Analisis Pola Pita Andaliman (Zanthoxylum Acanthopodium D.C) Berdasarkan Primer OPC-07, OPD-03, OPD-20, OPM-20, OPN-09

Lampiran. 1 Data Geografis dan Morfologis Andaliman
No.
Kabupaten/Kecamatan/Kota
Aksesi

Titik koordinat

Ketinggian Tinggi
Tempat Tanaman
(mdpl.)
(cm)
1001
330

lilit
Batang
(cm)
13

Warna
Umur

Daun Tanaman
(cm)
Hijau
2

D1

Dairi/Sidikalang/Hutarakyat

N: 0245’14.6”
E : 9817’46.9”

D2

Dairi/Sidikalang/Hutarakyat

N: 0245’17,5”
E: 9816’50”

978

80

3

Merah

D3

Dairi/Sumbul/Parbuahan

N: 0246’45,6”
E: 9824’52,2”

1254

308

21

Hijau

2,5

D4

Dairi/Sumbul/Parbuahan

N: 0247’02,1”
E: 9825’09”

1253

294

17

Hijau

2

D5

Dairi/Sumbul/Lae Tangiang

N:0247’16,6”
E: 9825’58,1”

1357

170,1

12,6

Hijau
Kemerahan

D6

Dairi/Parbuluan/Sigalingging

N:0236’07,9”
E:9830’21,8”

1518

265

28

Hijau
1,5
Kemerahan

D7

Dairi/Parbuluan/Sigalingging

N:0236’07,9”
E:9830’21,4”

1518

156

10

Merah

1

D8

Dairi/Parbuluan/Sihotang

N:0239,13,7”
E:9827’02,9”

1317

430

28

Hijau
Kemerahan

3

D9

Dairi/Parbuluan/Sihotang

N:0239’13,8”
E: 9827’02,5”

1317

320

15

Hijau

1,5

D10

Dairi/Parbuluan/Sihotang

N:0239’13,8”
E:9827’2,5”

1317

128

7

Hijau

1,5

D11

Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:0239’57,5”
E: 9825’06,5”
Dairi/Parbuluan/Siarung-arung N:0239’55”
E:9825’5,1”

1290

190

20

Merah

3

D12

0,5

1

1292

200

25

Merah

2,5

D13

Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7

N:0245’14,6”
E: 9817’46,9

1109

300

15

Hijau

1,5

D14

Dairi/Sumbul/Pegagan Julu7

N:0247’9,2”
E:9823’22,7”

1109

310

18

Hijau

2

D15

Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N:0248’47,6”
E: 9823’38,9”

1202

294

20

Hijau

2

D16

Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 0248’43,9”
E: 9823’43,8”

1206

192

9

Hijau
Kemerahan

1

D17

Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 0248’39,2”
E: 9823’48,5

1217

177

7

Merah

1

D18

Dairi/Pegagan Hilir/Tiga Baru N: 0248’38,8”
E: 9824’29,4”

1276

203

14

Hijau

1

K1

Tanah Karo/Merek/Garingging N: 0258’13,8”

1483

333

20

Merah

4

Universitas Sumatera Utara

E : 9832’11”
K2

Tanah Karo/Merek/Garingging N: 0258’15,7”
E : 9832’09,8”

1483

400

22

Hijau

4,5

K3

Tanah Karo/Merek/Garingging N: 0258’33,5”
E : 9831’27,6”

1495

248

10

Hijau

1,5

S1

Simalungun/Purba/Purba
Hinalang

N : 0255’13,3”
E : 9838’18,8”

1423

240

15

Hijau
kemerahan

S2

Simalungun/Purba/Purba
Hinalang

N : 0255’13,5”
E : 9838’18,8”

1423

238

14

Hijau

S3

Simalungun/Purba/Purba
Hinalang

N : 0255’13,7”
E : 9838’18,6”

1423

144

9

Hijau
Kemerahan

1

S4

Simalungun/Purba/Purba
Hinalang

N : 0254’56,6”
E : 9838’30,9”

1408

370

18

Merah

1

S5

Simalungun/Purba/Kampung N : 0253’19,5”
Baru
E : 9843’39,9”

1211

290

22

Hijau

1,5

S6

Simalungun/Purba/Kampung N : 0253’19,6”
Baru
E : 9843’39,8”

1211

198

21

Hijau
Kemerahan

2

S7

Simalungun/Purba/Kampung
Baru

N : 0253’19,8”
E : 9843’40,1”

1211

155

10

Hijau

1

S8

Simalungun/Purba/Kampung N : 0253’20,3”
Baru
E : 9843’43,4”

1213

290

23

Merah

2

S9

Simalungun/Purba/Kampung N : 0253’20,7”
Baru
E : 9843’44”

1214

310

24,8

Hijau

1,5

1

1

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok


CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak
5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml
aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate.



Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris

sebanyak 12.114 gram.

Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote
plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH
mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan
dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.


Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan
Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran
larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai
7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan
aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.



EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan
80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian
diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi
sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian
volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

Universitas Sumatera Utara



NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam
erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan
menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam
gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.

**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
B. Pembuatan Larutan Buffer


Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl
5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.



Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml
Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume
larutan menjadi 100 ml.



Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.



Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5
M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.



Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2
ml Isoamilalkohol.



Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3 : Alur penelitian

ISOLASI DNA ANDALIMAN

UJI KUALITAS DNA

UJI KUANTITAS DNA

AMPLIFIKASI DAN GENOTYPING

ELEKTROFORESIS

SKORING DAN ANALISIS DATA

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 4 : Isolasi DNA
Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil ditambahkan
nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstraksi dan 10
µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu
650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan
13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan
13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu 40C
selama semalaman

Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit dan
dikeringkan

Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl

Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan diinkubasi dalam
freezer (-200C) selama 30 menit

Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan

Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE

Stok DNA disimpan dalam freezer (-200C)

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 5 : Amlplifikasi dan Genotyping
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
Nuclease free water 9.5 µl
Primer 1 µl
DNA sampel 2 µl

Running PCR sebanyak 45 siklus :
Denaturasi awal 940C 2 menit
Denaturai 940C 1 menit
Annealing 360C 1 menit
Extension 720C 2 menit
Post extension 720C 10 menit
Kondisi akhir PCR 40C tak terbatas

Proses running dimulai selama kurang lebih 4 jam

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 6 : Proses Elektroforesis
Agar rose 2.6 gram ditambahkan dengan 130 ml buffer TAE 1 x

Campuran dipanaskan dengan hot plate

Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr

Larutan gel dituang kedalam cetakan yang telah dipasang sisir

Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber berisi buffer TAE 1 x

Sampel hasil PCR, marker dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan
perbandingan (8:5:2)

Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt

Proses running dimulai selama 65 menit

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 7 : Data Skoring 30 aksesi Andaliman
OPD 3
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

OPD 3 OPD 20 OPD20 OPD 20 OPD 20 OPD 20 OPM 20 OPM 20 OPM 20 OPM 20 OPC 7
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1

OPC 7
0
1
0
1
0

OPC 7
1
1
0
0
0

OPC 7 OPM 09 OPM 09 OPM 09 OPM 09
1
1
0
0
0
1
1
0
0
1
1
1
0
0
1
1
1
1
0
1
1

1
0
0

1
1
0

1
1
1

1

0

1

0

1

1

0
1
1

1
1
1

1
1
1

0
0

0
0

1
1

0
1
1
1
1

1
1
1
1
1

1
1
1
1
1

1
0
1
0
0
0

1
0
0
1
0
0

0
0
0
1
1
0

1
1
0
1
1
1

1
1
0
0
0

0
1
0
1
1

0
0
1
0
0

0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
1
0
1

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

1
1
0
1
0
1
0
0
0
1

0
0
1
0
1
1
1
0
1
1

Lampiran 8. Jarak kekerabatan 15 aksesi Andaliman

Unit
3
4
5
8
9
11
15
16
17
22
23
24
25
26

2
0.13439
0.11108
0.18087
0.23741
0.23289
0.14886
0.22209
0.17645
0.24234
0.16201
0.09494
0.15856
0.11534
0.0913

3

4

5

8

9

11

15

16

17

0.12883
0.20762
0.26416
0.25964
0.07692
0.24884
0.2032
0.26909
0.18876
0.12169
0.13903
0.14209
0.07177

0.18431
0.24084
0.23632
0.1433
0.22552
0.17988
0.24578
0.16545
0.09837
0.15299
0.11878
0.08574

0.20614
0.14286
0.22209
0.2184
0.17276
0.23866
0.15833
0.13326
0.23179
0.15366
0.16453

0.25815
0.27863
0.27494
0.2293
0.29519
0.21486
0.18979
0.28832
0.21019
0.22107

0.27411
0.27042
0.22478
0.29067
0.21034
0.18527
0.2838
0.20567
0.21655

0.26331
0.21767
0.28356
0.20323
0.13616
0.1535
0.15656
0.08625

0.11402
0.125
0.14739
0.17447
0.273
0.19487
0.20575

0.13427
0.10175
0.12883
0.22736
0.14923
0.16011

0.16765
0.19473
0.29326
0.21513
0.226

22

23

24

25

0.11439
0.21293 0.14585
0.1348 0.03226 0.16625
0.14567 0.0786 0.07143 0.099

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 9. Molecular weight 30 aksesi Andaliman

