Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi Multivariat untuk Penentuan Simultan Kafein, vitamin B1, B2, dan B6
KOMBINASI SPEKTRUM ULTRAVIOLET DAN
MODEL KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK
PENENTUAN SIMULTAN KAFEIN,
VITAMIN B1, B2, DAN B6
YULIA FATMAWATI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
YULIA FATMAWATI. Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi
Multivariat untuk Penentuan Simultan Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6. Dibimbing oleh
MOHAMAD RAFI dan UTAMI DYAH SYAFITRI.
Kombinasi spektrum ultraviolet dan model kalibrasi multivariat telah
dikembangkan untuk penentuan simultan kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam
contoh minuman berenergi karena mempunyai kriteria cepat, mudah, dan tidak
membutuhkan pemisahan terlebih dahulu. Teknik kalibrasi multivariat yang digunakan
adalah regresi komponen berganda (principle component regression, PCR) dan kuadrat
terkecil parsial (partial least square, PLS).
Kemampuan pendugaan yang lebih baik diberikan oleh PCR yang ditentukan
berdasarkan nilai parameter validasi koefisien determinasi (R2) yang tinggi, root mean
square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of prediction
(RMSEP) yang kecil. Hasil yang diperoleh untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6
menunjukkan nilai RMSEC secara berturut-turut sebesar 0.1572, 0.2184, 0.0979, dan
0.2735. Nilai R2 sebesar 0.9984, 0.7143, 0.9970, dan 0.9822. Sedangkan nilai RMSEP
sebesar 0.0991, 0.1168, 0.0782, dan 0.1308. Kadar kafein vitamin B1, B2, dan B6 yang
diperoleh dari contoh minuman berenergi dengan PCR adalah 50.0452, 1.5120, 5.2502,
dan 5.0045 mg. Berdasarkan evaluasi kinerja analitik pada contoh minuman berenergi,
model terbaik juga diberikan oleh PCR karena diperoleh hasil presisi dan akurasi yang
lebih baik dibandingkan PLS.
ABSTRACT
YULIA FATMAWATI. Combination of Ultraviolet Spectrum and Multivariate
Calibration Models for Simultaneous Determination of Caffeine, B1, B2, and B6Vitamins. Supervised by MOHAMAD RAFI and UTAMI DYAH SYAFITRI.
Combination of ultraviolet spectrum and multivariate calibration has been
developed for simultaneous determination of caffeine, B1, B2, and B6-vitamins contents
in energy drinks because it is a fast, easy, and simple method without any pre-separation.
The multivariate calibration techniques were used principle component regression (PCR)
and partial least square (PLS).
Higher prediction capability was showed by PCR as indicated from the statistical
parameters: higher coefficient of determination (R2), low root mean square error of
calibration (RMSEC), and root mean square error of prediction (RMSEP). The result for
caffeine, B1, B2, and B6-vitamins gave RMSEC values were 0.1572, 0.2184, 0.0979, and
0.2735. R2 values were 0.9984, 0.7143, 0.9970, and 0.9822. And also RMSEP values
were 0.0991, 0.1168, 0.0782, and 0.1308, respectively. The content of caffeine, B1, B2,
and B6-vitamins in one pack of energy drink for PCR was 50.0452, 1.5120, 5.2502, and
5.0045 mg, respectively. Based on analytical parameters evaluation in energy drink, the
best model gave also by PCR because the result of precision and accuration better than
PLS.
KOMBINASI SPEKTRUM ULTRAVIOLET DAN
MODEL KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK
PENENTUAN SIMULTAN KAFEIN,
VITAMIN B1, B2, DAN B6
YULIA FATMAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul : Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi Multivariat untuk
Penentuan Simultan Kafein, vitamin B1, B2, dan B6
Nama : Yulia Fatmawati
NIM : G44203004
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132 321 454
Utami Dyah Syafitri, S.Si. M.Si
NIP 132 311 922
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor,
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahi robbil’aalamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah
SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Karya ilmiah
berjudul Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi Multivariat untuk
Penentuan Simultan Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6 merupakan hasil penelitian yang
dilaksanakan mulai bulan Mei sampai Juli 2007 di Laboratorium Kimia Analitik dan
Laboratorium Bersama Departemen Kimia FMIPA IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
terselesaikannya karya ilmiah ini, di antaranya Mohamad Rafi, S.Si. dan Utami Dyah
Syafitri, S.Si. M.Si. selaku pembimbing yang memberikan masukan, pengarahan, dan
dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih
penulis ucapkan kepada Mama dan Papa tercinta, Kodet, dan Ewink atas segala cinta,
kasih sayang, semangat, kesabaran, dan doa yang diberikan. Penghargaan dan terima
kasih penulis sampaikan kepada Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB, Om Em, seluruh
laboran Kimia Analitik, Mbak Siti, dan Mas Heri atas kemudahan yang diberikan kepada
penulis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Riko dan Rahayu yang telah
pusing dengan datanya, Elin, Chia, Niken, Wina, Rahma, Max, Ratna, Iqo, dan semua
teman-teman Kimia angkatan 40 atas kebersamaan dan semangatnya, serta semua pihak
yang telah membantu.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2007
Yulia Fatmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Solok, Sumatera Barat pada tanggal 23 Juli 1985 sebagai anak
pertama dari pasangan Marion dan Etismawati. Tahun 2003 penulis menyelesaikan studi
di SMU Negeri I Gunung Talang. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk
Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia
Dasar 2 tahun ajaran 2004/2005, Spektroskopi D3 tahun ajaran 2006/2007, Kimia
Analitik IV tahun ajaran 2006/2007, Kimia Layanan Biokimia tahun ajaran 2006/2007,
Kimia Lingkungan tahun ajaran 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 tahun ajaran
2006/2007, asisten praktikum matrikulasi Kimia Dasar D3 tahun ajaran 2007/2008, dan
asisten praktikum Kimia Makanan dan Manajemen Laboratorium D3 tahun ajaran
2007/2008. Selain itu, penulis juga merupakan staf pengajar bimbingan belajar
Nurul Ilmi. Tahun 2006 Penulis melaksanakan Praktik Lapangan di Balai Penelitian
Tanaman Obat dan Aromatik, Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................
viii
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................................
x
PENDAHULUAN ......................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Kafein ...............................................................................................................
Vitamin B .........................................................................................................
Spektrofotometer Ultraviolet ...........................................................................
Rancangan Fraksional Faktorial ......................................................................
Kalibrasi Multivariat ........................................................................................
Kriteria Kebaikan Model .................................................................................
1
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................................
Kalibrasi Satu Komponen ...............................................................................
Penentuan Kadar Kafein, VitaminB1, B2, dan B6 dalam Contoh Sintetik ......
Penentuan Kadar Kafein, VitaminB1, B2, dan B6 dalam Contoh Minuman ...
6
6
6
6
6
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................................
Kalibrasi Satu Komponen ...............................................................................
Pembentukan Model dengan PCR dan PLS .....................................................
Perbandingan Model antara PCR dan PLS ......................................................
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6 dalam Contoh Minuman ..
Evaluasi Kinerja Analitik .................................................................................
7
8
9
11
11
12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ..........................................................................................................
Saran ................................................................................................................
13
13
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
13
LAMPIRAN ...............................................................................................................
16
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Prediksi komposisi set kalibrasi ..........................................................................
6
2
Prediksi komposisi set validasi .............................................................................
7
3
Koefisien determinasi dan DLD untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6 ..............
10
4
Hasil analisis lima komponen utama PCR ...........................................................
10
5
Hasil analisis regresi PLS .....................................................................................
10
6
Nilai PRESS dan R2 kafein, vitamin B1, B2, dan B6 .........................................
10
7
Perbandingan parameter kebaikan model validasi kafein, vitamin B1, B2,
dan B6...................................................................................................................
11
8
Korelasi nilai Y sebenarnya dan Y prediksi kafein, vitamin B1, B2 dan B6.........
11
9
Hasil penentuan simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh
minuman dengan selang kepercayaan 95% .........................................................
12
10 Kandungan Extra Joss® Active B7 ......................................................................
12
11 Hasil pengukuran kadar kafein, vitamin B2, dan B6 dengan metode HPLC .......
12
12 Hasi uji presisi dan akurasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari contoh
minuman berenergi ...............................................................................................
12
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur kafein ......................................................................................................
2
2
Struktur tiamin ......................................................................................................
2
3
Struktur riboflavin ................................................................................................
2
4
Struktur piridoksin ................................................................................................
3
5
Bagan peralatan Spektrofotometer UV/Vis ..........................................................
3
6
Komponen utama prediktor X1, X2, dan X3 (Miller & Miller 2000) .....................
4
7
Panjang gelombang maksimum kafein dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 8.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
7
Panjang gelombang maksimum vitamin B1 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 1.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
9
Panjang gelombang maksimum vitamin B2 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 2.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
10 Panjang gelombang maksimum vitamin B6 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 2.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
11 Hubungan antara konsentrasi kafein dan absorbans .............................................
8
12 Hubungan antara konsentrasi vitamin B1 dan absorbans .....................................
9
13 Hubungan antara konsentrasi vitamin B2 dan absorbans .....................................
9
14 Hubungan antara konsentrasi vitamin B6 dan absorbans .....................................
9
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Diagram alir penelitian .........................................................................................
16
2
Kurva kalibrasi kafein dari konsentrasi 2.0–62.0 ppm .........................................
17
3
Kurva kalibrasi vitamin B1 dari konsentrasi 0.2–4.8 ppm ...................................
17
4
Kurva kalibrasi vitamin B2 dari konsentrasi 1.0–36.0 ppm .................................
18
5
Kurva kalibrasi vitamin B6 dari konsentrasi 1.0–52.0 ppm .................................
18
6
Hasil analisis komponen utama (PC) (pada delapan PC pertama) .......................
19
7
Hasil analisis regresi kafein dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..................
19
8
Hasil analisis regresi vitamin B1 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
20
9
Hasil analisis regresi vitamin B2 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
23
10 Hasil analisis regresi vitamin B6 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
25
11 Perhitungan parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP pada PCR ......................
27
12 Perhitungan parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP pada PLS .......................
30
13 Analisis simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
berenergi ...............................................................................................................
33
14 Perhitungan kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
berenergi dengan PCR dan PLS .........................................................................
34
15 Perhitungan uji presisi ..........................................................................................
35
16 Perhitungan uji akurasi .........................................................................................
35
1
PENDAHULUAN
Kafein, vitamin B1, B2, dan B6 adalah
senyawa organik yang banyak terdapat di
berbagai jenis sediaan obat, makanan, dan
minuman. Salah satu contohnya ialah
minuman berenergi yang banyak beredar di
pasaran. Kafein banyak digunakan sebagai
obat sakit kepala, dan sebagai stimulan
pembentukan
energi
dalam
minuman
berenergi (Nurachman 2004). Pemberian
kafein secara berlebihan dapat menyebabkan
gelisah, tremor, insomnia, gugup, hipertensi,
kejang, dan mual.
Vitamin B berperan penting dalam
metabolisme pembentukan energi yang
diperlukan sel-sel otak. Kekurangan atau
kelebihan vitamin dapat menyebabkan
masalah fisiologi yang serius. Pemberian
vitamin
B1
yang
berlebihan
dapat
mempengaruhi sistem saraf, kelebihan vitamin
B2 sejauh ini tidak menimbulkan efek yang
berbahaya, tetapi pemberian vitamin B6
secara berlebihan dapat menimbulkan
kerusakan saraf pada kaki dan tangan (ODS
2006). Oleh karena itu, kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 yang ditambahkan dalam
minuman berenergi perlu ditentukan agar
tidak menimbulkan efek yang merugikan dan
sebagai kendali mutu produk.
Analisis kadar kafein dan vitamin B secara
terpisah maupun simultan telah banyak
dikembangkan.
Salah
satunya
adalah
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
(Siong & Swan-Choo 1996) yang sangat luas
penggunaannya, tetapi selalu membutuhkan
preparasi contoh, waktu pengerjaan yang
lama, serta peralatan dan bahan relatif mahal.
Teknik spektrofotometri ultraviolet-visible
(UV-Vis) juga telah dioptimalisasi untuk
penentuan simultan kadar vitamin B1, B6, dan
B12 dalam sirup dan tablet dengan
spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV)
menggunakan teknik zero-crossing (Ozgur &
Koyuncu 2002). Teknik analisis terpisah
kafein juga telah banyak berkembang, seperti
penentuan kafein dalam kopi, teh dan kola
dengan spektrofotometri derivatif (Alpdogan
et al. 2000) dengan hasil yang cukup baik.
Safitri (2007) telah mengembangkan
metode cepat penentuan simultan kafein,
vitamin B2, dan B6 dalam minuman berenergi
dengan teknik zero – crossing. Tetapi hasil
yang diperoleh belum memuaskan karena
teknik ini hanya dapat digunakan untuk
pengukuran simultan kafein dan vitamin B6,
tapi tidak dapat digunakan untuk pengukuran
simultan kafein, vitamin B2, dan B6. Hal ini
disebabkan karena minuman berenergi
memiliki
matriks
yang
berbeda-beda,
sehingga
teknik
SDUV
yang
telah
dikembangkan oleh Safitri (2007) tidak bisa
langsung diterapkan. Selain itu, semakin
banyak derivatisasi spektrum yang dilakukan,
nisbah sinyal terhadap derau (noise) akan
menurun sehingga akan menurunkan pula
ketelitian dan ketepatannya.
