapat
direduksi
Hal
ini
dengan
menggunakan bahan tanaman yang baru. Disimpulkan bahwa organogenesis
langsung merupakan metode terbaik untuk mikropropagasi tanaman nenas.
Penggunaan manitol lebih baik daripada paklobutrazol untuk penyimpanan in vitro
dengan periode simpan 4 bulan. Metode karakterisasi morfologi dapat diterapkan
pada biakan in vitro untuk eliminasi varian yang tidak diharapkan selama proses
mikropropagasi secara dini. Teknik RAPD mengkonfirmasi dugaan terjadinya variasi
somaklonal pada kultur in vitro nenas.
Kata kunci: Organogenesis, embriogenesis somatik, benih sintetik, konservasi in
vitro, karakterisasi morfologi, karakterisasi molekuler, keragaman
somaklonal.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi oleh Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang
wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
PENGEMBANGAN METODE ORGANOGENESIS DAN
EMBRIOGENESIS SOMATIK PADA NENAS (Ananas comosus
(L.) Merr.) SERTA DETEKSI DINI UNTUK MEREDUKSI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
IKA ROOSTIKA TAMBUNAN
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Pemuliaan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul
:
Pengembangan Metode Organogenesis dan Embriogenesis
Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta
Deteksi Dini untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal
Nama
:
Ika Roostika Tambunan
NRP
:
A263090111
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.S.
Ketua
Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena, M.Sc.
Anggota
Prof. (R) Dr. Ika Mariska, APU
Anggota
Diketahui,
Ketua Mayor
Pemuliaan Bioteknologi Tanaman
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Tri Koesoemaningtyas, M.Sc.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Agr.
Tanggal Ujian: 26 Juli 2012
Tanggal lulus: 9 Agustus 2012
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof. Dr. Ir. Slamet Susanto, MAgr
Dr. Ir. Darda Efendi, MSi
Penguji pada Ujian Terbuka: Dr. Ir. Sobir, MS
Dr. Ir. Yusdar Hilman, MSc
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala
petunjuk dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Disertasi
ini mengangkat topik tentang Pengembangan Metode Organogenesis dan
Embriogenesis Somatik pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) serta Deteksi Dini
untuk Mereduksi Keragaman Somaklonal. Penelitian tersebut dilaksanakan sejak
Februari 2010 hingga April 2012.
Disertasi ini memuat enam bab yang merupakan pengembangan dari naskah
artikel yang diajukan ke jurnal dan pertemuan ilmiah. Bab 2 telah diterbitkan pada
Jurnal Agrobiogen Vol.8 No.1 Th. 2012 dengan judul Indirect organogenesis and
somatic embryogenesis of pineapple induced by dichlorophenoxy acetic acid. Bab 3
sedang dalam proses penerbitan pada Indonesian Journal of Agricultural Science
dengan judul The effect of picloram and light on somatic embryogenesis
regeneration of pineapple. Bab 4 sedang diajukan ke Jurnal Hortikultura dengan
judul Pembentukan Benih Sintetik Nenas dan Konservasi In Vitro secara
Pertumbuhan Minimal. Bab 5 masih dalam proses pendampingan publikasi pada
jurnal internasional (Plant Cell Tissue and Organ Culture) dengan judul
Morphological characterization of pineapple in vitro cultures and acclimated
seedlings. Bab 6 akan disampaikan pada International Seminar on Agriculture
Adaptation in The Tropics dengan judul Molecular characterization of pineapple in
vitro cultures for detecting plant off-types during micropropagation.
Penghargaan yang setinggi-tingginya disampaikan kepada Badan Litbang
Pertanian yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan
studi S3 dan atas dukungan dana penelitian melalui Program KKP3T 2011. Terima
kasih yang tidak terhingga penulis ucapkan kepada Dr. Nurul Khumaida, Prof. Dr.
G.A. Wattimena dan Prof. (R) Dr. Ika Mariska sebagai komisi pembimbing. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Sutrisno, Dr. Karden Mulya (Kepala BBBiogen), Dr. Sobir, Dr. Wicaksono, Prof. Dr. Sudarsono, Prof. Dr. Wasmen Manalu,
Dr. Tri Koesoemaningtyas, Dr. Endah Retno Palupi, Prof. Dr. Bambang S. Purwoko,
dan Dr. Made Tasma yang telah memberikan dukungan sebelum dan semasa
penelitian serta pemahaman, saran dan masukan dalam penelitian maupun
penyusunan naskah publikasi ilmiah. Kepada penguji luar komisi, Dr. Agus Purwito
dan Dr. Sintho W. Ardie (pada ujian Prakualifikasi Doktor), Prof. Dr. Slamet Susanto
dan Dr. Darda Efendi (pada Ujian Tertutup) serta Dr. Yusdar Hilman, APU dan Dr.
