Penghitungan Persentase Pewarnaan Imunohistokimia Cu, Zn SOD

c. Penghitungan Persentase

Profil kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada ginjal tikus perlakuan juga ditunjukkan dengan penghitungan persentase jumlah rata-rata inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD Gambar 3. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Persentase Jumlah Inti Sel Tubuli Renalis K ZE I IZ IE IZE Kelompok + - Gambar 3. Persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikanreaksi positif + dan reaksi negatif - terhadap kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Dari hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikan reaksi positif dan reaksi negatif terhadap kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD, diketahui bahwa kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok K paling rendah dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif yaitu 55. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling rendah juga terlihat pada paling tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 45 pada kelompok K dibandingkan dengan kelompok lain. Pada kelompok ZE, berdasarkan hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD sedikit lebih rendah dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini ditunjukkan dengan lebih tingginya persentase jumlah sel tubuli yang bereaksi negatif 26 pada kelompok ZE dibandingkan dengan kelompok I yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 25 . Kelompok I memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih rendah dibandingkan dengan kelompok IZ dan kelompok IE. Hal ini terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif 75 pada kelompok I dibandingkan dengan kelompok IZ dan IE yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif 78 dan 79. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih rendah juga terlihat pada lebih tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 25 pada kelompok I dibandingkan dengan kelompok IZ dan IE yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 22 dan 21. Pada kelompok IZE, berdasarkan hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang paling tinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini ditunjukkan dengan lebih tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif yaitu 83. Kandungan antioksidan Cu,Zn- SOD yang paling tinggi juga terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 17 pada kelompok IZE dibandingkan dengan kelompok lain. Gambaran Morfologi Ginjal Gambaran morfologi ginjal tikus pada semua kelompok perlakuan dapat terlihat dengan menggunakan pewarnaan Hematoksilin dan Eosin HE. Secara umum, pada semua kelompok inti sel-sel tubuli renalis berbentuk bulat dan mengambil warna biru. Seperti halnya pada bagian inti, sitoplasma dari sel-sel epitel tubuli renalis mengambil warna merah. Hasil pengamatan terhadap morfologi umum jaringan ginjal, pada kelompok K menunjukkan adanya infiltrasi sel radang dan degenerasi sel berkisar 10-20. Sedangkan pada kelompok ZE, I, IZ, IE dan IZE tidak menunjukkan gambaran histopatologis Gambar 4. Gambar 4. Fotomikrograf jaringan tikus perlakuan. Pewarnaan HE. G : Glomerulus, Tp Tubuli proksimalis, Td : tubuli distalis, a : degenerasi sel, b : nekrosa sel, c : infiltrasi sel radang. Skala 50 µm . G G G G G G K ZE IZ Tp Td Td Td Td Td Td Tp Tp Tp Tp Tp b a I IE c IZE PEMBAHASAN Profil Antioksidan Cu,Zn-SOD Metabolisme merupakan aktivitas yang sangat penting di dalam kehidupan makhluk hidup karena metabolisme menghasilkan energi yang bermanfaat bagi aktivitas hidup. Makhluk hidup tingkat tinggi melakukan sebagian besar proses metabolismenya dalam suasana aerobik membutuhkan O 2 . Bahan-bahan makromolekul dari hasil pencernaan karbohidrat, protein, lipid dimetabolisme menjadi molekul yang lebih kecil hasil akhir berupa energi bebas dengan cara oksidasi. Proses oksidasi bahan-bahan makromolekul akan menghasilkan produk sampingan berupa radikal bebas Voet dan Voet 1995. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil mempunyai satu elektron atau lebih yang tanpa pasangan pada orbital terluarnya, sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak sel. Sebenarnya radikal bebas sangat berperan didalam rantai transport elektron proses metabolisme aerobikreaksi redoksVoet dan Voet 1995. Untuk mengatasi sifat radikal bebas yang tidak stabil, reaktif dan cenderung merusak, tubuh akan memberikan respon penggunaan enzim yang bersifat antioksidatif antioksidan endogen. Antioksidan superoksida dismutase SOD merupakan salah satu enzim yang bertanggung jawab dalam menjaga tubuh dari radikal bebas Kerksick dan Willoughby 2005 terutama antioksidan Cu,Zn-SOD merupakan lini pertahanan pertama dalam melawan radikal bebas Desphande et al. 1996. Enzim ini akan bereaksi dengan anion superoksida menjadi hidrogen peroksida H 2 O 2 yang lebih stabil atau tidak berbahaya bagi tubuh Hwang et al. 2005. Selanjutnya H 2 O 2 akan dinetralisir oleh enzim katalase dan glutathion peroksidase. Kandungan antioksidan Cu,Zn SOD paling rendah dimiliki oleh kelompok K dibandingkan kelompok lain. Hal ini disebabkan oleh tidak adanya penambahan isoflavon, vitamin E dan zinc pada ransum kelompok K. Tidak adanya bantuan isofalvon dan vitamin E sebagai antioksidan Ames et al. 1993 serta zinc sebagai metaloenzim antioksidan seluler Cu,Zn-SOD dan Katalase Powell 2000 untuk mengatasi radikal bebas, tubuh melakukan perlawanan dengan penggunaan antioksidan seluler sehingga terjadi penurunan kandungan antioksidan tubuh. Pemberian vitamin E dan zinc pada ransum kelompok ZE dapat memberikan pengaruh yang nyata terhadap tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Hal ini disebabkan karena vitamin E mempunyai peran sebagai antioksidan yang melindungi membran bilayer sel dari peroksidasi lipid dengan cara membentuk ikatan dengan radikal bebas Noguchi and Niki 1998. Zinc adalah trace mineral esensial yang berperan dalam berbagai reaksi enzimatis dalam tubuh dan sebagai kofaktor beberapa sistem enzim antioksidan : Cu,Zn- SOD Bunker 1992. Pada kelompok I dengan pemberian isoflavon memberikan pengaruh yang nyata terhadap tingginya kandungan Cu,Zn-SOD. Isoflavon adalah senyawa golongan flavonoid yang mempunyai peran sebagai antioksidan yang kuat terutama Genistein Wei et al. 1996. Mekanisme kerja isoflavon sebagai antioksidan ditunjukkan dengan banyak cara, diantaranya yaitu dengan menangkap radikal bebas secara langsung Nijveldt 2001 dan mempertahankan stabilitas membran terhadap peroksidasi lipid Wiseman et al. 1993. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok I lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok ZE. Hal ini disebabkan isoflavon secara struktur molekul memiliki dua pharmacophore yang bersifat antioksidatif yaitu grup 4’hydroxyl pada B-ring dan grup hydroxyl AC-ring Gambar 5. Keduanya dapat sebagai donor hidrogenelektron Heijnen et al. 2002. Gambar 5. Struktur molekul dari isoflavon sumber Heijnen et al. 2002 Dengan adanya dua pharmacophore tersebut aktivitas sebagai scavanger radikal bebas semakin tinggi Wu 2005. Berbeda dengan isoflavon, vitamin E hanya mempunyai satu pharmacophore yang berperan sebagai donor hidrogenelektron Gambar 6. Sedangkan zinc hanya sebagai kofaktor sistem enzim antioksidan tidak secara langsung melawan radikal bebas. Sehingga kapasitas isoflavon sebagai antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan kobinasi vitamin E dan zinc. Gambar 6. struktur molekul vitamin E sumber Manalu, 1999 Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok IZ dan IE lebih tinggi secara nyata dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini disebabkan adanya kombinasi isoflavon dengan zinc pada kelompok IZ dan kombinasi isoflavon dengan vitamin E pada kelompok IE. Pada kelompok IZ, isoflavon berperan sebagai scavenger radikal bebas Cristobal, 2000 dan mempertahankan stabilitas membran dari peroksidasi lipid sedangkan zinc berperan sebagai kofaktor sistem enzim antioksidan Cu,Zn-SOD. Pada kelompok IE, isoflavon dan vitamin E mempunyai fungsi antioksidan yang hampir sama yaitu scavenger radikal bebas dan mempertahankan stabilitas membran dari peroksidasi lipid. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok IE sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok IZ. Hal ini mungkin disebabkan adanya dua antioksidan yang berperan sebagai scavenger radikal bebas yaitu isoflavon dan vitamin E pada kelompok IE. Sedangkan pada kelompok IZ hanya ada isoflavon sebagai scavenger radikal bebas dan zinc yang tidak secara langsung melawan radikal bebas. Kelompok IZE memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling tinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini menunjukkan penggunaan antioksidan endogen berkurang karena pada kelompok ini dikombinasikan pemberian isoflavon, vitamin E dan zinc. Isoflavon dan vitamin E bersinergi sebagai scavenger radikal bebas dan pelindung membran dari peroksidasi lipid serta dibantu zinc sebagai motor reaksi enzimatis dan kofaktor sistem enzim antioksidan. Sehingga dengan kombinasi dari tiga bahan tersebut membentuk pertahanan yang kuat dari serangan radikal bebas. Morfologi Ginjal Ginjal adalah organ pengatur utama cairan tubuh dan alat ekskresi tubuh. Menurut Dellman dan Brown 1992 fungsi utamanya adalah mengatur cairan elektrolit, mengeluarkan limbah metabolisme, memusnahkan zat toksik dan kesetimbangan asam basa serta tekanan darah. Karena mempunyai fungsi sebagai alat ekskresi tubuh, produksi radikal bebas di ginjal akan lebih banyak dibandingkan dengan organ lain. Radikal bebas tersebut merupakan molekul reaktif atau molekul yang tidak stabil, sehingga untuk melengkapi kekurangan tersebut radikal bebas akan berikatan dengan senyawa makromolekul seperti karbohidrat, protein dan lipid yang merupakan komponen pembentuk sel tubuh Desphande et al. 1996. Dengan pewarnaan Hematoksilin dan Eosin HE hasil penelitian menunjukkan pada kelompok K ditemukan lebih banyak infiltrasi sel radang dan sel yang mengalami degenerasi dan nekrosa dibandingkan dengan kelompok lain. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh penyerangan radikal bebas terhadap sel dan lemahnya kemampuan antioksidan endogen mengatasi hal tersebut terjadi penurunan kandungan antioksidan endogen. Sehingga sel mengalami degenerasi yang menyebabkan terjadinya infiltrasi sel radang. Pada jaringan ginjal kelompok ZE, I, IZ, IE dan IZE yang diberi isoflavon, vitamin E dan zinc tidak menunjukkan adanya perubahan histopatologis. Pemberian isoflavon, vitamin E dan zinc dapat mengatasi serangan radikal bebas sehingga memberikan dampak pada sedikitnya kerusakan sel akibat radikal bebas. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Pemberian isoflavon dapat meningkatkan profil antioksidan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibandingkan dengan pemberian vitamin E dan Zn. 2. Pemberian isoflavon yang dikombinasikan dengan vitamin E dan Zn dapat meningkatkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus dibandingkan dengan pemberian isoflavon saja atau vitamin E dan Zn. 3. Pemberian vitamin E yang dikombinasi dengan isoflavon meningkatkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal yang lebih tinggi dibandingkan pemberian mineral Zn yang dikombinasikan dengan isoflavon. 4. Pemberian isoflavon, vitamin E dan Zn secara lengkap menunjukkan profil antioksidan Cu,Zn-SOD terbaik pada jaringan ginjal tikus. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang dosis optimum dari isoflavon yang dikombinasikan dengan vitamin E dan mineral Zn dalam membantu kerja antioksidan Cu,Zn-SOD. DAFTAR PUSTAKA Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. 1993. Oxidant, atioxidant and degenerative disease of aging. Proc Natl Acad Sci 90:15-22. Bank WJ. 1986. Applied Veterinary Histology. 2th edition. Baltimore.[hal 374- 384]. Bunker VW. Free radicals, antioxidants and aging. Medical laboratory sciences, 1992, 49:299–312. Cristobal M. 2000. Antioxidant activities of flavonoids. lpi.oregonstate.eduf- w00flavonoid.html .[9 Februari 2007]. Dellman HD, Brown E. 1992. Buku Teks Histologi Veteriner II. Jakarta: UI Press.[hal 411-433]. Desphande SS, Desphande US, Salunkhe DK. 1996. Food Antioxidant : Nutritional and Health Aspect . Marcel Dekker.USA.[hal 365-387]. Dormandy T.L.1977.Vitamin E and antioxidant activity. Proc.roy.Soc.Med. 70:91-92 Gitawati. 1995. Radikal bebas, sifat dan peranan dalam menimbulkan kerusakan atau kematian sel. Cermin Dunia Kedokteran. 102:33-36. Halliwell B, Gutteridge JMC. 1990. Role of free radical and catalytic ions in human disease : overview. Meth Ency mol. 86:1-83. Heijnen C, Haenen GR, Oostveen RM, Stalpers EM, Bast A. 2002. Protection of flavonoids against lipid peroxidation : the structure activity relationship revisited. Free. Radic. Res. 36 : 575-581. Hwang J, Kleinhenz DJ, Lassègue B, Griendling KK, Dikalov S, Hart CM. 2005. Peroxisome proliferator-activated receptor- ligands regulate endothelial membrane superoxide production. AM J Physiol Cell. 288 : C899-C905. Hidayati M. 2004. Profil imunohistokimia enzim antioksidan copper,zinc superokside dismutase Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus dengan perlakuan stres dan pemberian α-tokoferol.[Skripsi].Bogor:Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Kaufman PB, Duke JA, Brielmann H, Boik J, Hoyt JE. 1997. A comparative survey of leguminous plants as sources of the isoflavones genistein and daidzein: Implications for human nutrition and health. J Altern Compl Med .3:7-12. Kartikawati. 1999. Study efek proteksi vitamin C dan E terhadap respon imun dan enzim antioksidan mencit yang dipapar paraquat. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Karyadi E. 2004. Antioksidant, resep sehat dan umur panjang. [terhubung berkala]. httpwww.indonesiamedia.com2004...kesehatan kesehatan- 0704-antioksidan-5k-.html . [4 Januari 2007]. Kerksick C, Willoghby D. 2005. The antioxidant role of gluthation and nacetyl- cystein supplements and exercise-induced oxidative stress. Journal of The International Society and Sport Nutrition. 22 : 38-44. Levy MA, Bray TM. 2003. Antioxidant function of dietary zinc and protection against neural disorders . lpi.oregonstate.eduss03zinc.html. [9 Februari 2007]. Martin DW, Mayes PA, Rodwell VW.1981. Harper’s Review of Biochemistry. 18th edition. California: Lange Medical Publication. [hal 119 dan 563]. Maclhlin. 1991. Handbook of vitamins. New York : Marcel Dekker Inc.[hal 99- 136]. Muhilal. 1991. Teori radikal bebas dalam gizi dan kedokteran. Cermin Dunia Kedokteran. 73:9. Manalu W.1999. Pengantar Ilmu Nutrisi Hewan. Bogor: Bagian Fisiologi dan Farmakologi, Institut Pertanian Bogor.[Bab VII hal 11-13 dan Bab VIII hal 21]. Maronpot RR, Boorman GA, Gaul BW. 1999. Pathology of Mouse. Viena ; Cache river Press.[hal 208-234]. Mahn K, Borras C, Knock GA, Taylor P, Khan IY, Sugden D, Poston L, Ward JP, Sharpe RM, Vina J, Aaronson PI, Mann GE. 2005.Dietary soy isoflavone- induced increases in antioxidant and eNOS gene expression lead to improved endothelial function and reduced blood pressure in vivo.The FASEB Journal Express Article doi:10.1096fj.05-4008fje. [hal 109-130]. Noguchi N, Niki E. 1998. Chemistry of Active Oxygen Species and Antioxidant: In Papas AM ed Antioxidant status, diet, nutrition and health. Bucaraton : CRC Press.