Salah satu solusi yang bisa digunakan
untuk penentuan simultan beberapa senyawa
dalam contoh adalah dengan teknik kalibrasi
multivariat yang merupakan bagian dari
kemometrik. Kemometrik pada saat ini
merupakan alternatif yang sangat cocok untuk
prosedur pemisahan dan deteksi dalam
analisis senyawa kimia. Analisis kemometrik
dengan teknik regresi komponen utama
(principle component regression, PCR) dan
kuadrat terkecil parsial (partial least square,
PLS), merupakan teknik kalibrasi multivariat
yang bisa digunakan untuk penentuan
multikomponen. Teknik PCR dan PLS dapat
digunakan untuk menghubungkan spektrum
absorpsi dengan konsentrasi kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 dari minuman berenergi.
Keuntungan
teknik
ini
ialah
dapat
mengeliminasi spektrum pengganggu dalam
kuantifikasi
contoh,
meningkatkan
selektivitas, dan tidak memerlukan pemisahan
atau prakonsentrasi terlebih dahulu (Lopezde-Alba et al. 2006).
Oleh karena itu, diperlukan penelitian
lebih lanjut untuk penentuan simultan kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dari minuman
berenergi. Penelitian ini mempelajari dan
mengembangkan metode analitik dengan
kriteria mudah, murah, dan cepat serta
memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik.
Selain itu, penelitian bertujuan menentukan
kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 secara
simultan dengan kombinasi spekrum UV dan
model
kalibrasi
multivariat,
juga
dibandingkan kebaikan model PCR dan PLS
dalam menduga kadar kafein, vitamin B1, B2,
dan B6, dan evaluasi kinerja analitik melalui
penentuan presisi dan akurasi.
TINJAUAN PUSTAKA
Kafein
Kafein
atau
1,3,7-trimetilxantin
merupakan senyawa golongan alkaloid purin
(Hesse 2002) dengan rumus molekul
C8H10N4O2 (Gambar 1). Senyawa ini
mempunyai sifat fisik berupa serbuk putih
atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya
2
menggumpal, tidak berbau, dan berasa pahit
seperti alkaloid pada umumnya. Kafein sukar
larut dalam eter, agak sukar larut dalam air
dan etanol, serta mudah larut dalam kloroform
(Depkes RI 1995).
Kafein dapat menimbulkan perangsangan
terhadap susunan saraf pusat (otak), sistem
pernapasan, serta sistem pembuluh darah dan
jantung. Bahkan senyawa xantin dalam dosis
rendah mampu merangsang susunan saraf
yang sedang depresi. Lebih jauh, kafein
ternyata dapat menetralisasi asam lemak
dalam darah. Pada dosis sedang, kafein dapat
meningkatkan produksi asam lambung yang
berlangsung lama, sehingga memperbesar
resiko penyakit lambung, tukak lambung, atau
tukak usus halus.
O
H3C
CH3
N
N
N
O
(kepiting, ikan, kerang, dan lain-lain), dan
telur.
H3C
N
+
N
N
CH3
NH2
Gambar 2 Struktur tiamin.
Riboflavin (vitamin B2)
Riboflavin terdiri atas sebuah cincin
isoaloksazin heterosiklik yang melekat pada
gula alkohol dan ribitol (Gambar 3). Vitamin
ini merupakan pigmen berpendar dan
berwarna yang relatif stabil terhadap
pemanasan, namun akan terurai dengan
adanya cahaya (Murray et al. 1996). Senyawa
ini memiliki warna kuning atau jinggakekuningan, sehingga sering digunakan
sebagai pewarna makanan.
O
N
CH3
Gambar 1 Struktur kafein.
H3C
N
H3C
N
NH
Tiamin (vitamin B1)
Tiamin atau vitamin B1 tersusun dari
pirimidin yang dihubungkan oleh jembatan
metilena dengan tiazol tersubstitusi (Gambar
2). Tiamin aktif berada dalam bentuk tiamin
difosfat (pirofosfat) (Murray et al. 1996).
Tiamin adalah senyawa tidak berwarna
dengan rumus kimia C12H17N4OS. Senyawa
ini larut dalam air, tetapi tidak larut dalam
alkohol dan dapat terdekomposisi jika
dipanaskan.
Tiamin terdapat hampir pada semua
tanaman dan tubuh hewan yang lazim
digunakan sebagai makanan, tetapi kandungan
vitamin ini biasanya kecil. Biji-bijian yang
tidak digiling sempurna dan daging
merupakan sumber tiamin yang baik. Selain
itu tiamin juga banyak terdapat pada roti,
ginjal, hati, sereal, susu, unggas, makanan laut
N
O
OH
Vitamin B
Vitamin B yang esensial bagi nutrisi
manusia adalah tiamin (B1), riboflavin (B2),
niasin (B3), asam pantotenat (B5), piridoksin
(B6), biotin, kobalamin (B12), dan asam folat.
Vitamin B larut dalam air, maka kelebihan
vitamin B ini akan dieksresikan ke dalam urin
dan dengan demikian, jarang tertimbun dalam
konsentrasi yang toksik (Murray et al. 1996).
OH
S
OH
HO
OH
Gambar 3 Struktur riboflavin.
Vitamin ini berada dalam bentuk aktifnya
berupa flavin mononukleotida (FMN) atau
flavin adenin dinukleotida (FAD). Seperti
halnya vitamin B yang lain, riboflavin juga
berperan dalam produksi energi, karena
senyawa ini berperan dalam metabolisme
lemak, karbohidrat, dan protein. Vitamin B2
juga diperlukan untuk pertumbuhan badan,
pembentukan dan respirasi sel darah merah,
dan pembentukan antibodi.
Defisiensi vitamin B2 akan menimbulkan
berbagai gejala, seperti stomatitis angularis,
keilosis, glositis, sebore, dan fotofobia.
Sumber alami riboflavin adalah susu, keju,
sayuran hijau, hati, ragi, almond, dan kacangkacangan.
Piridoksin (vitamin B6)
Vitamin B6 terdiri atas tiga derivat piridin
yang berhubungan erat, yaitu piridoksin,
piridoksal, dan piridoksamin, serta derivat
3
fosfat yang bersesuaian (Gambar 4).
Piridoksal fosfat merupakan bentuk utama
vitamin B6 yang aktif (Murray et al. 1996).
Defisiensi akibat kekurangan vitamin B6 saja
jarang terjadi, dan setiap defisiensi biasanya
merupakan bagian dari defisiensi umum
vitamin B kompleks. Hati, ikan makerel,
alpukat, pisang, daging, sayuran, dan telur
merupakan sumber vitamin B6 yang baik.
OH
OH
OH
N
CH3
Gambar 4 Struktur piridoksin.
Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer sesuai dengan namanya
terdiri atas spektrometer dan fotometer
(Gambar 5). Spektrometer menghasilkan sinar
dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang yang ditransmisikan
atau yang diabsorpsi. Jadi, spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energi secara
relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang (Khopkar 1990).
Monokromator
Detektor
Hukum Lambert menyatakan bahwa
penyerapan sinar tidak bergantung pada
intensitas sumber cahaya. Hukum Beer
menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar
sebanding dengan banyaknya molekul yang
menyerap (Sudjadi 1985). Sumber radiasi
yang dipancarkan harus memiliki panjang
gelombang yang sama untuk penyerapan agar
memenuhi hukum Beer.
Cara-cara analisis kuantitatif dengan
pengukuran absorbans menggunakan teknik
spektrofotometri UV-Vis telah banyak
dikembangkan, seperti memakai kurva
kalibrasi dari sederet larutan standar, adisi
standar, adisi standar titik H, dan teknik
derivatif. Kurva kalibrasi menggunakan
larutan-larutan standar yang sebaiknya
mempunyai
komposisi
sama
dengan
komposisi cuplikan yang sebenarnya, dan
konsentrasi cuplikan berada di antara
konsentrasi-konsentrasi
larutan
standar
(Supriatna 1994).
Metode adisi standar dilakukan dengan
menambahkan larutan standar ke dalam
larutan cuplikan maupun campuran cuplikan
dan standar (Skoog et al. 1998). Metode adisi
standar titik H hampir sama dengan adisi
standar, yakni juga dilakukan penambahan
standar. Hanya saja pengukuran dilakukan
pada dua panjang gelombang terpilih, dan
konsentrasi contoh bisa langsung diperoleh di
titik H tersebut. Sementara itu, dengan teknik
derivatif spektrofotometri, spektrum didapatkan dari plot derivatif pertama atau orde
tertinggi absorbans atau transmitans sebagai
fungsi panjang gelombang (Skoog et al.
1998).
Lensa
Sumber
Sinar
Contoh
Amplifier
Keluaran
Gambar 5 Bagan peralatan spektrofotometer
UV/Vis.
Dasar teknik spektroskopi adalah interaksi
antara radiasi elektromagnetik dan bahan yang
dianalisis. Analisis dengan spektrofotometri
UV didasarkan pada penyerapan energi sinar
dengan panjang gelombang tertentu oleh
molekul dalam suatu senyawa. Semua
molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah
UV-Vis karena mengandung elektron yang
dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang
lebih tinggi. Besar energi radiasi bergantung
pada frekuensi atau panjang gelombang
radiasi yang dimiliki.
Rancangan Fraksional
Faktorial
Rancangan faktorial merupakan salah satu
cara yang digunakan dalam melakukan suatu
percobaan untuk melihat efek dari dua faktor
atau lebih terhadap hasil yang diperoleh.
Dengan menggunakan rancangan faktorial,
didefinisikan bahwa setiap percobaan yang
dilakukan adalah kombinasi percobaan yang
mungkin untuk setiap level dalam faktor yang
dicoba (Montgomery 2001).
Untuk percobaan yang memiliki jumlah
faktor sedikit, semua kombinasi faktorial
desain untuk setiap level dari setiap faktor
dapat dilakukan. Namun, untuk percobaan
dengan jumlah faktor relatif lebih banyak,
jumlah pengamatan yang dilakukan akan
sangat besar pula. Jumlah pengamatan yang
4
sangat besar tersebut dapat dikurangi dengan
menggunakan rancangan fraksional faktorial.
Sebagai contoh, dalam penelitian ini
terdapat empat faktor yang terdiri dari delapan
tingkat konsentrasi untuk masing-masing
senyawa. Kemudian faktor dan tingkat
konsentrasi digunakan sebagai masukan
dalam program statistical analysis software
(SAS) 9.1, sehingga terdapat 84 fraksi, yaitu
4096 komposisi. Selanjutnya diperoleh luaran
berupa desain percobaan yang telah
terfraksionalisasi menjadi 84-2. Luaran ini
berupa komposisi 64 campuran set yang
terdiri atas 48 komposisi kalibrasi set dan 16
komposisi validasi set.
Kalibrasi Multivariat
Kemometrik adalah seni mengekstraksi
informasi kimia dari data yang dihasilkan oleh
suatu percobaan kimia (Wold 1995).
Kemometrik menyediakan teknik untuk
mengurangi data berukuran besar yang
diperoleh
dari
instrumen
seperti
spektrofotometer
(Varmuza
2002).
Selanjutnya model ini dapat digunakan untuk
menduga contoh yang tidak diketahui.
Kalibrasi multivariat merupakan salah satu
bentuk teknik analisis kemometrik yang dapat
digunakan untuk menentukan campuran dari
beberapa
senyawa.
Teknik
kalibrasi
multivariat ini antara lain berupa PCR dan
PLS, yang sering digunakan dalam analisis
spektrum kuantitatif untuk mendapatkan
informasi yang selektif dari data yang tidak
selektif (Diaz et al. 1997).
PCR dan PLS memiliki beberapa
perbedaan. Pada teknik PCR, hanya informasi
dalam matriks X yang digunakan untuk
dekomposisi spektrum, sedangkan pada PLS
data konsentrasi matriks juga digunakan; jadi
bergantung pada X dan Y (Diaz et al. 1997).
Pada PCR, dekomposisi spektrum didasarkan
pada semua variasi spektrum tanpa
memperhatikan konsentrasi contoh.
Teknik-teknik kalibrasi multivariat dengan
berbagai
kombinasi
telah
banyak
dikembangkan untuk analisis simultan
berbagai senyawa dalam campuran, beberapa
di antaranya ialah penentuan simultan empat
campuran obat farmasi (Cevdet et al. 1998),
penentuan piridoksal, piridoksamin, dan asam
piridoksat menggunakan fluorimetri dengan
variabel spektrum non-linier dan PLS (Berzas
et al. 1998), simultan parasetamol, kafein, dan
asam asetilsalisilat dengan spektrofotometri
UV dan kombinasi PLS (Medina et al 1999),
penentuan Fe, Co, dan Cu dalam medium
misel (Abdollahi et al. 2003), dan penentuan
empat senyawa pestisida (Diaz et al. 1997).
Regresi Komponen Utama (PCR)
Ide dari PCR adalah membentuk model
antara konsentrasi senyawa dan komponen
utama (principle component, PC) pada data
matriks (spektrum) (Cevdet et al. 1998). PCR
menggunakan regresi untuk mengubah skor
dalam konsentrasi (Brereton 2000). Untuk
mendapatkan skor yang akan diregresikan
dengan konsentrasi dibutuhkan analisis
komponen utama (principle component
analysis, PCA). PCA merupakan suatu teknik
untuk mengurangi jumlah peubah dalam suatu
matriks data. Prinsip PCA adalah mencari
komponen utama yang merupakan kombinasi
linear dari peubah asli (Varmuza 2000).