OPN 09
1

2
1786

3
1786
1044

4
1786
1044

5
1786
1044
491

6

7
1786
875
491

8
1786

9
491

10
1786
1044
875

11
1786
1044

12
1786
875

13

14
491

15
875
491

16
1044

17
1044

18
1044

19

20

21
1044

22
1044

23
1786

24
1044

25
1786

26
1786
1044

27
1786

28
491

29
1786

30
1786
1044
491

2
1082
863
648
500

3
1082
863
648
500

4
1082
863
648
500

5
1082
863
648
500

6
1082
863
648
500

7

8
1082
863
648
500

9
1082
863
648
500

10
1082
863
648
500

11
1082
863
648
500

12
1082
863
648
500

13

14
863
648
500

15
1082
863
648
500

16
1082
863
648
500

17
1082
863
648
500

18
1082
863
648
500

19
1082
863
648
500

20
1082
863
648
500

21
1082
863
648

22
1082
863
648
500

23
1082
863
648
500

24
1082
863
648
500

25
1082
863
648
500

26
1082
863
648
500

27
1082
863
648
500

28
1082
863
648
500

29
1082
863
648
500

30
1082
863
648
500

OPD 20
1
2
2223 2223
1217 1217
799 799

3
2223
1217
799

4
2223
1217
799
615

5
2223
1217
799
615

6
2223

7
2223

8
2223
1217
615

9
2223
1217
615

10
2223
1217
799
615
418

11
2223
1217
799

12
2223
1217
799

13
2223
1217
799
615
418

14
2223
1217
799
615
418

15
2223
1217
799
615
418

16
2223
1217
799
615
418

17
2223
1217
799
615
418

18
2223
1217
799
615
418

19
2223
1217
799
615
418

20
2223
1217
799
615
418

21
2223
1217

22
2223
1217
799
615
418

23
2223
1217
799
615

24
2223
1217

25
2223
1217
799
615
418

26
2223
1217
799
615

27
2223
1217
799
615
418

28
29
30
2223 2223 2223
1217 798.843 1217
799 615 799
615 418 418
418

3
2277
1857
1704

4
2277
1857

5
2277
1857
1704

6
2277
1857

7
2277
1857
1704

8
2277

9
2277
1857
1704

10
2277
1857

11
2277
1857

12
2277
1857
1704

13
2277
1857
1704

14
2277
1857
1704

15
2277
1857
1704

16
2277
1857

17
2277

18
2277
1704

19
2277
1857
1704

20
2277
1857
1704

21
2277
1857
1704

22
2277
1857
1704

23
2277
1857
1704

24
2277
1857
1704

25
2277
1857
1704

26
2277
1857
1704

27
2277
1857
1704

28
2277
1857
1704

29
2277
1857
1704

30
2277
1857
1704

3
2500

4
2500
900

5
2500
586

6

7
2500
2098
900

8
2500
2098
586

9
2500

10

11
2500
900

12

13
2500
2098
586

14

15
2500
2098
586

16
2500
2098
900
586

17
2500
2098
900
586

18

19
2500

20
2500

21

22
2500
2098

23
2500
2098
900

24
2500
2098
900

25
2500
2098
900

26
2500
2098
900

27

28

29

30

OPM 20
1
1082
863
648
500

OPD 03
1

Universitas Sumatera Utara

2
2277
1857

OPC 07
1
2
2500 2500
2098 2098
900

Lampiran 10. Hasil elektroforesis
OPC 07

OPD 03

Universitas Sumatera Utara

OPD 20

OPM 20

Universitas Sumatera Utara

OPN 09

Universitas Sumatera Utara

Universitas Sumatera Utara

DAFTAR PUSTAKA
Andras G. 1996. Effect of Temperature on separation efficiency in capillary gel
electrophoresis. Trends in Analytical Chemistry. Vol 15 no 5
Anggereini, E. 2008. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Suatu
Metode Analisis DNA Dalam Menjelaskan Berbagai Fenomena Biologi.
Program studi Pendidikan Biologi. FKIP Universitas Jambi. Jambi.
Asyari, M dan Saifuddin A. N. 2005. Optimasi Konsentrasi Mgcl2 Dan Suhu
Annealing Pada Proses Amplifikasi Multifragmens Mtdna Dengan Metoda
PCR. JKSA 8(1):24-28.
Ayuningrum, P. I., Eddy, A. dan Yuniar, M. 2012. Keragaman Genetik Rumput
Laut Berdasarkan Metode RAPD PCR. J. Perikanan dan Kelautan
3(4):337-345.
Azizah, A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi Dna Daun, Bunga Kelapa
Sawit Normal dan Abnormal. Institut Pertanian Bogor . Bogor.
Bahagiawati. 2011. Peran Markah Molekuler Dalam Pemuliaan Tanaman. Badan
Litbang Pertanian. Edisi 16-22 Maret 2011 No.3397 Tahun XLI.
Fatchiyah, 2011. Pelatihan analisis fingerprinting DNA tanaman dengan metode
RAPD. [Modul]. Laboratorium sentral ilmu hayati Universitas Brawijaya,
Malang.
Ferita, I., Jamsari., Irvan, S. dan Gustian. 2011. Studi Hubungan Karakter
Morfologi,
Anatomi, Dan Molekuler Terkait Potensi Kadar Katekin
Pada Tanaman
Gambir ( Uncaria Gambir (Hunter) Roxb). Jurusan
Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Andalas Padang.
Handoyo, D. dan Ari, R. 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi – Universitas Surabaya.
Unitas 9(1):17-29.
Hasairin, A. 1994. Etnobotani Tanaman Rempah dalam Makanan Adat
Masyarakat Batak Angkola dan Mandailing. Thesis. Bogor: Program
Pascasarjana IPB
Harahap, A.S. 2014. Keragaman Genetik Aren Asal Sulawesi Tenggara
Berdasarkan Marka Random Amplified Polymorphic DNA. Tesis.
Magister Agroekoteknologi. Universitas Sumatera Utara. Medan

Universitas Sumatera Utara

Julisaniah, N, I., Liliek, S. dan Arifin, N,S. 2011. Analisis Kekerabatan Mentimun
(Cucumis sativus L.) menggunakan Metode RAPD-PCR dan Isozim.
Biodiv 9(2):99-102.
Jones, C.J., K.J. Edwards, S. Castagiole, M.O.Winfield, F. Sala, C. van del Wiel,
G. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, A. Dally, R. Brettsshneider, P.
Bettini, M, Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N.Marmiroli,R. Aert, G.
Volkaert, J. Rueda, R. Linacero, A. Vasques and A. Karp. 1997. A
Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a
network of European laboratories. Molecular Breeding 3 (5): 382-390.
Kristanty, R, E., Abdul, M dan Katrin. 2013. Aktivitas Antioksidan dan
Penghambat Xantin Oksidase dari Ekstrak Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium
DC.)
dalam
Jurnal
Farmasi
Indonesia. JFI6(3):122-128.
Martono, B. 2009. Keragaman Genetik, Heritabilitas dan Korelasi Antar Karakter
Kuantitatif Nilam Hasil Fusi Protoplas. Jurnal Littri. 15(1), 9-15.
Mashudi. 2008. Peran Konservasi Genetik dan Pemuliaan Pohon terhadap
Pembangunan Hutan Tanaman. Laporan Hasil Penelitian. Pemuliaan
Tanaman Hutan. Yogyakarta.
Moektiwardoyo, M. , Muchtaridi, M dan Eli, H. 2014. Chemical Composition
And Locomotor Activity Of Andaliman Fruits (Zanthoxylum
Acanthopodium Dc.) Essential Oil On Mice. Int J Pharm Pharm Sci
6(2): 547-550.
Miftakhhurohmah Dan Sinta, S . 2009. Potensi Andaliman Sebagai Sumber
Antioksida Dan Antimikroba Alami. Warta Penelitian Dan Pengembangan
Tanaman Industri, 15(2: 8-10
Mulia,L.2000. Kajian Aktivitas Antimikroba Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium ) dan Antarasa (Litsea cubeba). Skkripsi . Institut Pertanian
Bogor .Bogor, hlm 7-21.
Nasir, M. 2002. Bioteknologi molekuler: Teknik rekayasa genetika tanaman.
Penerbit PT. Citra Aditya Bakti, Bandung. hlm 111-133.
Nurjannah, S. 2013. Teknik Analisis Biomolekuler PCR. Fakultas Kedokteran
Hewan. Universitas Brawijaya. Malang.
Ogden, R. C., and Adams, D. A. 1987. Electrophoresis in agarose and acrylamide
gels. Methods Enzymo. 152. 61-87
Poerba, Y, S Dan Diyah, M. 2008. Keragaman Genetik Berdasarkan Marka
Random
Amplified Polymorphic DNA Pada Amorphophallus

Universitas Sumatera Utara

Muelleri Blume Di Jawa.
Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI),Biodiversitas 9( 4) : 245-249.
Rahayu, S. E dan Handayani. 2010. Keragaman Genetik Pandan Asal Jawa Barat
Berdasarkan Penanda Inter Simple Sequence Repeat. Makara Sains.
14(2): 158-162.
Simajuntak, SP. 2006. Perkecambahan Biji Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC) Deskripsi dan Perkecambahan. Hayati Vol.10 No.1
Sinaga, A.O.Y. 2015. Analisis Keragaman Genetik Andaliman Sumatera Utara
Menggunakan Marka RAPD. J.Agroekoteknologi. 3(1) : 350-358.
Siregar, B, L. 2003. Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) di Sumatera
Utara: Deskripsi dan Perkecambahan. Jurusan Agronomi, Faperta,
Universitas Katolik St. Thomas Sumatera Utara. Hayati, 10(1): 38-40.
___________. 2011. Studi Pemecahan Dormansi Benih Andaliman (Zanthoxylum
Acanthopodium). Lembaga Penelitian Universitas HKBP Nommensen.
Medan.
Sudarmi. 2013. Peranan Biologi Molekuler Pada Pemuliaan Tanaman. Fak
Pertanian
Universitas Veteran Bangun Nusantara Sukoharjo. Magistra
84 (25):75-80.
Sulandri S & MSA Zein. 2003.Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bidang
Zoologi LIPI. Bogor

Suryanto, D. 2003. Melihat Keanekaragaman Organisme Melalui Beberapa
Teknik
Genetika Molekuler. Program Studi Biologi Fakultas
Matematika Dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera
Utara.
Wicaksono BD, Yohana AH, Enos T, Irawan W, Dina Y, Aldrin N,Ferry S. 2009.
Antiproliferative effect of the methanol extract of Piper crocatum ruiz
&pav leaves on human breast (T47D)cells In-vitro. Trop J Pharm Res
8:345-352.
Wijaya, C. H. 1999. Andaliman, Rempah Tradisional Sumatera Utara Dengan
Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Bul. Teknol. Dan Industri Pangan.
10(2).
Wijaya, C.H. 2000. Isolasi dan Identifikasi senyawa trigeminal aktif buah
andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). J.Hayati 7:9-95.
William. JG. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are
useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 18(22):6531-5.

