Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Perbandingan antara Metode

SYBR

Green

dan Metode

Hydrolysis

Probe

dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan

DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan

Real

Time

PCR

SKRIPSI

AFIFAH NURUL IZZAH NIM : 1110102000014

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2014

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Perbandingan antara Metode

SYBR

Green

dan Metode

Hydrolysis

Probe

dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan

DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan

Real

Time

Polymerase Chain Reaction (PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AFIFAH NURUL IZZAH NIM : 1110102000014

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2014

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Afifah Nurul Izzah NIM : 1110102000014 Tanda Tangan :

Tanggal : 9 Oktober 2014

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Afifah Nurul Izzah NIM : 1110102000014 Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

HydrolysisProbe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

Disetujui Oleh:

Pembimbing 1 Pembimbing 2

Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt NIP: 19750104200912201

Zilhadia, M.Si., Apt NIP: 197308222008012007

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh

Nama : Afifah Nurul Izzah NIM : 1110102000014 Program Studi : Farmasi

Judul : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt ( ) Pembimbing II : Zilhadia, M.Si., Apt ( ) Penguji I : Yuni Anggraeni, M.Farm., Apt ( ) Penguji II : Lina Elfita, M.Si., Apt ( )

Ditetapkan di : Ciputat

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRAK

Nama : Afifah Nurul Izzah Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pemanfaatan gelatin secara luas menimbulkan kontroversi dan kekhawatiran bagi masyarakat muslim karena pada umumnya gelatin terbuat dari kulit babi dan sapi. Salah satu teknik analisis yang dapat membedakan gelatin sapi dan gelatin babi adalah Real Time PCR. Real Time PCR merupakan metode analisis berbasis DNA yang handal, efektif, dan terpecaya. Dalam analisa kualitatif dan kuantitatif, Real Time PCR membutuhkan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang umum digunakan pada Real Time PCR, yaitu SYBR Green dan Hydrolysis Probe. Telah dilakukan perbandingan antara metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin menggunakan Real Time PCR. DNA pada gelatin diekstraksi dan diisolasi menggunakan kit komersial. Isolat DNA gelatin sapi dan DNA gelatin

babi didapatkan sebanyak 19,38 ng/μl dan 13,63 ng/μl dengan kemurnian 1,566 dan

1,573. Isolat DNA dilakukan analisis dengan metode SYBR Green menggunakan suhu annealing 65oC untuk primer sapi dan suhu annealing 60oC untuk primer babi. Isolat DNA dianalisis dengan metode Hydrolysis Probe menggunakan suhu

annealing 60oC untuk primer babi dan primer sapi. Hasil analisis dari kedua metode menunjukkan bahwa metode Hydrolysis Probe mampu mengidentifikasi DNA pada gelatin secara spesifik dibandingkan menggunakan metode SYBR Green.

Kata Kunci: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, SYBR Green, Hydrolysis Probe

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRACT

Name : Afifah Nurul Izzah Major : Pharmacy

Title : Comparison of SYBR Green and Hydrolysis Probe methods in Analysis of Porcine Gelatin DNA and Bovine Gelatin DNA Using Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

The wide usage of gelatin in various products led to continous controvercy among Muslim consumers because most of them are derived from porcine and bovine skin. One of the analytical techniques that can differentiate bovine gelatin and porcine gelatin is Real Time PCR. Real Time PCR is a DNA-based technology analysis which is a robust, effective, and reliable. In qualitative and quantitative analysis, there are two kinds methods popular of floresence dye. They are SYBR Greenand Hydrolysis Probe. In this study, we have perfomed a comparison between SYBR Green method and Hydrolysis Probe method in analysis Porcine gelatin DNA and Bovine gelatin DNA using Real Time PCR. The DNA is extracted and isolated by commercial kit. Porcine gelatine DNA and Bovine gelatin DNA obtained were 19.38 ng/μl and 13.63 ng/μl with purity were 1,566 and 1,573. Then, DNA isolates were analyzed by SYBR Green methods, with annealing temperature was 65oC using bovine primer and 60oC using porcine primer. While DNA is analyzed by Hydrolysis Probe methods, with annealing temperature was 60o_{C using both}

porcine primer annd bovine primer. The result showed that Hydrolysis Probe is able to identify DNA of porcine and bovine gelatin with high specificity than SYBR Green.

Keyword: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, SYBR Green, Hydrolysis Probe.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta KATAPENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa mencurahkan segala rahmat-Nya kepada kita semua, khususnya penulis dalam menyelesaikan

skripsi yang berjudul “Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

HydrolysisProbe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time PCR”. Shalawat dan salam senantiasa terlimpah kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW, teladan bagi umat manusia dalam menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Selesainya penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, maka dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang tulus dan sebesar-besarnya, khususnya kepada:

1. Bapak Prof. Dr. (hc). Dr. MK.Tadjudin, Sp. And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sangat baik telah memberikan ilmu, nasehat, waktu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi.

3. Bapak Drs.Umar Mansur, M.Sc., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua, ayahanda tersayang Ali Mugiono dan ibunda tercinta Fahrida yang selalu ikhlas memberikan dukungan moral, material, nasehat-nasehat, serta lantunan doa yang tiada pernah putus di setiap hembusan nafas beliau hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Juga kepada kakakku tersayang Aini Zahra dan adikku tercinta Abdurrahman Marahimin yang selalu memberikan dukungan dan semangat

5. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh pendidikan di farmasi, FKIK UIN Jakarta

6. Teman-teman Andalusia yang telah menjadi kepingan memori yang berharga. Kebersamaan kita di dalam suka dan duka akan selalu terkenang didalam hati

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7. Kak Rahmadi, Kak Liken, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak Lilis, dan Kak Ai yang sangat banyak membantu penulis melakukan penelitian di laboratorium.

8. Teman-teman seperjuangan tim PCR: Yanti dan Kak Sulaiman yang selalu meluangkan waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan, membantu penulis dalam melakukan peneltian, serta memberikan dukungan doa dan semangat kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini. Terimakasih atas kebersamaan yang indah ini.

9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, dan Mbak Helen yang telah memberikan masukan dan bantuan selama penulis melakukan penelitian. 10.Sahabat tersayang “ngocol”: Dias, Zakiya, Ipho, Vicka, Diah, Amel, Dita, dan

Desi yang senantiasa mewarnai kehidupan selama dikampus. Terima kasih atas dukungan, kasih sayang, perhatian, doa dan persahabatan yang indah ini. 11. Farida, Yusna, Fahrur, Yuni, Deisy, Desti, Hanny, Liana, Delvina, Mayta,

Athiyah, Fathia, Dwikky, Hadi, Fikry, yang menginspirasi. Terimakasih atas dukungan dan semangatnya.

12. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan penulis nantikan. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, 14 Oktober 2014

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Afifah Nurul Izzah NIM : 1110102000014 Program Studi : Strata-1 Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan

Menggunakan Real Time PCR

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : Oktober 2014

Yang menyatakan,

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTARISI

HALAMAN JUDUL... i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS... ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING... iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI... iv

ABSTRAK... v

ABSTRACT... vi

KATA PENGANTAR... vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... ix

DAFTAR ISI... x

DAFTAR GAMBAR... xii

DAFTAR TABEL... xiii

DAFTAR LAMPIRAN... xiv

DAFTAR SINGKATAN... xv

DAFTAR ISTILAH... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN... 1

1.1 Latar Belakang... 1

1.2 Rumusan Masalah... 3

1.4 Tujuan Penelitian... 3

1.5 Manfaat Penelitian... 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA... 4

2.1 Gelatin... 4

2.1.1 Sifat Fisika Kimia Gelatin... 5

2.1.2 Struktur Kimia Gelatin... 7

2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan gelatin... 7

2.2 Asam Nukleat... 8

2.2.1 DNA... 9

2.2.3.1 Struktur DNA... 9

2.2.3.2 Sifat Fisika DNA... 11

2.2.2 DNA Mitokondria... 12

2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA... 14

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa... 16

2.5 PCR... 18

2.5.1 Pengertian PCR... 18

2.5.2 Tahapan PCR... 19

2.5.3 Komponen PCR... 22

2.6 Real-Time PCR... 22

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 Metodologi Penelitian... 26

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian... 26

3.1.1 Tempat... 26

3.1.2 Waktu... 26

3.2 Alat dan Bahan... 26

3.2.1 Alat... 26

3.2.2 Bahan... 26

3.3 Prosedur Penelitian... 27

3.3.1 Ekstraksi dan Isolasi DNA... 27

3.3.2 Analisis Isolat DNA... 29

3.3.2.1 Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa... 29

3.3.2.2 Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV... 30

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI... 31

3.3.4. Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR... 31

3.3.5.1 Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green... 31

3.3.5.2 Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe... 34

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN... 36

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA... 36

4.1.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa... 36

4.1.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV... 37

4.2. Hasil Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI... 38

4.3 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)... 40

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR dengan Metode SYBR Green... 40

4.3.2 Hasil Ampifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe... 46

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN... 50

5.1 Kesimpulan... 50

5.2 Saran... 50

DAFTAR PUSTAKA... 51

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Metode Ekstraksi Gelatin dari Jaringan yang Mengandung

Kolagen... 5

Gambar 2.2 Struktur dan Asam Amino Penyusun Kolagen dan Gelatin... 6

Gambar 2.3 Komponen Asam Amino Penyusun... 7

Gambar 2.4 Struktur Nukleotida... 9

Gambar 2.5 Ikatan Fosfodiester pada DNA dan RNA... 10

Gambar 2.6 Struktur DNA... 11

Gambar 2.7 Struktur Mitokondria... 12

Gambar 2.8 Struktur DNA Mitokondria... 13

Gambar 2.9 Presipitasi DNA Setelah Penambahan Etanol Absolut... 15

Gambar 2.10 Interkalasi Etidium Bromida pada DNA... 18

Gambar 2.11 Tahapan Proses PCR... 19

Gambar 2.12 Pelipatgandaan Molekul DNA Target... 21

Gambar 2.13 Bentuk Kurva Real-TimePCR... 23

Gambar 2.14 Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green... 25

Gambar 4.1 Hasil Elektroforesis Isolat DNA... 37

Gambar 4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer Babi pada Database NCBI... 39

Gambar 4.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi pada Database NCBI... 39

Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi... 41

Gambar 4.5 Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi... 42

Gambar 4.6 Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi... 44

Gambar 4.7 Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi... 45

Gambar 4.8 Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe Menggunakan Primer-Probe Sapi... 47

Gambar 4.9 Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe Menggunakan Primer-Probe Babi... 48

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL

Tabel 1 Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa... 17

Tabel 2 Urutan Basa Primer-Probe... 27

Tabel 3 Pengaturan Program Amplifikasi dengan Metode SYBR Green... 32

Tabel 4 Pengaturan Program Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe.. 34

Tabel 5 Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi... 38

Tabel 6 Campuran Reaksi SYBR Green Mastermix... 60

Tabel 7 Campuran Reaksi Hydrolysis Probe Mastermix... 60

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Kerangka Penelitian... 57

Lampiran 2 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe... 58

Lampiran 3 Perhitungan Tm (MeltingTemperature) Primer... 60

Lampiran 4 Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA... 61

Lampiran 5 Hasil Optimasi Suhu Annealing dengan Metode Gradien PCR. 62 Lampiran 6 Spesifikasi Kit Ekstraksi dan Isolasi DNA... 63

Lampiran 7 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu Annealing 60oC... 64

Lampiran 8 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu Annealing 62oC... 65

Lampiran 9 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu Annealing 64oC... 66

Lampiran 10 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu Annealing 65o_{C... 67}

Lampiran 11 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi dengan Waktu Annealing 10 detik dan Waktu Extension 7 detik... 68

Lampiran 12 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi dengan Waktu Annealing 20 detik dan Waktu Extension 30 detik... 69

Lampiran 13 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi dengan Waktu Annealing 20 detik dan Waktu Extension 25 detik... 70

Lampiran 14 Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe Menggunakan Primer Sapi... 71

Lampiran 15 Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe Menggunakan Primer Babi... 71

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

CP : Crossing Point cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FAM : Fluorescein Amidite

FTIR : Forier Transform Infrared Spectroscopy

LCMS : Liquid ChromatographyMass-Spectrophotometry

mtDNA : mitochondria DNA

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

pb : Pasang Basa

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma RNA : Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

TAE : Tris-Acetate-EDTA Tm : Temperature Melting

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran sekuen query (DNA atau protein) dengan sekuen DNA atau protein pada database

NCBI.

Blastn : Nucleotide Basic Local Aligment Search Tool merupakan salah satu variasi dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran nukleotida query dengan nukleotida pada

database di NCBI.

CP : Crossing Point merupakan siklus yang menunjukkan sinyal fluoresensi dari akumulasi amplikon telah melewati garis

threshold.

Garis Treshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal fluoresensi berada pada tingkat terendah ( siklus 3-15). Formasi Hairpin : Terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer yang

disebabkan oleh interaksi intramolekular yang dapat memicu terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik.

Melting curve : Analisis data pada Real-time PCR digunakan untuk menguji spesifisitas amplikon yanng terbentuk.

Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik.

NCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan suatu institusi milik United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekular. Situs NCBI berisi

database meliputi gene bank mengenai sekuens DNA atau protein serta memuat publikasi ilmiah.

NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif karena well tidak dimasukkan DNA.

Primer-Dimer : Berikatannya suatu primer dengan primer sejenis atau dengan primer lainnya sehingga membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik.

Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya.

Tm : Temperature melting atau suhu melting adalah suhu saat 50% bagian DNA telah terbuka menjadi untai tunggal.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Gelatin adalah polipeptida larut air yang merupakan hasil hidrolisis parsial kolagen dari kulit, tulang dan tulang rawan hewan (Zhang et al., 2008). Gelatin memiliki sifat yang unik dan berbagai fungsi yaitu sebagai zat pembentuk gel, zat pengental, zat pembentuk film, zat pengemulsi, dan zat pensuspensi (Rowe, Sheskey & Quinn, 2009). Oleh karena itu gelatin digunakan secara luas dalam berbagai sektor industri, misalnya sektor industri farmasi, makanan, fotografi, kosmetik, dan produk kedokteran. Dalam industri makanan, gelatin dapat ditemukan dalam produk ice cream, jelly, dan marshmallow. Pada industri farmasi, gelatin digunakan dalam tablet, cangkang kapsul keras dan lunak, tablet salut gula, enkapsulasi vitamin, dan pensubtitusi plasma darah (Nhari, Ismail & Che Man, 2012).