Komponen-komponen utama (PC) tersebut
dipilih sedemikian rupa sehingga komponen
utama pertama memiliki variasi terbesar
dalam set data, sedangkan komponen utama
kedua tegak lurus terhadap komponen utama
pertama dan memiliki variasi terbesar
berikutnya (Miller & Miller 2000). Jika
jumlah ragam dari komponen utama satu (PC
1) dan dua (PC 2) lebih besar dari 70%, maka
plot skor memperlihatkan visualisasi dua
dimensi yang baik (Varmuza 2000). Gambar 6
menggambarkan komponen utama dari
peubah X1, X2, dan X3.
Nilai PC yang didapatkan dari PCA
kemudian diregresikan secara linear berganda
dengan PC sebagai penduga dan konsentrasi
sebagai respon. Regresi yang didapat ini
menghasilkan matriks koefisien yang apabila
dikalikan
dengan
matriks
absorbans
menghasilkan matriks konsentrasi.
Gambar 6 Komponen utama prediktor X1,
X2, dan X3 (Miller & Miller
2000).
5
Kuadrat Terkecil Parsial (PLS)
PLS merupakan salah satu teknik kalibrasi
multivariat yang sangat luas digunakan dalam
analisis kuantitatif data spektroskopi dan
elektrokimia (Abdollahi et al. 2003). PLS
digunakan untuk menduga serangkaian
peubah dependen dari peubah independen
(penduga) yang jumlahnya sangat banyak,
memiliki struktur sistematik linear atau
nonlinear, dengan atau tanpa data yang hilang,
dan memiliki kolinearitas yang tinggi.
Teknik ini membentuk model dari peubahpeubah yang ada untuk membentuk
serangkaian respon dengan menggunakan
regresi kuadrat terkecil dalam bentuk matriks
(Lindblom 2004). Inti dari PLS adalah untuk
menghitung nilai (skor) dari matriks X dan Y
dan untuk membuat model regresi antara
nilai-nilai tersebut. Kelebihan dari PLS
dibandingkan dengan regresi berganda adalah
dalam mengatasi masalah kolinearitas data,
peubah penjelas (X) yang banyak, dan juga
dapat secara simultan memodelkan beberapa
peubah respon (Y) (Wold 1995).
PLS menggambarkan hubungan eksternal
dan hubungan internal antara X dan Y.
Hubungan eksternal ditulis dengan persamaan
berikut:
a
X= TP'+E= ∑thp'h +E
(1)
h=1
a
Y= UQ'+F =
∑u q' +F
h
h
(2)
h=1
dengan
X = peubah penjelas
Y = peubah respon
T dan U = vektor skor faktor komponen
utama peubah X dan Y
P dan Q = vektor
pembobot
dari
peubah X dan Y
E = matriks sisaan peubah penjelas (X)
F = matriks sisaan peubah respon (Y)
Y = XB + F
(5)
dengan
Y = peubah respon
X = peubah penjelas
F = matriks sisaan peubah respon (Y)
B = koefisien regresi PLS
Kriteria Kebaikan Model
Kebaikan suatu model dapat dilihat dari
beberapa parameter. Selisih antara nilai aktual
dan dugaan dari peubah penjelas (Y) dihitung,
dan jumlah kuadrat dari selisih tersebut
dikumpulkan untuk mendapatkan nilai
prediction residual error sum of square
(PRESS).
n
PRESS =
∑( y
uh = bhth
(3)
bh =u'hth t'hth
(4)
internal
dengan
t h dan u h = vektor skor faktor omponen
utama ke-h peubah X dan Y
b h = koefisien internal
Pendugaan parameter dalam regresi PLS
didapatkan melalui model persamaan:
− yˆ
)
i
2
(6)
i =1
dengan:
ŷi = respon dugaan
yi = respon aktual
Selain dari nilai PRESS, kebaikan model
juga dilihat dari nilai R2, root mean square
error of calibration (RMSEC), dan root mean
square error of prediction (RMSEP). R2
mengindikasikan mutu data antara konsentrasi
nyata dan konsentrasi yang diperkirakan. R2
menunjukkan kemampuan suatu metode untuk
menghasilkan angka analisis yang proporsional terhadap konsentrasi contoh pada interval
konsentrasi tertentu.
RMSEC digunakan untuk menghitung
galat dugaan. Dalam model yang memiliki
peubah x atau faktor PCR dan PLS yang
banyak menyebabkan perbedaan antara
RMSEC dan galat dugaan akan menjadi besar
(Naes et al. 2002).
RMSEP digunakan untuk data yang dibagi
menjadi dua bagian, satu untuk model
kalibrasi dan yang lainnya untuk validasi
(Naes et al. 2002).
N
Sedangkan untuk hubungan
ditulis dengan persamaan berikut:
i
RMSEP =
∑ ( yˆ
p
i
−y
i
)
2
N
p
(7)
i =1
dengan:
ŷi = respon dugaan
yi = respon aktual
Np = jumlah data
Selang kepercayaan merupakan selang
yang mengandung kemungkinan tertentu
parameter yang tidak diketahui yang akan
diukur. Selang kepercayaan digunakan tidak
hanya untuk menentukan nilai contoh yang
tidak
diketahui,
tetapi
juga
untuk
6
menunjukkan nilai ketidaktentuan dalam
prosedur perhitungan (Naes et al. 2002).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
standar kafein diperoleh dari Lab. Kimia
Analitik FMIPA IPB, standar vitamin B1, B2,
dan B6 diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka
LPPM IPB, air deionisasi, dan contoh
minuman berenergi Extra Joss® dari PT
Bintang Toedjoe yang akan dianalisis.
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1701 PC
dengan perangkat lunak UV Probe versi 2.0,
kuvet kuarsa 1 cm, seperangkat komputer, dan
alat-alat kaca. Analisis data menggunakan
perangkat lunak SAS 9.1 dan Minitab 14.
Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dalam beberapa
tahap, yaitu penentuan λmaks, penentuan daerah
linear dinamis, pembentukan model kalibrasi
dan validasi, penentuan kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 dalam contoh sintetik dan
contoh minuman berenergi, dan evaluasi
kinerja metode yang dikembangkan dngan
menentukan presisi dan akurasinya (Lampiran
1).
Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum
Panjang gelombang maksimum (λmaks) tiap
senyawa ditentukan dengan membuat larutan
stok 40 ppm untuk masing-masing senyawa.
Sebanyak 20 mg kafein, vitamin B1, B2, dan
B6 dilarutkan dengan air deionisasi dan
ditepatkan dalam labu takar 500 mL.
Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok
kafein, 1 mL larutan stok vitamin B1, dan 5
mL larutan stok vitamin B2 dan B6,
diencerkan ke dalam labu takar 50 mL dengan
pelarut yang sama. Spektrum absorpsi diukur
pada panjang gelombang 200–400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. λmaks diperoleh dari absorbans
maksimum masing-masing senyawa.
Kalibrasi Satu Komponen
Kalibrasi satu komponen dilakukan dengan
membuat variasi konsentrasi tiap senyawa:
yaitu 0.10–78.00 ppm untuk kafein, 0.05–6.00
ppm untuk vitamin B1, 0.05–60 ppm untuk
vitamin B2, dan 0.05–72.00 ppm untuk
vitamin B6. Spektrum absorpsi masingmasing senyawa diukur pada panjang
gelombang maksimumnya. Daerah linear
dinamis untuk tiap senyawa kemudian
ditentukan dengan kurva kalibrasi antara
absorbans
pada
panjang
gelombang
maksimum dan konsentrasi contoh dengan
melihat nilai koefisien korelasi atau koefisien
determinansinya.
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Sintetik
Penentuan kadar kafein, vitamin B1, B2,
dan B6 dalam contoh sintetik menggunakan
kalibrasi multivariat dilakukan dengan
membuat dua set larutan standar. Set kalibrasi
mengandung 48 larutan standar (Tabel 1) dan
set validasi mengandung 16 larutan standar
(Tabel 2).
Konsentrasi tiap senyawa yang berada
dalam daerah linear dinamis divariasikan:
2.0–16.0 ppm untuk kafein, 0.2–1.6 ppm
untuk vitamin B1, dan 1.0–8.0 ppm untuk
vitamin B2 dan B6. Kedua set larutan standar
diukur serapannya secara simultan pada
panjang gelombang 200–400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. Data absorbans dari set validasi dan
set kalibrasi dikumpulkan dalam 2 matriks
yang berbeda. Kemudian konsentrasi dalam
set validasi dihitung dengan model kalibrasi
multivariat yang diperoleh.
Tabel 1 Prediksi komposisi set kalibrasi
Konsentrasi (ppm)
No.
Contoh
B1
B2
B6
Kafein
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.60
0.60
0.60
0.60
0.60
2.00
3.00
4.00
6.00
5.00
7.00
1.00
2.00
3.00
5.00
6.00
7.00
1.00
4.00
5.00
7.00
8.00
8.00
4.00
5.00
2.00
7.00
6.00
8.00
1.00
5.00
2.00
7.00
3.00
4.00
8.00
6.00
7.00
2.00
16.00
8.00
10.00
4.00
14.00
12.00
14.00
4.00
12.00
2.00
16.00
8.00
4.00
12.00
16.00
10.00
8.00
7
Lanjutan Tabel 1 Prediksi
komposisi
set
kalibrasi
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0.60
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.20
1.20
1.20
1.20
1.20
1.20
1.40
1.40
1.40
1.40
1.40
1.40
1.60
1.60
1.60
1.60
1.60
1.60
5.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1.00
2.00
3.00
5.00
6.00
7.00
2.00
3.00
4.00
6.00
7.00
8.00
2.00
3.00
4.00
5.00
7.00
8.00
1.00
2.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1.00
4.00
8.00
1.00
3.00
6.00
2.00
7.00
2.00
6.00
1.00
8.00
4.00
7.00
3.00
6.00
1.00
5.00
4.00
3.00
7.00
2.00
4.00
1.00
8.00
3.00
6.00
7.00
5.00
4.00
8.00
10.00
2.00
10.00
8.00
4.00
14.00
6.00
6.00
12.00
4.00
10.00
8.00
16.00
8.00
16.00
2.00
12.00
4.00
14.00
10.00
2.00
16.00
12.00
14.00
4.00
12.00
6.00
4.00
8.00
10.00
2.00
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Minuman Berenergi
Contoh minuman berenergi yang akan
diukur secara simultan kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6-nya, ditimbang sebanyak 4.0
g. Kemudian contoh dilarutkan dengan air
deionisasi dan ditepatkan dalam labu takar 50
mL. Selanjutnya sebanyak 0.625 mL larutan
contoh diencerkan ke dalam labu takar 50 mL.
Spektrum contoh diukur dari panjang
gelombang 200 sampai 400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. Data absorbans yang diperoleh
kemudian dimasukkan ke dalam persamaan
regresi multivariat yang telah didapat dari set
kalibrasi untuk mendapatkan konsentrasi
contoh dan evaluasi model yang diajukan dari
set validasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum
Panjang gelombang maksimum yang
diperoleh dari hasil pengukuran larutan
standar kafein, vitamin B1, B2, dan B6
dengan pelarut air deionisasi menggunakan
spektrofotometer UV-Vis secara berurutan
adalah 272.9, 234.2, 267.0, dan 222.2 nm.
Spektrum
absorpsi
yang
diperoleh
ditunjukkan berturut-turut pada Gambar 7–10.
Tabel 2 Prediksi komposisi set validasi
Konsentrasi (ppm)
No.
Contoh
B1
B2
B6
Kafein
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0.20
0.20
0.40
0.40
0.60
0.60
0.80
0.80
1.00
1.00
1.20
1.20
1.40
1.40
1.60
1.60
1.00
8.00
4.00
8.00
2.00
6.00
1.00
8.00
4.00
8.00
1.00
5.00
1.00
6.00
2.00
8.00
1.00
3.00
4.00
6.00
5.00
3.00
5.00
7.00
3.00
5.00
2.00
8.00
6.00
5.00
3.00
1.00
2.00
6.00
6.00
10.00
14.00
2.00
16.00
12.00
14.00
2.00
10.00
6.00
8.00
6.00
14.00
16.00
272,9 nm
Gambar 7 Panjang gelombang maksimum
kafein
dalam
pelarut
air
deionisasi dengan konsentrasi 8.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
8
222,2 nm
234,2 nm
Gambar 8 Panjang gelombang maksimum
vitamin B1 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 1.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Gambar 10 Panjang gelombang maksimum
vitamin B6 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 2.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Kalibrasi Satu Komponen
267 nm
Kalibrasi satu komponen dilakukan untuk
memperoleh daerah konsentrasi linear yang
dinamis untuk tiap senyawa di panjang
gelombang maksimumnya. Gambar 11–14
berturut-turut
merupakan
kurva
yang
menunjukkan daerah linear dinamis (DLD)
dalam hubungan antara konsentrasi kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dan absorbans.
Gambar 9 Panjang gelombang maksimum
vitamin B2 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 2.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Gambar 11 Hubungan antara konsentrasi
kafein dan absorbans.
9
absorbans. Ketidaklinearan ini disebabkan
adanya penyimpangan hukum Lambert-Beer
yang disebabkan oleh konsentrasi contoh yang
terlalu pekat atau terlalu encer. Konsentrasi
yang dipilih adalah yang berada dalam DLD
dan memberikan kelinearan yang tinggi
(Hwang & Nettleton 2002). Kurva kalibrasi
masing-masing senyawa terlampir pada
Lampiran
2–5.
Konsentrasi
yang
menunjukkan DLD dan daerah tidak linear
ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel 3 Koefisien determinasi dan DLD
untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6
Gambar 12 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B1 dan absorbans.
