KARAKTERISASI KITINASE HASIL PRODUKSI BAKTERI KITINOLITIK ISOLAT 26 PADA TEPUNG CANGKANG UDANG
KARAKTERISASI KITINASE HASIL PRODUKSI BAKTERI KITINOLITIK
ISOLAT 26 PADA TEPUNG CANGKANG UDANG
SKRIPSI
Oleh
Ririn Rahmawati
NIM 091810401013
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014
KARAKTERISASI KITINASE HASIL PRODUKSI BAKTERI
KITINOLITIK ISOLAT 26 PADA TEPUNG CANGKANG UDANG
SKRIPSI
diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat
untuk menyelesaikan Program Studi Biologi (S1)
dan mencapai gelar Sarjana Sains
Oleh
Ririn Rahmawati
NIM 091810401013
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014
PENGESAHAN
Skripsi berjudul “Karakterisasi Kitinase Hasil Produksi Bakteri Kitinolitik Isolat 26
Pada Tepung Cangkang Udang” telah diuji dan disahkan pada:
hari, tanggal :
tempat
: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember.
Tim Penguji
Ketua,
Sekretaris,
Esti Utarti, S.P., M.Si
NIP 197003031999032001
Drs. Rudju Winarsa., M.Kes
NIP 196008161989021001
Anggota I,
Anggota II,
Drs. Siswanto, M.Si
NIP 196012161993021001
Kahar Muzakhar, S.Si., Ph.D
NIP 196805031994011001
Mengesahkan
Dekan,
Prof. Drs. Kusno, DEA., Ph.D.
NIP 196101081986021001
vi
RINGKASAN
Karakterisasi Kitinase Hasil Produksi Bakteri Kitinolitik Isolat 26 Pada Tepung
Cangkang Udang; Ririn Rahmawati, 091810401013; 2014: 30 halaman; Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember.
Kitinase (E.C.3.2.1.14) sering disebut sebagai poli 1,4-
(2-asetamido-2-
deoksi-D-glukosaminida) merupakan enzim yang mendegradasi kitin pada ikatan 1,4-asetamido-2-deoksi-D-glikosida menjadi produk turunan kitin yaitu kitin
oligosakarida atau monomer N-asetilglukosamin. Hasil hidrolisis kitin tersebut
banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang antara lain industi, pertanian dan medis.
Penggunaan kitinase dalam industri perlu diketahui kondisi optimal enzim tersebut.
Kondisi yang mempengaruhi aktivitas suatu enzim yaitu pH, konsentrasi substrat dan
enzim, suhu dan adanya aktivator atau inhibitor yang menyebabkan enzim
mempunyai karakter tertentu. Kitinase dihasilkan oleh mikroba, tanaman dan hewan
termasuk manusia. Aktivitas kitinase dihitung berdasarkan N-asetilglukosamin yang
terbentuk dari hidrolisis kitin. Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah
enzim yang menghasilkan 1 µmol N-asetilglukosamin per menit pada kondisi
tertentu.
Metode yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari (i) Produksi Kitinase
dengan berbagai waktu produksi; (ii) Penentuan waktu produksi terbaik berdasarkan
aktivitas ktinase pada substrat kitin; (iii) Presipitase kitinase dengan Amonium sulfat
80% dilanjutkan dengan dialisis (iv) Penentuan Aktivitas spesifik kitinase dari
masing-masing tahap (v) Karakterisasi berdasarkan pH, suhu, ion logam dan kinetika
enzim.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa, kitinase ekstrak kasar yang dihasilkan
oleh bakteri isolat 26 pada media produksi tepung cangkang udang 2,5% (b/v)
mempunyai aktivitas terbaik pada waktu inkubasi 24 jam yaitu sebesar 0,024 U/ml.