Sumber gelatin yang beredar di pasaran berasal dari babi, sapi, tulang ikan, kerang, rumput laut, dan lain-lain (Hinterwaldner, 1997; R.T. Jones, 2004). Produksi gelatin di dunia pada tahun 2007 dilaporkan bahwa 46% berasal dari kulit babi; 29,4% dari kulit sapi; 23,1% dari campuran tulang babi dan sapi; dan 1,5% dari tulang ikan, kerang, dan lain-lain (Guillen et al.,

2009). Pembuatan gelatin yang bersumber dari babi dan sapi lebih banyak diminati karena gelatin yang dihasilkan memberikan kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan (Hinterwaldner, 1997).

Gelatin umumnya masih diimpor dari negara-negara nonmuslim sehingga menimbulkan kontroversi kehalalannya. Pemanfaatan gelatin dalam berbagai bidang industri dan peningkatan kesadaran masyarakat muslim terhadap penggunaan produk halal, menimbulkan konsekwensi perlunya perlindungan konsumen dengan pemberian jaminan kehalalan sumber gelatin (Jamaludin et al., 2012). Hal ini membutuhkan metode identifikasi gelatin sapi dan gelatin babi yang handal, tepercaya, efektif, dan efisien.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Keberadaan gelatin babi dan sapi pada produk pangan, kosmetik, dan obat-obatan sangat sukar untuk diidentifikasi karena memiliki sifat fisik dan kimia yang sangat mirip (Nemati et al., 2004). Oleh karena itu, perlu diupayakan metode yang akurat untuk identifikasi gelatin sapi dan gelatin babi. Metode identifikasi gelatin sapi dan gelatin babi telah banyak dilakukan dan dikembangkan. Di antaranya dengan teknik presipitasi kimia (Hikada dan Liu, 2003), FTIR (Hashim et al., 2010), LCMS (Zhang et al., 2008), ELISA (Venien dan Levieux, 2005), dan analisis berbasis DNA dengan Real Time PCR (Cai et al., 2011; Demirhan et al., 2011).

DNA merupakan molekul yang memiliki kestabilan tinggi, sehingga analisis berbasis DNA dengan Real Time PCR dapat dilakukan pada produk olahan. Selain itu, metode ini dapat mendeteksi campuran gelatin babi dan gelatin sapi dengan level kontaminasi 1% (Cai et al., 2011; Demirhan et al.,

2011). Dengan metode ini, kita dapat mengamati secara langsung hasil amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen. Metode ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sampel dengan mengukur peningkatan pewarna fluoresens yang berpendar ketika terikat dengan untai ganda DNA (Arya et al., 2005). Dengan demikian, analisis kehalalan gelatin dengan Real-Time PCR merupakan metode yang sederhana, handal dan terpercaya (Cai et al., 2011).

Dalam mendeteksi dan identifikasi DNA pada sampel, Real Time PCR

membutuhkan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang umum digunakan dalam Real-Time PCR adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe. Pewarna fluoresens SYBR Green akan berpendar ketika terinterkalasi dengan untai ganda DNA. Sedangkan fluoresens dari Hydrolysis Probe akan berpendar ketika Probe, yang merupakan dua pewarna fluoresens (terdiri atas

Reporter dan Quencher), secara fisik terpisah melalui hidrolisis oleh aktivitas nuclease (Arya et al., 2005). Dibandingkan Hydrolysis Probe, metode SYBR Green lebih ekonomis dan mudah dalam penanganan. SYBR Green tidak memerlukan Probe yang membutuhkan banyak biaya untuk mensintesisnya. Namun demikian, SYBR Green sangat tergantung dari spesifisitas primer karena dapat menyebabkan terjadinya mis-priming dan primer-dimer

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sehingga menyebabkan terbentuknya produk amplifikasi yang nonspesifik. Sedangkan Hydrolysis Probe lebih mampu mencegah terjadinya produk amplifikasi yang nonspesifik (Arya et al., 2005).

Pada penelitian ini akan dilakukan perbandingan antara metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan Real Time PCR.

1.2 RUMUSAN MASALAH

a. Belum diketahuinya efektivitas metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam menganalisis DNA gelatin sapi dan gelatin babi menggunakan Real Time PCR.

b. Belum diketahuinya apakah metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe secara spesifik dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi atau gelatin babi.

1.3 TUJUAN PENELITIAN

Mengetahui perbandingan hasil analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan metode SYBRGreen dan Hydrolisis Probe.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi, khususnya pada produk makanan, obat-obatan, ataupun kosmetik yang mengandung gelatin.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

Kata gelatin berawal dari bahasa latin “gelatus” yang berarti kaku

atau beku. Gelatin adalah polipeptida hasil hidrolisis parsial kolagen yang diperoleh dari jaringan ikat, kulit, atau tulang rawan sapi dan babi. Proses hidrolisis ini dapat dikatalisis dengan penambahan asam kuat atau basa kuat (Rabadiya, 2013). Ketika kolagen diperlakukan dengan asam atau basa dan diikuti dengan panas, struktur fibrosa kolagen dipecah ireversibel menghasilkan gelatin. Gelatin dihasilkan melalui cross-linking (ikatan silang) diantara rantai polipetida pada kolagen dengan disertai sejumlah perusakan pada rantai ikatan peptida (Zhou dan Regenstein, 2004). Selain berasal dari hewan mamalia, gelatin juga dapat diperoleh dari limbah tulang ikan. Pembuatan gelatin merupakan upaya untuk mendayagunakan limbah tulang yang biasanya tidak terpakai dan dibuang dirumah pemotongan hewan (Balti

et al., 2010).

Berdasarkan proses pembuatannya, gelatin dapat dikategorikan dalam dua prinsip dasar (Jannah, 2008), yaitu:

a. Gelatin Tipe A (Acid)

Gelatin ini dihasilkan dengan proses asam dari bahan baku kolagen. Tipe A umumnya diperoleh dari kulit babi, tetapi ada juga beberapa pabrik yang menggunakan bahan dasar tulang babi. Kulit dari babi muda tidak memerlukan penanganan alkalis yang intensif, karena jaringan ikatnya tidak terlalu kuat. Oleh karena itu, pada proses ini kulit muda cukup direndam dengan asam klorida (HCl) encer selama beberapa hari, kemudian dinetralkan dan dicuci beberapa kali dengan aquadest agar garam yang terbentuk hilang.

b. Gelatin Tipe B (Base)

Gelatin tipe tipe ini dihasilkan melalui proses basa atau alkali. Bahan dasar biasanya berasal dari kulit tua atau keras maupun tulang

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ruminasia. Proses pembuatannya yaitu bahan mula-mula direndam dalam larutan kalsium hidroksida, sehingga ikatan jaringan kolagen akan mengembang dan terurai. Kemudian bahan dinetralkan dengan asam dan dicuci dengan aquadest untuk menghilangkan garam yang terbentuk.

Gambar 2.1 Metode ekstrasi gelatin dari jaringan yang mengandung kolagen (Sumber: Ikada, 2002)

2.1.1 Sifat Fisika Kimia Gelatin

Fraksi protein pada gelatin hampir seluruhnya terdiri atas berbagai macam asam amino yang bergabung melalui ikatan amida dan membentuk polimer yang linear. Gelatin memiliki berat molekul yang bervariasi yaitu 20 kDa sampai 200 kDa. Kadar protein pada gelatin tinggi yaitu pada gelatin kering (dengan kadar air 8 – 12%) mengandung protein sekitar 84 - 86% (Carr et al.,1995).