[hal 3-20]. Nijveldt RJ, Nood E, Hoorn DEC, Boelens PG, Norren K, Leeuwen PA. 2001. Flavonoids: A review of probable mechanism of action an potential application. Am J Clin Nutr. 74 4 418-425. . Powell SR. 2000. The antioxidant properties of zinc. Journal Nutrition. 130 : 1447S-1454S. Sutrisno K. 2006. Isoflavon senyawa multi manfaat dalam kedelai. ebookpangan.com . [1 Januari 2007]. Tejasari. 2000. Efek proteksi komponen bioaktif oleoresin rimpang jahe Zingiberofficiae Roscoe terhadap fungsi limfosit secara invitro.[Disertasi]. Bogor :Prgram Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Voet D, Voet GJ. 1995. Biochemistry. 2 rd Edition . JHON WILEY SONS,INC. New York. Winarsi H. 2004. Respon hormonal imunologis wanita premonopause terhadap minuman fungsional berbahan dasar susu skiming disuplementasi dengan isoflavon dan zinc.[Disertasi].Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Walji H. 1992. Vitamin Guide : Essential nutritient for healthly living. Shaftesbury Element.[hal 181-194]. Wei H, Bowen R,Cai Q. 1995. Isoflavones are natural antioxidants. Proc Soc Exp Bio Med. 2081 :124-130. Wei H, Cai Q. 1996. Effect of dietary genistein on antioksidant enzime activities in SENCAR mice. Nutritional Cancer. 25: 1-7. Wiseman H, Quinn P, Halliwell B. 1993. Tamoxifen and related compounds decrease membrane fludity in liposomes : mechanism for the antioxidant action of tamoxifen and cardioprotective action ?. FEBS Lett. 330 : 53-56. Wresdiyati T, Astawan M, Nurwati VD. 2006. Level antioksidan superoksida dismutase SOD pada ginjal tikus hiperkolesterolemia : suatu kajian imunohistokimia. Jurnal Sain Veteriner. 242 : 168-176. Wu Q .2003. Purification and antioxidant activities of soybean isoflavones. [Thesis].Louisiana.Lousiana State University. LAMPIRAN Ginjal Difiksasi dalam Bouin 24 jam Stopping point alkohol 70 Dehidrasi dalam alkohol bertingkatalkohol 80-95 dan alkohol absolut I, II, III Embedding dalam parafin Clearing dengan xilol I, II, III Pemotongan dengan mikrotom Lampiran 1. Proses Preparasi Jaringan Infiltrasi parafin cair I, II, III dalam oven Lampiran 2. Deparafinisasi -rehidrasi Xilol III-I, alkohol absolut III - I dan alkohol 95 -70 5 menit Air mengalir 10 -15 menit Akuades 5 -10 menit Haematoksilin 1 menit Eosin 2 menit Akuades 5 menit Air mengalir 5 menit Akuades 5 menit Mounting Dehidrasi dan Clearing alkohol 70 - 95, absolut I -III silol I-III 3-5 menit Sediaan Lampiran 3. Proses Pewarnaan Imunohistokimia Deparafinisasi – Rehidrasi 5 menit Akuades Hydrogen Peroksida dalam Metanol Akuades 10-15 menit PBS 2x 5- 10 menit Serum Normal 10 50-60 µmsediaan 60 menit, 37 o C PBS 3x 5 menit Antibodi SOD 1:200 50-60 µmsediaan 2 malam, 4 o C PBS 3x 5-10 menit DAKO Envision Peroxidase System 50-60 µmsediaan, 37 o C PBS 3x 5 menit DAB + H 2 O 2 25 menit cek mikroskop Counterstain dengan Haematoxylin Mayer Dehidrasi, Clearing, Mounting Lampiran 4. Komposisi Ransum Standar Komposisi Ransum Standar Tikus per 100gr Komposisi bahan Perlakuan K I IZ IZ IE IZE Kasein g 16.64 16.64 16.64 16.64 16.64 16.64 Minyak jagung g 7.91 7.91 7.91 7.91 7.91 7.91 Mineral mix g 4.35 4.35 4.35 4.35 4.35 4.35 ZnSO4.7H2O - - 2.7 2.7 - 2.7 Vitamin g multivitaplex 1 1 1 1 1 1 Asam folat mg 30 30 30 30 30 30 Vitamin K mg 5 5 5 5 5 5 Vitamin E mg - - 50 - 50 50 Selulosa 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 Air 4.28 4.28 4.28 4.28 4.28 4.28 pati 64.83 64.83 64.83 64.83 64.83 64.83 Jumlah 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 Keterangan : Pembuatan ransum standar didasarkan pada AOAC 1990 Lampiran 5. Analisis Sidik Ragam ANOVA dengan uji lanjutan Duncan yang memberikan reaksi positif kuat terhadap kandungan Cu,Zn-SOD sel