Potensi Senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil Oktanoil Ester Dan 2-Hidroksinikotinil Oktilamida Sebagai Antikanker

POTENSI SENYAWA 2-HIDROKSINIKOTINIL SERIN METIL

OKTANOIL ESTER DAN 2-HIDROKSINIKOTINIL

OKTILAMIDA SEBAGAI ANTIKANKER

HARIYANTI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil Oktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil Oktilamida sebagai Antikanker adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, 2 Juni 2010 Hariyanti NIM G451070061

ABSTRACT

HARIYANTI. Potency of the novel compounds of 2-hydroxynicotinyl serine methyl octanoyl ester and 2-hydroxynicotinyl octylamide for anticancer. Under the supervision of SUMINAR S. ACHMADI and MUHAMMAD HANAFI.

The novel compounds of 2-hydroxynicotinyl serine methyl octanoyl ester (NSMOE) and 2-hydroxynicotinyl octylamide (NOA) were synthesized by modifying of the UK-3A compound known biologically active to inhibit bacterial and cancer cells growth. Based on e-docking value of -11.12 kcal/mol (log P 1.49) for NSMOE and e-docking -10.46 kcal/mol (log P 2.50) for NOA, synthesis of these two compounds were carried out in two-step reaction for the first compound and one step reaction for the second compound. The synthesis of NSMOE started by amidation reaction between L-serine methyl ester and 2-hydroxynicotinic acid yielded 87.8% of 2-hydroxynicotinyl serine methyl ester, which was further esterified with octanoic acid yielded 74.5% of NSMOE. Overall yield of NSMOE was 65.4%. NOA was synthesized by amidation reaction between 2-hydroxynocotinic acid and octylamin yielded 76.1% of the product. The compound were confirmed with Fourier transformed infrared spectrometry, liquid chromatography mass spectroscopy, and nuclear magnetic resonance spectrometry. In vitro test to murine leukemia P-388 cells and breast cancer T47D demonstrated that the inhibition to growth of cancer cells with IC50 for NSMOE ,and NOA were 10.0; 3.19, and 32.0; 4.67 µg/mL,

respectively. The IC50 values indicated that the synthesis products were sufficiently

potential to be anticancer for murine leukemia P-388 cells and breast cancer T47D. Keywods: anticancer, UK-3A analog, NSMOE, NOA, murine leukemia P-388, breast cancer T47D

RINGKASAN

HARIYANTI. Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil Oktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil Oktilamida sebagai Antikanker. Dibimbing oleh SUMINAR S. ACHMADI dan MUHAMMAD HANAFI.

Senyawa UK-3A telah berhasil diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 dan diketahui mempunyai aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. Senyawa UK-3A mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah sel kanker leukemia murin P-388 dengan nilai IC50 38 μg/mL.

Struktur senyawa UK-3A telah dimodifikasi dan menghasilkan beberapa senyawa analog baru. Analog senyawa UK-3A tersebut belum mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang optimum. Sampai tahun 2009, penelitian senyawa analog UK-3A tercatat aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang paling baik didapatkan pada senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksilpikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC50 15,4 μg/mL dan senyawa 3-hidroksipikolinil oktilamida (POA) dengan

aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC50 13,2 μg/mL. Dari hasil penelitian tersebut perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan aktivitas antikanker yang optimum IC50

Pada penelitian ini dilakukan modifikasi struktur PSMOE dan POA dengan menggantikan substituen pikolinil dengan substituen nikotinil sehingga akan terjadi perbedaan posisi gugus aktif hidroksil dan diuji aktivitas keduanya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Untuk mengevaluasi kesesuaian senyawa yang disintesis (ligan) dengan reseptor (protein Bcl-xL), dilakukan proses docking dengan menggunakan program ArgusLab versi 4,0.

< 10 μg/mL dengan meragamkan struktur PSMOE dan POA.

Penelitian tesis ini bertujuan memperoleh senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE), dan 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA) dan mengukur aktivitas antikanker senyawa hasil sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D.

Penelitian ini dilaksanakan dalam 5 tahap: (a) penentuan nilai e-docking dan log P NSMOE dan NOA, (b) sintesis NSMOE dan NOA, (c) identifikasi hasil sintesis dengan spektrofotometri inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti, (d) uji letalitas larva udang, dan (e) uji sitotoksisitas terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D.

Hasil e-docking dan log P NSMOE dan NOA berturut-turut adalah -11,12 kcal/mol; log P 1,49 dan -10,46 kcal/mol; log P 2,50. Kedua senyawa tersebut disintesis melalui dua tahap untuk NSMOE dan satu tahap untuk NOA. Sintesis dimulai melalui reaksi amidasi antara L-serin metil ester hidroklorida dengan asam hidroksinikotinat dan didapatkan senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester dengan

rendemen sebesar 87,8%, yang selanjutnya diesterifikasi dengan asam oktanoat dan didapatkan senyawa NSMOE dengan rendemen sebesar 74,5%. Rendemen keseluruhan sintesis NSMOE adalah 65,4%. Senyawa NOA didapatkan melalui reaksi amidasi antara asam-2-hidroksinikotinat dengan oktil amin dan didapatkan produk dengan rendemen sebesar 76,1%.

Senyawa hasil sintesis dikonfirmasi menggunakan spektrofotometri inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti. Hasil identifikasi NSMOE dan NOA sesuai dengan kedua struktur senyawa tersebut, salah satunya adalah hasil uji cair spektroskopi massa didapatkan kesesuaian bobot molekul NSMOE dan NOA, yaitu 366,12 dan 250,30 g/mol.

Uji toksisitas NSMOE dan NOA dengan metode BSLT hanya dapat dilakukan untuk NOA saja karena adanya pengaruh rendahnya kelarutan NSMOE pada air laut meskipun telah dilakukan penambahan DMSO. NOA mempunyai nilai toksisitas 116,9 ppm. Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mendapatkan senyawa bersifat antikanker. Uji aktivitas selanjutnya adalah uji sitotoksisitas NSMOE dan NOA secara

in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D dan hasilnya memperlihatkan penghambatan pada pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC50

NSMOE, dan NOA berturut-turut sebesar 10,0; 3,19, and 32,0; 4,67 µg/mL. Nilai IC50 menunjukkan bahwa kedua senyawa hasil sintesis berpotensi sebagai antikanker

terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D.

Kata kunci: antikanker, analog UK-3A, NSMOE, NOA, leukemia murin P-388, kanker payudara T47D

POTENSI SENYAWA 2-HIDROKSINIKOTINIL SERIN METIL

OKTANOIL ESTER DAN 2-HIDROKSINIKOTINIL OKTILAMIDA

SEBAGAI ANTIKANKER

HARIYANTI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

Judul Penelitian : Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil Oktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil Oktilamida sebagai Antikanker

Nama : Hariyanti

NIM : G451070061

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Suminar S Achmadi Dr. Muhammad Hanafi Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Kimia Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS.

Tanggal Lulus: Tanggal Ujian: 29 Juni 2010

@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tunjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang keras mengumumkan atau memperbanyak sebaigian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

viii

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Tesis ini berjudul “Potensi senyawa 2-hidroksinikotinil serin meti oktanoil ester dan 2-hidroksinikotinil oktilamida sebagai antikanker” sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan berlangsung selama 10 bulan, mulai bulan Maret 2009 sampai Februari 2010 bertempat di Pusat Penelitian Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dan Jurusan Kimia FMIPA Institut Teknologi Bandung.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Suminar S Achmadi dan Dr. Muhammad Hanafi atas semua bimbingan, saran, dan arahannya. Ucapan terima kasih kepada Laboratorium Kimia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu dan Teknologi (Puspiptek) yang telah mensponsori penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami tercinta, kedua orang tua serta seluruh keluarga, atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya.

Semoga tesis ini bermanfaat.

Bogor, 2 Juni 2010 Hariyanti

ix

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 11 September 1977 dari ayah Ahmad Sa’ari dan ibu Murtasiah. Penulis merupakan putri keenam dari tujuh bersaudara.

Tahun 1995 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Serang dan pada tahun yang sama lulus seleksi sebagai mahasiswa Universitas Indonesia melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih Program Sarjana Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Farmasi. Penulis lulus pendidikan sarjana pada tahun 2000 dan lulus Pendidikan Profesi Apoteker pada tahun 2001. Pada tahun yang sama penulis diterima bekerja sebagai staf pengajar di Jurusan Farmasi Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka. Pada tahun 2002 penulis menikah dengan Nurman Irawan, S.E., Ak. dan telah dikaruniai satu orang putri bernama Rizki Qanita Irawan, dan satu orang putra bernama Ahmad Fadhillah Yasin Irawan.