Kemudian aktivitas spesifiknya meningkat setelah presipitasi menggunakan amonium
sulfat dan dialisis yaitu masing-masing sebesar 0,024 U/mg, 0,269 U/mg dan 0,530
vii
U/mg. Aktivitas kitinase terbaik didapatkan pada pH 7 dan suhu 60 dengan aktivitas
sebesar 0,077 U/ml. Aktivitas enzim ini meningkat dengan penambahan ion logam
Mn2+ 5 mM dengan aktivitas sebesar 0,101 U/ml tetapi aktivitasnya menurun dengan
adanya penambahan ion Mg2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+
dan Al2+. Kecepatan maksimal
(Vmaks) reaksi yang dikatalisis oleh kitinase ini sebesar 0,0255 mg/ml dengan
ketetapan Michaels-Menten (Km) sebesar 0,186 mg/ml.
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................................
i
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................
ii
HALAMAN MOTO .......................................................................................
iii
HALAMAN PERNYATAAN........................................................................
iv
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................
vi
RINGKASAN .................................................................................................
vii
PRAKATA ....................................................................................................
ix
DAFTAR ISI ...................................................................................................
xi
DAFTAR TABEL .........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xvi
BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................
1
1.1 Latar Belakang ..........................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah ...................................................................
2
1.3 Tujuan dan Manfaat.................................................................
2
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................
3
2.1 Kitinase ......................................................................................
3
2.2 Bakteri Kitinolitik Isolat 26 .....................................................
4
2.3 Karakter Kitinase .....................................................................
6
2.3.1 Derajat Keasaman (pH) .....................................................
6
2.3.2 Suhu ...................................................................................
6
2.3.3 Kofaktor .............................................................................
7
2.3.4 Inhibitor .............................................................................
8
2.3.5 Kinetika Enzim ..................................................................
9
BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................
10
3.1 Waktu dan Tempat ..................................................................
10
ix
3.2 Rancangan Penelitian ..............................................................
10
3.3 Alat dan Bahan .........................................................................
10
3.3.1 Alat ...................................................................................
10
3.3.2 Bahan ................................................................................
10
3.4 Prosedur Penelitian ...................................................................
11
3.4.1 Peremajaan Bakteri Kitinolitik Isolat 26 ...........................
11
3.4.2 Pembuatan Tepung Cangkang Udang ...............................
11
3.4.3 Pembuatan Koloidal Kitin .................................................
11
3.4.4 Produksi Enzim Kitinase ..................................................
11
a. Produksi dan Ekstraksi Enzim .......................................
11
b. Presipitasi menggunakan Amonium Sulfat ...................
12
c. Dialisis ...........................................................................
12
3.4.5 Pengukuran Aktivitas Enzim .............................................
13
3.4.6 Penentuan Standar N-asetilglukosamin .............................
14
3.4.7 Penentuan Aktivitas Spesifik Kitinase ...............................
14
3.4.8 Karakterisasi Kitinase ........................................................
14
a. pH Optimum ...................................................................
14
b. Suhu Optimum ................................................................
14
c. Pengaruh Ion Logam .......................................................
15
d. Kinetika Enzim ...............................................................
15
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................
16
1.1 Pengaruh
Waktu
Produksi
Terhadap
Aktivitas
Kitinase Isolat 26 .......................................................................
16
4.2 pH Optimum Kitinase Isolat 26...................................................
19
4.3 Suhu Optimum Enzim Kitinase Isolat 26 ..............................
20
4.4 Pengaruh Ion Logam Terhadap Kitinase Isolat 26 ...............
21
4.5 Kinetika Kitinase Isolat 26 ....................................................... `
23
BAB 5. PENUTUP..........................................................................................
25
5.1 Kesimpulan ...............................................................................
25
x
5.2 Saran .........................................................................................
25
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
26
LAMPIRAN ....................................................................................................
31
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
4.1 Tingkat kemurnian pada setiap pemurnian kitinase isolat 26 ....................
xii
18
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.1 Skema lintasan degradasi kitin..................................................................