Sobir (pada Ujian Terbuka), disampaikan terima kasih. Terima kasih juga ditujukan
kepada teman-teman sejawat dan rekan-rekan teknisi di Kelti BSJ BB-Biogen serta
rekan-rekan mahasiswa pascasarjana IPB. Rasa cinta dan terima kasih juga
disampaikan kepada Ibunda dan Ayahanda (Ibu Suhaesih dan Alm. Djamian
Tambunan), suami (Faleh Setia Budi, MT.), ananda (Furaida Alya Muna) serta
keluarga besar dan seluruh pihak yang telah memberikan dukungan moril, dan
spirituil. Besar harapan penulis akan seluas-luasnya manfaat dari hasil karya ini.
Bogor, Juli 2012
Ika Roostika Tambunan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Magelang pada tanggal 12 September 1972 sebagai
anak kedua dari pasangan Djamian Tambunan dan Suhaesih. Pendidikan sarjana
ditempuh pada Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Program Studi Fitopatologi,
Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, lulus pada tahun 1997. Pada tahun
1999, penulis diterima sebagai mahasiswa pascasarjana pada Program Studi
Agronomi dengan peminatan Pemuliaan Non Konvensional Institut Pertanian Bogor,
lulus pada tahun 2003. Kesempatan untuk melanjutkan studi ke program doktor pada
Program Studi Pemuliaan Bioteknologi Tanaman IPB diperoleh pada tahun 2009,
dengan beasiswa dari Badan Litbang Pertanian.
Sejak lulus sebagai sarjan hingga saat ini, penulis bekerja di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
Bogor. Bidang keahlian adalah Bioteknologi Pertanian dengan spesifikasi kultur in
vitro, terutama pada aspek konservasi in vitro (pertumbuhan minimal dan
kriopreservasi) serta variasi somaklonal.
Selama mengikuti program S3, penulis mengikuti beberapa macam pelatihan,
yaitu penulisan publikasi pada jurnal internasional, perancangan percobaan, dan
bahasa Inggris. Karya ilmiah yang berjudul Indirect organogenesis and somatic
embryogenesis of pineapple induced by dichlorophenoxy acetic acid telah
diterbitkan pada Jurnal Agrobiogen Vol.8 No.1 Th. 2012. Artikel lainnya yang
berjudul The effect of picloram and light on somatic embryogenesis regeneration
of pineapple menunggu penerbitannya pada Indonesian Journal of Agricultural
Science (Jurnal IJAS), sedangkan naskah yang berjudul Morphological
characterization of pineapple in vitro cultures and acclimated seedlings masih
dalam proses pendampingan publikasi pada jurnal internasional (Plant Cell Tissue
and Organ Culture). Naskah yang berjudul Pembentukan Benih Sintetik Nenas
dan Konservasi In Vitro secara Pertumbuhan Minimal sedang diajukan ke Jurnal
Hortikultura dan naskah yang berjudul Molecular characterization of pineapple in
vitro cultures for detecting plant off-types during micropropagation akan
disampaikan pada International Seminar on Agriculture Adaptation in The Tropics.
Karya-karya tersebut merupakan bagian dari program S3 penulis.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ………………………………………………………..
Halaman
viii
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………….
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang ……………………………………………………
Tujuan Penelitian …………………………………………………
Manfaat Penelitian ………………………………………………..
Ruang Lingkup Penelitian ………………………………………..
1
3
4
5
TINJAUAN PUSTAKA
Taksonomi, Morfologi, Anatomi, dan Nilai Penting Nenas ……………..
Perbanyakan In Vitro ……………………………………………………..
Konservasi In Vitro ………………………………………………...........
Fenomena Keragaman Somaklonal ………………………………………
Deteksi Keragaman Somaklonal ………………………………………….
6
9
12
13
14
STUDI MORFOGENESIS EKSPLAN NENAS YANG DIINDUKSI
OLEH AUKSIN DAN SITOKININ
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
16
16
17
19
20
29
30
ORGANOGENESIS DAN EMBRIOGENESIS SOMATIK TIDAK
LANGSUNG PADA NENAS YANG DIINDUKSI OLEH 2,4-D
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
32
32
33
35
38
48
48
INDUKSI EMBRIOGENESIS SOMATIK TIDAK LANGSUNG PADA
NENAS MELALUI PENGGUNAAN PIKLORAM
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
51
52
52
54
57
70
71
PEMBENTUKAN BENIH SINTETIK NENAS DAN KONSERVASI
IN VITRO SECARA PERTUMBUHAN MINIMAL
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
74
74
75
76
79
90
90
KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN MOLEKULER BIAKAN
IN VITRO DAN BIBIT NENAS
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
93
94
94
96
99
112
113
EVALUASI KERAGAMAN BIBIT NENAS DARI POPULASI LAMA
DAN PEMBENTUKAN POPULASI BARU SERTA DETEKSI DINI
KERAGAMAN SOMAKLONAL
Abstrak …………………………………………………………....
Abstract …………………………………………………………...
Pendahuluan ………………………………………………………
Bahan dan Metode ………………………………………………..
Hasil dan Pembahasan ……………………………………………
Simpulan ………………………………………………………….
Daftar Pustaka …………………………………………………….
116
116
117
119
122
133
134
PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………..
136
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………
149
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….
150
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Status penelitian kultur in vitro nenas di mancanegara ........................
10
2
Status penelitian kultur in vitro nenas di Indonesia dan peluang
risetnya ……………………………………………………….............