Tahun 2007 penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

x DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRACT ... iii

ABSTRAK ... iv

DAFTAR GAMBAR ... xi

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

PENDAHULUAN……… 1

Latar belakang... 1

Tujuan Penelitian... 2

Pendekatan Sintesis... 3

TINJAUAN PUSTAKA... 5

Hubungan Struktur dan Aktivitas UK-3A... 5

Sintesis Senyawa Analog UK-3A... 7

Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A...11

Sel kanker leukemia murin P-388...14

Sel kanker Payudara T47-D... 14

Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang... 15

Uji Sitotoksik Antikanker ... 16

BAHAN DAN METODE... 17

Alat dan Bahan………..17

Prosedur ………... 17

HASIL DAN PEMBAHASAN...21

Nilai e-Docking dan Log P Senyawa Analog UK-3A……….. 21

Sintesis NSME... 23

Sintesis NSMOE... 28

Sintesis NOA... 33

Letalitas Larva Udang... 38

Sitotoksisitas NSMOE dan NOA... 38

KESIMPULAN DAN SARAN... 40

DAFTAR PUSTAKA... 41

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester ... 3

2. Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester ... 4

3. Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida ... 4

4. Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida ... 4

5. Struktur senyawa antimisin A3 6. Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A ... 8

, senyawa UK 2A dan UK 3A ... 6

7. Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC ... 10

8. Mekanisme reaksi pembentukan ester dengan katalis DMAP ... 10

9. Reaksi sintesis 3-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester ... 11

10. Struktur inti senyawa analog UK-3A ... 12

11. Hasil e-docking senyawa NSMOE menggunakan program ArgusLab Versi 4,0...………..21

12. Hasil e-docking senyawa NOA menggunakan program ArgusLab versi 4,0……… 22

13. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis NSME……….23

14. Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester (NSME)………...25

15. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis NSMOE……….. 28

16. Struktur NSMOE..………..………... 30

17. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis NOA...……….32

18. Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA) ……..………...34

DAFTAR TABEL Halaman 1. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A3 ... 12

2. Nilai log P, e-docking, dan ujiaktivitas antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P388…..………..………13

xii

3. Nilai Log P dan e-docking senyawa target sintesis dan senyawa induk

UK3A………..14

4. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-NMR (500 MHz) dan 13 C-NMR (125 MHz) untuk senyawa NSME (CD3OD)………...25

5. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-NMR (500 MHz) dan 13 C-NMR (125 MHz) untuk senyawa NSMOE (CD3Cl) ... 30

6. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-NMR (500 MHz) dan 13 C-NMR (125 MHz) untuk senyawa NOA (CD3Cl) ... 34

7. Hasil uji sitotoksisitas (IC50) senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D ... 37

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Hasil analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 45

2. Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa NSME, NSMOE, dan NOA ... 47

3. Spektrum FT-IR senyawa serin metil ester hidroklorida, NSME, NSMOE, dan NOA ... 50

3. Spektrum 1H-NMR senyawa NSME, NSMOE, dan NOA... 52

5. Spektrum 13C-NMR senyawa NSME, NSMOE, dan NOA ... 54

6. Hasil Uji Letalitas Larva Udang ... 56

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Banyak upaya telah dilakukan untuk mengatasi penyakit kanker, salah satu di antaranya adalah mencari sumber obat baru. Salah satu upaya penemuan obat baru yang lebih disukai dan banyak dilakukan dalam dunia penelitian adalah pengembangan senyawa aktif atau obat melalui modifikasi struktur senyawa yang telah diketahui aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, untuk mendapatkan senyawa baru dengan mempunyai aktivitas lebih tinggi. Modifikasi molekul mempunyai beberapa keuntungan sebagai berikut: senyawa homolog atau analog kemungkinan besar mempunyai sifat farmakologis yang sama dengan senyawa induk, kemungkinan produk yang dihasilkan mempunyai aktivitas farmakologis yang lebih besar, data yang diperoleh dapat menjelaskan hubungan struktur dan aktivitas, metode sintesis dan uji hayati yang digunakan sama sehingga menghemat waktu dan biaya, dan produksi obat baru menjadi lebih murah. Modifikasi struktur atau membuat senyawa analog yang lebih sederhana banyak dilakukan karena selain lebih cepat, juga lebih murah (Siswandono & Soekarjo 2000).

Senyawa UK-3A telah berhasil diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 dan diketahui mempunyai aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. Senyawa UK-3A mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah sel kanker leukemia murin P-388 dengan nilai IC50

Struktur senyawa UK-3A telah dimodifikasi dan menghasilkan beberapa senyawa analog baru. Analog senyawa UK-3A tersebut belum mempunyai aktivitas

38 μg/mL. Pada penelitian sebelumnya telah ditunjukkan bahwa gugus hidroksil (-OH), gugus amida (-CONH) dan gugus dilakton merupakan gugus yang menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker (Hanafi 1995). Hal ini mendorong perlunya penelitian untuk mensintesis senyawa analog UK-3A yang memiliki aktivitas tinggi sebagai antikanker dengan cara memodifikasi gugus aktif pada senyawa induk UK-3A.

dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang optimum. Sampai tahun 2009, penelitian senyawa analog UK-3A tercatat aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang paling baik didapatkan pada senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksilpikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC50 15,4 μg/mL (Anita et al. 2007) dan senyawa

3-hidroksipikolinil oktilamida (POA) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC50 13,2 μg/mL (Hanafi 2008). Pada

penelitian ini dicoba dilakukan modifikasi struktur PSMOE dan POA dengan menggantikan substituen pikolinil dengan substituen nikotinil sehingga akan terjadi perbedaan posisi gugus aktif hidroksil dan diuji aktivitas keduanya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Untuk mengevaluasi kesesuaian senyawa yang disintesis (ligan) dengan reseptor (protein Bcl-xL), dilakukan proses docking dengan menggunakan program ArgusLab versi 4,0.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan memperoleh senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE), dan 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA) dan mengukur aktivitas antikanker senyawa hasil sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D.

Pendekatan Sintesis

Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) dilakukan dengan pendekatan retrosintesis (Gambar 1) dan jalur sintesis (Gambar 2).

Gambar 2 Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktil amida (NOA) dilakukan dengan pendekatan retrosintesis (Gambar 3) dan jalur sintesis (Gambar 4).

Gambar 3 Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA)

TINJAUAN PUSTAKA

Hubungan Struktur dan Aktivitas UK-3A

Senyawa UK-3A termasuk ke dalam golongan senyawa antibiotik yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 oleh Ueki et al. (1997a). Senyawa ini diisolasi dalam bentuk kristal tidak berwarna dengan konfigurasi absolut (+)-(2R, 3R, 4S, 7S, 8R). Struktur senyawa UK-3A ini memiliki kemiripan dengan senyawa antimisin A3. Antimisin A3

UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 5). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK-2A (Shimano et al. 1998). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu antimisin A

yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005) memiliki aktivitas sebagai antibiotik dan digunakan sebagai insektisida. Senyawa 3A juga memiliki kesamaan struktur dengan senyawa UK-2A, yaitu memiliki gugus hidroksil, amida, dan dilakton cincin beranggota 9, tetapi senyawa UK-3A tidak memiliki gugus metoksi pada cincin piridin. Berdasarkan penelitian terhadap senyawa UK-3A, diketahui bahwa tidak adanya gugus metoksi pada cincin piridin dapat meningkatkan aktivitasnya sebagai antikanker.

3

yang diisolasi dari Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005). Antimisin A3

diketahui sebagai antibiotik dan juga mempunyai aktivitas yang tinggi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Antimisin A3 dapat menginduksi apoptosis sel

leukemia HL-60. Bc12 terdapat dalam 90% sel kanker usus, 80% B-sel limfomas, dan 70% sel kanker payudara (Liu et al. 2003).

Gambar 5 Struktur senyawa antimisin A3

Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa 3A. Kajian hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK-2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugus-gugus yang berperan dalam aktivitas hayati. Dari hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas tinggi (Hanafi et al. 1999).

dan senyawa UK 2A dan UK 3A (Ueki 1997a)

Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana akan menghasilkan senyawa UK-2(OMe) dan UK-2(NMe) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin piridin dan NH (amida) merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati.

Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin beranggota-9 merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996).

Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil OH), dan amida (-CONH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawa-senyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus -OH pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi dan tidak menimbulkan efek samping (Hanafi & Thelma 1998).

Sintesis Senyawa Analog UK-3A

Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker, seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa antimisin A3 (Shimano et al. 1998). Aktivitas

sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A dengan IC50 sebesar 38 merupakan

senyawa yang kurang aktif (IC50

Sintesis senyawa UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 2000).

> 10 µg/mL) sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih baik (Pan et al. 2009).

Topliss (Patrick 2005) mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer, yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien.

Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugus-gugus yang bersifat lipofilik, elektronik, dan sterik tertentu pada posisi yang tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan.

Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Ragam tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al.

2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 6.

OH

OH O

H2N

ROH / p-TsOH O

OH O

H2N

benzena, 110o_{C, 24 jam}

N OH OH O N OH H N O DCC/py,55o_{C, 24 jam}

O O OH RCOOH N OH H N O O O

O R2

O DMAP

DMAP PSME

3-hidroksipoklinil-serin-metil-butananoil-ester (PSMBE) dan 3-hidroksipoklinil-serin-metil-pentananoil-ester (PSMPE)

DCC / py, 55o_{C, 24 jam}

R

R

R1

PSMPE R₁= -CH₃R₂= C₄H₉ CO-PSMBE, R1= -CH3R2= C3H9

Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. Agar menjadi sempurna, reaksi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (p-TsOH), karbonil diimidazol (CDI), disikloheksilkarbodiimida (DCC), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sundberg 2007).

RCOOH + R'OH H R-COOR' + H₂O

Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dengan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. Oleh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan DCU (disikloheksilurea) sebagai hasil samping penggunaan DCC (March 1992). Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC dapat dilihat pada Gambar 7.

R C O O

+ N C C₆H₁₁

N C6H11

C R

O

O- _{+ HN C}+

C6H11

N C₆H₁₁

Disikloheksilkarbodiimida (DCC)

R C O

O CNHC6H11

NC6H11

+ R'OH H

+

R C OR' O

+ C6H11

H

N C HN O

C6H11

ester

Disikloheksilurea (DCU) H

Gambar 7 Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC (March 1992)

DMAP (4-N,N-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sundberg 2007). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester. Mekanisme reaksi pembentukan ester yang dikatalis DMAP dapat dilihat pada Gambar 8.