3
2.2 Jenis-jenis enzim kitinase..........................................................................
4
2.3 Struktur enzim dengan kofaktor................................................................
7
2.4 Hubungan antara Km dan Vmaks .............................................................
9
4.1 Pengaruh waktu produksi terhadap aktivitas kitinase isolat 26 ................
16
4.2 Pengaruh pH terhadap aktivitas kitinase isolat 26 ....................................
19
4.3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas kitinase isolat 26..................................
21
4.4 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas kitinase isolat 26 .........................
22
a. Ion logam konsentrasi 1 mM.................................................................
22
b. Ion logam konsentrasi 5 mM ................................................................
22
4.5 Kurva transformasi Lineweaver-Burk kitinase isolat 26 ...........................
23
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
A.
Diagram Alir Penelitian .................................................................
31
B.
Komposisi media nutrient agar .......................................................
32
C.
Komposisi Media LB (Luria Broth) ................................................
32
D.
Komposisi Mineral Basal ...............................................................
32
E.
Komposisi Reagen Schale ...............................................................
32
F.
Komposisi buffer asam sitrat ..........................................................
33
G.
Komposisi buffer fosfat ..................................................................
33
H.
Kurva standar N-asetil glukosamin.................................................
33
I.
Hasil kurva standar Protein Metode Bradford .............................
34
J.
Pengaruh Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26
34
K.
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26 .....................
34
L.
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26 ................
35
M.
Pengaruh Ion Logam Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26......
35
N.
Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Aktivitas Kitinase
Isolat 26 .............................................................................................
O.
P.
35
Grafik Hubungan Antara Konsentrasi Substrat dan
Aktivitas Kitinase isolat 26 ..............................................................
36
Grafik Hubungan antara 1/[S] dan 1/V kitinase Isolat 26 ...........
36
xiv
ISOLAT 26 PADA TEPUNG CANGKANG UDANG
SKRIPSI
Oleh
Ririn Rahmawati
NIM 091810401013
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014
KARAKTERISASI KITINASE HASIL PRODUKSI BAKTERI
KITINOLITIK ISOLAT 26 PADA TEPUNG CANGKANG UDANG
SKRIPSI
diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat
untuk menyelesaikan Program Studi Biologi (S1)
dan mencapai gelar Sarjana Sains
Oleh
Ririn Rahmawati
NIM 091810401013
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014
PENGESAHAN
Skripsi berjudul “Karakterisasi Kitinase Hasil Produksi Bakteri Kitinolitik Isolat 26
Pada Tepung Cangkang Udang” telah diuji dan disahkan pada:
hari, tanggal :
tempat
: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember.
Tim Penguji
Ketua,
Sekretaris,
Esti Utarti, S.P., M.Si
NIP 197003031999032001
Drs. Rudju Winarsa., M.Kes
NIP 196008161989021001
Anggota I,
Anggota II,
Drs. Siswanto, M.Si
NIP 196012161993021001
Kahar Muzakhar, S.Si., Ph.D
NIP 196805031994011001
Mengesahkan
Dekan,
Prof. Drs. Kusno, DEA., Ph.D.
NIP 196101081986021001
vi
RINGKASAN
Karakterisasi Kitinase Hasil Produksi Bakteri Kitinolitik Isolat 26 Pada Tepung
Cangkang Udang; Ririn Rahmawati, 091810401013; 2014: 30 halaman; Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember.
Kitinase (E.C.3.2.1.14) sering disebut sebagai poli 1,4-
(2-asetamido-2-
deoksi-D-glukosaminida) merupakan enzim yang mendegradasi kitin pada ikatan 1,4-asetamido-2-deoksi-D-glikosida menjadi produk turunan kitin yaitu kitin
oligosakarida atau monomer N-asetilglukosamin. Hasil hidrolisis kitin tersebut
banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang antara lain industi, pertanian dan medis.