Gambar 13 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B2 dan absorbans.
Analat
R2
DLD
(ppm)
Kafein
0.9984
2.0–62.0
Vit. B1
0.9994
0.2–4.8
Vit. B2
0.9992
1.0–36.0
Vit. B6
0.9972
1.0–52.0
Daerah tidak
linear (ppm)
0.10–1.60 dan di
atas 62.00
0.05–0.15 dan di
atas 48.00
0.05–0.70 dan di
atas 36.00
0.05–0.70 dan di
atas 52.00
Nilai konsentrasi yang termasuk ke dalam
DLD
digunakan
untuk
menentukan
konsentrasi dalam set kalibrasi dan set
validasi contoh sintetik kafein, vitamin B1,
B2, dan B6. Pembentukan set kalibrasi dan set
validasi terdiri dari delapan tingkat
konsentrasi. Delapan tingkat konsentrasi
tersebut adalah 2.0–16.0 ppm untuk kafein
dengan interval 2 ppm, 0.2–1.6 ppm untuk
vitamin B1 dengan interval 0.2 ppm, serta
1.0–6.0 ppm untuk vitamin B2 dan B6 dengan
interval 1 ppm.
Pembentukan Model
dengan PCR dan PLS
Gambar 14 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B6 dan absorbans.
Gambar 11 sampai dengan Gambar 14
juga menunjukkan daerah-daerah saat
konsentrasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6
tidak lagi memiliki hubungan linear dengan
Model PCR dan PLS dibentuk dari 48
komposisi set kalibrasi (Tabel 1) dan 16
komposisi set validasi (Tabel 2). Seluruh
campuran diukur absorbansnya pada panjang
gelombang 200–400 nm dengan interval 0.2
nm menggunakan air deionisasi sebagai
blangko. Nilai absorbans spektrum dari 48
komposisi set kalibrasi digunakan untuk
membuat model PCR dan PLS, dan 16
campuran set validasi digunakan untuk
validasi model yang didapat dari set kalibrasi.
Penentuan konsentrasi kafein, vitamin B1, B2,
dan B6 dari tiap campuran dilakukan dengan
membentuk dua model kalibrasi, yaitu PCR
dan PLS.
10
Pemodelan dengan PCR
Model PCR diawali dengan PCA yang
menghasilkan nilai loading PC sebanyak
jumlah peubah yang dipakai, yaitu 1001
panjang gelombang yang digunakan. Hasil PC
yang diperoleh tidak semuanya digunakan,
karena tiap PC memberikan proporsi yang
berbeda dari seluruh data. Hasil analisis PC
ditunjukkan pada Lampiran 6. Nilai PC yang
diambil lima, yang cukup mewakili
keseluruhan data yang ada. Proporsi dan
kumulatif dari kelima PC terdapat pada Tabel
4.
Tabel 4
PC
PC1
PC2
PC3
PC4
PC5
Hasil analisis
utama PCR
Nilai
Eigen
2.3181
0.1744
0.0951
0.0038
0.0006
lima
komponen yang akan digunakan dalam model
regresi PLS. Berdasarkan nilai rataan akar
PRESS didapatkan nilai minimum sebesar
0.3324 untuk set kalibrasi dan banyaknya
komponen yang akan digunakan dalam
model, yaitu 5 komponen.
Pemodelan regresi PLS pada tahap
selanjutnya
dengan
menggunakan
5
komponen mampu menjelaskan persentase
keragaman peubah penjelas (X) sebesar
99.90% dan 92.22% untuk peubah respon (Y).
Hasil analisis PC secara keseluruhan untuk
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dengan PLS
terdapat pada Tabel 6.
komponen
Tabel 5 Hasil analisis regresi PLS
Proporsi
Kumulatif
Peubah
Kafein
0.8940
0.0670
0.0370
0.0010
0.0000
0.8940
0.9610
0.9980
0.9990
1.0000
Ragam X
Ragam Y
n PC
99.91
99.83
5
Langkah berikutnya, PC 1, 2, 3, 4, dan 5
diregresikan secara linear berganda dengan
konsentrasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6
sebagai respon, dan skor PC sebagai penduga,
sehingga diperoleh persamaan regresi
komponen utama. Persamaan regresi untuk
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 adalah sebagai
berikut:
[kafein] = 0.575 – 2.760 PC1 + 3.830 PC2 –
1.700 PC3 + 4.670 PC4 + 5.440 PC5.
[Vit. B1] = 0.816 + 0.014 PC1– 0.120 PC2 +
0.064 PC3 – 5.710 PC4 – 8.040 PC5.
[Vit. B2] = – 0.116 – 0.466 PC1– 4.250 PC2 –
2.860 PC3 + 2.620 PC4 + 3.330 PC5.
[Vit. B6] = 0.240 – 0.305 PC1– 1.480 PC2 +
7.210 PC3 + 4.270 PC4 – 0.790 PC5.
Sementara hasil analisis lengkap regresi
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dengan kelima
PC dapat dilihat pada Lampiran 7 – 10.
Pemodelan
terhadap
PC
tersebut
dikembalikan lagi ke dalam bentuk absorbans
dengan mengalikan koefisien hasil regresi
dengan nilai loading pada masing-masing PC
sehingga diperoleh persamaan regresi dalam
bentuk absorbans. Persamaan regresi tersebut
selanjutnya digunakan untuk menduga kadar
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari data set
validasi.
Pemodelan dengan PLS
Model PLS juga diawali dengan
pembentukan PC. Kemudian dilakukan
validasi silang untuk menentukan banyaknya
Vit.
B1
99.90
72.19
5
Vit.
B2
99.91
99.78
5
Vit.
B6
99.87
99.59
5
Pengolahan dengan PLS juga memberikan
konsentrasi dugaan untuk masing-masing
senyawa. Konsentrasi dugaan yang didapatkan
dari hasil pemodelan 48 set kalibrasi,
selanjutnya digunakan untuk menduga kadar
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari 16
campuran set validasi.
Perbandingan Model Antara PCR dan PLS
Ukuran kebaikan model dilihat dari nilai
PRESS dan R2. Sedangkan kebaikan validasi
model dilihat dari nilai korelasi (r), RMSEP,
dan RMSEC dari model tersebut. Hasil R2 dan
PRESS kafein, vitamin B1, B2, dan B6
ditunjukkan pada Tabel 6, sedangkan
parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP
ditunjukkan pada Tabel 7. Perhitungan kedua
parameter kebaikan ini terlampir pada
Lampiran 11 untuk PCR dan Lampiran 12
untuk PLS.
Tabel 6 Nilai PRESS dan R2 kafein, vitamin
B1, B2, dan B6
Standar
Kafein
Vit. B1
Vit. B2
Vit. B6
Model
PCR
PLS
PCR
PLS
PCR
PLS
PCR
PLS
PRESS
1.5935
0.0506
2.8794
0.6219
0.6198
0.0602
4.7564
0.2174
R2
0.9984
0.9983
0.7143
0.7219
0.9970
0.9978
0.9822
0.9137
11
Berdasarkan Tabel 6, nilai PRESS PCR
lebih besar dibandingkan dengan PLS,
sedangkan nilai R2 kedua model menunjukkan
hasil yang cukup baik untuk semua senyawa,
kecuali pada vitamin B1. Hal ini disebabkan
karena konsentrasi yang digunakan untuk
vitamin B1 terlalu rendah (encer) yang dapat
memengaruhi serapan saat pengukuran.
Besarnya nilai PRESS pada PCR disebabkan
karena jumlah galat sisaan dari dugaan pada
PCR lebih besar dibandingkan PLS.
Nilai korelasi menggambarkan hubungan
yang proporsional antara dua peubah.
Semakin mendekati 1 berarti hubungan antara
dua peubah (konsentrasi sebenarnya dengan
konsentrasi
dugaan)
semakin
linear.
Berdasarkan Tabel 8 terlihat bahwa nilai
korelasi ke dua model menunjukkan hubungan
yang positif (mendekati 1). Nilai korelasi PCR
lebih besar dibandingkan dengan PLS
walaupun perbedaan ke dua nilai tersebut
tidak signifikan.
Tabel 7 Perbandingan parameter kebaikan
validasi model kafein, vitamin B1,
B2, dan B6.
Standar Model
RMSEC
RMSEP
PCR
0.1572
0.0991
Kafein
PLS
0.2943
0.1356
PCR
0.2184
0.1168
Vit. B1
PLS
0.2292
0.1197
PCR
0.0979
0.0782
Vit. B2
PLS
0.1354
0.0919
PCR
0.2735
0.1308
Vit. B6
PLS
0.3355
0.1448
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Minuman Berenergi
Berdasarkan kriteria kebaikan model di
atas, pemilihan model terbaik difokuskan
kepada nilai RMSEC dan RMSEP karena
keduanya digunakan untuk validasi model.
Model yang lebih baik ditunjukkan oleh PCR,
karena nilai RMSEC dan RMSEP yang
diperoleh pada tiap senyawa lebih kecil
dibandingkan dengan PLS.
Nilai RMSEC dan RMSEP yang
dihasilkan sangat baik, karena mendekati nol.
Evaluasi RMSEP pada kedua model
memberikan nilai yang lebih kecil daripada
RMSEC sehingga model yang diperoleh
sangat baik. Naes et al. (2002) menyatakan
bahwa model dugaan yang baik memiliki nilai
RMSEP yang rendah dan dapat mengimbangi
nilai RMSEC, dan nilai korelasi antara Y
dugaan dengan Y sebenarnya yang tinggi,
mendekati 1 (Tabel 8).
Tabel 8 Korelasi nilai Y sebenarnya dengan Y
dugaan untuk kafein, vitamin B1, B2,
dan B6
Nilai
korelasi
Kaf vs Kaf^
PCR
PLS
0.9990
0.9980
B1 vs B1^
0.8790
0.8660
B2 vs B2^
0.9990
0.9980
B6 vs B6^
0.9930
0.9900
^ : dugaan
Kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6
dalam contoh minuman ditunjukkan pada
Tabel 9. Spektrum contoh minuman dan
contoh perhitungan terlampir pada Lampiran
13 dan 14 . Kadar yang diperoleh PCR tidak
jauh berbeda dengan nilai yang tertera pada
label minuman (Tabel 10) dan hasil analisis
PT Bintang Toedjoe (Tabel 11).
PCR mampu menduga tiga konsentrasi
(kafein, vitamin B2, dan B6) dengan baik
dibandingkan PLS yang hanya mampu
menduga dua konsentrasi saja (Vitamin B1
dan B2). Hal ini dikarenakan kemampuan dari
metode PCR dalam mereduksi pengganggu
seperti vitamin-vitamin, ion-ion, dan gula
yang ada dalam contoh minuman. Selain itu,
menurut Chin (2002) untuk penggunaan PLS
ukuran contoh tidaklah harus berukuran besar,
sedangkan dalam penelitian ini ukuran contoh
yang digunakan cukup besar (48 pengamatan
dan 1001 peubah untuk masing-masing
pengamatan),
sehingga
menyebabkan
pendugaan PLS menjadi kurang baik.
Berdasarkan kepada batas atas dan batas
bawah nya, selang antara ke dua batas yang
diberikan
oleh
PCR
lebih
sempit
dibandingkan PLS. Hal ini disebabkan karena
ragam dari PLS lebih besar dibandingkan
dengan PCR, sehingga pendugaan dengan
PCR akan lebih baik dibandingkan dengan
PLS. Berdasarkan Tabel 9 kadar kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 masih termasuk ke
dalam selang kepercayaan karena bobot yang
diperoleh untuk kedua model berada di antara
batas bawah dan batas atasnya.
12
Tabel 9 Hasil penentuan simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
dengan selang kepercayaan 95%
Contoh
PCR
PLS
Batas bawah
Bobot (mg)
Batas atas
Batas bawah
Kafein
49.9056
50.0452
50.1848
47.7450
48.2799
48.8148
Vit. B1
1.3238
1.5120
1.7002
1.0080
1.5105
2.0130
Vit. B2
5.1656
5.2502
5.3348
4.8299
5.2705
5.7110
Vit. B6
4.7681
5.0045
5.2409
6.3200
6.8727
7.4254
Tabel 10 Kandungan Extra Joss® Active B7
Setiap sachet (4 g) mengandung:
Komponen
Tabel 12 Hasi uji presisi dan akurasi kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dari contoh
minuman berenergi
Jumlah (mg)
Taurin
1000
Ginseng
20
Vitamin B1
1.2
Vitamin B2
5.2
Vitamin B3
20
Vitamin B5
5
Vitamin B6
5
Vitamin B12
1
Inositol
50
Kafein
50
Royal Jelly
#
Aspartam
#
Acesulfame-K
#
Na-bikarbonat
#
Asam sitrat
#
Pemberi rasa
#
# Tidak dipublikasikan perusahaan
Standar
Tabel 11 Hasil pengukuran kadar kafein,
vitamin B2 dan B6 dengan metode
HPLC
Contoh
Bobot (mg) Batas bawah
Kadar (mg/4 gram)
Kafein
50.1884
Vitamin B2
5.0240
MODEL KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK
PENENTUAN SIMULTAN KAFEIN,
VITAMIN B1, B2, DAN B6
YULIA FATMAWATI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
YULIA FATMAWATI. Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi
Multivariat untuk Penentuan Simultan Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6. Dibimbing oleh
MOHAMAD RAFI dan UTAMI DYAH SYAFITRI.