Gelatin komersial secara luas diproduksi di berbagai belahan dunia. Di eropa, gelatin untuk pangan tersedia dalam bentuk lembaran tipis (flake), sedangkan di Amerika Serikat gelatin dapat diperoleh dalam bentuk granul atau serbuk. Gelatin tidak memiliki rasa dan bau. Warna serbuk granul dan

flakes pada gelatin yaitu putih agak kuning pucat. Pada bentuk lembaran, gelatin berwarna kuning pucat transparan (Rowe, Sheskey & Quinn, 2009).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gelatin praktis tidak larut dalam pelarut organik seperti aseton, kloroform, etanol (95%), eter dan metanol. Zat ini larut dalam gliserin, larutan asam dan basa. Namun pada larutan asam kuat atau basa kuat, gelatin akan mengalami presipitasi. Gelatin larut dalam air hangat dan apabila didinginkan dibawah suhu 30oC, larutan koloid ini akan membetuk gel dengan sifat tiksotropik dan reversibel menjadi cair kembali apabila dipanaskan. pH larutan atau gel gelatin akan berbeda tergantung tipenya yaitu tipe A pH 3,8 – 5,5; sedangkan tipe B pH 5,0 – 7,5.

Gambar 2.2. Struktur dan Asam Amino Penyusun Kolagen dan Gelatin (Sumber: http://www.gelatin.in)

Bloom (kekuatan gel)tergantung pada konsentrasi gelatin di dalam air, berat molekul gelatin, dan pH gel. Bloom akan meningkat apabila konsentrasi gelatin tinggi, berat molekul gelatin tinggi, dan pH gel yang mendekati netral. Gelatin memiliki kekuatan Bloom yang bervariasi, yaitu 50 hingga 300. Industri gelatin umumnya mencampur bahan baku untuk mendapatkan kekuatan gelyang diinginkan (Rabadiya, 2013).

2.1.2 Struktur Kimia Gelatin

Struktur gelatin terdiri dari 300 sampai 4.000 rantai asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Gelatin mengandung sejumlah 18 asam

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta amino spesifik yang berbeda dan bekerja sama berurutan untuk membentuk rantai polipeptida dengan 1000 asam amino setiap rantai. Sebanyak 3 rantai polipeptida terbentuk bekerja sama sebagai spiral sisi kiri untuk memberi struktur sekunder. Dalam struktur tersier, spiral menggulung dan melipat sendiri pada sisi kanan (triplehelix). Ini membentuk molekul berbentuk tangkai yang disebut protofibril.

Rantai asam amino dominan yang terdapat dalam gelatin adalah glysin (26-34%), prolin (10-18%) dan hidroksiprolin (7-15%). Jenis asam amino lain terdapat dalam gelatin, yaitu alanin (8-11%), arginin (8-9%), asam aspartat (6-7%), dan asam glutamat (10-12%). Meskipun demikian, gelatin bukan merupakan protein yang lengkap. Hal ini karena gelatin tidak mengandung asam amino triptofan dan hanya sedikit mengandung asam amino isoleusin, treonin, metionin, sistein, dan sistin (Rabadiya, 2013).

Gambar 2.3. Komponen Asam Amino Penyusun Gelatin (Sumber: http://www.pbgelatins.com)

2.1.3 Aplikasi dan pemanfaatan gelatin

Gelatin merupakan bahan pangan yang telah lama digunakan secara luas pada produk pangan dan farmasi. Gelatin tidak memiliki rasa dan bau, akan tetapi gelatin memiliki sifat gel yang unik, sehingga dapat digunakan sebagai penstabil, pengikat, dan pengemulsi dalam industri farmasi. Sebagai bahan pangan, gelatin memiliki sifat yang unik sebagai

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta penstabil busa, yaitu dibutuhkan pada saat pembuatan permen. Bahan pangan yang menggunakan gelatin antara lain cokelat, susu, permen, jelly, roti, marshmallow, pada produk daging sebagai pengikat air, dan lain-lain. Sedangkan penggunaan gelatin pada industri farmasi dan kedokteran meliputi cangkang kapsul, salut tablet, zat pengemulsi dan penstabil dalam pembuatan krim, mikroenkapsulasi, dan plasma pensubtitusi darah. Tidak hanya pada industri pangan dan farmasi, gelatin juga dapat bermanfaat pada bidang fotografi yaitu sebagai pelapis zat warna film.

Dari data SKW biosystem, penggunaan gelatin dalam industri nonpangan sejumlah 100.000 ton, pada industri pembuatan film foto sebanyak 27.000 ton, untuk kapsul lunak sebanyak 22.600 ton, untuk produksi cangkang capsul keras sebanyak 20.200 ton, serta dalam dunia farmasi dan teknis sebanyak 12.000 ton dan 6.000 ton. Penggunaan gelatin dalam industri pangan adalah sebesar 154.000 ton, dimana penggunaan terbesar adalah industri konfeksioneri yaitu sebesar 68.000 ton, dan produk jelli sebanyak 36.000 ton. Pada industri daging dan susu memiliki jumlah penggunaan gelatin yang sama yaitu 16.000 ton dan pada makanan fungsional (food supplement) memeliki kontribusi penggunaan gelatin yang sama yaitu sebesar 4.000 ton (LPPOM MUI, 2008).

2.2. Asam Nukleat

Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetik dalam sel (Koolman & Roehm, 2005). Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya (Gaffar, 2007). DNA ditemukan di dalam nukleus pada sel eukariotik, dan ditemukan di sitoplasma atau nukleoid pada sel prokariotik. Molekul RNA disintesis dari DNA template dan berperan dalam pembentukan protein didalam sitoplasma (Stansfield et al., 2003).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.2.1 DNA

2.2.1.1 Struktur DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit nukleotida. Nukleotida merupakan ester dari asam fosfat dan nukleosida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen heterosiklik, dan gugus fosfat yang bermuatan negatif (Gaffar, 2007).

Gambar 2.4. Struktur Nukleotida (Sumber: Gaffar, 2007)

Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, dan urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon

3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’

molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan membentuk

polinukleotida melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil. Sehingga tulang punggung molekul DNA dan RNA

terdiri dari gugus fosfat dan pentosa secara bergantian (Stansfield et al., 2003).

Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara keduanya terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernya serta jumlah untai penyusunnya. DNA tidak terdapat gugus hidroksil pada

posisi karbon 2’ dari molekul gula (2-deoksiribosa) sementara pada RNA molekul gulanya adalah ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada RNA jenis

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakan polinukleotida yang membentuk satu rantai/untai sedangkan DNA merupakan polinukleotida yang membentuk 2 untai (heliks ganda) yang memutar ke kanan. Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang sama dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-basanya (Gaffar, 2007).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada DNA, basa guanin berpasangan dengan basa sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenin berpasangan dengan basa tymin membentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A sama dengan jumlah basa T. Kemudian jumlah basa purin akan sama dengan jumlah basa pirimidin (Purves et al., 2004).