N N

CH3

H3C ..

.. N

N

CH3

H3C +

-.. C O O R C R O N N CH3

H3C +

..

-N N

CH3

H3C +

C O O R C O R -N N CH3

H3C +

C O R ion N-asilpiridinium O R' H O CR O -N N CH3

H3C

C OR' O R -RCOR' O + N N CH3

H3C ..

..

4-N,N-dimetilaminopiridin (DMAP)

Gambar 8 Mekanisme reaksi pembentukan ester dengan katalis DMAP (Carey & Sundberg 2007)

Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A

Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan mengubah gugus dilakton cincin beranggota-9 menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik. Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b).

Sintesis senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester, telah dilakukan pada tahun 1995. Sintesis ini dilakukan dengan mereaksikan 3-hidroksipikolinil serin ester dengan asam propionat. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester terhadap sel kanker menunjukkan adanya kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker pada konsentrasi 43-90 µg/mL (Hanafi 1995). Mekanisme reaksi sintesisnya dapat dilihat pada Gambar 9.

N

OH

H N

O

O OMe

OH PHCH2CH2COOH

N

OH

H N

O

O OMe O

3-hidroksipikolinil-metil-serin-ester

DCC/DMAP, CH₂Cl

O

3-hidroksipikolinil-metil-fenilpropionil-serin-ester

Gambar 9 Reaksi sintesis 3-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester (Hanafi 1995)

Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997b).

Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997). Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan antimisin A3 dinyatakan

dalam IC50

Senyawa

(µg/mL) (Ueki et al. 1997a)

IC50 Sel Uji (µg/mL)

P-388 B-16 KB COLO201 3T3 UK-3A 38 18 20 45 100 UK-2A 100 100 17 35 100 Antimisin A3 0,015 0,02 0,063 0,018 15

IC50 = Inhibition Concentration

Pada tahun 2008 mulai dilakukan sintesis analog UK-3A dengan menghilangkan satu gugus lakton pada senyawa 3-hidroksipikolinil oktilamida (POA), kemudian dilihat pengaruhnya pada nilai e-docking dan diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker (Hanafi 2008). Beberapa senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis mempunyai struktur inti pada Gambar 10. Perbedaan nilai log P dan nilai e-docking serta diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murinP-388 dirangkum pada Tabel 2.

Gambar 10 Struktur inti senyawa analog UK-3A N

OH

H N

O

O O O

R2

R1

N

OH

H N

O

C8H17

Tabel 2 Nilai log P, nilai e-docking, dan uji aktivitas antikanker terhadap sel kanker leukemia murinP388

Nama senyawa analog

Struktur inti

Struktur Gugus Nilai

Log P Nilai e-docking IC50 P388 (µg/mL)

R1 R2

3-hidroksipikolinil serin metil pentanoil ester (PSMPE) (Marlupi 2007)

A -CH3 C4H9CO- 0,37 -9,70 39

3-hidroksipikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) (Anita 2008)

A -CH3 C7H15CO- 1,56 -11,93 15,4

3-hidroksipikolinil serin oktil heksanoil ester (PSOHE) (Zainuddin 2008)

A -C8H17 C5H11CO- 3,56 -12,45 35

3-hidroksipikolinil serin oktil oktanoil ester (PSOOE) (Darmawan 2008)

A -C8H17 C7H15CO- 4,35 -13,50 50

3-hidroksi-pikolinil-oktilamid (POA) (Hanafi 2008)

B - - 0,82 -10,16 13,2

Senyawa analog UK-3A yang disintesis pada penelitian ini adalah senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) yang akan dilakukan melalui dua tahapan reaksi dan senyawa 2-hidroksinikotinil oktil amida (NOA) yang dilakukan melalui satu tahapan reaksi. Sintesis senyawa NSMOE dan NOA dipilih untuk melihat perbedaan posisi gugus hidroksil pada cincin aromatik (cincin nikotinat) terhadap aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murin P-388 dan juga dilakukan uji aktivitas terhadap sel kanker payudara T47D. Penyakit kanker terjadi karena sel normal yang telah kehilangan sifat apoptosis, yaitu kemampuan untuk membunuh sel itu sendiri, sehingga sel terus bertambah. Hal ini terjadi karena adanya overekspresi pada enzim Bcl-xL yang merupakan enzim antiapoptosis. Oleh karena itu, salah satu mekanisme yang diharapkan pada senyawa obat antikanker adalah kemampuannya menghambat kerja enzim Bcl-xL tersebut (Enyedy et al. 2001). Pada penelitian ini juga ditentukan nilai e-docking yang

dilakukan secara in silico pada protein Bcl-xL yang merupakan enzim antiapoptosis.yang spesifik untuk kanker payudara (Espana et al. 2005). Nilai log P juga ditentukan untuk melihat pengaruh perbedaan nilai lipofilisitas/hidrofobisitas senyawa hasil sintesis pada uji aktivitas antikanker. Hasil nilai log P dan nilai e-docking dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Nilai Log P dan e-docking senyawa target sintesis dan senyawa induk UK-3A Nama senyawa analog Log P _(kkal/mol) e-docking

2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) 1,49 -11,45 2-hidroksinikotinil oktil amin (NOA) 2,50 -10,46

UK-3A 1,61 -11,65

Antimisin A3 1,30 -10,34

Artonin E -10,26

E-docking adalah percobaan dengan menggunakan program komputer tertentu dan dalam penelitian ini digunakan program ArgusLab versi 4,0 yang menghasilkan energi bebas ikatan (∆G bind) dalam satuan kka l/mol. Nilai log P didapatkan dengan

program Hyperchem pro 6,0.

Sel Kanker Leukimia Murin P-388

Leukimia murin P-388 merupakan salah satu jenis sel kanker leukemia yang sering digunakan dalam uji sitotoksisitas untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Sel kanker ini dikembangbiakkan dari sel tikus yang dikenai agen leukemia. Jenis sel leukimia lain yang sering digunakan adalah sel leukemia L1210 yang antara lain telah digunakan dalam uji sitotoksisitas kalanon menghasilkan nilai IC50 sebesar 59,4 μg/mL (Chasani 2002).

Sel Kanker Payudara T47D

Kanker payudara sering ditemukan di seluruh dunia dengan insiden relatif tinggi, yaitu 20 % dari seluruh keganasan. Menurut WHO 8-9% wanita mengalami kanker payudara. Hal ini menjadikan kanker payudara sebagai jenis kanker yang paling banyak ditemui pada wanita. Setiap tahun lebih dari 250.000 kasus baru

kanker payudara terdiagnosis di Eropa dan kurang lebih 175.000 di Amerika Serikat (Jemal 2003).

Kanker payudara memperlihatkan proliferasi keganasan sel epitel yang membatasi duktus atau lobus payudara. Kanker membutuhkan waktu 7 tahun untuk tumbuh dari satu sel menjadi massa yang cukup besar untuk dapat dipalpasi (kira-kira berdiameter 1 cm). Pada ukuran itu, sekitar 25% kanker payudara sudah mengalami metastasis (Price 2005). Sel T47D merupakan sel kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen atau yang biasa disebut ER positif serta mengekspresikan p53 yang telah termutasi. Pada sel ini p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding 11 domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika P53 tidak dapat memberi respons pada DNA, maka P53 akan mengurangi atau menghilangkan kemampuan dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis (Schafer et al. 2000).

Sel T47D merupakan continuous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continuous cell line sering dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi, serta mudah diganti dengan stok beku jika terjadi kontaminasi (Burdall et al. 2003).

Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang

Pada umumnya zat aktif pada konsentrasi yang tinggi bersifat toksik, oleh karena itu Meyer (1982) melakukan pendekatan untuk uji toksisitas dengan menggunakan hewan sederhana dan memilih Artemia salina (nauplius) sebagai hewan uji. Metode ini sering digunakan untuk penapisan awal terhadap senyawa aktif yang memiliki khasiat sebagai antitumor di dalam ekstrak tanaman karena mudah, cepat, murah, dan dapat dipercaya. Selain itu uji toksisitas menggunakan larva udang ini dapat juga digunakan pada analisis toksisitas pestisida, polutan, dan senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik. Besarnya aktivitas toksisitas terhadap larva udang laut dinyatakan dengan LC50 (median lethal concentration), yaitu konsentrasi

senyawa uji (ppm) yang dapat menyebabkan kematian 50% organisme uji di bawah kondisi yang sesuai (McLaughlin et al. 1998).

Uji Sitotoksik Antikanker

Suatu zat dikatakan bersifat sitotoksik apabila zat tersebut memiliki efek toksisitas atau beracun terhadap sel yang dapat menyebabkan kematian sel. Obat-obatan kemoterapi seringkali bersifat toksik terhadap sel kanker yang tumbuh dengan cepat.

Secara in vitro, uji sitotoksisitas dilakukan untuk menentukan potensi sitotoksik senyawa-senyawa seperti produk-produk farmasi, kosmetik, dan obat-obat antikanker. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo, di tempat terjadinya kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik atau karena efek-efek fisiologi seperti efek inflamasi, neurotoksisitas, dan juga efek-efek sistemik. Uji in vitro harus dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Respons sel terhadap agen-agen sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel (Freshney 1996).