Universitas Sumatera Utara

Wright, J.W, 1976. Introduction to Forest Genetics. Academic Press, Inc. San
Diego California.
Wulandari, Y. 2008. Analisis Keragaman Genetik Kayu Afrika ( Maesopsis
eminii Engl.) Berdasarkan Penanda Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD). Skripsi. Institut Pertanian Bogor.
Yuwono, T., 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi.
Yogyakarta

Universitas Sumatera Utara

METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas
Kedokteran Universitas sumatera Utara, Medan yang akan dimulai pada bulan
April 2015 sampai dengan bulan Agustus 2015.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah DNA
Andaliman yang sudah di isolasi (penelitian yang sebelumnya). Bahan yang
digunakan adalah buffer ekstraksi CTAB,buffer TAE (Tris-acetate-EDTA)
(pembuatan dapat dilihat pada lampiran 1.), buffer TE (Tris-EDTA), NaOH, NaEDTA, HCl p.a, alkohol 70%, aquadest, agarose, kertas tissue, Green Master Mix
(Promega, M7122), DNA MW Marker ladder 10000 bp, Primer oligonukleotida
(Sigma Aldrich), masker.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital,
hotplate, freezer, tabung eppendorf 2 ml dan 1,5 ml, mikropippete 1-50 µl, 100500 µl dan 200-1000 µl, sarung tangan karet, tip pipet kristal, tube PCR, kamera,
pengaduk magnetik, pH meter, oven, autoclave, alat-alat gelas (beaker gelas,
erlenmeyer, dll), UV Transluminator (UV Tec Cambridge 20 UV), elektroforesis
(Power PAC 3000, Biorad), PCR (Therma Cycler), Gel-Doc (UV Cambridge),
power supply, alat tulis.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak.

Universitas Sumatera Utara

Pelaksanaan Penelitian

Pengambilan Sampel Daun

Daun andaliman yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah
kabuupaten dairi dan sekitarnya. Daun dipilih yang masih muda/lembut berwana
hijau kemerahan, kemudian dicuci bersih , dilap pakai tisu dan kemudian dibawa
ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran.

Isolasi DNA
Tahapan isolasi yang dilakukan adalah daun andaliman dibuang tulang
daunnya lalu dicuci dan dikeringkan dengan tisu dan ditimbang masing-masing
0,1-0,3 gram. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Daun
andaliman digerus menggunakan mortar sambil ditambahkan nitrogen cair dan
PVPP. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 1
ml buffer ekstraksi dan β-mercaptoetanol 10 µl kemudian tabung dikocok
menggunakan vortex lalu tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit
pada suhu 650C. Setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahanlahan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit lalu 1 ml
kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung.
Tabung disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama
10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada tabung sentrifus lain, lalu
1 ml kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung
dikocok menggunakan vortex dan tabung disentrifus lagi dengan kecepatan
13.000 pada suhu ruang rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperolah
dipindahkan lalu 1 ml isopropanol dingin ditambahkan ke dalam tabung.

Universitas Sumatera Utara

Supernatan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung lalu tabung disimpan
dalam lemari es (40C) selama satu malam kemudian tabung disentrifus kembali
dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh dibuang kemudian pelet dikeringanginkan. Pelet yang sudah kering
dilarutkan dengan buffer TE sebanyak 100 µl kemudian tabung dispin manual
hingga homogen.
Kemudian etanol absolut dingin ditambahkan lalu dibolak-balik hingga
homogen. Setelah itu, supernatan diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 2 jam
kemudian supernatant disentrifus lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu
40C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan pelet dicuci menggunakan
etanol 70% dan pellet dikeringanginkan. Pelet DNA yang sudah kering dilarutkan
dengan 100 µl buffer TE. Simpan DNA dalam freezer (-200C).
Uji Kuantitas DNA

Pengujian dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri. Larutan
stok DNA diambil sebanyak 2 μl, kemudian alat dijalankan. Absorbansi (A)
diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Sebagai contoh digunakan
aquades . Bila nilai panjang gelombang 260 (a) = 1 dapat dikatakan bahwa
konsentrasi DNA adalah 50 µl/ml, karena banyaknya sinar UV berbanding lurus
dengan konsentrasi DNA . selanjutnya angka 50 ini digunakan sebagai faktor
konversi dalam menghitung konsentrasi DNA dengan rumus :
Konsentrasi DNA = Faktor konvensi × Faktor pengenceran X
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan
cara memasukkan 5 µl stok DNA ditambah 2 µl loading dye dan dihomogenkan.

Universitas Sumatera Utara

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v).
Agarose ditimbang 0,28 g kemudian dilarutkan kedalam 35 ml buffer TAE 1x.
Larutan tersebut dimasukkan kedalam elenmeyer dan diberi tanda, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening
dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume
dalam tabung berkurang maka ditambahkan aquades sampai batas tanda dan
kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan dan
bersamaan dengan itu, ditambahkan larutan etidium bromide 0,5%. Kemudian
dihomogenkan dengan magnetik stirer, lalu didinginkan dengan cara, tabung
dialirkan pada air yang mengalir.
Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60º C), larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat
selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan kedalam elektroforesis
dan diberi larutan TAE( Tris-acetate-EDTA) 1x ± 670 ml (hingga terendam).
Stok DNA yang telah disiapkan dimasukkan kedalam sumur didalam gel. Pada
saat stok DNA akan dimasukkan kedalam sumur gel, maka setiap stok DNA
diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2 µl dan stok DNA 5 µl kemudian
dicampur dengan mikropipet

dan setelah rata masing-masing dimasukkan

kedalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya
dielektroforesis. Running elektroforesis dapat dilakukan pada kondisii 70 volt
selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan
UV transluminator dan didokumentasikan.