Gambar 2.6. Struktur DNA (Sumber: Purves et al., 2004)

Untai ganda DNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya dengan arah antiparalel (berlawanan 5’→ 3’ dan 3’→5’),

ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan

pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut

ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk

struktur heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang punggung (backbone) molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang melekat pada molekul gula (Gaffar, 2007). Struktur helix ganda membentuk pilinan berjarak 3.4 nm dengan sepuluh pasang basa setiap pilinan dan memiliki lebar sekitar 2 nm (Stansfield, 2003).

2.2.1.2 Sifat Fisika DNA

Untai heliks DNA dapat memisah menjadi struktur untai tunggal dengan adanya pemanasan dengan suhu tinggi (> 90o_{C), peristiwa ini}

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sering dikenal dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible. Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi disebut renaturasi. Proses renaturasi dapat berjalan jika suhu mendekati suhu subdenaturasi (mendekati 60oC). DNA menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm (Yuwono, 2009).

2.2.2 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil energi dalam bentuk ATP yang akan dipergunakan untuk aktivitas seluruh sel-sel tubuh manusia. Mitokondria memiliki diameter sebesar 1-2 μm (Passarge, 2007). Sel eukariotik rata-rata terdiri dari 103-104 salinan mitokondria yaitu mencapai 25% volume sel. Mitokondria dikelilingi oleh dua membran yaitu membran dalam dan membran luar. Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebut kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase. Membran dalam juga memiliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks. Matriks ini mengandung DNA, RNA, ribosom, dan berbagai enzim yang berperan dalam oksidasi zat-zat makanan. DNA yang terdapat pada mitokondria disebut DNA mitokondria atau disingkat menjadi mtDNA (Koolman dan Roehm, 2005).

Gambar 2.7. Sruktur Mitokondria (Koolman dan Roehm, 2005).

Umumnya, mitokondria terdiri dari 2-10 molekul DNA. mtDNA merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler dengan ukuran genom mitokondria hewan berkisar 14000-39000 pasang basa. Ukuran

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mtDNA relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran DNA inti. DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; dan 22 gen pengkode tRNA (Sharma et al., 2005).

Gambar 2.8. Struktur DNA Mitokondria (www.bmb.leeds.ac.uk)

Karakteristik mtDNA dapat dijadikan alat yang signifikan untuk keperluan analisis. mtDNA mempunyai jumlah copy yang tinggi, meskipun di dalam sel yang tidak mengandung inti. Jumlah copy per sel yaitu sekitar 1000-10000 sehingga mtDNA dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah DNA yang sangat terbatas, atau DNA yang mudah terdegradasi, apabila analisis DNA inti tidak dapat dilakukan. mtDNA manusia diturunkan secara maternal sehingga setiap individu pada garis keturunan ibu yang sama akan mempunyai tipe mtDNA yang identik. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh. mtDNA mempunyai laju polimorfisme yang tinggi dengan laju evolusinya sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti (Hartati et al., 2004).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-komponen sel. Isolasi DNA dari organisme eukariotik dilakukan melalui proses penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein sel, dan purifikasi DNA (Muladno, 2010). Berikut adalah uraian tahapan isolasi DNA:

1. Penghancuran Membran Sel (lisis)

Untuk mendapatkan DNA, membran terlebih dahulu dilisiskan dengan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA, dan SDS. Lisozim merupakan enzim yang dapat memakan dinding sel. Penggunaan Lisozim biasanya untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. SDS (sodium dodesil sulfat) merupakan detergent yang dapat merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran sel. Larutan pelisis sel umumnya terdiri atas satu atau lebih detergent seperti SDS, NP-40, atau Triton X-100. Sel debris yang ditimbulkan akibat cairan pelisis dilakukan setrifugasi sehingga hanya tertinggal molekul nukleotida.

2. Pemisahan DNA dari Protein Sel

Protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim proteinase K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon sehingga DNA terurai. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan fenol (untuk mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Umumnya ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Kemudian dilakukan sentifugasi kembali untuk mengendapkan molekul yang berat, dan dipisahkan DNA yang berada pada supernatant.

3. Purifikasi DNA

DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA. Untuk membersihkan molekul RNA dari larutan, enzim RNAse

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta digunakan untuk mendegradasi molekul RNA. Dengan hilangnya protein dan RNA, maka DNA dapat diisolasi secara utuh. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi menggunakan etanol absolut dan larutan garam. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi.

Gambar 2.9. Presipitasi DNA setelah Penambahan Etanol Absolut (Sumber: www.learn.genetics.utah.edu)

Pada umumnya isolasi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam bahkan beberapa hari. Selain itu, berkembang pesatnya kebutuhan di bidang diagnostik molelular dan filogeni molekular yang menuntut kecepatan, prosedur yang sederhana, hasil yang akurat dalam ekstraksi DNA dari berbagai jenis sampel, menciptakan pengembangan teknologi baru untuk pengektraksian DNA yang mudah dan lebih cepat dari sebelumnya.

Salah satu pengembangan teknik purifikasi DNA adalah dengan bantuan spin column yang mengandung silicon dioxide sebagai filter yang dapat mengabsorpsi asam nukleat (Chee Tan dan Chin Yiap, 2009). Prinsip ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode ini adalah berdasarkan tingginya afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA terhadap partikel silika yang bermuatan positif. DNA dapat terikat dengan kuat pada silika dibawah

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air. DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan

buffer Tris-EDTA atau Aquabidest (Gjerse et al., 2009).

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi suatu campuran berdasarkkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis telah digunakan untuk analisa virus, asam nukleat, enzim, protein, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti asam amino (Westermeier, 2004).

Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA dengan ukuran molekul lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor (Sambrook et al., 2001), yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran lebih besar. Sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen berdasarkan ukuran panjangnya.

2. Konsentrasi Agarosa

Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 1. Kisaran umum konsentrasi agarosa (Muladno, 2010)

Konsentrasi Agarosa (%)

Efisiensi Pemisahan DNA (kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-3

2,0 0,1-2

3. Konformasi DNA

Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda. DNA dalam bentuk sirkular akan lebih cepat bermigrasi dibandingkan dengan DNA bentuk linier.

4. Voltase yang Digunakan

Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi, apabila penggunaan voltase terlalu tinggi, mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Hal ini mengakibatkan efektifitas pemisahan molekul DNA menurun dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm.

5. Etidium Bromida

Keberadaan etidium bromida di dalam gel dapat mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15%.

6. Komposisi Larutan Buffer

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Visualisasi fragment DNA dilakukan dengan penambahan larutan etidium bromida yang akan masuk (interkalasi) di antara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa terdapat DNA pada setiap lajur. Larutan etidium bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen, oleh karena itu semua larutan yang mengandung etidium bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang. Selain etidium bromida, pewarnaan dapat dilakukan dengan larutan SYBR safe sebagai penggantinya (Muladno, 2010; Sambrook dan Russel, 2001; Gaffar, 2007).

Gambar 2.10. Interkalasi Etidium Bromida pada DNA (Sumber: www.sciencemag.org)

2.5 PCR

2.5.1 Pengertian PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu metode amplifikasi DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase, dimana potongan DNA tertentu dapat dilipat gandakan (Zyskind dan Bernstain, 1992). Metode ini paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas. Dalam waktu sembilan tahun sejak pertama kali dikemukakan oleh ilmuan dari Cetus Corporation, Kary Mullis, PCR telah berkembang

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler, antara lain untuk transkripsi in vitro dari PCR template, PCR rekombinan, DNAse I

footprinting, sequencing dengan bantuan phage promoters, dan sebagainya (Putra, 1999).