Kombinasi spektrum ultraviolet dan model kalibrasi multivariat telah
dikembangkan untuk penentuan simultan kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam
contoh minuman berenergi karena mempunyai kriteria cepat, mudah, dan tidak
membutuhkan pemisahan terlebih dahulu. Teknik kalibrasi multivariat yang digunakan
adalah regresi komponen berganda (principle component regression, PCR) dan kuadrat
terkecil parsial (partial least square, PLS).
Kemampuan pendugaan yang lebih baik diberikan oleh PCR yang ditentukan
berdasarkan nilai parameter validasi koefisien determinasi (R2) yang tinggi, root mean
square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of prediction
(RMSEP) yang kecil. Hasil yang diperoleh untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6
menunjukkan nilai RMSEC secara berturut-turut sebesar 0.1572, 0.2184, 0.0979, dan
0.2735. Nilai R2 sebesar 0.9984, 0.7143, 0.9970, dan 0.9822. Sedangkan nilai RMSEP
sebesar 0.0991, 0.1168, 0.0782, dan 0.1308. Kadar kafein vitamin B1, B2, dan B6 yang
diperoleh dari contoh minuman berenergi dengan PCR adalah 50.0452, 1.5120, 5.2502,
dan 5.0045 mg. Berdasarkan evaluasi kinerja analitik pada contoh minuman berenergi,
model terbaik juga diberikan oleh PCR karena diperoleh hasil presisi dan akurasi yang
lebih baik dibandingkan PLS.
ABSTRACT
YULIA FATMAWATI. Combination of Ultraviolet Spectrum and Multivariate
Calibration Models for Simultaneous Determination of Caffeine, B1, B2, and B6Vitamins. Supervised by MOHAMAD RAFI and UTAMI DYAH SYAFITRI.
Combination of ultraviolet spectrum and multivariate calibration has been
developed for simultaneous determination of caffeine, B1, B2, and B6-vitamins contents
in energy drinks because it is a fast, easy, and simple method without any pre-separation.
The multivariate calibration techniques were used principle component regression (PCR)
and partial least square (PLS).
Higher prediction capability was showed by PCR as indicated from the statistical
parameters: higher coefficient of determination (R2), low root mean square error of
calibration (RMSEC), and root mean square error of prediction (RMSEP). The result for
caffeine, B1, B2, and B6-vitamins gave RMSEC values were 0.1572, 0.2184, 0.0979, and
0.2735. R2 values were 0.9984, 0.7143, 0.9970, and 0.9822. And also RMSEP values
were 0.0991, 0.1168, 0.0782, and 0.1308, respectively. The content of caffeine, B1, B2,
and B6-vitamins in one pack of energy drink for PCR was 50.0452, 1.5120, 5.2502, and
5.0045 mg, respectively. Based on analytical parameters evaluation in energy drink, the
best model gave also by PCR because the result of precision and accuration better than
PLS.
KOMBINASI SPEKTRUM ULTRAVIOLET DAN
MODEL KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK
PENENTUAN SIMULTAN KAFEIN,
VITAMIN B1, B2, DAN B6
YULIA FATMAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul : Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi Multivariat untuk
Penentuan Simultan Kafein, vitamin B1, B2, dan B6
Nama : Yulia Fatmawati
NIM : G44203004
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132 321 454
Utami Dyah Syafitri, S.Si. M.Si
NIP 132 311 922
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor,
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahi robbil’aalamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah
SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Karya ilmiah
berjudul Kombinasi Spektrum Ultraviolet dan Model Kalibrasi Multivariat untuk
Penentuan Simultan Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6 merupakan hasil penelitian yang
dilaksanakan mulai bulan Mei sampai Juli 2007 di Laboratorium Kimia Analitik dan
Laboratorium Bersama Departemen Kimia FMIPA IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
terselesaikannya karya ilmiah ini, di antaranya Mohamad Rafi, S.Si. dan Utami Dyah
Syafitri, S.Si. M.Si. selaku pembimbing yang memberikan masukan, pengarahan, dan
dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih
penulis ucapkan kepada Mama dan Papa tercinta, Kodet, dan Ewink atas segala cinta,
kasih sayang, semangat, kesabaran, dan doa yang diberikan. Penghargaan dan terima
kasih penulis sampaikan kepada Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB, Om Em, seluruh
laboran Kimia Analitik, Mbak Siti, dan Mas Heri atas kemudahan yang diberikan kepada
penulis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Riko dan Rahayu yang telah
pusing dengan datanya, Elin, Chia, Niken, Wina, Rahma, Max, Ratna, Iqo, dan semua
teman-teman Kimia angkatan 40 atas kebersamaan dan semangatnya, serta semua pihak
yang telah membantu.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2007
Yulia Fatmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Solok, Sumatera Barat pada tanggal 23 Juli 1985 sebagai anak
pertama dari pasangan Marion dan Etismawati. Tahun 2003 penulis menyelesaikan studi
di SMU Negeri I Gunung Talang. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk
Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia
Dasar 2 tahun ajaran 2004/2005, Spektroskopi D3 tahun ajaran 2006/2007, Kimia
Analitik IV tahun ajaran 2006/2007, Kimia Layanan Biokimia tahun ajaran 2006/2007,
Kimia Lingkungan tahun ajaran 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 tahun ajaran
2006/2007, asisten praktikum matrikulasi Kimia Dasar D3 tahun ajaran 2007/2008, dan
asisten praktikum Kimia Makanan dan Manajemen Laboratorium D3 tahun ajaran
2007/2008. Selain itu, penulis juga merupakan staf pengajar bimbingan belajar
Nurul Ilmi. Tahun 2006 Penulis melaksanakan Praktik Lapangan di Balai Penelitian
Tanaman Obat dan Aromatik, Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................
viii
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................................
x
PENDAHULUAN ......................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Kafein ...............................................................................................................
Vitamin B .........................................................................................................
Spektrofotometer Ultraviolet ...........................................................................
Rancangan Fraksional Faktorial ......................................................................
Kalibrasi Multivariat ........................................................................................
Kriteria Kebaikan Model .................................................................................
1
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................................
Kalibrasi Satu Komponen ...............................................................................
Penentuan Kadar Kafein, VitaminB1, B2, dan B6 dalam Contoh Sintetik ......
Penentuan Kadar Kafein, VitaminB1, B2, dan B6 dalam Contoh Minuman ...
6
6
6
6
6
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................................
Kalibrasi Satu Komponen ...............................................................................
Pembentukan Model dengan PCR dan PLS .....................................................
Perbandingan Model antara PCR dan PLS ......................................................
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2, dan B6 dalam Contoh Minuman ..
Evaluasi Kinerja Analitik .................................................................................
7
8
9
11
11
12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ..........................................................................................................
Saran ................................................................................................................
13
13
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
13
LAMPIRAN ...............................................................................................................
16
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Prediksi komposisi set kalibrasi ..........................................................................
6
2
Prediksi komposisi set validasi .............................................................................
7
3
Koefisien determinasi dan DLD untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6 ..............
10
4
Hasil analisis lima komponen utama PCR ...........................................................
10
5
Hasil analisis regresi PLS .....................................................................................
10
6
Nilai PRESS dan R2 kafein, vitamin B1, B2, dan B6 .........................................
10
7
Perbandingan parameter kebaikan model validasi kafein, vitamin B1, B2,
dan B6...................................................................................................................
11
8
Korelasi nilai Y sebenarnya dan Y prediksi kafein, vitamin B1, B2 dan B6.........
11
9
Hasil penentuan simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh
minuman dengan selang kepercayaan 95% .........................................................
12
10 Kandungan Extra Joss® Active B7 ......................................................................
12
11 Hasil pengukuran kadar kafein, vitamin B2, dan B6 dengan metode HPLC .......
12
12 Hasi uji presisi dan akurasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari contoh
minuman berenergi ...............................................................................................
12
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur kafein ......................................................................................................
2
2
Struktur tiamin ......................................................................................................
2
3
Struktur riboflavin ................................................................................................
2
4
Struktur piridoksin ................................................................................................
3
5
Bagan peralatan Spektrofotometer UV/Vis ..........................................................
3
6
Komponen utama prediktor X1, X2, dan X3 (Miller & Miller 2000) .....................
4
7
Panjang gelombang maksimum kafein dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 8.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
7
Panjang gelombang maksimum vitamin B1 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 1.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
9
Panjang gelombang maksimum vitamin B2 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 2.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
10 Panjang gelombang maksimum vitamin B6 dalam pelarut air deionisasi dengan
konsentrasi 2.0 ppm pada daerah 200–400 nm.....................................................
8
11 Hubungan antara konsentrasi kafein dan absorbans .............................................
8
12 Hubungan antara konsentrasi vitamin B1 dan absorbans .....................................
9
13 Hubungan antara konsentrasi vitamin B2 dan absorbans .....................................
9
14 Hubungan antara konsentrasi vitamin B6 dan absorbans .....................................
9
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Diagram alir penelitian .........................................................................................
16
2
Kurva kalibrasi kafein dari konsentrasi 2.0–62.0 ppm .........................................
17
3
Kurva kalibrasi vitamin B1 dari konsentrasi 0.2–4.8 ppm ...................................
17
4
Kurva kalibrasi vitamin B2 dari konsentrasi 1.0–36.0 ppm .................................
18
5
Kurva kalibrasi vitamin B6 dari konsentrasi 1.0–52.0 ppm .................................
18
6
Hasil analisis komponen utama (PC) (pada delapan PC pertama) .......................
19
7
Hasil analisis regresi kafein dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..................
19
8
Hasil analisis regresi vitamin B1 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
20
9
Hasil analisis regresi vitamin B2 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
23
10 Hasil analisis regresi vitamin B6 dengan PC 1, PC2, PC3, PC4, dan PC5 ..........
25
11 Perhitungan parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP pada PCR ......................
27
12 Perhitungan parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP pada PLS .......................
30
13 Analisis simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
berenergi ...............................................................................................................
33
14 Perhitungan kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
berenergi dengan PCR dan PLS .........................................................................
34
15 Perhitungan uji presisi ..........................................................................................
35
16 Perhitungan uji akurasi .........................................................................................
35
1
PENDAHULUAN
Kafein, vitamin B1, B2, dan B6 adalah
senyawa organik yang banyak terdapat di
berbagai jenis sediaan obat, makanan, dan
minuman. Salah satu contohnya ialah
minuman berenergi yang banyak beredar di
pasaran. Kafein banyak digunakan sebagai
obat sakit kepala, dan sebagai stimulan
pembentukan
energi
dalam
minuman
berenergi (Nurachman 2004). Pemberian
kafein secara berlebihan dapat menyebabkan
gelisah, tremor, insomnia, gugup, hipertensi,
kejang, dan mual.
Vitamin B berperan penting dalam
metabolisme pembentukan energi yang
diperlukan sel-sel otak. Kekurangan atau
kelebihan vitamin dapat menyebabkan
masalah fisiologi yang serius. Pemberian
vitamin
B1
yang
berlebihan
dapat
mempengaruhi sistem saraf, kelebihan vitamin
B2 sejauh ini tidak menimbulkan efek yang
berbahaya, tetapi pemberian vitamin B6
secara berlebihan dapat menimbulkan
kerusakan saraf pada kaki dan tangan (ODS
2006). Oleh karena itu, kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 yang ditambahkan dalam
minuman berenergi perlu ditentukan agar
tidak menimbulkan efek yang merugikan dan
sebagai kendali mutu produk.
Analisis kadar kafein dan vitamin B secara
terpisah maupun simultan telah banyak
dikembangkan.
Salah
satunya
adalah
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
(Siong & Swan-Choo 1996) yang sangat luas
penggunaannya, tetapi selalu membutuhkan
preparasi contoh, waktu pengerjaan yang
lama, serta peralatan dan bahan relatif mahal.
Teknik spektrofotometri ultraviolet-visible
(UV-Vis) juga telah dioptimalisasi untuk
penentuan simultan kadar vitamin B1, B6, dan
B12 dalam sirup dan tablet dengan
spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV)
menggunakan teknik zero-crossing (Ozgur &
Koyuncu 2002). Teknik analisis terpisah
kafein juga telah banyak berkembang, seperti
penentuan kafein dalam kopi, teh dan kola
dengan spektrofotometri derivatif (Alpdogan
et al. 2000) dengan hasil yang cukup baik.
Safitri (2007) telah mengembangkan
metode cepat penentuan simultan kafein,
vitamin B2, dan B6 dalam minuman berenergi
dengan teknik zero – crossing. Tetapi hasil
yang diperoleh belum memuaskan karena
teknik ini hanya dapat digunakan untuk
pengukuran simultan kafein dan vitamin B6,
tapi tidak dapat digunakan untuk pengukuran
simultan kafein, vitamin B2, dan B6. Hal ini
disebabkan karena minuman berenergi
memiliki
matriks
yang
berbeda-beda,
sehingga
teknik
SDUV
yang
telah
dikembangkan oleh Safitri (2007) tidak bisa
langsung diterapkan. Selain itu, semakin
banyak derivatisasi spektrum yang dilakukan,
nisbah sinyal terhadap derau (noise) akan
menurun sehingga akan menurunkan pula
ketelitian dan ketepatannya.