Uji sitotoksisitas merupakan uji yang digunakan untuk mengevaluasi keamanan suatu senyawa yang akan digunakan sebagai bahan obat, kosmetik, zat tambahan makanan, dan pestisida dengan menggunakan kultur sel secara in vitro. Salah satu syarat uji sitotoksisitas adalah sistem uji tersebut harus menghasilkan kurva dosis respons yang reprodusibel dan dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Sistem uji sitotoksisitas ini merupakan uji kuantitatif dan kualitatif dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney 1996).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spektrofotometer inframerah (FT-IR) Perkin Elmer, FT-NMR JEOL 500 MHz, spektrometri massa (LC-MS), dan seperangkat alat refluks.

Bahan yang digunakan antara lain asam 2-hidroksinikotinat, asam p-toluena sulfonat (p-TsOH), L-serin metil ester, asam oktanoat, oktilamina, DCC, DMAP, larva Artemia salina, sel kanker P-388, sel kanker T47D, media EAGLE, serum fetal bovine.

Prosedur Sintesis NSME

Senyawa NSME disintesis dengan menyediakan labu bulat dua leher, kemudian diisi dengan 2-hidroksinikotinat 8 mmol, aktivator DCC 4,4 mol, dan katalis DMAP 0,8 mmol. Ke dalam labu ditambahkan L-serin metil ester 4 mmol. Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 mL pelarut kloroform melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55°C selama 24 jam (Hanafi et al. 1997b). Selama reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n -diklorometana:metanol 10% untuk memantau hasil senyawa yang terbentuk.

Ke dalam hasil reaksi ditambahkan senyawa magnesium sulfat anhidrat untuk menghilangkan air sebagai reaksi samping, kemudian disaring dan sisa pelarut CHCl3

diuapkan. Produk dimurnikan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol 10%. Senyawa hasil 2-hidroksinikotinil serin metil ester (NSME) yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1H-NMR, dan 13

Senyawa NSMOE disintesis dengan cara mereaksikan 2-hidroksinikotinil metil ester 0,4 mmol dengan asam oktanoat 2 mmol menggunakan aktivator DCC 2

C-NMR. Sintesis NSMOE

mmol dan katalis DMAP 0,05 mmol dalam pelarut CHCl3 pada suhu ruang selama 4

jam. Rendemen sintesis dihitung berdasarkan nisbah terhadap hasil teoretis. Sintesis NOA

Senyawa NOA disintesis dengan menyediakan labu bulat dua leher, kemudian dengan asam-2-hidroksinikotinat 4 mmol, aktivator DCC 4,4 mmol, dan katalis DMAP 0,4 mol. Ke dalam labu ditambahkan oktilamina 4,2 mmol. Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 mL pelarut kloroform melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55°C selama 24 jam (Hanafi et al.

1997b). Selama reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n-diklorometana:metanol 10% untuk mendeteksi hasil senyawa yang terbentuk.

Magnesium sulfat anhidrat ditambahkan untuk menghilangkan air sebagai reaksi samping, kemudian disaring dan sisa pelarut CHCl3 diuapkan. Pemurnian

dilakukan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n -diklorometana:metanol 10%. Senyawa hasil 2-hidroksinikotinil oktilamin yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1H-NMR dan 13C-NMR. Rendemen sintesis dihitung berdasarkan nisbah terhadap hasil teoretis. Identifikasi

Spektrum FT-IR dari senyawa hasil reaksi diukur dalam bentuk pelet KBr dengan menggunakan spektrofotometer Perkin Elmer. Spektrum NMR diukur menggunakan instrumen JEOL 500 MHz. Nilai geseran kimia (δ) sinyal diukur dalam satuan ppm. Pengukuran pada 1H-NMR menggunakan pelarut CDCl3, CD3OD, dan

sebagai standar internal digunakan tetrametilsilana (TMS) pada δ 0,0.

Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan menggunakan pelat silika gel Merck GF254 dengan tebal 0,25 mm. Identifikasi spot KLT menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Kromatografi kolom dilakukan menggunakan silika gel Merck dengan ukuran 70-230 mesh.

Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang (BSLT)

Telur udang dimasukkan ke dalam kotak yang berisi air laut dan ditutupi dengan sebagian foil aluminium (agar tidak tembus cahaya) lalu dibiarkan selama 24 jam sehingga semua telur menetas menjadi larva. Kemudian larva yang telah berumur 1 hari diambil sebanyak 10–15 ekor dan ditempatkan di dalam vial pengujian yang telah diisi dengan 100 µL air laut. Selanjutnya ditambahkan 100 µL larutan sampel dan dibiarkan selama 24 jam pada tempat yang cukup cahaya dan udara. Jumlah larva yang mati diamati setelah 24 jam dan pengujian sampel dilakukan triplo (secara bersamaan). Blanko untuk uji BSLT ini juga dilakukan dengan cara yang sama dengan tetapi tanpa tambahan sampel.

Data dari hasil pengujian dianalisis dengan menghitung jumlah larva yang mati dan yang masih hidup. Persentase kematian dihitung dengan rumus Abbot sebagai berikut:

100%

-Kematian = ×

C B A

keterangan:

A = Jumlahlarva yang mati pada kelompok percobaan

B = Jumlah larva yang mati pada kelompok blanko

C = Jumlah larva awal

Data yang diperoleh menggunakan analisis regresi linear dengan cara membuat grafik hubungan antara persentase kematian dan konsentrasi sampel. Nilai LC50

Aktivitas senyawa analog UK-3A diuji terhadap dua senyawa hasil sintesis, yaitu NSMOE dan NOA. Kedua senyawa diuji sebagai antikanker secara in vitro terhadap

ditentukan dengan cara mengalurkan data pada grafik (Chozin et al. 1997).

Uji Aktivitas Antikanker secara in vitro terhadap Sel Kanker Leukemia Murin P-388 dan Sel Kanker Payudara T47D

sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Aktivitas sitotoksik ini diuji dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromida. Metode ini diawali dengan inokulasi sel dengan jumlah 3 x 103 sel/mL dalam media RPMI 1640 yang dilengkapi fetal bovine serum (FBS), pada 96 lubang

microplate. Setelah inokulasi ditambahkan sampel NSMOE atau NOA masing-masing dengan ragam konsentrasi 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; dan 100 µg/mL. Sebagai kontrol positif digunakan senyawa antikanker artonin E untuk sel kanker leukemia murin P-388 dan cisplatin untuk sel kanker payudara T47D dengan ragam konsentrasi yang sama. Setelah 48 jam dari penambahan sampel ditambahkan pereaksi MTT dan sel diinokulasi kembali. Setelah 4 jam ditambahkan larutan penghenti untuk menghentikan reaksi MTT. Prinsip pengujian didasarkan pada pengukuran intensitas warna yang terjadi sebagai hasil metabolisme pada sel hidup. Garam MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromida) yang ditambahkan pada media, akan direduksi oleh mitokondrial dehidrogenase menjadi formazan (zat warna ungu). Jumlah sel hidup dan sel mati dihitung berdasarkan pengukuran rapatan optis (OD) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 550 nm dan 600 nm. Besarnya intensitas larutan sebanding dengan jumlah sel hidup. Dari pengukuran diperoleh nilai serapan rata-rata untuk tiap lubang dari tiga kali ulangan. Nilai A kemudian dimasukkan dalam grafik untuk memperoleh nilai IC50 (Freshney 1996).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Nilai e-docking dan Log P Senyawa Analog UK-3A

E-docking program ArgusLab 4,0 digunakan untuk melihat kesesuaian antara senyawa aktif (ligan) dengan reseptor (protein/ligan) secara in silico

kemudian diperkirakan afinitas ikatan antara ligan dan reseptor sehingga diperoleh nilai energi bebas minimum (∆G⁰bind) dalam satuan kkal/mol. Pada pelaksanaan

docking, ligan dioptimasi bentuk dan orientasi struktur paling stabil untuk dapat berikatan dengan tapak aktif dari reseptor (dalam hal ini protein Bcl-xL) tertentu yang menjadi target sampai mendapatkan energi bebas minimum (∆G⁰bind) yang

sesuai (Oda & Takahashi 2009). Tidak adanya ketentuan yang jelas mengenai batas optimum batas atas maupun batas bawah dari nilai e-docking yang diperoleh menunjukkan bahwa ligan tersebut cocok atau sesuai dengan tapak aktif protein yang dijadikan target. Namun dari acuan yang diperoleh, ada kecenderungan bahwa semakin kecil nilai e-docking semakin cocok ikatan antara ligan dan protein target (Thomas 2003). Dari hasil docking senyawa NSMOE diperoleh nilai -11,12 kkal/mol dan dari senyawa NOA nilai -10,46 kkal/mol. Hasil e-docking senyawa NSMOE dan NOA dapat dilihat berturut-turut pada Gambar 11 dan 12.

Gambar 11 Hasil e-docking NSMOE menggunakan program ArgusLab versi 4,0 Protein

Gambar 12 Hasil e-docking NOA menggunakan program ArgusLab versi 4,0 Log P (lipofilisitas/hidrofobisitas) merupakan koefisien partisi senyawa yang diukur berdasarkan nisbah kelarutan zat pada pelarut n-oktanol dan air. Log P merupakan suatu parameter krusial yang menentukan kemampuan senyawa (obat) menembus membran sel dan berinteraksi dengan target. Hal ini juga sesuai dengan salah satu faktor pada lima aturan Lipinski yang juga mensyaratkan nilai log P < 5 karena berhubungan dengan kemampuan senyawa untuk melarut dan menembus membran sel. Perubahan struktur pada senyawa akan memberikan pengaruh yang signifikan pada nilai log P dan juga pada aktivitas hayatinya (Patrick 2005; Mishra et a.l 2009). Nilai log P senyawa NSMOE dan NOA adalah 1,49 dan 2,50.