11
3
Data produksi buah-buahan di Indonesia tahun 1995-2009 ………….
18
4
Penampilan kalus embriogenik nenas kultivar Smooth Cayenne pada
beberapa macam formulasi media, 2 bulan setelah subkultur ..............
45
Pengaruh media dasar dan adenin sulfat terhadap pertumbuhan FETs
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………………………...
45
Respon kalus nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap media induksi
kalus embriogenik pada dua macam kondisi inkubasi yang berbeda,
1 bulan setelah subkultur ……………………………………………..
61
Perkembangan ETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media MS
yang mengandung Kn 1 mg l-1, 2 bulan setelah subkultur
65
Pengaruh pencahayaan dan formulasi media terhadap pembentukan
suspensi sel nenas kultivar Smooth Cayenne .......................................
68
Tingkat pencoklatan FETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada
media regenerasi, 1 bulan setelah subkultur ………………………….
69
Tingkat regenerasi FETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media
regenerasi, 1 bulan setelah subkultur ………………………….
69
Jumlah embrio somatik dewasa yang terbentuk dari FETs nenas
kultivar Smooth Cayenne, 1 bulan setelah subkultur ………………...
70
Pengaruh suhu penyimpanan terhadap pertumbuhan biakan tunas
nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dalam Naalginat 3% ……………………………………………………….........
83
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Pengaruh suhu penyimpanan dan taraf manitol terhadap daya tembus
biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dengan
Na-alginat 3% ………………………………………………………...
88
Pengaruh suhu penyimpanan dan taraf manitol terhadap daya hidup
biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang terenkapsulasi dengan
Na-alginat 3% ………………………………………………………...
89
Karakter dan sub karakter yang diamati pada fenotipe normal dan
varian dari biakan in vitro nenas kultivar smooth Cayenne (umur 4
tahun) ………………………………………………………................
98
Ciri-ciri spesifik dari varian yang muncul dari populasi biakan
in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun ........................
103
Proporsi varian yang muncul dalam populasi biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun ……………………………...
104
Stabilitas fenotipe setiap individu varian nenas kultivar Smooth
Cayenne dan regenerannya selama subkultur dan aklimatisasi ............
107
Jumlah pita DNA yang teramplifikasi dan yang bersifat polimorfik
dalam analisis RAPD populasi biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 4 tahun ……………………………………………....
109
Proporsi variasi fenotipe dari populasi biakan in vitro nenas kultivar
Smooth Cayenne yang dihasilkan dari metode organogenesis
(langsung dan tidak langsung serta embriogenesis somatik tidak
langsung................................................................................................
125
Rekapitulasi tingkat variasi dari biakan in vitro yang dihasilkan dari
tiga macam metode regenerasi dibandingkan dengan populasi biakan
induk.....……………………………………………………….............
126
Proporsi bibit yang tidak berduri, berduri khimera, dan berduri
lengkap yang dihasilkan dari metode organogenesis langsung yang
diinduksi oleh BA dan NAA................................................................
126
Proporsi bibit nenas kultivar Smooth Cayenne dengan daun tidak
berduri, berduri khimera, dan berduri lengkap yang dihasilkan dari
metode organogenesis tidak langsung yang diinduksi oleh
2,4-D......................................................................................................
127
Proporsi bibit nenas kultivar Smootha Cayenne dengan daun tidak
berduri, berduri khimera, dan berduri lengkap yang dihasilkan dari
metode embriogenesis somatik yang diinduksi oleh pikloram ........….
128
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Diagram alir tahapan penelitian dalam studi pengembangan metode
organogenesis dan embriogenesis somatik pada nenas serta deteksi
dini untuk mereduksi keragaman somaklonal ………………………....
6
2
Berbagai macam organ vegetatif tanaman nenas………………………
8
3
Keragaan kultur nenas kultivar Smooth Cayenne yang berasal dari
eksplan basal daun (1 bulan setelah tanam) …………………………...
21
Pengaruh tipe eksplan dan ZPT serta pengaruh interaksi antara tipe
eksplan dan ZPT terhadap morfogenesis eksplan basal daun nenas
kultivar Smooth Cayenne pada media padat.............................………..
23
Penampilan kalus nenas pasca-perlakuan NAA dan tipe sel yang
menyusunnya …………………………………………………………..
25
Pembelahan sel secara asimetris dari sel embriogenik yang diiduksi
oleh NAA ………………………………………………………….......
25
Pengaruh kombinasi sitokinin dan auksin pada media cair terhadap
pembentukan tunas, nodul, dan akar kultur in vitro nenas kultivar
Smooth Cayenne yang berasal dari eksplan daun utuh dan potongan
basal daun, umur 1.5 bulan ……………………………………………
27
4
5
6
7
8
9
Pengaruh kombinasi sitokinin dan auksin pada media cair terhadap
jumlah tunas kultur in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne yang
berasal dari eksplan daun utuh dan potongan basal daun ...... ................
28
Tahapan morfogenesis dari eksplan daun nenas kultivar Smooth
Cayenne pada media cair ……………………………………………....
29
Tahapan analisis histologi kalus embriogenik nenas, modifikasi
metode Kiernan (1990) ………………………………………………...