Salah satu solusi yang bisa digunakan
untuk penentuan simultan beberapa senyawa
dalam contoh adalah dengan teknik kalibrasi
multivariat yang merupakan bagian dari
kemometrik. Kemometrik pada saat ini
merupakan alternatif yang sangat cocok untuk
prosedur pemisahan dan deteksi dalam
analisis senyawa kimia. Analisis kemometrik
dengan teknik regresi komponen utama
(principle component regression, PCR) dan
kuadrat terkecil parsial (partial least square,
PLS), merupakan teknik kalibrasi multivariat
yang bisa digunakan untuk penentuan
multikomponen. Teknik PCR dan PLS dapat
digunakan untuk menghubungkan spektrum
absorpsi dengan konsentrasi kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 dari minuman berenergi.
Keuntungan
teknik
ini
ialah
dapat
mengeliminasi spektrum pengganggu dalam
kuantifikasi
contoh,
meningkatkan
selektivitas, dan tidak memerlukan pemisahan
atau prakonsentrasi terlebih dahulu (Lopezde-Alba et al. 2006).
Oleh karena itu, diperlukan penelitian
lebih lanjut untuk penentuan simultan kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dari minuman
berenergi. Penelitian ini mempelajari dan
mengembangkan metode analitik dengan
kriteria mudah, murah, dan cepat serta
memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik.
Selain itu, penelitian bertujuan menentukan
kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6 secara
simultan dengan kombinasi spekrum UV dan
model
kalibrasi
multivariat,
juga
dibandingkan kebaikan model PCR dan PLS
dalam menduga kadar kafein, vitamin B1, B2,
dan B6, dan evaluasi kinerja analitik melalui
penentuan presisi dan akurasi.
TINJAUAN PUSTAKA
Kafein
Kafein
atau
1,3,7-trimetilxantin
merupakan senyawa golongan alkaloid purin
(Hesse 2002) dengan rumus molekul
C8H10N4O2 (Gambar 1). Senyawa ini
mempunyai sifat fisik berupa serbuk putih
atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya
2
menggumpal, tidak berbau, dan berasa pahit
seperti alkaloid pada umumnya. Kafein sukar
larut dalam eter, agak sukar larut dalam air
dan etanol, serta mudah larut dalam kloroform
(Depkes RI 1995).
Kafein dapat menimbulkan perangsangan
terhadap susunan saraf pusat (otak), sistem
pernapasan, serta sistem pembuluh darah dan
jantung. Bahkan senyawa xantin dalam dosis
rendah mampu merangsang susunan saraf
yang sedang depresi. Lebih jauh, kafein
ternyata dapat menetralisasi asam lemak
dalam darah. Pada dosis sedang, kafein dapat
meningkatkan produksi asam lambung yang
berlangsung lama, sehingga memperbesar
resiko penyakit lambung, tukak lambung, atau
tukak usus halus.
O
H3C
CH3
N
N
N
O
(kepiting, ikan, kerang, dan lain-lain), dan
telur.
H3C
N
+
N
N
CH3
NH2
Gambar 2 Struktur tiamin.
Riboflavin (vitamin B2)
Riboflavin terdiri atas sebuah cincin
isoaloksazin heterosiklik yang melekat pada
gula alkohol dan ribitol (Gambar 3). Vitamin
ini merupakan pigmen berpendar dan
berwarna yang relatif stabil terhadap
pemanasan, namun akan terurai dengan
adanya cahaya (Murray et al. 1996). Senyawa
ini memiliki warna kuning atau jinggakekuningan, sehingga sering digunakan
sebagai pewarna makanan.
O
N
CH3
Gambar 1 Struktur kafein.
H3C
N
H3C
N
NH
Tiamin (vitamin B1)
Tiamin atau vitamin B1 tersusun dari
pirimidin yang dihubungkan oleh jembatan
metilena dengan tiazol tersubstitusi (Gambar
2). Tiamin aktif berada dalam bentuk tiamin
difosfat (pirofosfat) (Murray et al. 1996).
Tiamin adalah senyawa tidak berwarna
dengan rumus kimia C12H17N4OS. Senyawa
ini larut dalam air, tetapi tidak larut dalam
alkohol dan dapat terdekomposisi jika
dipanaskan.
Tiamin terdapat hampir pada semua
tanaman dan tubuh hewan yang lazim
digunakan sebagai makanan, tetapi kandungan
vitamin ini biasanya kecil. Biji-bijian yang
tidak digiling sempurna dan daging
merupakan sumber tiamin yang baik. Selain
itu tiamin juga banyak terdapat pada roti,
ginjal, hati, sereal, susu, unggas, makanan laut
N
O
OH
Vitamin B
Vitamin B yang esensial bagi nutrisi
manusia adalah tiamin (B1), riboflavin (B2),
niasin (B3), asam pantotenat (B5), piridoksin
(B6), biotin, kobalamin (B12), dan asam folat.
Vitamin B larut dalam air, maka kelebihan
vitamin B ini akan dieksresikan ke dalam urin
dan dengan demikian, jarang tertimbun dalam
konsentrasi yang toksik (Murray et al. 1996).
OH
S
OH
HO
OH
Gambar 3 Struktur riboflavin.
Vitamin ini berada dalam bentuk aktifnya
berupa flavin mononukleotida (FMN) atau
flavin adenin dinukleotida (FAD). Seperti
halnya vitamin B yang lain, riboflavin juga
berperan dalam produksi energi, karena
senyawa ini berperan dalam metabolisme
lemak, karbohidrat, dan protein. Vitamin B2
juga diperlukan untuk pertumbuhan badan,
pembentukan dan respirasi sel darah merah,
dan pembentukan antibodi.
Defisiensi vitamin B2 akan menimbulkan
berbagai gejala, seperti stomatitis angularis,
keilosis, glositis, sebore, dan fotofobia.
Sumber alami riboflavin adalah susu, keju,
sayuran hijau, hati, ragi, almond, dan kacangkacangan.
Piridoksin (vitamin B6)
Vitamin B6 terdiri atas tiga derivat piridin
yang berhubungan erat, yaitu piridoksin,
piridoksal, dan piridoksamin, serta derivat
3
fosfat yang bersesuaian (Gambar 4).
Piridoksal fosfat merupakan bentuk utama
vitamin B6 yang aktif (Murray et al. 1996).
Defisiensi akibat kekurangan vitamin B6 saja
jarang terjadi, dan setiap defisiensi biasanya
merupakan bagian dari defisiensi umum
vitamin B kompleks. Hati, ikan makerel,
alpukat, pisang, daging, sayuran, dan telur
merupakan sumber vitamin B6 yang baik.
OH
OH
OH
N
CH3
Gambar 4 Struktur piridoksin.
Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer sesuai dengan namanya
terdiri atas spektrometer dan fotometer
(Gambar 5). Spektrometer menghasilkan sinar
dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang yang ditransmisikan
atau yang diabsorpsi. Jadi, spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energi secara
relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang (Khopkar 1990).
Monokromator
Detektor
Hukum Lambert menyatakan bahwa
penyerapan sinar tidak bergantung pada
intensitas sumber cahaya. Hukum Beer
menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar
sebanding dengan banyaknya molekul yang
menyerap (Sudjadi 1985). Sumber radiasi
yang dipancarkan harus memiliki panjang
gelombang yang sama untuk penyerapan agar
memenuhi hukum Beer.
Cara-cara analisis kuantitatif dengan
pengukuran absorbans menggunakan teknik
spektrofotometri UV-Vis telah banyak
dikembangkan, seperti memakai kurva
kalibrasi dari sederet larutan standar, adisi
standar, adisi standar titik H, dan teknik
derivatif. Kurva kalibrasi menggunakan
larutan-larutan standar yang sebaiknya
mempunyai
komposisi
sama
dengan
komposisi cuplikan yang sebenarnya, dan
konsentrasi cuplikan berada di antara
konsentrasi-konsentrasi
larutan
standar
(Supriatna 1994).
Metode adisi standar dilakukan dengan
menambahkan larutan standar ke dalam
larutan cuplikan maupun campuran cuplikan
dan standar (Skoog et al. 1998). Metode adisi
standar titik H hampir sama dengan adisi
standar, yakni juga dilakukan penambahan
standar. Hanya saja pengukuran dilakukan
pada dua panjang gelombang terpilih, dan
konsentrasi contoh bisa langsung diperoleh di
titik H tersebut. Sementara itu, dengan teknik
derivatif spektrofotometri, spektrum didapatkan dari plot derivatif pertama atau orde
tertinggi absorbans atau transmitans sebagai
fungsi panjang gelombang (Skoog et al.
1998).
Lensa
Sumber
Sinar
Contoh
Amplifier
Keluaran
Gambar 5 Bagan peralatan spektrofotometer
UV/Vis.
Dasar teknik spektroskopi adalah interaksi
antara radiasi elektromagnetik dan bahan yang
dianalisis. Analisis dengan spektrofotometri
UV didasarkan pada penyerapan energi sinar
dengan panjang gelombang tertentu oleh
molekul dalam suatu senyawa. Semua
molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah
UV-Vis karena mengandung elektron yang
dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang
lebih tinggi. Besar energi radiasi bergantung
pada frekuensi atau panjang gelombang
radiasi yang dimiliki.
Rancangan Fraksional
Faktorial
Rancangan faktorial merupakan salah satu
cara yang digunakan dalam melakukan suatu
percobaan untuk melihat efek dari dua faktor
atau lebih terhadap hasil yang diperoleh.
Dengan menggunakan rancangan faktorial,
didefinisikan bahwa setiap percobaan yang
dilakukan adalah kombinasi percobaan yang
mungkin untuk setiap level dalam faktor yang
dicoba (Montgomery 2001).
Untuk percobaan yang memiliki jumlah
faktor sedikit, semua kombinasi faktorial
desain untuk setiap level dari setiap faktor
dapat dilakukan. Namun, untuk percobaan
dengan jumlah faktor relatif lebih banyak,
jumlah pengamatan yang dilakukan akan
sangat besar pula. Jumlah pengamatan yang
4
sangat besar tersebut dapat dikurangi dengan
menggunakan rancangan fraksional faktorial.
Sebagai contoh, dalam penelitian ini
terdapat empat faktor yang terdiri dari delapan
tingkat konsentrasi untuk masing-masing
senyawa. Kemudian faktor dan tingkat
konsentrasi digunakan sebagai masukan
dalam program statistical analysis software
(SAS) 9.1, sehingga terdapat 84 fraksi, yaitu
4096 komposisi. Selanjutnya diperoleh luaran
berupa desain percobaan yang telah
terfraksionalisasi menjadi 84-2. Luaran ini
berupa komposisi 64 campuran set yang
terdiri atas 48 komposisi kalibrasi set dan 16
komposisi validasi set.
Kalibrasi Multivariat
Kemometrik adalah seni mengekstraksi
informasi kimia dari data yang dihasilkan oleh
suatu percobaan kimia (Wold 1995).
Kemometrik menyediakan teknik untuk
mengurangi data berukuran besar yang
diperoleh
dari
instrumen
seperti
spektrofotometer
(Varmuza
2002).
Selanjutnya model ini dapat digunakan untuk
menduga contoh yang tidak diketahui.
Kalibrasi multivariat merupakan salah satu
bentuk teknik analisis kemometrik yang dapat
digunakan untuk menentukan campuran dari
beberapa
senyawa.
Teknik
kalibrasi
multivariat ini antara lain berupa PCR dan
PLS, yang sering digunakan dalam analisis
spektrum kuantitatif untuk mendapatkan
informasi yang selektif dari data yang tidak
selektif (Diaz et al. 1997).
PCR dan PLS memiliki beberapa
perbedaan. Pada teknik PCR, hanya informasi
dalam matriks X yang digunakan untuk
dekomposisi spektrum, sedangkan pada PLS
data konsentrasi matriks juga digunakan; jadi
bergantung pada X dan Y (Diaz et al. 1997).
Pada PCR, dekomposisi spektrum didasarkan
pada semua variasi spektrum tanpa
memperhatikan konsentrasi contoh.
Teknik-teknik kalibrasi multivariat dengan
berbagai
kombinasi
telah
banyak
dikembangkan untuk analisis simultan
berbagai senyawa dalam campuran, beberapa
di antaranya ialah penentuan simultan empat
campuran obat farmasi (Cevdet et al. 1998),
penentuan piridoksal, piridoksamin, dan asam
piridoksat menggunakan fluorimetri dengan
variabel spektrum non-linier dan PLS (Berzas
et al. 1998), simultan parasetamol, kafein, dan
asam asetilsalisilat dengan spektrofotometri
UV dan kombinasi PLS (Medina et al 1999),
penentuan Fe, Co, dan Cu dalam medium
misel (Abdollahi et al. 2003), dan penentuan
empat senyawa pestisida (Diaz et al. 1997).
Regresi Komponen Utama (PCR)
Ide dari PCR adalah membentuk model
antara konsentrasi senyawa dan komponen
utama (principle component, PC) pada data
matriks (spektrum) (Cevdet et al. 1998). PCR
menggunakan regresi untuk mengubah skor
dalam konsentrasi (Brereton 2000). Untuk
mendapatkan skor yang akan diregresikan
dengan konsentrasi dibutuhkan analisis
komponen utama (principle component
analysis, PCA). PCA merupakan suatu teknik
untuk mengurangi jumlah peubah dalam suatu
matriks data. Prinsip PCA adalah mencari
komponen utama yang merupakan kombinasi
linear dari peubah asli (Varmuza 2000).
Komponen-komponen utama (PC) tersebut
dipilih sedemikian rupa sehingga komponen
utama pertama memiliki variasi terbesar
dalam set data, sedangkan komponen utama
kedua tegak lurus terhadap komponen utama
pertama dan memiliki variasi terbesar
berikutnya (Miller & Miller 2000). Jika
jumlah ragam dari komponen utama satu (PC
1) dan dua (PC 2) lebih besar dari 70%, maka
plot skor memperlihatkan visualisasi dua
dimensi yang baik (Varmuza 2000). Gambar 6
menggambarkan komponen utama dari
peubah X1, X2, dan X3.