Korelasi hubungan antara struktur dan aktivitas serta nilai yang diperoleh dari hasil komputasi e-docking akan dapat dilihat setelah hasil uji bioaktivitas kedua senyawa NSMOE dan NOA tersebut selesai dilakukan.

Sintesis NSME

NSME disintesis dengan mereaksikan asam 2-hidroksinikotinat dengan L-serin metil ester hidroklorida dengan bantuan disikloheksilkarbodiimida (DCC) dan dimetil amino piridin (DMAP) sebagai katalis (aktivator) dalam kloroform

Protein

pada suhu 55°C selama 24 jam. Senyawa asam-2-hidroksinikotinat diaktivasi menggunakan DCC dan dibantu dengan katalis DMAP untuk mempermudah reaksi dengan L-serin metil ester hidroklorida (SME) yang mengandung gugus amina sehingga membentuk gugus amida. Reaksi sintesis NSME mengikuti perkiraan mekanisme reaksi pada Gambar 13.

N O O H C N N C6H11

C6H11

N O O C N NH

C6H11

C6H11

C6H11 N- C

H N O

C6H11

N N N OH DMAP DCC N O OH N N .. .. + -Asam-2-hidroksinikolinat + o O CH3 OH HCl:N

C6H11 N C

H N O

C6H11

-H

H

L-serin metil ester hidroklorida

C6H11

H

N C HN C6H11

O DCU N OH N O_ H N O O CH3 OH N + N N .. .. DMAP N O H N O OH O CH3

2-hidroksinikotinil serin metil ester (NSME)

OH OH

O

OH

Gambar 13 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis NSME

Hasil reaksi sintesis NSME yang diperoleh berupa larutan tidak berwarna bercampur dengan padatan putih disikloheksilurea (DCU). DCU merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC. Pemisahan hasil reaksi dari DCU dipisahkan dengan penyaringan dan pemurnian secara kromatografi. Filtrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporatorputar.

Analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk dilakukan menggunakan KLT analitik dengan fase diam silika gel dan fase gerak n -diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Analisis KLT menghasilkan 3 spot dari hasil reaksi sintesis tahap pertama, yaitu spot senyawa awal asam hidroksinikotinat dengan Rf = 0,19, spot produk 2-hidroksinikotinil serin metil ester yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,42, dan spot produk samping dengan Rf = 0,51. Spot produk reaksi yang dominan merupakan spot berwarna ungu dan memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dari spot standar asam 2-hidroksinikotinat karena bersifat lebih nonpolar. Produk samping reaksi dapat terbentuk karena adanya reaksi samping yang tidak spesifik sehingga terjadi reaksi pada gugus aktif yang tidak diinginkan (Anita et al.2008). Hasil analisis KLT NSME dapat dilihat pada Lampiran 1a.

Senyawa hasil samping dipisahkan dari produk NSME dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fasa gerak n -diklorometana:metanol secara bergradien. Fraksi-fraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,42 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih. Rendemen hasil sintesis NSME yang diperoleh sebesar 87,8 %. Produk reaksi tersebut dapat dikatakan murni berdasarkan spot tunggal hasil KLT dan jarak titik leleh yang sempit, yaitu 73-74°C.

Hasil pengukuran menggunakan LC-MS (liquid chromatography mass spectroscopy) (Lampiran 2a) terhadap senyawa NSME menghasilkan 2 puncak dengan 1 puncak dominan yang muncul pada waktu retensi 1,61 menit (T1,6) dengan luas area 6053,5. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 240,23 g/mol (M + H = 241,23 g/mol) yang merupakan bobot molekul senyawa NSME. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 1,12 (T1,1) dengan area sebesar 291,06 yang merupakan hasil samping reaksi yang masih mengotori produk. Senyawa pengotor ini adalah DCU sesuai dengan bobot molekulnya 224,39. Nilai bobot molekul NSME hasil pengukuran sesuai dengan bobot molekul NSME penelitian sebelumya (Shimano et al. 1998).

Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal menujukkan pita-pita serapan antara lain pada bilangan gelombang ν = 3350

cm-1 yang merupakan serapan lebar dari vibrasi ulur OH, bilangan gelombang ν = 1743 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur gugus karbonil (C=O) ester, dan ν = 1448 cm-1 merupakan vibrasi tekuk C-O (Lampiran 3a).

Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis NSME menunjukkan pita serapan baru pada ν = 1680 cm-1

yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari amida, serapan tunggal pada ν = 3381 cm-1

yang merupakan vibrasi ulur NH dari amida sekunder (Pavia et al. 2001). Hasil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur karbonil (C=O) ester pada ν = 1746 cm-1_{, dan serapan pada ν}

= 3481 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur OH (Lampiran 3b). Hasil analisis FT-IR ini menunjukkan senyawa NSME telah terbentuk karena adanya serapan-serapan baru yang menunjukkan adanya gugus amida yang tidak terdapat pada spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal.

Spektrum hasil analisis senyawa NSME menggunakan spektrometer 1 H-NMR (Lampiran 4a) dan 13

N O H N O O OH 1"' 1' 2' 3' 3 4 5 6 OH 2

C-NMR (Lampiran 5a) dapat ditunjukkan dalam Tabel 4 dan menggunakan panduan Gambar 14.

Gambar 14 Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester (NSME) Tabel 4 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1

H-NMR (500 MHz) dan 13C-NMR (125 MHz) untuk senyawa NSME (CD3

C/H

OD)

Geseran Kimia (δ, J dalam Hz) 1H-NMR 13C-NMR 1’’’ 3,78 (s, 3H) 53,16 1’ - 173,00 2’ 4,70 (m, 1H, J = 3,7; 7,3) 56,51 3’ 4,01 (dd, 1H, J = 3,7; 11) 63,08

3,90 (dd, 1H, J = 3,7; 11) CONH 10,62 (d, 1H, J = 7,3) 166,06 2 - 166,15 3 - 121,53 4 8,49 (dd, 1H J = 2,5; 7,4) 140,68 5 6,59 (t, 1H, J = 7,4) 108,28 6 7,71 (dd, 1H J = 2,5; 6,1) 146,35

Berdasarkan hasil pengukuran menggunakan spektrometer 1H-NMR dengan standar TMS dan pelarut CDCl3 untuk senyawa NSME dapat dijelaskan

bahwa geseran kimia pada δ = 3,78 ppm (s, 3H) merupakan geseran proton pada gugus metil, yaitu C1”’. Puncak yang dihasilkan berbentuk singlet karena gugus metil terikat pada atom oksigen pada ester yang tidak mengikat proton. Nilai geseran kimia ini lebih bawah-medan karena berdekatan dengan gugus ester pada posisi α. Gugus metilena C3’ ditunjukkan oleh δ = 3,90 (dd, 1H, J = 3,7; 11 Hz) dan δ = 4,01 (dd, 1H, J = 3,7; 11 Hz). Nilai geseran kimia ini lebih bawah-medan karena pengaruh dari atom oksigen yang elektronegatif pada posisi α dan gugus amida serta ester pada posisi β. Proton yang terikat pada C2’ ditunjukkan oleh δ = 4,70 (m, 1H, J = 3,7 Hz) yang terletak di bawah-medan karena berdekatan dengan karbonil pada ester dan amida pada posisi α. Puncak berbentuk multiplet karena interaksi dengan proton pada NH amida, OH pada cincin nikotinil dan 2 proton pada metilena. Proton pada gugus amida ditunjukkan oleh δ = 10,62 (d, 1H, J = 7,3 Hz), berupa puncak doblet yang berasal dari interaksi proton pada amida dengan 1 proton yang terikat pada C2’. Puncak pada δ = 6,59 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,71 (dd, 1H J = 2,5; 6,1 Hz), dan 8,49 (dd, 1H J = 2,5; 7,4 Hz) masing-masing menunjukkan 1 proton aromatik pada C4, C5, dan C6 pada cincin nikotinil. Puncak berbentuk doblet-doblet pada C4 dan C6 serta kuartet pada C5. Tetapan kopling untuk H-4 terhadap H-5 sebesar 7,4 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk H-4 terhadap H-6 sebesar 2,5 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi meta. Tetapan kopling untuk H-5 terhadap H-6 sebesar 7,4 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-5 dan H-6 terhadap H-4 sebesar 6,1 dan 2,5 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta, yaitu 6-9 Hz untuk posisi orto dan 1-3 Hz untuk posisi

meta (Jenie et al. 2006). Geseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CD3

Pengukuran menggunakan OD muncul pada δ = 3,31.

13

C-NMR menghasilkan geseran kimia antara lain δ = 53,01 yang merupakan geseran kimia dari gugus metil C1’’’ yang

bawah-medan karena berdekatan dengan atom oksigen pada ester yang bersifat elektronegatif. Geseran pada δ = 56,5 menunjukkan C2’ yang bawah-medan karena pengaruh atom nitrogen amida yang elektronegatif, sedangkan δ = 63,08 menunjukkan karbon metilena C3’ yang lebih bawah-medan karena pengaruh atom oksigen hidroksil yang lebih elektronegatif dari atom nitrogen. Karbon gugus karbonil pada ester, yaitu C1’, ditunjukkan oleh δ = 173,0 yang lebih bawah-medan karena pengaruh atom oksigen.

Puncak pada δ = 108,28; 121,53; 140,68; 146,35; dan 166,15 menunjukkan geseran kimia atom karbon aromatik pada cincin nikotinil, yaitu masing-masing C5, C3, C4, C6, dan C2. C2 memiliki nilai geseran kimia paling bawah-medan di antara karbon-karbon lain pada cincin nikotinil karena C3 mengikat gugus hidroksil yang elektronegatif. Hasil spektrum 13C-NMR juga memberikan nilai δ = 49,1 yang merupakan geseran kimia atom karbon dari pelarut CD3OD.