Teknik ini memungkinkan adanya amplifikasi antara dua region DNA yang diketahui, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diamplifikasi merupakan DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA template-nya. Amplifikasi ini dapat menghasilkan lebih dari satu kali DNA asli.

2.5.2 Tahapan PCR

Menurut Sambrook et al., (2001), tahapan yang terjadi dalam proses amplifikasi DNA pada PCR yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA

template, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.

Gambar 2.12. Tahapan Proses PCR (Sumber: www.bioserv.fiu.edu)

1.Denaturasi DNA template

Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90-95oC selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat gandakan jumlahnya benar-benar telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95oC atau 15 detik pada suhu 97oC.

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika DNA target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi, hal ini dikarenakan ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak dibandingkan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga tidak boleh terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama, karena dapat mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase.

2. Penempelan Primer (annealing)

Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan primernya. Pada proses

annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk. Selanjutnya, enzim

Taq DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60oC. Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu

dimana separuh jumlah primer menempel pada template.

Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5oC di bawah Tm, dimana formula untuk menghitung Tm = 4oC (G+C) + 2oC (A+T). Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.

3. Reaksi polimerisasi (extension)

Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3' nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Umumnya reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan rantai, terjadi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada suhu 72oC karena merupakan suhu optimum Taq polymerase. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap pemanjangan primer ini.

Ketiga tahapan tersebut terjadi dalam satu siklus. Produk DNA pada siklus amplifikasi pertama akan menjadi cetakan pada siklus berikutnya. Produk yang dihasilkan bersifat eksponensial (2n), dengan n adalah jumlah siklus yang dilakukan (Keller dan Manak, 1989). Ini mengakibatkan PCR sangat efektif karena dapat menghasilkan DNA dalam jumlah mikrogram dari jumlah DNA awal dalam pikogram (Zyskind dan Bernstain, 1992).

Gambar 2.13. Pelipatgandaan Molekul DNA Target (Sumber: www.bioserv.fiu.edu)

2.5.3 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam PCR adalah DNA template, primer, enzim Taq DNA Polymerase, deoxyribonucleaside triphosphate (dNTP’s), dan buffer PCR. DNA template merupakan DNA yang akan diamplifikasi, dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Primer yang digunakkan sebaiknya berukuran 20-26 pasang basa, dengan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta komposisi 50-60% C+G, sekuens DNA kedua primer tidak saling berkomplemen yang akan menyebabkan terjadinya penempelan antar primer (primer-dimer), dan sekuens DNA dalam satu primer tidak saling berkomplemen yang akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder dan mengurangi efisiensi PCR. Deoxyribonucleaside triphosphate

(dNTP’s) merupakan bahan dasar pembentuk DNA yang terdiri dari dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. Taq DNA Polymerase berfungsi sebagai katalisator terjadinya pemanjangan primer. Buffer PCR yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Ion Mg2+ yang biasanya terdapat dalam buffer berfungsi sebagai kofaktor enzim. Keberadaan ion ini sangat penting karena ion Mg2+ bebas akan mengikat DNA template, primer dan membentuk kompleks terlarut dengan dNTP untuk membuat subtrat yang akan dikenali oleh enzim Taq Polymerase

(Zyskind dan Bernstain, 1992).

2.6 Real-Time PCR

Real-Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real-Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR atau qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi sekaligus mengkuantifikasi jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Instrumen Real-Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan untai ganda DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin `tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

Alat ini dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman, 2004).

Gambar 2.14. Bentuk Kurva Real-Time PCR (Sumber: bio-rad.com)

2.6.1. Pewarna Fluoresensi

Real-time PCR menggunakan pewarna fluoresensi dan probe dengan fluoresensi. Probe berupa oligonukleotida yang tersusun dari sekuen spesifik dan akan berpasangan dengan sekuen DNA cetakan yang akan diamplifikasi. Macam-macam fluoresensi yang umumnya digunakan antara lain SYBR Green, Hydrolysis probes, Hybridization probes, dan

Molecular beacons. Fluoresensi akan berpendar hijau saat berikatan dengan DNA cetakan (Kubista et al., 2006). Pewarna yang umum digunakan adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe.

a. Hydrolysis Probe

Hydrolisis probe menggunakan oligonukleotida spesifik yang berkomplemen dengan DNA target disebut Probe. Probe dilabeli oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5’ probe yang merupakan pewarna fluoresensi dan quencer pada ujung 3’ probe

yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan DNA target, molekul reporter akan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencer karena jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu annealing, lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencer terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe

berdekatan maka 5’nuklease yang terdapat pada DNA polimerase

akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada Real Time PCR

(Shipley, 2007). Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multiplex pada qRT PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan primer lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda (BioRad, 2006).

b. SYBR Green

Prinsip dari SYBR Green adalah pewarna fluoresensi akan mengikat bagian minor dari untai ganda DNA sehingga menghasilkan pendaran warna hijau pada akhir fase extension selama proses Real Time PCR berlangsung (Shipley, 2007). Intensitas fluoresensi yang semakin tinggi meenunjukkan peningkatan jumlah untai ganda DNA yang terdeteksi oleh detektor. Intensitas fluoresensi yang akan dihitung dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif pada qRT PCR. SYBR Green umumnya digunakan dalam singleplex

pada Real Time PCR yang menggunakan satu DNA target dan sepasang primer. SYBR Green lebih sering digunakan dibandingkan

Hydrolisis probe karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu dapat digunakan untuk beberapa pengujian karena mampu bekerja pada semua jenis primer, teknik pengujian lebih sederhana karena tidak perlu merancang probe, dan harga pewarna fluoresensi yang relatif lebih rendah (Shipley, 2007). SYBR Green memiliki kelemahan, yaitu SYBR Green dapat mengikat DNA untai ganda

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada bagian tidak spesifik sehingga primer-dimer juga akan diikat oleh SYBR Green. Namun, produk tidak spesifik dapat dianalisis keberadaannya dalam analisis melting curve (Valasek & Repa ,2005; Kubista et al., 2006).

Gambar 2.16. Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green (Sumber: Thermoscientificbio.com)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat & Pangan Halal; Laboratorium Penelitian 2; dan Laboratorium Biokimia/ Patologi Klinis. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014 hingga September 2014.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat

Real Time PCR (Light Cycler® 480 - Roche), Multiwell Plate 96 (Roche), Sealing Foil (Roche), Mikropipet 0.5-10 μl (Biorad), Mikropipet 2-20 μl (Biorad), Mikropipet 20-200 μl (Biorad), Mikropipet 100-1000 μl (Biorad), Microtips volume 10 μl; 200 μl; dan 1000 μl (Genfollower), Spektrofotometri UV DNA (BioDrop), Gel Documentation (AE-6933 ATTO), satu set alat Elektroforesis Agarosa (Biorad), Digital Waterbath

(SB-100 Eyela), Vortex, Sentrifugator (5417R – Eppendorf), Filter Tube

dan Collection Tube (Kit High Pure PCR Template Preparation – Roche),

plastic wrap, alumunium foil, Microsentrifuge tube volume 1,5 ml (Biogenix), pisau steril, kaca arloji, erlenmeyer 50 ml, dan spatula.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, gelatin sapi (Sigma Aldrich), gelatin babi (Sigma Aldrich), Tris Base (SBS Genetech), asam asetat glasial (Merck), EDTA (Merck), satu set reagen isolasi DNA meliputi

Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer; Proteinase K; Inhibitor Removal Buffer; Washing Buffer; dan Elution Buffer (Kit High Pure PCR Template

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Preparation - Roche), Aquabidest (IKA Pharmindo), Etanol Absolut (Merck), Isopropanol (Merck), Etidium Bromida 10 mg/ml (Bio Basic Inc.), Agarosa (Fermentas), loading dye (Promega), SYBR Green I Master

(LC 480 - Roche), Probe Master (LC 480 - Roche), Aquadest (PCR Grade - Roche) dan Primer-probe (Alpha DNA).