Nilai PC yang didapatkan dari PCA
kemudian diregresikan secara linear berganda
dengan PC sebagai penduga dan konsentrasi
sebagai respon. Regresi yang didapat ini
menghasilkan matriks koefisien yang apabila
dikalikan
dengan
matriks
absorbans
menghasilkan matriks konsentrasi.
Gambar 6 Komponen utama prediktor X1,
X2, dan X3 (Miller & Miller
2000).
5
Kuadrat Terkecil Parsial (PLS)
PLS merupakan salah satu teknik kalibrasi
multivariat yang sangat luas digunakan dalam
analisis kuantitatif data spektroskopi dan
elektrokimia (Abdollahi et al. 2003). PLS
digunakan untuk menduga serangkaian
peubah dependen dari peubah independen
(penduga) yang jumlahnya sangat banyak,
memiliki struktur sistematik linear atau
nonlinear, dengan atau tanpa data yang hilang,
dan memiliki kolinearitas yang tinggi.
Teknik ini membentuk model dari peubahpeubah yang ada untuk membentuk
serangkaian respon dengan menggunakan
regresi kuadrat terkecil dalam bentuk matriks
(Lindblom 2004). Inti dari PLS adalah untuk
menghitung nilai (skor) dari matriks X dan Y
dan untuk membuat model regresi antara
nilai-nilai tersebut. Kelebihan dari PLS
dibandingkan dengan regresi berganda adalah
dalam mengatasi masalah kolinearitas data,
peubah penjelas (X) yang banyak, dan juga
dapat secara simultan memodelkan beberapa
peubah respon (Y) (Wold 1995).
PLS menggambarkan hubungan eksternal
dan hubungan internal antara X dan Y.
Hubungan eksternal ditulis dengan persamaan
berikut:
a
X= TP'+E= ∑thp'h +E
(1)
h=1
a
Y= UQ'+F =
∑u q' +F
h
h
(2)
h=1
dengan
X = peubah penjelas
Y = peubah respon
T dan U = vektor skor faktor komponen
utama peubah X dan Y
P dan Q = vektor
pembobot
dari
peubah X dan Y
E = matriks sisaan peubah penjelas (X)
F = matriks sisaan peubah respon (Y)
Y = XB + F
(5)
dengan
Y = peubah respon
X = peubah penjelas
F = matriks sisaan peubah respon (Y)
B = koefisien regresi PLS
Kriteria Kebaikan Model
Kebaikan suatu model dapat dilihat dari
beberapa parameter. Selisih antara nilai aktual
dan dugaan dari peubah penjelas (Y) dihitung,
dan jumlah kuadrat dari selisih tersebut
dikumpulkan untuk mendapatkan nilai
prediction residual error sum of square
(PRESS).
n
PRESS =
∑( y
uh = bhth
(3)
bh =u'hth t'hth
(4)
internal
dengan
t h dan u h = vektor skor faktor omponen
utama ke-h peubah X dan Y
b h = koefisien internal
Pendugaan parameter dalam regresi PLS
didapatkan melalui model persamaan:
− yˆ
)
i
2
(6)
i =1
dengan:
ŷi = respon dugaan
yi = respon aktual
Selain dari nilai PRESS, kebaikan model
juga dilihat dari nilai R2, root mean square
error of calibration (RMSEC), dan root mean
square error of prediction (RMSEP). R2
mengindikasikan mutu data antara konsentrasi
nyata dan konsentrasi yang diperkirakan. R2
menunjukkan kemampuan suatu metode untuk
menghasilkan angka analisis yang proporsional terhadap konsentrasi contoh pada interval
konsentrasi tertentu.
RMSEC digunakan untuk menghitung
galat dugaan. Dalam model yang memiliki
peubah x atau faktor PCR dan PLS yang
banyak menyebabkan perbedaan antara
RMSEC dan galat dugaan akan menjadi besar
(Naes et al. 2002).
RMSEP digunakan untuk data yang dibagi
menjadi dua bagian, satu untuk model
kalibrasi dan yang lainnya untuk validasi
(Naes et al. 2002).
N
Sedangkan untuk hubungan
ditulis dengan persamaan berikut:
i
RMSEP =
∑ ( yˆ
p
i
−y
i
)
2
N
p
(7)
i =1
dengan:
ŷi = respon dugaan
yi = respon aktual
Np = jumlah data
Selang kepercayaan merupakan selang
yang mengandung kemungkinan tertentu
parameter yang tidak diketahui yang akan
diukur. Selang kepercayaan digunakan tidak
hanya untuk menentukan nilai contoh yang
tidak
diketahui,
tetapi
juga
untuk
6
menunjukkan nilai ketidaktentuan dalam
prosedur perhitungan (Naes et al. 2002).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
standar kafein diperoleh dari Lab. Kimia
Analitik FMIPA IPB, standar vitamin B1, B2,
dan B6 diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka
LPPM IPB, air deionisasi, dan contoh
minuman berenergi Extra Joss® dari PT
Bintang Toedjoe yang akan dianalisis.
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1701 PC
dengan perangkat lunak UV Probe versi 2.0,
kuvet kuarsa 1 cm, seperangkat komputer, dan
alat-alat kaca. Analisis data menggunakan
perangkat lunak SAS 9.1 dan Minitab 14.
Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dalam beberapa
tahap, yaitu penentuan λmaks, penentuan daerah
linear dinamis, pembentukan model kalibrasi
dan validasi, penentuan kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6 dalam contoh sintetik dan
contoh minuman berenergi, dan evaluasi
kinerja metode yang dikembangkan dngan
menentukan presisi dan akurasinya (Lampiran
1).
Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum
Panjang gelombang maksimum (λmaks) tiap
senyawa ditentukan dengan membuat larutan
stok 40 ppm untuk masing-masing senyawa.
Sebanyak 20 mg kafein, vitamin B1, B2, dan
B6 dilarutkan dengan air deionisasi dan
ditepatkan dalam labu takar 500 mL.
Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok
kafein, 1 mL larutan stok vitamin B1, dan 5
mL larutan stok vitamin B2 dan B6,
diencerkan ke dalam labu takar 50 mL dengan
pelarut yang sama. Spektrum absorpsi diukur
pada panjang gelombang 200–400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. λmaks diperoleh dari absorbans
maksimum masing-masing senyawa.
Kalibrasi Satu Komponen
Kalibrasi satu komponen dilakukan dengan
membuat variasi konsentrasi tiap senyawa:
yaitu 0.10–78.00 ppm untuk kafein, 0.05–6.00
ppm untuk vitamin B1, 0.05–60 ppm untuk
vitamin B2, dan 0.05–72.00 ppm untuk
vitamin B6. Spektrum absorpsi masingmasing senyawa diukur pada panjang
gelombang maksimumnya. Daerah linear
dinamis untuk tiap senyawa kemudian
ditentukan dengan kurva kalibrasi antara
absorbans
pada
panjang
gelombang
maksimum dan konsentrasi contoh dengan
melihat nilai koefisien korelasi atau koefisien
determinansinya.
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Sintetik
Penentuan kadar kafein, vitamin B1, B2,
dan B6 dalam contoh sintetik menggunakan
kalibrasi multivariat dilakukan dengan
membuat dua set larutan standar. Set kalibrasi
mengandung 48 larutan standar (Tabel 1) dan
set validasi mengandung 16 larutan standar
(Tabel 2).
Konsentrasi tiap senyawa yang berada
dalam daerah linear dinamis divariasikan:
2.0–16.0 ppm untuk kafein, 0.2–1.6 ppm
untuk vitamin B1, dan 1.0–8.0 ppm untuk
vitamin B2 dan B6. Kedua set larutan standar
diukur serapannya secara simultan pada
panjang gelombang 200–400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. Data absorbans dari set validasi dan
set kalibrasi dikumpulkan dalam 2 matriks
yang berbeda. Kemudian konsentrasi dalam
set validasi dihitung dengan model kalibrasi
multivariat yang diperoleh.
Tabel 1 Prediksi komposisi set kalibrasi
Konsentrasi (ppm)
No.
Contoh
B1
B2
B6
Kafein
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.40
0.60
0.60
0.60
0.60
0.60
2.00
3.00
4.00
6.00
5.00
7.00
1.00
2.00
3.00
5.00
6.00
7.00
1.00
4.00
5.00
7.00
8.00
8.00
4.00
5.00
2.00
7.00
6.00
8.00
1.00
5.00
2.00
7.00
3.00
4.00
8.00
6.00
7.00
2.00
16.00
8.00
10.00
4.00
14.00
12.00
14.00
4.00
12.00
2.00
16.00
8.00
4.00
12.00
16.00
10.00
8.00
7
Lanjutan Tabel 1 Prediksi
komposisi
set
kalibrasi
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0.60
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
0.80
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.20
1.20
1.20
1.20
1.20
1.20
1.40
1.40
1.40
1.40
1.40
1.40
1.60
1.60
1.60
1.60
1.60
1.60
5.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1.00
2.00
3.00
5.00
6.00
7.00
2.00
3.00
4.00
6.00
7.00
8.00
2.00
3.00
4.00
5.00
7.00
8.00
1.00
2.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1.00
4.00
8.00
1.00
3.00
6.00
2.00
7.00
2.00
6.00
1.00
8.00
4.00
7.00
3.00
6.00
1.00
5.00
4.00
3.00
7.00
2.00
4.00
1.00
8.00
3.00
6.00
7.00
5.00
4.00
8.00
10.00
2.00
10.00
8.00
4.00
14.00
6.00
6.00
12.00
4.00
10.00
8.00
16.00
8.00
16.00
2.00
12.00
4.00
14.00
10.00
2.00
16.00
12.00
14.00
4.00
12.00
6.00
4.00
8.00
10.00
2.00
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Minuman Berenergi
Contoh minuman berenergi yang akan
diukur secara simultan kadar kafein, vitamin
B1, B2, dan B6-nya, ditimbang sebanyak 4.0
g. Kemudian contoh dilarutkan dengan air
deionisasi dan ditepatkan dalam labu takar 50
mL. Selanjutnya sebanyak 0.625 mL larutan
contoh diencerkan ke dalam labu takar 50 mL.
Spektrum contoh diukur dari panjang
gelombang 200 sampai 400 nm dengan
interval 0.2 nm dan kecepatan pemayaran
medium. Data absorbans yang diperoleh
kemudian dimasukkan ke dalam persamaan
regresi multivariat yang telah didapat dari set
kalibrasi untuk mendapatkan konsentrasi
contoh dan evaluasi model yang diajukan dari
set validasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum
Panjang gelombang maksimum yang
diperoleh dari hasil pengukuran larutan
standar kafein, vitamin B1, B2, dan B6
dengan pelarut air deionisasi menggunakan
spektrofotometer UV-Vis secara berurutan
adalah 272.9, 234.2, 267.0, dan 222.2 nm.
Spektrum
absorpsi
yang
diperoleh
ditunjukkan berturut-turut pada Gambar 7–10.
Tabel 2 Prediksi komposisi set validasi
Konsentrasi (ppm)
No.
Contoh
B1
B2
B6
Kafein
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0.20
0.20
0.40
0.40
0.60
0.60
0.80
0.80
1.00
1.00
1.20
1.20
1.40
1.40
1.60
1.60
1.00
8.00
4.00
8.00
2.00
6.00
1.00
8.00
4.00
8.00
1.00
5.00
1.00
6.00
2.00
8.00
1.00
3.00
4.00
6.00
5.00
3.00
5.00
7.00
3.00
5.00
2.00
8.00
6.00
5.00
3.00
1.00
2.00
6.00
6.00
10.00
14.00
2.00
16.00
12.00
14.00
2.00
10.00
6.00
8.00
6.00
14.00
16.00
272,9 nm
Gambar 7 Panjang gelombang maksimum
kafein
dalam
pelarut
air
deionisasi dengan konsentrasi 8.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
8
222,2 nm
234,2 nm
Gambar 8 Panjang gelombang maksimum
vitamin B1 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 1.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Gambar 10 Panjang gelombang maksimum
vitamin B6 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 2.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Kalibrasi Satu Komponen
267 nm
Kalibrasi satu komponen dilakukan untuk
memperoleh daerah konsentrasi linear yang
dinamis untuk tiap senyawa di panjang
gelombang maksimumnya. Gambar 11–14
berturut-turut
merupakan
kurva
yang
menunjukkan daerah linear dinamis (DLD)
dalam hubungan antara konsentrasi kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dan absorbans.
Gambar 9 Panjang gelombang maksimum
vitamin B2 dalam pelarut air
deionisasi dengan konsentrasi 2.0
ppm pada daerah 200–400 nm.
Gambar 11 Hubungan antara konsentrasi
kafein dan absorbans.
9
absorbans. Ketidaklinearan ini disebabkan
adanya penyimpangan hukum Lambert-Beer
yang disebabkan oleh konsentrasi contoh yang
terlalu pekat atau terlalu encer. Konsentrasi
yang dipilih adalah yang berada dalam DLD
dan memberikan kelinearan yang tinggi
(Hwang & Nettleton 2002). Kurva kalibrasi
masing-masing senyawa terlampir pada
Lampiran
2–5.
Konsentrasi
yang
menunjukkan DLD dan daerah tidak linear
ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel 3 Koefisien determinasi dan DLD
untuk kafein, vitamin B1, B2, dan B6
Gambar 12 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B1 dan absorbans.