Geseran kimia 1H-NMR dan 13C-NMR pada struktur NSME telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11,0 dan menghasilkan data geseran kimia yang sesuai dengan penelitian sebelumnya (Shimano et al.

1998).

Hasil analisis menggunakan KLT, FT-IR, LC-MS, 1H-NMR, dan 13

Reaksi sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa NSMOE dilakukan dengan mereaksikan senyawa hasil sintesis tahap pertama, yaitu NSME dengan asam oktanoat untuk membentuk NSMOE. Reaksi esterifikasi dapat terjadi karena gugus asam dari asam oktanoat diaktivasi oleh DCC dan dikatalisis dengan DMAP sehingga mudah diserang oleh elektron bebas pada atom oksigen dalam gugus OH yang terdapat pada senyawa NSME. Gugus OH yang diserang adalah gugus OH primer pada NSME karena memiliki ikatan karbon sp

C-NMR menunjukkan bahwa senyawa NSME telah terbentuk dalam sintesis tahap pertama. Produk ini kemudian digunakan sebagai bahan sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) melalui reaksi esterifikasi.

Sintesis NSMOE

3 yang

lebih lemah dibandingkan dengan ikatan karbon sp2

O O C₇H₁₅

H C N

N C6H11

C₆H₁₁ DCC

O C₇H₁₅ O

C N C6H11

NH C₆H₁₁

C6H11 N- C

H N O

C6H11

N N

C7H15 O

DMAP

N N

C₇H₁₅ O

N O H N O O O H

H₃C

C₆H₁₁ N C HN O

C₆H₁₁ .. .. + -+ + ..

-C₆H₁₁ HN C HN C₆H₁₁ O DCU N N + :O O O C₇H₁₅

H₃C

O H N O N : .. -N N .. N O H N O O O CH3

C₇H₁₅ O HO

OH HO

pada gugus OH yang terdapat di cincin nikotinil. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis senyawa NSMOE dapat dilihat pada Gambar 15.

Perpanjangan rantai ester pada sintesis NSMOE ini dilakukan untuk menggantikan cincin dilakton, karena cincin dilakton merupakan gugus yang berperan dalam aktivitas hayati senyawa UK-3A (Hanafi 1995). Perpanjangan rantai ini bertujuan mendapatkan senyawa yang lebih aktif dengan cara meningkatkan lipofilitas senyawa. Lipofilitas senyawa berpengaruh pada kemampuan senyawa dalam menembus dinding sel kanker yang tersusun dari fosfolipid yang bersifat nonpolar (Hanafi et al. 1999).

Setelah reaksi berlangsung, dilakukan analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk menggunakan KLT analitik dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Pada KLT diperoleh 2 spot, yaitu spot NSME dengan Rf = 0,428, dan spot produk NSMOE yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,595. Nilai Rf senyawa NSME lebih kecil dibandingkan produk NSMOE karena senyawa produk bersifat lebih nonpolar akibat penambahan rantai alifatik pada gugus ester. Hasil analisis KLT NSMOE dapat dilihat pada Lampiran 1b.

Senyawa NSMOE berupa larutan berwarna jernih. Larutan ini dikeringkan menggunakan evaporator putar, kemudian dilarutkan dalam diklorometana. Larutan ini bercampur dengan padatan putih DCU. DCU dipisahkan dengan penyaringan. Filtrat ditambah dengan magnesium sulfat anhidrat untuk menyerap air yang mungkin masih tersisa guna menghindari hidrolisis produk. Produk dipisahkan dengan MgSO4

Spektrum FT-IR untuk NSMOE menunjukkan pita serapan pada ν = 1743 cm

dengan penyaringan. Filtrat yang diperoleh dikeringkan dan pemurnian dilakukan dengan kromatografi kolom silika gel. Fase diam yang digunakan adalah silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol secara gradien. Kolom kromatografi dilakukan untuk memurnikan produk dari sisa pereaksi NSME, sisa asam, dan DCU. Senyawa NSMOE yang dihasilkan seperti-minyak (oily) berwarna kuning. Rendemen hasil sintesis NSMOE yang diperoleh adalah 74,50%. Rendemen sintesis untuk tahap reaksi pertama maupun kedua cukup baik tetapi rendemen síntesis NSMOE keseluruhan reaksi masih < 70%, yaitu 65,4%.

Hasil analisis LC-MS senyawa NSMOE menunjukkan adanya satu puncak dominan yang muncul pada kromatogram (Lampiran 2b). Puncak ini muncul pada waktu retensi 2,72 menit (T2,7) dengan area 644895,98 yang merupakan produk senyawa NSMOE. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 366,12 g/mol (M + H = 367,12 g/mol) yang merupakan bobot molekul NSMOE, muncul pada serapan spektroskopi massa.

-1 _{yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari ester, dan ν = 1672 cm}-1

yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) pada amida. Hasil analisis juga menunjukkan ada vibrasi ulur CH alifatik pada ν = 2954-2854 cm-1

senyawa NSMOE dapat dilihat munculnya gugus alifatik pada serapan ν = 2954-2854 cm-1 yang menunjukkan terbentuknya rantai alifatik pada gugus ester yang baru (Lampiran 3c).

Spektrum hasil analisis senyawa produk sintesis tahap kedua, yaitu senyawa NSMOE menggunakan spektrometer 1H-NMR (Lampiran 4b) dan 13

N O H N O O O O

1'' 2'' _3'' 4" 5"

1"' 3' 1' 2' 3 4 5 6 OH 2

6" _7" 8"

C-NMR (Lampiran 5b), membantu dalam menganalisis struktur produk reaksi yang terbentuk. Data hasil pengukuran terhadap senyawa NSMOE dapat dilihat pada Tabel 5 yang disertai dengan struktur kimia NSMOE (Gambar 16).

Gambar 16 Struktur NSMOE Tabel 5 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1

H-NMR (500 MHz) dan 13C-NMR (125 MHz) senyawa NSMOE (CDCl3

C/H

)

Geseran Kimia (δ, J dalam Hz) 1H-NMR 13C-NMR 1” - 173,62

2” 2,32 (t, 2H, J = 7,3) 34,23 3” 1,59 (m, 2H, J = 7,3) 25,09

4” 1,27 29,18 5” 1,27 (m, 8H, J = 7,3) 29,07 6” 1,27 31,80 7” 1,27 22,75 8” 0,84 (t, 3H, J = 7,3) 14,22 1’’’ 3,79 (s, 3H) 52,93 1’ - 170,13 2’ 5,03 (m, 1H, J = 3,7; 7,4) 51,34 3’ 4,54 (dd, 1H, J = 4,3; 11,6) 63,49

4,56 (dd, 1H, J = 4,3; 11,6) -CONH 10,27 (d, 1H, J = 7,4) 163,73

2 - 164,22 3 - 120,91 4 8,61 (dd, 1H, J = 2,4; 7,3) 138,51 5 6,58 (t, 1H, J = 6,7) 108,20 6 7,69 (m, 1H, J = 1,9; 8,8) 145,89

Spektrum 1H-NMR dengan standar internal TMS dan pelarut CDCl3 untuk

gugus metil pada C8” ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 0,84 (t, 2H, J = 7,3 Hz). Serapan muncul sebagai pita berbentuk triplet karena terikat pada C7” yang memiliki 2 proton. Integrasi pada spektrum menunjukkan bahwa proton pada C8” ini berjumlah 3 proton. Geseran kimia untuk C4”, C5”, C6”, dan C7” muncul pada δ = 1,27 (m, 8H, J = 7,3 Hz). Puncak muncul sebagai pita multiplet karena di sekitar atom-atom tersebut terikat 2 proton. Geseran kimia ini menyatakan geseran kimia untuk 8 buah proton, yaitu 2 proton pada C4”, 2 proton pada C5”, 2 proton pada C6”, dan 2 proton pada C7”. Geseran kimia pada δ = 2,32 (t, 2H, J = 7,3 Hz) merupakan geseran kimia untuk 2 buah proton pada C2”. Serapan berbentuk triplet karena terikat pada C3” yang memiliki 2 proton dan C1” yang tidak memiliki proton. Serapan ini muncul lebih bawah-medan karena berdekatan dengan gugus ester yang memiliki atom elektronegatif. Tetapan kopling proton alifatik ini sebesar 7,3 Hz, sesuai tetapan proton alifatik pada umumnya yang berkisar 6,5-7,5 Hz (Jenie et al. 2006). Geseran kimia proton-proton lainnya pada NSMOE hampir sama dengan nilai geseran kimia pada NSME karena perubahan struktur hanya terjadi pada gugus OH pada serin menjadi gugus ester.

Spektrum 13C-NMR dari senyawa NSMOE dapat memperkuat hasil spektrum 1H-NMR yang dapat memberi informasi geseran kimia atom-atom karbon pada senyawa NSMOE.Pembentukan senyawa NSMOE ditunjukkan oleh adanya rantai alifatik pada gugus ester yang merupakan hasil esterifikasi gugus OH pada NSME. Rantai alifatik ini ditunjukkan oleh geseran kimia untuk C2” pada δ = 34,23, C3” pada δ = 25,09, C4” pada δ = 29,18, C5” pada δ = 29,07, C6” pada δ = 31,80, C7” pada δ = 22,75 dan C8” pada δ = 14,226. Geseran kimia pada rantai alifatik C2” lebih bawah-medan karena pengaruh atom elektronegatif. Karbon pada gugus ester C1” muncul pada δ = 173,62. Geseran kimia karbon-karbon lain pada NSMOE mirip dengan geseran kimia karbon-karbon-karbon-karbon pada NSME. Pelarut CDCl3 ditunjukkan oleh geseran kimia atom karbon pada δ =

77,20. Geseran kimia 1H-NMR, dan 13C-NMR pada struktur NSMOE telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11,0.