Universitas Sumatera Utara

Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola
pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan
mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Amflifikasi dan Genotyping
Amflifikasi

mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur

Wiliiam et al., (1990). Amflifikasi dilakukan dengan menggunakan 5 primer
polimefrik,yaitu OPH-12, OPC-09, OPN-03, OPD-08 Dan OPB-10.
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5
ɰl stok DNA dan ditambahkan 45 µ ml ddH2O sehinnga diperoleh 50 µl aliquot
DNA . kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5
menit setelah itu ditambahkan dd H2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer
yaitu dengan mengambil 10-15 ɰl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu
paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk
mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan
digunakan maka larutan master terdiri atas :dd H²O 9.5 ɰ x 5= 47.5 ɰl, Go tag
12,5 x 5 = 62,5 ɰl, aliquot primer 1 ɰ x 5 = 5 ɰl. Dari tube diambil 23 ɰl ke
tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masingmasing DNA sebanyak 2 ɰl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok
DNA

dan campuran master dimasukkan dalam block sampel dimesin PCR

dengan suhu annealing 36ºC. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied
Biosystem di desain waktu,suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit)
berdasarkan yang digunakan peneliti Setiyo (2001).

Proses amplifikasi PCR

dapat dilihat pada tabel 1

Universitas Sumatera Utara

Tabel 1. Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA 30 aksesi andaliman
Tahapan

Proses

Suhu ºC

Waktu

I ( 1 siklus )

Pre Denaturasi

94

2 menit

II ( 45 siklus )

Denaturasi

94

1 menit

Penempelan

36

1 menit

Elongasi

72

1 menit

Post Elongasi

72

10 menit

III ( 1 siklus )

Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu
±20º C bila sedang tidak digunakan.
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 %
(b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukan ke dalam elenmeyer, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi
bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didingikan ditambah larutan etidium
bromide 0,5 % kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang
sama. Setelah larutan agak dingin ( suhu ± 60º C) larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang ( well-forming combs) dan
dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming
combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm diatas permukaan gel atau sampai batas yang

Universitas Sumatera Utara

telah ditemukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur
pada gel.
Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam sumur (well) , tank
elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 65
volt selama 90 menit. Setelah running elektroforesi selesai, arus listrik dimatikan
dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah
dielektroforesis dilakukaan dengan UV transluminator dan jika pita/band molekul
DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
Analisis Data
Pola pita yang muncul pada gel diterjemahkan ke dalam data biner dengan
scoring manual. Setiap pita mewakili satu karakter dan diberi nilai berdasarkan
ada tidaknya pita. Angka satu “1” untuk pita yang terbentuk dan angka nol “0”
untuk pita yang tidak terbentuk (Harahap, 2014).
Untuk melihat persentase pita polimorfik menggunakan rumus berikut ini:
∑

∑

Setiap pita SSR dalam gel yang merepresentasikan fragmen DNA dari
setiap genotipe tanaman diberi nilai satu ketika pita muncul dan diberi nilai nol
ketika pita tidak muncul. Analisis pengelompokan (cluster analysis) dilakukan
menggunakan metode UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic) dari
program NTSYS 2.1-pc (ROHLF, 2000 dalam Tasma dan Sekar, 2013).

Universitas Sumatera Utara

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA
DNA yang digunakan dalam penelitian ini adalah hasil isolasi DNA dari
penelitian sebelumnya. Yang diisolasi dari 3 kabupaten di Sumatera Utara yaitu
Kabupaten Dairi, Karo dan Simalungun.
Uji Kuantitas DNA
Tabel 2. Hasil uji kuantitatif 30 aksesi DNA tanaman andaliman
Kode Sampel Konsentrasi DNA (ng/µl) Kemurnian 260/280
1
3041
2.018
2
2201
2.078
3
796
2.089
4
1769
2.014
5
2476
2.016
6
97.1
1.143
7
2398
1.31
8
1073
2.075
9
1367
2.077
10
2046
2.113
11
1335
2.052
12
1524
1.975
13
1417
2.079
14
1211
2.079
15
1415
2.075
16
937
1.969
17
1340
2.044
18
823
1.926
19
1551
2.061
20
1801
2.073
21
2100
2.007
22
2204
2.05
23
2337
2.019
24
2951
2.1
25
2612
2.11
26
3760
1.625
27
221
1.596
28
1422
1.934
29
2891
2.127
30
3757
2.08
Rataan
1829.103333
1.9638

Universitas Sumatera Utara

Uji kuantitatif DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm untuk memperoleh nilai kemurnian
dan konsentrasi DNA hasil isolasi. Panjang gelombang 260 nm merupakan
serapan maksimum untuk asam nukleat, sedangkan panjang gelombang 280 nm
merupakan serapan maksimum untuk protein (Harahap, 2014).
Kemurnian DNA yang diperoleh pada penelitian ini berkisar 1.143 –
2.113. Dari 30 sampel DNA yang diisolasi hanya 4 sampel yang nilai kemurnian
nya berkisar 1.8 – 2.0. Yaitu aksesi nomor 12, 16, 18, dan 28. Menunjukkan
bahwa sampel DNA telah murni.
Sampel dengan nilai kemurnian dibawah 1.8 sebanyak 4 sampel. Yaitu
aksesi nomor 6, 7, 26 dan 27. Hal ini menunjukkan bahwa stok DNA masih
banyak mengandungkontaminan protein. Sedangkan sampel dengan kemurnian
diatas 2.0 sebanyak 22 sampel. Yaitu aksesi nomor 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 13,
14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29 dan 30. Hal ini menunjukkan bahwa
sampel masih belum murni dan mengandung kontaminan RNA. Hal ini sesuai
dengan literatur Sulandri dan Zein (2003) yang menyatakan bahwa kemurnian
DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan. Molekul DNA
dikatakan murni jika rasio A260 dengan A280 berkisar 1.8 – 2.0. Jika nilai rasio
lebih kecil dari 1.8 maka masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam
larutan.
Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil penelitian ini adalah berkisar
221 ng/µl – 3760 ng/µl. Konsentrasi paling rendah terdapat pada aksesi nomor 27
sedangkan konsentrasi paling tinggi terdapat pada aksesi nomor 26. Konsentrasi

Universitas Sumatera Utara

yang digunakan dalam penelitian ini adalah 10 ng/µl – 25 ng/µl. Dengan
pengenceran yang dihitung dengan memperhatikan factor pengenceran.
Kerusakan stok DNA dapat diakibatkan oleh kurang baiknya penyimpanan
di Laboratorium. Kemungkinan pada saat penggunaan tidak menggunakan ice box
sehingga suhu DNA meningkat menyebabkan penurunan konsentrasi DNA. Hal
ini sesuai dengan literature Andras (1996) yang menyatakan bahwa temperature
penyimpanan DNA yang dianjurkan adalah pada -20 C hingga -4C. DNA (tanpa
tambahan) dapat mengalami kerusakan struktur jika berada pada temperature yang
tinggi. . Hal itu dikarenakan DNA terdiri dari dua jalinan yang dihubungkan
dengan ikatan hidrogen, dan ikatan itu sangat rentan untuk rusak pada suhu tinggi.
Tabel 3. Persentase pita polimorfis pada lima primer
No Nama Primer
1
OPD 03
2
OPD 20
3
OPC 07
4
OPM 20
5
OPN 09
Total
Rataan