Gambar 13 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B2 dan absorbans.
Analat
R2
DLD
(ppm)
Kafein
0.9984
2.0–62.0
Vit. B1
0.9994
0.2–4.8
Vit. B2
0.9992
1.0–36.0
Vit. B6
0.9972
1.0–52.0
Daerah tidak
linear (ppm)
0.10–1.60 dan di
atas 62.00
0.05–0.15 dan di
atas 48.00
0.05–0.70 dan di
atas 36.00
0.05–0.70 dan di
atas 52.00
Nilai konsentrasi yang termasuk ke dalam
DLD
digunakan
untuk
menentukan
konsentrasi dalam set kalibrasi dan set
validasi contoh sintetik kafein, vitamin B1,
B2, dan B6. Pembentukan set kalibrasi dan set
validasi terdiri dari delapan tingkat
konsentrasi. Delapan tingkat konsentrasi
tersebut adalah 2.0–16.0 ppm untuk kafein
dengan interval 2 ppm, 0.2–1.6 ppm untuk
vitamin B1 dengan interval 0.2 ppm, serta
1.0–6.0 ppm untuk vitamin B2 dan B6 dengan
interval 1 ppm.
Pembentukan Model
dengan PCR dan PLS
Gambar 14 Hubungan antara konsentrasi
vitamin B6 dan absorbans.
Gambar 11 sampai dengan Gambar 14
juga menunjukkan daerah-daerah saat
konsentrasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6
tidak lagi memiliki hubungan linear dengan
Model PCR dan PLS dibentuk dari 48
komposisi set kalibrasi (Tabel 1) dan 16
komposisi set validasi (Tabel 2). Seluruh
campuran diukur absorbansnya pada panjang
gelombang 200–400 nm dengan interval 0.2
nm menggunakan air deionisasi sebagai
blangko. Nilai absorbans spektrum dari 48
komposisi set kalibrasi digunakan untuk
membuat model PCR dan PLS, dan 16
campuran set validasi digunakan untuk
validasi model yang didapat dari set kalibrasi.
Penentuan konsentrasi kafein, vitamin B1, B2,
dan B6 dari tiap campuran dilakukan dengan
membentuk dua model kalibrasi, yaitu PCR
dan PLS.
10
Pemodelan dengan PCR
Model PCR diawali dengan PCA yang
menghasilkan nilai loading PC sebanyak
jumlah peubah yang dipakai, yaitu 1001
panjang gelombang yang digunakan. Hasil PC
yang diperoleh tidak semuanya digunakan,
karena tiap PC memberikan proporsi yang
berbeda dari seluruh data. Hasil analisis PC
ditunjukkan pada Lampiran 6. Nilai PC yang
diambil lima, yang cukup mewakili
keseluruhan data yang ada. Proporsi dan
kumulatif dari kelima PC terdapat pada Tabel
4.
Tabel 4
PC
PC1
PC2
PC3
PC4
PC5
Hasil analisis
utama PCR
Nilai
Eigen
2.3181
0.1744
0.0951
0.0038
0.0006
lima
komponen yang akan digunakan dalam model
regresi PLS. Berdasarkan nilai rataan akar
PRESS didapatkan nilai minimum sebesar
0.3324 untuk set kalibrasi dan banyaknya
komponen yang akan digunakan dalam
model, yaitu 5 komponen.
Pemodelan regresi PLS pada tahap
selanjutnya
dengan
menggunakan
5
komponen mampu menjelaskan persentase
keragaman peubah penjelas (X) sebesar
99.90% dan 92.22% untuk peubah respon (Y).
Hasil analisis PC secara keseluruhan untuk
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dengan PLS
terdapat pada Tabel 6.
komponen
Tabel 5 Hasil analisis regresi PLS
Proporsi
Kumulatif
Peubah
Kafein
0.8940
0.0670
0.0370
0.0010
0.0000
0.8940
0.9610
0.9980
0.9990
1.0000
Ragam X
Ragam Y
n PC
99.91
99.83
5
Langkah berikutnya, PC 1, 2, 3, 4, dan 5
diregresikan secara linear berganda dengan
konsentrasi kafein, vitamin B1, B2, dan B6
sebagai respon, dan skor PC sebagai penduga,
sehingga diperoleh persamaan regresi
komponen utama. Persamaan regresi untuk
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 adalah sebagai
berikut:
[kafein] = 0.575 – 2.760 PC1 + 3.830 PC2 –
1.700 PC3 + 4.670 PC4 + 5.440 PC5.
[Vit. B1] = 0.816 + 0.014 PC1– 0.120 PC2 +
0.064 PC3 – 5.710 PC4 – 8.040 PC5.
[Vit. B2] = – 0.116 – 0.466 PC1– 4.250 PC2 –
2.860 PC3 + 2.620 PC4 + 3.330 PC5.
[Vit. B6] = 0.240 – 0.305 PC1– 1.480 PC2 +
7.210 PC3 + 4.270 PC4 – 0.790 PC5.
Sementara hasil analisis lengkap regresi
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dengan kelima
PC dapat dilihat pada Lampiran 7 – 10.
Pemodelan
terhadap
PC
tersebut
dikembalikan lagi ke dalam bentuk absorbans
dengan mengalikan koefisien hasil regresi
dengan nilai loading pada masing-masing PC
sehingga diperoleh persamaan regresi dalam
bentuk absorbans. Persamaan regresi tersebut
selanjutnya digunakan untuk menduga kadar
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari data set
validasi.
Pemodelan dengan PLS
Model PLS juga diawali dengan
pembentukan PC. Kemudian dilakukan
validasi silang untuk menentukan banyaknya
Vit.
B1
99.90
72.19
5
Vit.
B2
99.91
99.78
5
Vit.
B6
99.87
99.59
5
Pengolahan dengan PLS juga memberikan
konsentrasi dugaan untuk masing-masing
senyawa. Konsentrasi dugaan yang didapatkan
dari hasil pemodelan 48 set kalibrasi,
selanjutnya digunakan untuk menduga kadar
kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dari 16
campuran set validasi.
Perbandingan Model Antara PCR dan PLS
Ukuran kebaikan model dilihat dari nilai
PRESS dan R2. Sedangkan kebaikan validasi
model dilihat dari nilai korelasi (r), RMSEP,
dan RMSEC dari model tersebut. Hasil R2 dan
PRESS kafein, vitamin B1, B2, dan B6
ditunjukkan pada Tabel 6, sedangkan
parameter kebaikan RMSEC dan RMSEP
ditunjukkan pada Tabel 7. Perhitungan kedua
parameter kebaikan ini terlampir pada
Lampiran 11 untuk PCR dan Lampiran 12
untuk PLS.
Tabel 6 Nilai PRESS dan R2 kafein, vitamin
B1, B2, dan B6
Standar
Kafein
Vit. B1
Vit. B2
Vit. B6
Model
PCR
PLS
PCR
PLS
PCR
PLS
PCR
PLS
PRESS
1.5935
0.0506
2.8794
0.6219
0.6198
0.0602
4.7564
0.2174
R2
0.9984
0.9983
0.7143
0.7219
0.9970
0.9978
0.9822
0.9137
11
Berdasarkan Tabel 6, nilai PRESS PCR
lebih besar dibandingkan dengan PLS,
sedangkan nilai R2 kedua model menunjukkan
hasil yang cukup baik untuk semua senyawa,
kecuali pada vitamin B1. Hal ini disebabkan
karena konsentrasi yang digunakan untuk
vitamin B1 terlalu rendah (encer) yang dapat
memengaruhi serapan saat pengukuran.
Besarnya nilai PRESS pada PCR disebabkan
karena jumlah galat sisaan dari dugaan pada
PCR lebih besar dibandingkan PLS.
Nilai korelasi menggambarkan hubungan
yang proporsional antara dua peubah.
Semakin mendekati 1 berarti hubungan antara
dua peubah (konsentrasi sebenarnya dengan
konsentrasi
dugaan)
semakin
linear.
Berdasarkan Tabel 8 terlihat bahwa nilai
korelasi ke dua model menunjukkan hubungan
yang positif (mendekati 1). Nilai korelasi PCR
lebih besar dibandingkan dengan PLS
walaupun perbedaan ke dua nilai tersebut
tidak signifikan.
Tabel 7 Perbandingan parameter kebaikan
validasi model kafein, vitamin B1,
B2, dan B6.
Standar Model
RMSEC
RMSEP
PCR
0.1572
0.0991
Kafein
PLS
0.2943
0.1356
PCR
0.2184
0.1168
Vit. B1
PLS
0.2292
0.1197
PCR
0.0979
0.0782
Vit. B2
PLS
0.1354
0.0919
PCR
0.2735
0.1308
Vit. B6
PLS
0.3355
0.1448
Penentuan Kadar Kafein, Vitamin B1, B2,
dan B6 dalam Contoh Minuman Berenergi
Berdasarkan kriteria kebaikan model di
atas, pemilihan model terbaik difokuskan
kepada nilai RMSEC dan RMSEP karena
keduanya digunakan untuk validasi model.
Model yang lebih baik ditunjukkan oleh PCR,
karena nilai RMSEC dan RMSEP yang
diperoleh pada tiap senyawa lebih kecil
dibandingkan dengan PLS.
Nilai RMSEC dan RMSEP yang
dihasilkan sangat baik, karena mendekati nol.
Evaluasi RMSEP pada kedua model
memberikan nilai yang lebih kecil daripada
RMSEC sehingga model yang diperoleh
sangat baik. Naes et al. (2002) menyatakan
bahwa model dugaan yang baik memiliki nilai
RMSEP yang rendah dan dapat mengimbangi
nilai RMSEC, dan nilai korelasi antara Y
dugaan dengan Y sebenarnya yang tinggi,
mendekati 1 (Tabel 8).
Tabel 8 Korelasi nilai Y sebenarnya dengan Y
dugaan untuk kafein, vitamin B1, B2,
dan B6
Nilai
korelasi
Kaf vs Kaf^
PCR
PLS
0.9990
0.9980
B1 vs B1^
0.8790
0.8660
B2 vs B2^
0.9990
0.9980
B6 vs B6^
0.9930
0.9900
^ : dugaan
Kadar kafein, vitamin B1, B2, dan B6
dalam contoh minuman ditunjukkan pada
Tabel 9. Spektrum contoh minuman dan
contoh perhitungan terlampir pada Lampiran
13 dan 14 . Kadar yang diperoleh PCR tidak
jauh berbeda dengan nilai yang tertera pada
label minuman (Tabel 10) dan hasil analisis
PT Bintang Toedjoe (Tabel 11).
PCR mampu menduga tiga konsentrasi
(kafein, vitamin B2, dan B6) dengan baik
dibandingkan PLS yang hanya mampu
menduga dua konsentrasi saja (Vitamin B1
dan B2). Hal ini dikarenakan kemampuan dari
metode PCR dalam mereduksi pengganggu
seperti vitamin-vitamin, ion-ion, dan gula
yang ada dalam contoh minuman. Selain itu,
menurut Chin (2002) untuk penggunaan PLS
ukuran contoh tidaklah harus berukuran besar,
sedangkan dalam penelitian ini ukuran contoh
yang digunakan cukup besar (48 pengamatan
dan 1001 peubah untuk masing-masing
pengamatan),
sehingga
menyebabkan
pendugaan PLS menjadi kurang baik.
Berdasarkan kepada batas atas dan batas
bawah nya, selang antara ke dua batas yang
diberikan
oleh
PCR
lebih
sempit
dibandingkan PLS. Hal ini disebabkan karena
ragam dari PLS lebih besar dibandingkan
dengan PCR, sehingga pendugaan dengan
PCR akan lebih baik dibandingkan dengan
PLS. Berdasarkan Tabel 9 kadar kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 masih termasuk ke
dalam selang kepercayaan karena bobot yang
diperoleh untuk kedua model berada di antara
batas bawah dan batas atasnya.
12
Tabel 9 Hasil penentuan simultan kafein, vitamin B1, B2, dan B6 dalam contoh minuman
dengan selang kepercayaan 95%
Contoh
PCR
PLS
Batas bawah
Bobot (mg)
Batas atas
Batas bawah
Kafein
49.9056
50.0452
50.1848
47.7450
48.2799
48.8148
Vit. B1
1.3238
1.5120
1.7002
1.0080
1.5105
2.0130
Vit. B2
5.1656
5.2502
5.3348
4.8299
5.2705
5.7110
Vit. B6
4.7681
5.0045
5.2409
6.3200
6.8727
7.4254
Tabel 10 Kandungan Extra Joss® Active B7
Setiap sachet (4 g) mengandung:
Komponen
Tabel 12 Hasi uji presisi dan akurasi kafein,
vitamin B1, B2, dan B6 dari contoh
minuman berenergi
Jumlah (mg)
Taurin
1000
Ginseng
20
Vitamin B1
1.2
Vitamin B2
5.2
Vitamin B3
20
Vitamin B5
5
Vitamin B6
5
Vitamin B12
1
Inositol
50
Kafein
50
Royal Jelly
#
Aspartam
#
Acesulfame-K
#
Na-bikarbonat
#
Asam sitrat
#
Pemberi rasa
#
# Tidak dipublikasikan perusahaan
Standar
Tabel 11 Hasil pengukuran kadar kafein,
vitamin B2 dan B6 dengan metode
HPLC
Contoh
Bobot (mg) Batas bawah
Kadar (mg/4 gram)
Kafein
50.1884
Vitamin B2
5.0240