37
11
Tahapan induksi kalus dari basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne
38
12
Pengaruh 2,4-D terhadap pembentukan kalus dan bobot basah kalus
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………………………….
39
Respon basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap
perlakuan 2,4-D ..................................................... ……………………
40
10
13
14
Penampilan tunas in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne hasil
perlakuan 2,4-D pada tahap regenerasi dan elongasi .............................
41
Pengaruh 2,4 terhadap persentase pembentukan tunas normal, tunas
abnormal, dan konversi dari tunas abnormal ke tunas
normal.....……………………………………………….........................
42
Penampilan jaringan embriogenik nenas kultivar Smooth Cayenne
pada berbagai macam media …………………………………………..
43
17
Tahapan embriogenesis somatik nenas kultivar Smooth Cayenne ........
44
18
Pengaruh faktor tunggal dan pengaruh interaksi antara media induksi
kalus embriogenik dan media regenerasi terhadap regenerasi FETs
nenas kultivar Smooth Cayenne .............................................................
46
Perbedaan perkembangan embrio somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 8 bulan pada media regenerasi ………………………...
47
Pengaruh pikloram terhadap pembentukan kalus dan bobot basah dari
eksplan basal daun nenas kultivar Smooth cayenne …………………...
58
Respon basal daun nenas kultivar Smooth Cayenne terhadap
perlakuan pikloram dan pengamatan mikroskopisnya ………………...
59
Pengamatan mikroskopis dari ECCs nenas kultivar Smooth Cayenne
setelah ditanam pada media induksi kalus embriogenik ………………
60
23
Penampilan ETs dan FETs nenas kultivar Smooth Cayenne ...………..
62
24
Pengaruh faktor tunggal (media dan pencahayaan) terhadap tingkat
pencoklatan, persentase pembentukan nodul, persentase pembentukan
embrio, dan jumlah embrio prematur (2 bulan setelah subkultur) .........
64
Regenerasi ETs nenas kultivar Smooth Cayenne pada media MS
dengan penambahan Kn 1 mg l-1 ………………………………………
66
Pengaruh faktor pencahayaan dan media induksi kalus embriogenik
serta pengaruh interaksinya terhadap pembentukan embrio somatik
nenas kultivar Smooth Cayenne ……………………..……………...…
66
Tahapan perkembangan embrio somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne dari struktur FETs yang diinduksi oleh pikloram ....................
67
Analisis histologi embrio somatik dari kultur suspensi sel nenas
kultivar Smooth Cayenne .......................................................................
68
15
16
19
20
21
22
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Pengaruh BA dan NAA terhadap pertumbuhan eksplan batang semu
nenas kultivar Smooth Cayenne yang dienkapsulasi dalam Na-alginat
3%, 1 bulan masa inkubasi ……………………………………………
80
Keragaan eksplan batang semu nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dienkapsulasi dengan Na-alginat 3% (1 bulan masa inkubasi) ..............
81
Proporsi pembentukan planlet, akar, dan nodul dari eksplan basal daun
nenas kultivar Smooth Cayenne yang diinduksi oleh BA 0.5 mg l-1 dan
NAA 0.5 mg l-1, 2 bulan periode inkubasi .............................................
82
Pengaruh kombinasi BA dan NAA terhadap pertumbuhan eksplan
basal daun nenas kultivar Smootha Cayenne yang terenkapsulasi
dalam Na-alginat 3% …………………………………………………..
82
Penampilan tunas nenas kultivar Smooth Cayenne yang dienkapsulasi
dengan alginat 3% yang mengandung paklobutrazol dan disimpan
pada suhu yang berbeda ……………………………………………….
84
Daya hidup, daya regenerasi dan jumlah tunas nenas kultivar Smooth
Cayenne pada tahap pemulihan pasca penyimpanan dengan
paklobutrazol ..........................................................................................
86
Penampilan tunas nenas kultivar Smooth Cayenne pada tahap
pemulihan (1 bulan) pasca-penyimpanan dengan paklobutrazol ...........
86
Penampilan kapsul embrio somatik nenas kultivar Smooth Cayenne
(4 bulan periode simpan) yang disimpan dengan menggunakan
manitol pada suhu penyimpanan yang berbeda ......................................
89
Keragaan varian dari populasi biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne umur 4 tahun …………………………………………………
100
Dendogram hasil karakterisasi morfologi biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun, berdasarkan metode (SAHN)UPGMA (r=0.83) …………………………………………...................
102
Kualitas DNA hasil isolasi sampel daun nenas kultivar Smooth
Cayenne dengan metode CTAB ……………………………………….
107
Profil DNA varian nenas kultivar Smooth Cayenne, hasil amplifikasi
PCR dengan penanda RAPD …………………………………………..
111
Dendogram hasil karakterisasi molekuler biakan in vitro nenas
kultivar Smooth Cayenne umur 4 tahun, menggunakan metode RAPD,
berdasarkan analisis (SAHN)-UPGMA (r=0.97) …………….
112
42
43
44
45
46
47
48
Tingkat keragaman bibit nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dihasilkan dari tiga metode regenerasi ………………………………...