Total Pola Pita
3
5
4
4
4
20
4

Jumlah Pita Polimorfik Jumlah Pita MonomorfikPersentase Pita Polimorfik (%)
2
1
66.7
5
0
100
3
1
75
2
2
50
4
0
100
16
4
391.7
3.2
0.8
78.34

Jumlah pola pita tertinggi terdapat pada primer OPD 20 yang berjumlah 5
pita sedangkan jumlah pola pita terendah terdapat pada primer OPD-03 yang
berjumlah 3 pita.
Jumlah pita polimorfik tertinggi terdapat pada primer OPD 20 yaitu 5 pita
polimorfik sedangkan jumlah pita polimorfik terendah terdapat pada primer OPD03 dan OPM 20

yaitu 2 pita polimorfik. Persentase pita polimorfik yang

mencapai 100% terdapat pada primer OPD-20 dan OPN-09 sedangkan OPD-03
dan OPC 07 masing-masing memiliki persentase polimorfik sebesar 66.67% dan
75%.

Universitas Sumatera Utara

Pita polimorfik adalah pita yang tidak terdapat pada seluruh sampel.
Persentase pita polimorfik yang tinggi menunjukkan tingginya variasi pada setiap
aksesi andaliman yang diteliti. Menurut Azizah (2009) bahwa

jumlah pita

polimorfik hasil amplifikasi berbeda-beda. Semakin banyak pita polimorfik yang
dihasilkan akan semakin mudah untuk mengamati adanya variasi.
Pita polimorfik terbentuk dari perbedaan ukuran pita yang terbentuk pada
setiap sampel yang diteliti. Pola pita yang terbentuk oleh setiap sampel unik dan
berbeda-beda. Hal ini menunjukkan adanya variasi genetic dari sampel andaliman
yang diteliti. Menurut Agustian (2008) Perbedaan pola pita dapat ditunjukkan
dalam perbedaan jumlah pita yang dihasilkan. Perbedaan pola pita dapat
menggambarkan perbedaan genetic sampel.
Hasil penelitian Agustian (2008) menunjukkan bahwa dengan persentase
63,76 % dapat menggambarkan perbedaan genetic jarak pagar yang diteliti.
Berdasarkan hasil rata-rata persentase polimorffisme sampel andaliman yang
diteliti sebesar 88.4% maka dapat disimpulkan bahwa andaliman dari setiap
sampel dapat dibedakan secara genetik.
Amplifikasi dan Genotyping
Tabel 4. Urutan basa lima primer dan aksesi yang tidak teramplifikasi

Ada 17 sampel yang tidak terampifikasi pada penelitian ini. Primer dengan
jumlah sampel tidak teramplikasi paling banyak adalah OPC-07 sebanyak 10

Universitas Sumatera Utara

sampel yaitu sampel 6,10,12,14,18,21,27,28,29,30. Sementara pada primer OPD
20 seluruh sampel teramplifikasi. Sampel 6 tidak teramplifikasi pada 3 primer
yaitu primer OPC-07, OPM-20 dan OPN-09 .

Menurut

William,

dkk(1990)

fragmen yang tidak muncul disebabkan tidak terjadinya amplifikasi, terjadi karena
munkin primer yang digunakan tidak sesuai dengan DNA cetakan. Beberapa bukti
percobaan menunjukkan bahwa perbedaan satu pasang basa saja sudah cukup
menyebabkan ketidaksesuaian cetakan primer yang kemudian mencegah
amplifikasi.
Beberapa dari pita DNA tersebut tidak terbentuk secara sempurna. Pada
saat didokumentasikan dengan menggunakan Gel-doc terlihat pita-pita DNA yang
blur (tidak jelas). Hal ini disebabkan pita DNA yang tidak terbentuk secara
sempurna. Menurut Azizah (2009) Hasil amplifikasi yang kurang baik dapat
disebabkan oleh ketidaksesuaian primer, efisiensi, dan optimasi proses PCR.
Primer yang tidak spesifik atau sesuai dapat menyebabkan teramplifikasinya
daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada
daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi PCR juga diperlukan untuk
menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini menyangkut suhu denaturasi
dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu denaturasi yang rendah dapat
menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda sehingga tidak dimungkinkan
terjadinya penempelan primer. Proses penempelan primer pada utas DNA yang
sudah terbuka memerlukan suhu optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat
menyebabkan amplifikasi tidak terjadi karena primer tidak menempel atau
sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel pada sisi lain
genom yang bukan sisi homolognya. Hal ini menyebabkan teramplifikasi banyak

Universitas Sumatera Utara

daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu penempelan (annealing) ini
ditentukan berdasarkan primer.

No
1
2
3
4
5

Nama Primer
OPD 03
OPD 20
OPC 07
OPM 20
OPN 09

Ukuran Pita (bp)
1704; 1857; 2277
418; 615; 799; 1217;2223
586; 900; 2098; 2500
500; 648; 863; 1082
491; 875; 1044; 1786

Ukuran pita pada setiap primer berbeda-beda berkisar 418 bp – 2500 bp.
Ukuran pita tertinggi terdapat pada primer OPC-07 sebesar 2500 bp sedangkan
ukuran pita terendah terdapat pada primer OPD-20 sebesar 418 bp.
Primer OPD-03 menunjukkan pola pita yang berjumlah 3 pita dengan
ukuran pita yang berukuran 1704bp, 1857bp dan 2277bp. Persentase pita
polimorfik sebesar 66.67 %. Dan persentase monomorfis sebesar 33.37 %.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

12 13

14

15

16

17 18

19 20

21 22 23 24

25 26 27

28

29 30

2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp

500 bp

250 bp

Gambar 2.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPD03, ket: Kab Dairi : (1-18), Kab Karo : (19-21), Dan Kab Simalungun
(22-30)

Universitas Sumatera Utara

Primer OPC-07 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita 586bp, 900bp, 2098bp, 2500bp. Persentase pita polimorfis sebesar
75%. Dan persentase monomorfis sebesar 25 %
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

12

13

14

15

16 17

18

19

20 21 22

23

24 25

26

27 28 29

30

.
2500 bp
2000 bp
1500 bp
1
1000 bp
750 bp

500 bp

250 bp

Gambar 3.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPC
07. Ket: Kab Dairi : (1-18), Kab Karo : (19-21), Dan Kab Simalungun
(22-30)