Tabel 3. Urutan Basa Primer dan Probe (Tanabe et al., 2007)

Nama Primer Runutan Basa

Babi Forward 5'-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'

Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

Probe 5'-(FAM)-ACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3' Sapi Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'

Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-(BHQ1)-3'

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Ekstraksi dan Isolasi DNA

Proses ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche).

1. Preparasi Sampel

a. Daging Segar (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012)

Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi segar dan daging babi segar dicincang halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 20 jam dalam digital waterbath. Larutan daging yang dihasilkan selanjutnya dilakukan proses ekstraksi dan isolasi DNA.

b. Gelatin (Rochea_{, 2012; Erwanto et al., 2012)}

Sebanyak 50 mg masing-masing gelatin sapi dan gelatin babi ditimbang dan dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 100 μl Aquabidest, 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 20 jam dalam digital waterbath. Larutan daging yang dihasilkan selanjutnya dilakukan proses ekstraksi dan isolasi DNA.

2. Proses Ekstraksi dan Isolasi DNA (Rochea, 2012 dengan modifikasi) Larutan daging sapi, daging babi, gelatin sapi dan gelatin babi yang telah dinkubasi sebelumnya selama 20 jam, masing-masing ditambahkan

200 μl larutan Binding Buffer. Campuran divortex segera selama 10 detik dan diinkubasi kembali pada suhu ± 70oC selama 10 menit dalam digital waterbath.

Ke dalam masing-masing tube tesebut kemudian ditambahkan 150

μl isopropanol absolut dan dihomogenkan dengan vortex selama 10 detik. Campuran dipipet dan dimasukkan ke dalam Filter Tube yang telah dipasangkan Collection Tube. Kemudian tube ditutup dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube

dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Kemudian 500 μl

Inhibitor Removal Buffer ditambahkan melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube

dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Kemudian 500 μl

Washing Buffer ditambahkan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dengan Washing Buffer dilakukan sekali lagi. Setelah itu, filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan

collection tube dan disetrifugasi kembali selama 10 detik pada kecepatan maksimum agar semua Washing Buffer tidak tertinggal pada filter. 3. Elusi DNA (Rochea, 2012 dengan modifikasi)

Filter tube dan Collection tube yang telah disentrifugasi pada kecepatan maksimum kemudian Filter tube dipisahkan dengan collection

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta tube. Collection tube dibuang dan Filter tube tersebut kemudian dipasangkan pada Microsentrifuge tube steril. Ke dalam filter yang mengandung DNA daging sapi dan daging babi, masing-masing

ditambahkan 200 μl Elution Buffer hangat (70oC). Sedangkan ke dalam filter yang mengandung DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi, masing-masing ditambahkan 150 μl Elution Buffer hangat (70oC).

Filter dan Microsentrifuge tube yang telah ditambahkan Elution Buffer kemudian disetrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8000 rpm.

Filter tube dilepaskan dari Microsentrifuge tube. Pada Microsentrifuge tube telah mengandung isolat DNA. Isolat DNA yang didapatkan dianalisis keberadaannya dengan elektroforesis agarosa dan dianalisis konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotmetri UV.

3.3.2 Analisis Isolat DNA

3.3.2.1 Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa

a. Pembuatan Buffer Elektroforesis TAE 10x, 1 liter (Biorad, 2012)

Sebanyak 48,4 g Tris Base dilarutkan dalam 800 mL aquabidest. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 11,4 mL asam asetat glasial dan 20 ml 0,5 M EDTA pH 8. Larutan dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 ml. Kemudian ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan aquabidest sampai tanda batas.

b. Pembuatan Buffer Elektroforesis TAE 1x, 1 liter (Biorad, 2012)

Sebanyak 100 ml TAE 10x dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 ml dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Larutan tersebut kemudian dihomogenkan.

c. Pembuatan Gel Agarosa 1% (Sambrook et al., 2001)

Sebanyak 0,5 g agarosa dilarutkan dengan 50 mL TAE 1x di dalam erlenmeyer. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil, kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai larutan menjadi bening dan mendidih. Larutan agarosa didiamkan hingga suhu 60oC dan ditambahkan 2,5 μL etidium bromida 10 mg/ml, kemudian larutan diaduk hingga homogen. Larutan dituangkan pada gel caster dan comb

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta disisipkan untuk membuat well (sumur). Larutan agarosa dibiarkan hingga mengeras. Setelah gel mengeras dan membentuk agar, gel diletakkan pada chamber electrophoresis dengan posisi well pada muatan negatif (warna hitam). Kemudian buffer TAE 1x dituang hingga gel terendam dalam chamber electrophoresis namun tidak melebihi garis batas maksimum buffer.

d. Loading Sampel (Sambrook et al., 2001 dengan modifikasi)

Plastic wrap direkatkan pada wadah mendatar sebagai tempat melakukan pencampuran sampel yang akan dimasukkan ke dalam well

pada gel. Masing-masing sebanyak 5 μL isolat DNA dipipet dan ditaruh di atas plastic wrap. Kemudian masing-masingnya ditambahkan 1 μL

loading dye dan dihomogenkan dengan menaik turunkan mikropipet. Masing-masing campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam

well agarosa yang telah dibuat sebelumnya dengan urutan dari kiri ke kanan adalah; DNA daging sapi; DNA daging babi; DNA gelatin sapi; DNA gelatin babi.

e. Running Sampel (Sambrook et al., 2001)

Chamber elektroforesis yang telah mengandung gel agarosa, DNA, dan buffer TAE 1X kemudian ditutup rapat dan kabel chamber

dihubungkan dengan power supply. Kabel merah (muatan positif) dipasangkan pada lubang merah dan kabel hitam (muatan negatif) dipasangkan pada lubang hitam. Running sampel dilakukan selama 45 menit dengan voltase 90 Volt 400 mA.

f. Dokumentasi Gel Agarosa (Atto, 2009)

Gel agarosa yang telah mengandung DNA terelektroforesis kemudian diletakkan pada Gel Doc untuk visulasi isolat DNA. Tombol ON ditekan pada Saver, Printer dan Transluminator. Stand by LED dipilih untuk melihat posisi Gel. Panjang gelombang dipilih, kemudian

exposure Time, Focus dan aperture cahaya diatur. Expose UV. Freeze

ditekan dan Save. Data gambar yang akan digunakan sebagai dokumentasi dicetak dengan menekan tombol Print.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3.2.2 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

Pada sistem layar, panel “Nucleic Acid” dipilih untuk penentuan

konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu

steril. Sebanyak 2 μL Elution Buffer ditaruh di atas Sample port dan dianalisis sebagai blangko. Sample port kembali dibersihkan dengan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 2

μL DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Kemudian tombol

”Measure” diklik. DNA dianalis pada panjang gelombang 260 nm dan 280

nm. Hasil instrumentasi akan didapatkan data konsentrasi DNA dalam ng/μl dan kemurnian DNA dengan perbandingan rasio A280 dan A260. (Biodrop, 2012)

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih menu

“nucleotide blast”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence”

dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji. Tombol “BLAST” kemudian diklik. Data hasil pengujian berupa daftar spesies yang memiliki kemiripan 99%-100% dengan urutan basa primer yang diuji (NCBI).