123
Profil DNA biakan nenas kultivar Smooth Cayenne yang diekstraksi
dari populasi biakan induk ………………………... .............................
129
Dendogram hasil evaluasi keragaman genetik (dengan penanda
RAPD, r=0.98) bibit nenas kultivar Smooth Cayenne populasi lama
yang diperbanyak secara organogenesis langsung, organogenesis tak
langsung, dan embriogenesis somatik ………………………………..
130
Profil DNA dari populasi baru biakan in vitro nenas kultivar Smooth
Cayenne ………………………………………………………………..
132
Dendogram hasil deteksi dini keragaman somaklonal biakan in vitro
nenas kultivar Smooth Cayenne dari populasi baru dengan penanda
RAPD (r=0.96) ………………………………………………………...
133
Tahapan lengkap embriogenesis somatik nenas kultivar Smooth
Cayenne ………………………………………………………………
140
Tahapan lengkap organogenesis nenas kultivar Smooth Cayenne …...
141
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
Tanaman CAM fakultatif
: tanaman yang berfotosintesis tipe CAM ketika
lingkungan tumbuhnya suboptimal dan
berfotosintesis tipe C3 atau C4 ketika lingkungan
tumbuhnya optimal (nenas bertipe C3-CAM)
Propagul
: bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai
bahan perbanyakan
Mikropropagasi
: teknik perbanyakan mikro untuk produksi bibit
Aklimatisasi
: proses penyesuaian fisiologi bibit tanaman dari
kondisi in vitro ke kondisi ex vitro
Multiplikasi
: tingkat penggandaan tunas atau bibit
Proliferasi tunas
: teknik perbanyakan in vitro melalui penggandaan
tunas aksilar
Organogenesis
: proses pembentukan organ yang bersifat unipolar
(satu kutub) berupa tunas atau akar
Embriogenesis somatik
: proses pembentukan embrio yang bersifat bipolar
(dua kutub), diregenerasikan dari sel-sel somatik
Suspensi sel
: kultur sel yang terdispersi di dalam media cair
yang selalu digoyang
Pertumbuhan minimal
: suatu teknik konservasi in vitro untuk
penyimpanan jangka menengah melalui modifikasi
unsur hara, sumber karbon, suhu penyimpanan,
penggunaan zat penghambat tumbuh dan retardan
Keragaman somaklonal
: keragaman yang terjadi pada sel-sel somatik,
disebabkan oleh mutasi atau perubahan sekuens
DNA, aktivasi atau pembungkaman gen
Syncarp
: sejumlah bakal buah yang membentuk satu ruang,
daun fertil pendukung makrospora berupa bakal biji
(ovulum) yang secara kolektif membentuk putik
Eksplan
: bahan tanaman yang digunakan dalam penanaman
secara in vitro
BA
: benzyl adenine, sitokinin turunan purin
Kn
: kinetin, sitokinin turunan purin
TDZ
: thidiazuron, secara fisiologis fungsinya sama
dengan sitokinin, turunan fenilurea
IAA
: indole acetic acid, auksin alami
NAA
: naphthalene acetic acid
IBA
: indole butyric acid
Gln
: glutamine, asam amino
Arg
: arginine, asam amino
Gly
: glycine, asam amino
CH
: casein hydrolysate, senyawa organik kompleks
AdS
: adenine sulfate, senyawa organik sumber nitrogen
2,4-D
: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
Pikloram
: 4-amino 3,5,6-trichloropicolinic acid
Sel embriogenik
: sel yang akan berdiferensiasi membentuk embrio melalui
pembelahan yang bersifat asimetris
Pro-embrio
: calon embrio yang terbentuk dari sel embriogenik
PEM
: pre-embryogenic mass, kumpulan atau massa proembrio
ETs
: embryogenic tissues
FETs
: friable embryogenic tissues
Planlet
: tanaman utuh yang telah lengkap mempunyai tunas dan
akar, dihasilkan dari regenerasi secara in vitro
Nekrosis
: gejala matinya sel dan berasosiasi dengan degradasi
klorofil yang disebabkan oleh oksidasi fenol
Paklobutrazol
: senyawa sintetik golongan triazol yang berfungsi sebagai
retardan
Manitol
: gula alkohol yang dapat berfungsi sebagai regulator
osmotik (pengatur tekanan osmotikum) media
Amplifikasi
: proses penggandaan molekul DNA
EtBr
: ethidium bromide
CTAB
: cetyl trimethyl amonium bromide
PCR
: polymerase chain reaction, proses polimerisasi DNA
secara in vitro
Denaturasi
: proses pemisahan DNA dari ikatan ganda menjadi utas
tunggal
Elektroforesis
: teknik pemisahan molekul berdasarkan gerakan yang
berbeda pada medan listrik
RAPD
: randomly amplified polymorphism DNA
Epigenetik
: perubahan sifat yang tidak disebabkan oleh perubahan
sekuens DNA, bersifat dapat balik
Monomorfik
: pola pita DNA yang sama antar individu
Polimorfik
: pola pita DNA yang berbeda antar individu
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nenas (Ananas comosus L. Merr.) merupakan tanaman penting di daerah
tropis, termasuk di Indonesia. Berdasarkan data produksi buah-buahan, komoditas
nenas menempati peringkat ketiga atau keempat setelah pisang, mangga, dan jeruk
(BPS 2009). Tanaman ini bersifat toleran terhadap cekaman kekeringan dan
kemasaman sehingga berpeluang besar dikembangkan di lahan-lahan marginal,
termasuk lahan gambut (Sagiman 2007).