2500 bp
1
2000 bp

15
1

15

1500 bp

1000 bp
750 bp

500 bp

250 bp

Gambar 3.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPD
20. Ket: Kab Dairi : (1-18), Kab Karo : (19-21), Dan Kab Simalungun
(22-30)

Universitas Sumatera Utara

Primer OPD-20 mennjukkan pola pita yang berjumlah empat pita dan
ukuran pita 586 bp, 900 bp, 2098 bp, 2500 bp. Persentase ppolimorfik sebesar 75
%. Dan persentase monomorfis sebesar 25%.
Primer OPM-20 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita 500bp, 648bp, 863bp, 1082bp. Persentase pita polimorfis sebesar 100
%. Dan persentase monomorfis sebesar 0 %.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13 14 15

16

17 18

19

20 21

22

23 24 25 26 27 28 29 30

1500 bp

1000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

Gambar 5.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPM20. ket: Kab Dairi : (1-18), Kab Karo : (19-21), Dan Kab Simalungun
(22-30)

Universitas Sumatera Utara

Primer OPN-09 menunjukkan pola pita yang berjumlah 4 pita dengan
ukuran pita 491bp, 875bp, 1044bp, 1786bp. Persentase pita polimorfis sebesar
100 %. Dan persentase monomorfis sebesar 0%.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14 15

16

17

18

19

20 21 22

23

24

25

26

27

28

29

30

2500 bp
2000 bp
1000 bp

1500 bp
750 bp

500 bp

250 bp

Gambar 6.Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Andaliman dengan primer OPN09, ket : Kab Dairi : (1-18), Kab Karo : (19-21), Dan Kab Simalungun (2230)
Ada beberapa faktor yang sangat mempengaruhi keberhasilan proses
elektroforesis dalam analisis ini. Menurut Ardhana (2011) Faktor-faktor tersebut
diantara nya adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi gel agarosa, konformasi
DNA, voltase, keberadaan pewarna DNA, komposisi buffer elektroforesis.
Dalam penelitian ini penulis menggunakan gel agarosa dengan konsentrasi
2%. Dengan perbandingan agarose sebesar 2,6 gr dengan 130 ml tris TAE 10 x
untuk chamber elektroforesis berukuran besar. Konsentrasi gel agarose sangat
mempengaruhi laju migrasi DNA pada proses elektroforesis. Menurut Fatciyah
(2008) konsentrasi Agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori
gel yang akan memisahkan-misahkan DNA. Semakin rendah konsentrasi agarose

Universitas Sumatera Utara

maka matriks gel akan semakin kecil dan fragmen DNA dapat dipisah semakin
jauh berdasarkan ukurannya.
Sama hal nya dengan konsentrasi agarose, voltase pada saat elektroforesis
juga berpengaruh pada laju migrasi DNA. Pada penelitian ini penulis mencoba
dua voltase dalam pelaksanaan nya yaitu 80 volt selama 60 menit dan 100 volt
selama 65 menit. Dari kedua voltase tersebut lebih banyak sampel yang
teramplifikasi dengan 100 volt selama 65 menit dibandingkan dengan 80 volt
selama 60 menit. Menurut Fatciyah (2008) penambahan voltase yang dialirkan ke
larutan buffer berarti arus yang diberikan juga semakin besar, sehingga kecepatan
migrasi DNA bertambah. Namun bila terlalu besar akan menimbulkan panas yang
jika terlalu besar dapat menyebabkan panas berlebih yang menyebabkan gel
meleleh.
Keberadaan pewarna DNA sangat menentukan tampak atau tidaknya pita
DNA saat didokumentasikan dengan geldoc. Pada penelitian ini penulis
menggunakan Etidhium Bromide (EtBr) sebagai pewarna. Hal ini sesuai dengan
literature Wicaksono (2009) yang menyatakan bahwa etidium bromide merupakan
sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Digunakan untuk
memvisualisasi potongan-potongan DNA yang telah dipisahkan pada gel
elektroforesis. Etidium mengikat dengan cara menyisip diantara ikatan basa pada
untai ganda DNA.
Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah maka akan tampak citra
berupa pita-pita pada gel. Yang dapat diamati dan dihitung panjang basepair nya
dan discoring sehingga bisa ditentukan kekerabatan antar sampel yang diamati.

Universitas Sumatera Utara

Menurut Yuwono (2008) pita-pita tersebut muncul peranan Etidium bromide
dalam membantu visualisasi dengan memendarkan sinar ultraviolet.
Buffer TAE (Tris Acetate EDTA) merupakan larutan penyangga oyang
biasa digunakan dalam elektroforesis. Larutan ini berfungsi untuk meneruskan
arus listrik sehingga diterima oleh fragmen DNA yang berada pada gel agarosa
yang terendam pada larutan tersebut (Ogden dan Adams, 1987).
Analisis Filogenetik Hasil Amplifikasi DNA Tanaman Andaliman
Setelah dilakukan scoring pada hasil amplifikasi DNA 30 sampel yang
diuji dengan 5 primer yang berbeda, hanya 15 aksesi yang dapat diproses dengan
menggunakan apikasi DARwin 6.0.12. Hal ini disebabkan ada beberapa sampel
dalam tiap aksesi yang tidak teramplifikasi.

Gambar 7. Analisis faktorial principal coordinates analysis (PCoA) aksis 1
(Horizontal) dan aksis 2 (Vertikal) yang dianalisis berdasarkan matrix
dissimilarity simple matching

Universitas Sumatera Utara

Pada penelitian ini, hasil analisis faktorial Principal Coordinates Analysis
(PCoA), menunjukkan bahwa aksis 1 dan aksis 2 mampu menjelaskan nilai
keragaman molekuler pada 5 primer yang digunakan pada 15 aksesi sebesar
53.98 %. Menurut Sinaga (2015) hal ini menunjukkan bahwa 15 aksesi andaliman
tersebut menyebar pada beberapa daerah pada keempat zona tersebut. Hal ini
menunjukkan bahwa aksesi andaliman tersebut memiliki keragaman genetic yang
tinggi, Setiap aksesi tidak mengelompok pada satu sisi.
Dari penelitian yang dilakukan dapat dilihat bahwa kelimabelas aksesi
terbagi dalam 3 kelompok besar. Kelompok 1 terdiri dari 6 aksesi yaitu aksesi 2,
3, 4, 11, 24 dan 26. Kelompok 2 terdiri dari 7 aksesi dengan nomor aksesi 5, 8, 9,
15, 16, 17 dan 22. Sedangkan pada kelompok yang ketiga ada 2 aksesi yaitu
aksesi 23 dan 25.