Sintesis NOA

Sintesis NOA dilakukan dengan mereaksikan asam 2-hidroksinikotinat dengan oktilamina sebagai material awal dengan bantuan disikloheksilkarbodiimida (DCC) dan dimetil amino piridin (DMAP) sebagai katalis/aktivator dalam kloroform pada suhu 55°C selama 24 jam. Senyawa asam-2-hidroksinikotinat diaktivasi menggunakan DCC dan dibantu dengan katalis DMAP untuk mempermudah reaksi dengan oktil amin yang mengandung gugus amina sehingga membentuk gugus amida. Adapun perkiraan mekanisme reaksi sintesis NOA dapat dilihat pada Gambar 17.

N O O H C N N C₆H₁₁

C6H11

N O O C N NH

C6H11

C6H11

C₆H₁₁ N- _C H_N

O

C₆H₁₁

N N N OH DMAP DCC N O OH N N .. .. + -Asam-2-hidroksinikolinat + :N

C6H11 N C

H N O

C6H11

-H

H

Oktilamina

C6H11

H

N C HN C6H11

O DCU N OH N O_ H N N+ N N .. .. DMAP N O H N OH OH O OH C8H17

C8H17

2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA)

Gambar 17 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis NOA

NOA hasil sintesis berupa larutan tidak berwarna bercampur dengan kristal putih DCU. DCU merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC. DCU dipisahkan dengan penyaringan dan pemurnian secara kromatografi.

Filtrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporatorputar.

Analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk dilakukan menggunakan KLT dengan fase gerak diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Pada KLT terdeteksi 3 spot, yaitu spot senyawa awal asam hidroksinikotinat dengan Rf = 0,19, spot produk 2-hidroksinikotinil oktilamida yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,67, dan spot produk samping dengan Rf = 0,83. Spot produk reaksi yang dominan merupakan spot berwarna ungu dan memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dari spot standar asam 2-hidroksinikotinat. Hasil KLT NOA dapat dilihat pada Lampiran 1c.

Senyawa hasil samping dipisahkan dari NOA dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol secara bergradien. Fraksi-fraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,67 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih. Produk reaksi tersebut dapat dikatakan murni berdasarkan spot tunggal hasil KLT dan jarak titik leleh yang sempit, yaitu 98-99°C. Rendemen sintesis NOA adalah 76,1%.

LC-MS NOA (Lampiran 2c) menunjukkan 2 puncak dengan 1 puncak dominan yang muncul pada waktu retensi 2.16 menit (T2,1) dengan area 40093,1. Hal ini dibukt ikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 250,30 g/mol (M + H = 251,31 g/mol) yang merupakan bobot molekul NOA. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 1.15 (T1,1) dengan area 459,60 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa. Senyawa pengotor ini memiliki bobot molekul (m/z) 225,4 g/mol yang menunjukkan kemungkinan masih adanya sisa pengotor dari DCU (BM = 224).

Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis NOA menunjukkan pita serapan pada ν = 1680 cm-1

yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari amida (Pavia et al. 2001). Pita serapan pada ν = 3086 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur CH aromatik pada cincin nikotinat. Hasil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur CH alifatik pada ν = 2926-2852 cm-1

Geseran kimia 1H-NMR (Lampiran 4c) dan 13

N

O H N

1' 2' 3' 4' 5' 8'

6 ₂ 3 4 5 6' _7' OH 9'

C-NMR (Lampiran 5c) untuk senyawa NOA dapat dilihat pada Tabel 6 dengan panduan menggunakan Gambar 18.

Gambar 18 Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA) Tabel 6 Data geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1

H-NMR (500 MHz) dan 13 C-NMR (125 MHz) untuk senyawa NOA (CDCl3

C/H

)

Geseran Kimia (δ, J dalam Hz) 1H-NMR 13C-NMR 1’ 9,60 (d, 1H, J = 8) -

2’ 3,46 (q, 2H, J =7,4) 39,69 3’ 1,61 (dt, 2H, J = 7,4) 31,99

4’ 1,32 27,31 5’ 1,32 29,73 6’ 1,32 29,45 7 1,32 34,03 8’ 1,63 (m, 2H, J = 7,4) 22,82 9’ 0,88 (t, 3H, J = 7,4) 14,27 -CONH - 163,70 2 - 164,13 3 - 121,95 4 8,63 (dd, 1H, J = 2,5; 7,4) 137,44 5 6,55 (t, 1H, J = 7,3) 107,99 6 7,54 (dd, 1H, J = 2,4; 6,7) 163,70 2-OH 12,68 (s, 1H) -

Hasil amidasi senyawa asam 2-hidroksinikotinat dengan oktilamina menghasilkan senyawa NOA yang memiliki rantai gugus amida dengan panjang rantai alifatik sebanyak 8 karbon. Spektrum 1H-NMR menunjukkan terbentuknya rantai alifatik berdasarkan geseran kimia pada δ = 3,46 (q, 2H, J = 7,4 Hz) proton pada C2. Proton pada C2’ ini ditunjukkan oleh geseran kimia yang lebih bawah-medan dibandingkan proton pada karbon alifatik lainnya karena C2’ lebih dekat dengan gugus amida yang mengandung atom oksigen yang elektronegatif. Serapan proton pada C2’ berbentuk kuartet karena bertetangga dengan C3’ yang mengikat 2 buah proton, NH amida dan OH pada cincin nikotinil. Proton pada

C3’ ditunjukkan oleh geseran kimia pada 1,71 (dt, 2H, J = 7,4 Hz) berbentuk dobel triplet. Proton yang terikat pada karbon alifatik C4’, C5’, C6’, dan C7’ masing-masing ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 1,32 (m, 8H, J = 6,8 Hz). Spektrum untuk proton-proton ini berbentuk multiplet karena banyak terdapat proton yang terikat pada atom karbon tetangga. Nilai geseran kimia semakin turun untuk karbon alifatik yang semakin jauh dari gugus amida. Proton pada C8’ ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 1,63 (m, 2H, J = 7,4 Hz) berbentuk multiplet karena banyak terdapat proton yang terikat pada atom karbon tetangga, yaitu 2 proton pada C7’ dan 3 proton pada C9’. Geseran kimia untuk proton pada metil C9’ berada pada δ = 0,88 (t, 3H, J = 7,4 Hz) yang spektrumnya berbentuk triplet karena mengikat atom C8’ yang memiliki 2 buah proton. Tetapan kopling proton alifatik ini 6,8 dan 7,4 Hz, sesuai dengan tetapan proton alifatik pada umumnya yang berkisar pada 6,5-7,5 Hz (Jenie et al. 2006).

Proton pada gugus amida (-CONH) ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 9,60 (d, 1H, J = 8 Hz) yang berbentuk doblet karena berinteraksi dengan 1 proton pada metin C2’. Geseran kimia proton pada gugus amida ini lebih bawah-medan karena berdekatan dengan atom nitrogen dan oksigen yang memiliki keelektronegatifan tinggi. Proton yang terikat pada karbon dalam cincin nikotinil ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 8,63 (dd, 1H, J = 2,5; 7,4 Hz) untuk proton pada C4, δ = 6,55 (t, 1H, J = 7,3 Hz) untuk proton pada C5, dan δ = 7,54

(dd, 1H, J = 2,4; 6,7 Hz) untuk proton pada C6. Tetapan kopling untuk H-4 terhadap H-5 sebesar 7,4 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk H-4 terhadap H-6 sebesar 2,5 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi meta. Tetapan kopling untuk H-5 terhadap H-6 sebesar 7,3 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-5 dan H-6 terhadap H-4 sebesar 6,7 dan 2,4 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta, yaitu 6-9 Hz untuk posisi orto dan 1-3 Hz untuk posisi meta (Jenie et al. 2006). Proton pada gugus hidroksil yang terikat pada C2 memilki δ = 12,68 (s, 1H) yang memiliki serapan singlet karena terikat pada C2 yang tidak memiliki proton dan

lebih bawah-medan karena terjadi penbentukan ikatan hidrogen intramolekular dengan karbonil pada gugus amida.

Spektrum 13C-NMR senyawa NOA dapat memperkuat hasil spektrum 1 H-NMR yang dapat memberi informasi geseran kimia atom-atom karbon pada senyawa NOA. Pembentukan senyawa NOA ditunjukkan oleh adanya rantai alifatik pada gugus amida yang merupakan hasil esterifikasi gugus OH pada asam-2-hidroksinikotinat dan gugus NH2 pada oktilamina. Rantai alifatik ini

ditunjukkan oleh geseran kimia C2’ pada δ = 39,69, C3’ pada δ = 31,99, C4’ pada δ = 27,31, C5’ pada δ = 29,73, C6’ pada δ = 29,45, C7’ pada δ = 34,0, C8’ pada δ = 22,82, dan C9’ pada δ = 14,27. Geseran kimia pada rantai alifatik C2’ lebih bawah-medan karena bertetangga dengan gugus amida.