Menurut Ochse et al. (1961) serta Coppens d’Eeckenbrugge dan Leal (2003),
tanaman nenas pada umumnya diperbanyak secara vegetatif dengan menggunakan
butt atau stump, ratoon, sucker, basal slips, hapas, crown slips, dan crown atau
mahkota. Sayangnya, jenis dan jumlah propagul tersebut sangat terbatas pada
kultivar Smooth Cayenne (sucker dan mahkota) sehingga perbanyakan secara
konvensional perlu dukungan teknologi lainnya, terutama ketika diperlukan bibit
dalam jumlah yang besar. Penerapan teknologi kultur in vitro akan berguna bagi
penyediaan materi genetik calon varietas unggul maupun perbanyakan varietas
unggul yang baru saja dilepas, serta pembukaan lahan baru untuk pengembangan
komoditas tersebut secara luas.
Di mancanegara, beberapa kultivar nenas telah dikembangkan secara
komersial, antara lain Cayenne (Champaka, Giant Kew, Sarawak, Maipuri,
Esmeralda, Claire, dan Typhon), Queen, Spanish (Red Spanish dan Singapore
Spanish), Perola (Pernambuco atau Abacaxi), Manzana, dan Perolera (atau Motilana)
(IBPGR 1991; Chan et al. 2003). Di antara beberapa kultivar tersebut, Queen dan
Smooth Cayene merupakan kultivar yang banyak dikembangkan di Indonesia.
Teknik mikropropagasi nenas telah diterapkan secara komersial oleh pihak
industri di mancanegara (Smith et al. 2003), tetapi industri di Indonesia masih
bertahan pada teknik perbanyakan konvensional. Teknik mikropropagasi masih
dipandang perlu diterapkan untuk menyediakan bibit dalam jumlah besar, terutama
untuk varietas baru hasil persilangan, seleksi, mutasi, dan rekayasa genetika
(Firoozabady dan Moy 2004; Nursandi et al. 2005). Secara praktis, mikropropagasi
digunakan untuk memantapkan blok multiplikasi bagi penyediaan bahan tanaman
perbanyakan konvensional dalam skala yang lebih luas. Selain itu, teknik
mikropapagasi dapat diterapkan untuk skrining varian sebelum diterapkannya
metode perbanyakan secara konvensional (Smith et al 2003). Dalam rangka
peningkatan produksi, populasi tanaman akan ditingkatkan dari 40.000 tanaman/ha
menjadi 100.000 tanaman/ha sehingga keperluan penyediaan bibit akan semakin
tinggi (Suminar 2010).
Dalam teknik kultur in vitro, terjadinya keragaman genetik atau keragaman
somaklonal (off-type) kadang-kadang tidak dapat dihindari. Keragaman somaklonal
merupakan kejadian abnormalitas yang terjadi oleh karena mutasi atau perubahan
sekuens, aktivasi gen, dan pembungkaman gen (Kaeppler et al. 2000). Keragaman
tersebut dapat dideteksi melalui karakterisasi morfologi (Noor et al. 2009; Somsri et
al. 2009; Zhao et al. 2005; Podwyszyńska 2005), sitologi (Al-Zahim et al. 1999),
biokimia, fisiologi (Perez et al. 2011), dan molekuler (Chen et al. 1998; Al-Zahim et
al. 1999; Soniya et al. 2001; Perez et al. 2011).
Wakasa (1979) telah melakukan pengamatan bibit nenas hasil kultur in vitro
1.5 tahun dalam periode in vitro, 14-22 bulan pada tahap aklimatisasi, dan 1 tahun
periode pertumbuhan tanaman melalui pengamatan karakter morfologi, yaitu duri
pada daun, warna daun, sekresi lilin pada permukaan daun bawah, dan corak daun.
Diperlukan waktu sekitar 4 tahun untuk mendeteksi keragaman yang terjadi pada
bibit hasil perbanyakan secara in vitro tersebut. Nursandi (2006) melaporkan bahwa
perlakuan in vitro dapat menimbulkan keragaman tanaman nenas hingga 88% untuk
karakter daun varigata, roset, dan kerdil, namun sebagian besar tanaman tersebut
mampu berubah menjadi normal setelah umur tertentu (25 minggu setelah tanam),
yang diduga sebagai epigenetik.
Untuk efisiensi waktu, biaya, dan area maka evaluasi stabilitas sifat tersebut
sebaiknya dilakukan secara dini, sejak biakan masih di dalam botol sebelum tanaman
tersebut ditanam di lapang. Selain itu, penggunaan penanda molekuler menjadi
sangat penting dalam membantu upaya mendeteksi keragaman somaklonal secara
dini.