Gambar 8. Pohon filogenetik 15 aksesi tanaman andaliman yang berasal dari
Sumatera Utara yang dianalisis berdasarkan matrix dissimilarity simple
matching

Universitas Sumatera Utara

Kelompok 1 terdiri dari 2 sub kelompok. Sub kelompok 1 terdiri dari ²
aksesi yaitu aksesi 15, 16, 17 dan 22. Aksesi ini masing masing berasal dari
Kabupaten Dairi (Akesi 15, 16 dan 17) dan Kabupaten Simalungun (Aksesi 22).
Kelompok 3 terdiri dari 2 aksesi yaitu aksesi 23 dan 25 yang keduanya berasal
dari kabupaten yang sama yaitu Kabupaten Simalungun.
Kelompok 2 terdiri dari 3 sub kelompok. Sub kelompok 1 terdiri dari 4
aksesi yaitu aksesi 3, 1, 24 dan 26 yang berasal dari dua daerah berbeda yaitu
akssesi nomor 24 dan 26 dari Kabupaten Simalungun sedangkan aksesi nomor1
dan 3 dari Kabupaten Dairi. Sub kelompok 2 terdiri dari 1 aksesi yaitu aksesi 4
yang berassal dari Kabupaten Dairi. Subkelompok 3 terdiri dari 1 aksesi 2 yang
berasal dari kabupaten Dairi.
Hasil pengelompokan menunjukkan bahwa setiap kelompok maupun sub
kelompok dapat berasal dari berbagai tempat yang berberda-beda. Hal ini berarti
bahwa lokasi tumbuh tidak mempengaruhi factor genetis pada andaliman. Seperti
hal nya pada kelompok 1 subkelompok 1 yang berasal dari 2 Kabupaten yang
berbeda. Dapat dilihat pula bahwa dalam setiap subkelompok terdapat aksesi
dengan lokasi tumbuh yang ketinggian nya bervariasi antara 978 – 1518m diatas
permukaan laut. Hal ini berarti bahwa ketinggian tempat juga tidak mempengaruhi
genetic tanaman andaliman. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya
Sinaga (2015) yang menyatakan bahwa hasil pengelompokan aksesi andaliman
berdasarkan marka RAPD tersebut menghasilkan 3 kelompok tidak dipengaruhi
oleh letak geografis dan ketinggian tempat dilihat dari beragamnya ketinggian
tempat setiap aksesi pada suatu kelompok tersebut.

Universitas Sumatera Utara

Gambar 8. Profil Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) 15 aksesi tanaman
andaliman yang berasal dari Sumatera Utara yang dianalisis
matrix dissimilarity simple matching

Hal tersebut juga dapat dibuktikan dari beragamnya subkelas pada aksesiaksesi yang berasal dari lokasi yang sama. Seperti aksesi yang berasal dari
Kabupaten Simalungun Kecamatan Purba Desa Kampung BarPurba Hinalang
tersebar pada 2kelompok yang berbeda. Aksesi 24 dan 26 berada pada kelompok
1 subkelompok 1 sedangkan aksesi 23 dan 25 berada pada sub kelommpok 3. Hal
ini menunjukkan tingginya keragaman genetic andaliman yang berasal dari daerah
tersebut. Perbedaan genetik andaliman pada daerah yang sama dipengaruhi

Universitas Sumatera Utara

berbagai factor. Terutama factor asal tetua. Kemungkinan terjadinya penyerbukan
secara alami, dapat terjadi melalui bantuan angin ataupun dengan serangga. Selain
itu, bisa juga karena terbawa oleh aliran air pada saat hujan turun ataupun aliran
sungai serta dari bantuan manusia yang memindahkan bibit tanaman ke tempat
lain.
Sementara aksesi yang berasal dari desa Parbuluan Dairi (aksesi 8 dan 9),
desa Tiga baru Kabupaten Dairi (aksesi 15, 16 dan 17), terdapat di masingmasing di subkelas yang sama. Hal ini menunjukkan masih dekatnya kekerabatan
antara masing-masing aksesi yang berasal dari desa yang sama.
Di masing-masing kelompok besar terdapat tanaman yang berbeda-beda
secara morfologisnya. Setiap kelompok terdapat tanaman berwarna daun hijau,
hijau kemerahan dan merah. Contohnya pada kelompok 1 aksesi 15 dan 17 yang
sangat dekat jarak kekerabatannya memiliki warna daun yang berbeda yaitu aksesi
15 berwarna hijau dan aksesi 17 berwarna merah. Setiap jenis andaliman yang
berbeda warna bagian belakang daun sama menyebar pada ketiga kelompok
tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan morfologi tidak menentukan
bahwa perbedaan tersebut dipengaruhi oleh faktor genetik.
Pengelompokan tersebut juga menunjukkan bahwa setiap kelompok tidak
berdasarkan ketinggian tempat dan letak geografis setiap aksesi. Contohnya dapat
dilihat pada aksesi 8 dan 22 yang terletak di kelompok yang

sama namun

ketinggian tempat tumbuh nya beragam yaitu aksesi 8 pada ketinggian 1317 mdpl
dan aksesi 22 pada ketinggian 1423 mdpl. Setiap kelompok tidak dipengaruhi oleh
ketinggian tempat setiap aksesi. Aksesi yang berasl dari tempat yang sama dengan

Universitas Sumatera Utara

ketinggian yang sama menyebar pada ketiga kelompok. Setiap aksesi pada
kelompok berada pada ketinggian 978 – 1423 mdpl.
Dilihat dari jarak kekerabatan antar aksesi dari setiap kelompok jarak
paling dekat adalah aksesi 23 dan 25 pada kelompok 3 yaitu sebesar 0.0326. Hal
ini menunjukkan kedekatan genetic antara aksesi dalam satu kelompok tersebut.
Sementara jarak terbesar adalah jarak antara aksesi 17 dan 24 yaitu sebesar
0.29326. Kedua aksesi ini terdapat pada dua kelompok yang berbeda.
Sementara 15 aksesi lainnya yaitu aksesi 1, 6, 7, 10, 12, 13, 14, 18, 19, 20,
21, 27, 28, 29, 30 tidak dapat diproses pada aplikasi DarWin karena ada sampel
yang tidak teramplifikasi dari aksesi tersebut pada beberapa primer.
Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk
merakit varietas unggul baru (Hutami et al., 2005) menyatakan bahwa dalam
pemuliaan tanaman pendugaan hubungan genetik sangat berguna untuk mengelola
plasma nutfah, identifikasi kultivar, membantu seleksi tetua persilangan serta
mengurangi jumlah individu yang dibutuhkan untuk mengambil sampel dengan
kisaran keragaman yang luas.

Universitas Sumatera Utara

KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Persentasse Polimorfik 30 aksesi andaliman pada 5 primer sebesar 78.34
% menunjukkan keragaman yang