Gugus 2-hidroksinikotinil amida dapat ditunjukkan oleh geseran kimia untuk karbon pada amida (-CONH) pada δ = 163,70. Cincin nikotinil ditunjukkan oleh geseran kimia C2-C6. C2 yang mengikat gugus hidroksil muncul lebih bawah-medan pada δ = 164,13 karena mengikat atom oksigen yang lebih elektronegatif. C3 dan C4 muncul pada δ = 121,95 dan δ = 137,44. C5 dan C6 masing-masing ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 107,99 dan δ = 145,29 yang bawah-medan karena berikatan nitrogen dalam cincin. Geseran kimia 1 H-NMR, dan 13C-NMR pada struktur NOA telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11.0.

Berdasarkan hasil analisis menggunakan KLT, FT-IR, LC-MS, 1H-NMR, dan 13C-NMR dibuktikan bahwa senyawa NSMOE dan NOA telah berhasil disintesis. Senyawa NSMOE dan NOA memiliki kemurnian yang cukup tinggi dan selanjutnya dilakukan uji pendahuluan untuk mengetahui efek toksisitas melalui metode uji larva udang dan uji aktivitas senyawa produk sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388. Perubahan cincin pikolinil menjadi nikotinil sehingga terjadi perubahan posisi gugus aktif hidroksil diharapkan berpengaruh pada aktivitas senyawa dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388.

Letalitas Larva Udang

Uji toksisitas dengan metode BSLT bertujuan memantau sifat sitotoksik senyawa hasil sintesis karena adanya korelasi positif antara nilai toksisitas dengan efek sitotoksik pada kultur sel kanker. Metode ini merupakan uji pendahuluan untuk mendapatkan senyawa bersifat antikanker. Dari hasil uji diketahui bahwa NOA mempunyai nilai toksisitas 116,9 ppm (Lampiran 6). Menurut Meyer (1982), suatu senyawa mempunyai efek toksisitas yang signifikan (tinggi) jika mempunyai nilai LC50 ≤ 50 ppm. NSMOE mempunyai kelarutan yang rendah dalam air laut dan penambahan DMSO pada pengujian tidak cukup melarutkan senyawa tersebut, sehingga diperlukan emulsifier yang lebih baik atau jumlah DMSO yang lebih banyak namun harus dikontrol menggunakan kontrol positif tanpa penambahan NSMOE.

Sitotoksisitas (IC50) NSMOE DAN NOA

Hasil uji sitotoksisitas NSMOE dan NOA terhadap sel kanker leukemia murin dan payudara T47D dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7 Hasil uji sitotoksisitas (IC50

Senyawa

) senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D

Log P ∆G⁰bind IC

(kkal/mol)

50 (µg/mL)

P388 T47D

PSMOE NSMOE POA NOA Artonin E Cis platin

UK-3A (Ueki et al. 1997)

1,56 1,49 0,82 2,50 1,61 -11,93 -11,45 -10,16 -10,46 -10,26 -11,65 15,4 10,0 13,2 32,0 0,06 12,0 38,0 3,19 4,67 1,09

Senyawa artonin E sebagai kontrol positif memperlihatkan aktivitas yang tinggi (IC50 0,06 µg/mL) dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia

murin P-388 jika dibandingkan dengan senyawa semua analog UK-3A. Senyawa NSMOE memiliki aktivitas yang lebih baik dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 jika dibandingkan dengan senyawa PSMOE dan senyawa analog UK-3A. Senyawa NOA memiliki aktivitas yang lebih rendah jika

dibandingkan dengan senyawa POA dan memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan senyawa UK-3A. Pergantian subtituen pikolinil dengan nikotinil tidak berbanding lurus dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388, ada pengaruh nilai log P dan e-docking pada perubahan struktur tersebut. Nilai log P NOA meningkat pada pergantian subtituen pikolinil menjadi nikotinil dari nilai log P 0,86 menjadi 2,50 sehingga mempengaruhi kemampuan senyawa dalam melewati membran sel dalam mencapai sel target. Senyawa obat yang mendekati nilai log P optimum yang dapat memberikan aktivitas yang lebih baik (Thomas 2003). Nilai log P dan e-docking NSMOE tidak berbeda jauh dengan PSMOE, yaitu 1,49; -11,45 kkal/mol dan 1,56; -11,93 kkal/mol tetapi aktivitas NSMOE dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Leukemia murin P-388 lebih baik daripada PSMOE, yaitu dengan nilai IC50 = 10,0 µg/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa nilai log

P NSMOE mendekati nilai log P optimum. Nilai e-docking menggambarkan nilai kesesuaian struktur suatu senyawa yang dapat berikatan dengan reseptor di sel target. Semakin rendah nilai ∆G⁰bind semakin tinggi tingkat kesesuaian antara ligan dengan reseptor (Thomas 2003, Patrick 2005). Hal tersebut sejalan pada hasil penelitian ini, yaitu nilai e-docking (∆G⁰bind) NSMOE lebih rendah daripada

nilai (∆G⁰bind) NOA.

Hasil uji aktivitas NSMOE dan NOA dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D memberikan hasil yang lebih baik daripada sel kanker leukemia murin P-388. Hal tersebut dtunjukkan dengan rendahnya nilai IC50

NSMOE dan NOA, yaitu 3,19 dan 4,67 µg/mL. Akan tetapi, aktivitas NSMOE dan NOA dalam menghambat pertumbuhan sel kanker ini masih lebih rendah dibandingkan senyawa cis-platin sebagai kontrol positif dengan nilai IC50 = 1,09 µg/mL. Aktivitas antikanker NSMOE memberikan hasil yang lebih baik daripada NOA. Hal tersebut sejalan nilai e-docking NSMOE (∆G⁰bind = -11,45) yang lebih

rendah dibandingkan NOA (∆G⁰bind = -10,46), yaitu semakin rendah nilai ∆G⁰bind

Hasil aktivitas NSMOE dan NOA dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D yang lebih baik daripada aktivitasnya pada sel kanker semakin tinggi pula tingkat kesesuaian antara ligan dengan reseptor (protein Bcl-xL).

leukemia murin P-388 disebabkan adanya pengaruh protein Bcl-xL yang digunakan docking karena protein Bcl-xL merupakan protein antiapoptosis spesifik pada sel kanker payudara (Espana et al. 2005).

KESIMPULAN DAN SARAN

Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) menghasilkan rendemen keseluruhan masih < 70%, yaitu 65,4% sedangkan 2-hidroksinikotinil oktilamida (NOA) menghasilkan rendemen yang cukup baik > 70%, yaitu 76,1%.

Uji aktivitas senyawa hasil sintesis dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P388 menghasilkan IC50 untuk senyawa NSMOE dan

NOA masing-masing sebesar 10,0 dan 32,0 µg/mL. Uji penghambatan pertumbuhan sel kanker payudara T47D menghasilkan IC50 untuk senyawa

NSMOE dan NOA masing-masing 3,19 µg/mL dan 4,67 µg/mL. Nilai IC50 ini

menunjukkan bahwa aktivitas kedua senyawa berbeda, senyawa NSMOE menghasilkan aktivitas yang lebih aktif dan selektif dibandingkan senyawa NOA dan senyawa induk UK 3A dan senyawa NSMOE berpotensi sebagai antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D.

Perlu dilakukan penelitian dengan meragamkan panjang rantai samping struktur pada senyawa NSMOE dan juga dilakukan uji aktivitas antikanker terhadap jenis sel kanker yang lain untuk memenuhi persyaratan senyawa-senyawa ini sebagai antikanker.

58

1. Kurva regresi sitotoksisitas Cisplatin

2. Kurva regresi sitotoksisitas NSMOE

59

IC50 Cisplatin

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00

-2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50

Log. Konsentrasi (ug/uL) % Viabilitas

60

IC50 NOA

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00

-2.0000 -1.5000 -1.0000 -0.5000 0.0000 0.5000 1.0000 1.5000

Log. Konsentrasi (ug/uL) % Viabilitas

NOA Regresi

IC50 NSMOEl

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00

-2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50

Log. Konsentrasi (ug/uL) % Viabilitas

viii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Tesis ini berjudul “Potensi senyawa 2-hidroksinikotinil serin meti oktanoil ester dan 2-hidroksinikotinil oktilamida sebagai antikanker” sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan berlangsung selama 10 bulan, mulai bulan Maret 2009 sampai Februari 2010 bertempat di Pusat Penelitian Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dan Jurusan Kimia FMIPA Institut Teknologi Bandung.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Suminar S Achmadi dan Dr. Muhammad Hanafi atas semua bimbingan, saran, dan arahannya. Ucapan terima kasih kepada Laboratorium Kimia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu dan Teknologi (Puspiptek) yang telah mensponsori penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami tercinta, kedua orang tua serta seluruh keluarga, atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya.

Semoga tesis ini bermanfaat.

Bogor, 2 Juni 2010 Hariyanti

ix

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 11 September 1977 dari ayah Ahmad Sa’ari dan ibu Murtasiah. Penulis merupakan putri keenam dari tujuh bersaudara.

Tahun 1995 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Serang dan pada tahun yang sama lulus seleksi sebagai mahasiswa Universitas Indonesia melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih Program Sarjana Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Farmasi. Penulis lulus pendidikan sarjana pada tahun 2000 dan lulus Pendidikan Profesi Apoteker pada tahun 2001. Pada tahun yang sama penulis diterima bekerja sebagai staf pengajar di Jurusan Farmasi Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka. Pada tahun 2002 penulis menikah dengan Nurman Irawan, S.E., Ak. dan telah dikaruniai satu orang putri bernama Rizki Qanita Irawan, dan satu orang putra bernama Ahmad Fadhillah Yasin Irawan.

Tahun 2007 penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.