Pada tanaman nenas, deteksi penyimpangan secara molekuler banyak
diterapkan dengan menggunakan penanda RAPD (Random Amplified Polymorphism
DNA). Soneji et al. (2002) telah mengkarakterisasi bibit nenas kultivar Queen untuk
sifat daun berduri dan tidak berduri dengan penanda RAPD. Feuser et al. (2003) juga
menganalisis ketepatan genetik planlet nenas kultivar Amarelinho (grup Perola) dan
Santos et al. (2008) melakukan evaluasi keragaman genetik dari biakan in vitro nenas
hias (Ananas comosus var. bracteatus) dengan menggunakan penanda RAPD.
Hingga saat ini, belum terdapat laporan tentang analisis keragaman somaklonal
terhadap biakan dan bibit nenas hasil perbanyakan in vitro yang dikulturkan dalam
periode yang panjang.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk memperoleh metode regenerasi yang
efektif (tingkat multiplikasi tinggi dan tingkat keragaman rendah), termasuk metode
pembentukan benih sintetik tanaman nenas, metode deteksi dini keragaman
somaklonal untuk eliminasi varian yang tak diharapkan, dan metode reduksi
keragaman somaklonal. Tujuan khusus penelitian ini adalah:
1. Mempelajari morfogenesis eksplan nenas kultivar Smooth Cayenne dalam
merespon zat pengatur tumbuh (ZPT) dan konsistensi media
2. Memperoleh informasi tentang pengaruh kombinasi sitokinin (benzyl adenine/
BA) dan auksin (naphthalene acetic acid/NAA, indole acetic acid/IAA, indole
butiric acid/IBA) terhadap regenerasi nenas kultivar Smooth Cayenne secara
organogenesis langsung
3. Mempelajari pengaruh auksin non herbisida NAA dan auksin herbisida 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) atau 4-amino 3,5,6-trichloropicolinic acid
(pikloram) terhadap induksi organogenesis dan embriogenesis somatik tidak
langsung pada nenas kultivar Smooth Cayenne
4. Mempelajari pengaruh suhu dan paklobutrazol atau manitol terhadap daya hidup,
daya simpan, dan daya regenerasi eksplan nenas kultivar Smooth Cayenne yang
dienkapsulasi dengan natrium alginat 3%
5. Mempelajari karakter morfologi dan molekuler biakan in vitro dan bibit nenas
kultivar Smooth Cayenne
6. Mengetahui tingkat keragaman biakan dan bibit nenas kultivar Smooth Cayenne
yang dihasilkan dari metode organogenesis langsung dan tidak langsung, serta
embriogenesis somatik tidak langsung
7. Mendeteksi keragaman molekuler biakan in vitro dari populasi yang baru dibentuk
untuk menentukan metode perbanyakan yang paling efektif.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini tidak hanya bermanfaat bagi perkembangan ilmu dasar,
namun juga bagi perkembangan ilmu terapan. Pada aspek ilmu dasar, penelitian ini
berhasil mengantisipasi fenomena dead-end pada eksplan yang berakar sehingga
mampu meregenerasikan tunas. Penelitian ini juga berhasil menjelaskan proses
embriogenesis somatik tanaman monokotil (khususnya tanaman nenas) secara
lengkap serta asal-usul pembentukan embrio somatik. Beberapa tahapan penting
dalam teori embriogenesis somatik berhasil terekam atau tervisualisasi (mulai dari
sel tunggal hingga terbentuknya planlet yang siap diaklimatisasi) sehingga akan
memudahkan pengguna dalam memahami proses tersebut maupun dalam menyusun
strategi penelitian yang berkaitan dengan proses tersebut. Penelitian ini juga
berkontribusi dalam upaya menguak misteri asal-usul terjadinya keragaman
somaklonal pada tanaman nenas. Pada aspek ilmu terapan, hasil penelitian ini
bermanfaat bagi upaya penyediaan metode perbanyakan bibit yang efektif untuk
perbanyakan materi pemuliaan (calon varietas baru) maupun produksi bibit secara
masal setelah pelepasan varietas baru serta untuk penyediaan bibit yang memadai
bagi pembukaan lahan-lahan baru. Metode embriogenesis somatik yang telah
dihasilkan dapat dimanfaatkan untuk melakukan rekayasa seluler (berbasis pada
teknik kultur in vitro) dan molekuler (berbasis pada teknik transformasi genetik)
untuk mendukung program pemuliaan tanaman nenas. Metode pembentukan benih
sintetik akan berguna bagi penyediaan benih yang aplikatif dan untuk konservasi in
vitro (secara pertumbuhan minimal) dalam upaya pelestarian koleksi plasma nutfah
dan nomor-nomor hasil persilangan sehingga terhindar dari resiko hilangnya
genotipe oleh cekaman lingkungan biotik dan abiotik di lapang serta dapat
menghemat tempat, waktu, biaya, dan tenaga. Manfaat lainnya adalah mendapatkan
metode deteksi keragaman somaklonal tanaman nenas secara dini untuk eliminasi
varian yang tidak diharapkan, sebelum bibit ditanam di lapang sehingga dapat
meningkatkan efisiensi produksi bibit. Selain itu, varian-varian yang dihasilkan
dalam penelitian ini juga dapat dimanfaatkan sebagai bahan pemuliaan tanaman atau
bahkan sebagai kandidat klon superior. Secara umum, hasil penelitian ini akan
bermanfaat bagi pengembangan komoditas nenas di Indonesia.