3.3.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR 3.3.4.1. Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green

a. Pembuatan Larutan Primer 10 μM dari Larutan Induk Primer100 μM Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ke dalam tube

tesebut ditambahkan 90 μL aquadest. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.

b. Pembuatan SYBR Green Mastermix (Rochec, 2005)

Mastermixdibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL

DNA yang diuji; 3 μL Aquabidest; 1 μL primer forward 10 μM; 1 μL

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

master (enzim Taq DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2).

c. Loading Sampel dan SYBR GreenMaster Mix ke dalam Multiwell Plate

(Rochec_{, 2005)}

Sebanyak 5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix

dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan. Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil. d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi (Rochec, 2005 dengan

modifikasi)

Pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi, dilakukan dengan percobaan sebagai berikut:

Tabel 4. Pengaturan program amplifikasi dengan metode SYBR Green

Analisis dengan Primer Sapi

Perc. 1 Jumlah Siklus Suhu Waktu

PreIncubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95o_C

60oC 72oC

10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95oC 60oC 97oC/5oC

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40o_{C 10 detik}

Perc. 2 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95o_{C 10 menit} Amplification

45 siklus

95oC 62oC 72oC

10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95oC 60oC 97o_C/5o_C

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pre Incubation 1 Siklus 95o_{C 10 menit} Amplification

45 siklus

95oC 64oC 72o_C

10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95oC 60o_C

97oC/5oC

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik

Perc. 4 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95o_C

65oC 72oC

10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95o_C

60oC 97oC/5oC

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40o_{C 10 detik}

Analisis dengan Primer Babi

Perc. 1 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95oC 60o_C

72oC

10 detik 10 detik 7 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95o_C

60o_C

97oC/5oC

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik

Perc. 2 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95oC 60oC 72oC

10 detik 20 detik 30 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 60o_C

97oC/5oC

1 menit -

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik

Perc. 3 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95oC 60oC 72oC

10 detik 20 detik 25 detik Melting Curve Analysis 1 Siklus

95oC 60oC 97oC/5oC

5 detik 1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40o_{C 10 detik}

Keterangan: = Modifikasi yang dilakukan pada proses amplifikasi

Real Time PCR

3.3.4.2. Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe

a. Pembuatan Primer dan Probe 10 μM dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dan probe 100 μM masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube volume 1,5

ml. Kemudian ke dalam tube tesebut masing-masing ditambahkan 90 μL aquadest. Larutan tersebut masing-masing dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.

b. Pembuatan Hydrolysis Probe Mastermix (Roched, 2008)

Mastermixdibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL

DNA yang diuji; 1,4 μL Aquabidest; 1,6 μL primer forward 10 μM; 1,6

μL primer reverse 10 μM; 0,4 μL probe 10 μM; dan 10 μL LightCycler® 480 Probe master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2).

c. Loading Sampel dan Hydrolisis Probe Mastermix ke dalam Multiwell Plate (Roched, 2008)

Sebanyak 5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix

dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan. Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi (Roched, 2008)

Proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR

yang akan digunakan untuk proses amplifikasi dilakukan sebagai berikut:

Tabel 5. Pengaturan program amplifikasi dengan metode Hydrolysis Probe

Analisis dengan Primer-probe Sapi

Jumlah Siklus Suhu Waktu

PreIncubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

60 siklus

95o_C

60oC

10 detik 1 menit

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik Analisis dengan Primer-probe Babi

Jumlah Siklus Suhu Waktu

PreIncubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

60 siklus

95oC 60oC

10 detik 1 menit

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan Real Time PCR. Perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dilihat melalui hasil kurva amplifikasi apakah metode tersebut dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi secara spesifik.

4.1. Hasil Analisis Isolat DNA

Isolat DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi DNA dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation. Prinsip kit ini yaitu DNA diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2) sehingga DNA

mudah dipisahkan dari protein dan sel debris hasil pelisisisan sel dengan cara sentrifugasi (Rocheb, 2012). Reagen yang ditambahkan pada proses ekstraksi dan isolasi DNA meliputi: Tissue lysis buffer sebagai pelisis membran sel, proteinase K sebagai enzim pemecah makromolekul protein menjadi molekul lebih kecil, Binding buffer sebagai chaotropic agent agar DNA dapat terabsorbsi kuat dengan silikon dioksida yang terdapat pada filter, Inhibitor Removal Buffer sebagai buffer yang dapat menghilangkan zat pengotor yang mengganggu proses PCR, Washing buffer sebagai pencuci garam chaotropic

dan pengotor lainya, dan Elution Buffer sebagai pengelusi DNA dari silikon dioksida (Rocheb, 2012).

Isolat DNA yang didapatkan dianalisis dengan Elektroforesis Agarosa dan Spektrofotometer UV.

4.1.1. Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa

Isolat DNA divisualisasi keberadaannya dengan elektroforesis gel agarosa 1% seperti gambar sebagai berikut:

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 11.

Hasil Kurva Amplifikasi dan

Melting Peaks

dengan

Metode

SYBR Green

Menggunakan Primer Babi dengan

Waktu

Annealing

10 detik dan Waktu

Extension

7 detik

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; CP = Crossing Point; Tm = Melting Temperature

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 12.

Hasil Kurva Amplifikasi dan

Melting Peaks

dengan

Metode

SYBR Green

Menggunakan Primer Babi dengan

Waktu

Annealing

20 detik dan Waktu

Extension

30 detik

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; CP = Crossing Point; Tm = Melting Temperature

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 13.

Hasil Kurva Amplifikasi dan

Melting Peaks

dengan

Metode

SYBR Green

Menggunakan Primer Babi dengan

Waktu

Annealing

20 detik dan Waktu

Extension

25 detik

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; CP = Crossing Point; Tm = Melting Temperature

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 14.

Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode

Hydrolysis

Probe

Menggunakan Primer Sapi

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; CP = Crossing Point

Lampiran 15.

Hasil Kurva Amplifikasi dengan metode

Hydrolysis

Probe

Menggunakan Primer Sapi

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; CP = Crossing Point

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 16. Gambar alat alat yang digunakan dalam penelitian

Gambar 1. Mikropipet

(1)

Vol 1000 ul; (2) Vol 200 ul; (3) Vol

20 ul; (4) Vol 10 ul

Gambar 2. Mikrotips

Gambar 3. Microsentrifuge tube

Gambar 4. Satu set alat elektroforesis

(1) Chamber; (2) Gel Caster; (3) Comb;

(4) Power Supply

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gamabar 7. Vortex

Gambar 8. Water Bath

Gambar 9. Kit Ekstraksi

Gambar 10. Filter tube dan

Collection tube

Gambar 11. Spektrofotometri DNA

Gambar 12. Multiwell Plates

Gambar 13. Sealing Foil