Ruang Lingkup Penelitian
Untuk mencapai tujuan penelitian tersebut maka dibuat suatu strategi dengan
serangkaian kegiatan penelitian secara komprehensif. Penelitian ini diawali dengan
studi karakterisasi morfologi dan molekuler dari populasi biakan in vitro lama
(berumur 4 tahun) yang selanjutnya digunakan sebagai biakan induk. Evaluasi
keragaman fenotipe bibit di rumah kaca juga dilakukan terhadap populasi tanaman
dari biakan induk tersebut. Penelitian dilanjutkan dengan melakukan studi
morfogenesis eksplan pada media padat dan cair secara organogenesis langsung
(yang diinduksi oleh auksin dan sitokinin), studi regenerasi secara organogenesis dan
embriogenesis somatik secara tidak langsung dengan menggunakan eksplan dari
biakan induk (yang diinduksi oleh auksin herbisida). Studi morfogenesis dilakukan
pula terhadap eksplan (batang semu, basal daun, tunas in vitro, dan embrio somatik)
yang dienkapsulasi dengan natrium alginat untuk pembentukan benih sintetik dan
konservasi in vitro secara pertumbuhan minimal melalui penerapan modifikasi suhu
penyimpanan dan penggunaan paklobutrazol atau manitol. Selain itu, juga dilakukan
evaluasi fenotipe dan stabilitas genetik biakan in vitro dan bibit aklimatisasi hasil
ekstraksi dari biakan induk menggunakan 3 macam metode regenerasi. Setelah itu,
dilakukan pembentukan populasi biakan in vitro yang baru (0 tahun) serta
pendeteksian keragaman somaklonal secara morfologi dan molekuler. Secara umum,
ruang lingkup kegiatan penelitian ini dijelaskan pada diagram alir penelitian
(Gambar 1).
Pembentukan populasi baru
biakan in vitro dan deteksi
dini keragaman somaklonal
Populasi lama biakan in vitro
(umur 4 tahun)
Studi morfogenesis
eksplan
Organogenesis
langsung pada media
cair
Studi organogenesis dan
embriogenesis tidak langsung
menggunakan 2,4-D
Organogenesis
langsung pada media
padat
Induksi kalus
Studi embriogenesis
somatik tidak langsung
menggunakan pikloram
Pembentukan benih
sintetik dan
pertumbuhan minimal
Karakterisasi morfologi
dan molekuler biakan
in vitro dan bibit nenas
Evaluasi keragaman bibit
dari 3 metode regenerasi
dari populasi lama (induk)
Sterilisasi dan inisiasi
tunas in vitro
Induksi kalus
embriogenik
Studi enkapsulasi:
pengaruh jenis eksplan
dan pra-perlakuan
Karakterisasi morfologi
biakan in vitro
Evaluasi keragaman bibit
hasil organogenesis
langsung
Isolasi eksplan basal
daun
Pemilihan metode
terbaik
Regenerasi kalus
menjadi tunas melalui
jalur organogenesis
Induksi kalus
embriogenik
Proliferasi kalus
embriogenik
Pertumbuhan minimal
dengan paklobutrazol
dan modifikasi suhu
Subkultur dan evaluasi
fenotipe individu varian
Evaluasi keragaman bibit
hasil organogenesis tidak
langsung
Regenerasi secara
organogenesis
langsung
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Regenerasi kalus
embriogenik menjadi
embrio somatik
Regenerasi kalus
embriogenik menjadi
embrio somatik
Pertumbuhan minimal
dengan manitol dan
modifikasi suhu
Evaluasi fenotipe bibit di
rumah kaca
Evaluasi keragaman bibit
hasil embriogenesis somatik
tidak langsung
Evaluasi fenotipe
biakan in vitro
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Aklimatisasi di rumah
kaca
Aklimatisasi di rumah
kaca
Pemulihan dan
regenerasi
Karakterisasi molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi ketepatan genetik
dengan metode RAPD
Deteksi dini secara
molekuler dengan
metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Evaluasi fenotipe dan
analisis molekuler
dengan metode RAPD
Induksi akar dan
aklimatisasi di rumah
kaca
Gambar 1. Diagram alir tahapan penelitian dalam studi pengembangan metode organogenesis dan embriogenesis pada nenas serta deteksi dini untuk
mereduksi keragaman somaklonal.
TINJAUAN PUSTAKA
Taksonomi, Morfologi, Anatomi, dan Nilai Penting Nenas
Ananas comosus (L.) Merr. termasuk dalam monocotyledonae, ordo
Bromeliales, famili
Bromeliaceae, dan
subfamily
Bromeliadeae. Nenas
merupakan tanaman herbaseus perenial. Batangnya memiliki internodus yang
sangat pendek (1-10 mm tergantung pada posisinya) sehingga tampak kompak
dan roset. Jaringan pembuluh yang padat memisahkan korteks