Penggunaan kitinase dalam industri perlu diketahui kondisi optimal enzim tersebut.
Kondisi yang mempengaruhi aktivitas suatu enzim yaitu pH, konsentrasi substrat dan
enzim, suhu dan adanya aktivator atau inhibitor yang menyebabkan enzim
mempunyai karakter tertentu. Kitinase dihasilkan oleh mikroba, tanaman dan hewan
termasuk manusia. Aktivitas kitinase dihitung berdasarkan N-asetilglukosamin yang
terbentuk dari hidrolisis kitin. Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah
enzim yang menghasilkan 1 µmol N-asetilglukosamin per menit pada kondisi
tertentu.
Metode yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari (i) Produksi Kitinase
dengan berbagai waktu produksi; (ii) Penentuan waktu produksi terbaik berdasarkan
aktivitas ktinase pada substrat kitin; (iii) Presipitase kitinase dengan Amonium sulfat
80% dilanjutkan dengan dialisis (iv) Penentuan Aktivitas spesifik kitinase dari
masing-masing tahap (v) Karakterisasi berdasarkan pH, suhu, ion logam dan kinetika
enzim.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa, kitinase ekstrak kasar yang dihasilkan
oleh bakteri isolat 26 pada media produksi tepung cangkang udang 2,5% (b/v)
mempunyai aktivitas terbaik pada waktu inkubasi 24 jam yaitu sebesar 0,024 U/ml.
Kemudian aktivitas spesifiknya meningkat setelah presipitasi menggunakan amonium
sulfat dan dialisis yaitu masing-masing sebesar 0,024 U/mg, 0,269 U/mg dan 0,530
vii
U/mg. Aktivitas kitinase terbaik didapatkan pada pH 7 dan suhu 60 dengan aktivitas
sebesar 0,077 U/ml. Aktivitas enzim ini meningkat dengan penambahan ion logam
Mn2+ 5 mM dengan aktivitas sebesar 0,101 U/ml tetapi aktivitasnya menurun dengan
adanya penambahan ion Mg2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+
dan Al2+. Kecepatan maksimal
(Vmaks) reaksi yang dikatalisis oleh kitinase ini sebesar 0,0255 mg/ml dengan
ketetapan Michaels-Menten (Km) sebesar 0,186 mg/ml.
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................................
i
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................
ii
HALAMAN MOTO .......................................................................................
iii
HALAMAN PERNYATAAN........................................................................
iv
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................
vi
RINGKASAN .................................................................................................
vii
PRAKATA ....................................................................................................
ix
DAFTAR ISI ...................................................................................................
xi
DAFTAR TABEL .........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xvi
BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................
1
1.1 Latar Belakang ..........................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah ...................................................................
2
1.3 Tujuan dan Manfaat.................................................................
2
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................
3
2.1 Kitinase ......................................................................................
3
2.2 Bakteri Kitinolitik Isolat 26 .....................................................
4
2.3 Karakter Kitinase .....................................................................
6
2.3.1 Derajat Keasaman (pH) .....................................................
6
2.3.2 Suhu ...................................................................................
6
2.3.3 Kofaktor .............................................................................
7
2.3.4 Inhibitor .............................................................................
8
2.3.5 Kinetika Enzim ..................................................................
9
BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................
10
3.1 Waktu dan Tempat ..................................................................
10
ix
3.2 Rancangan Penelitian ..............................................................
10
3.3 Alat dan Bahan .........................................................................
10
3.3.1 Alat ...................................................................................
10
3.3.2 Bahan ................................................................................
10
3.4 Prosedur Penelitian ...................................................................
11
3.4.1 Peremajaan Bakteri Kitinolitik Isolat 26 ...........................
11
3.4.2 Pembuatan Tepung Cangkang Udang ...............................
11
3.4.3 Pembuatan Koloidal Kitin .................................................
11
3.4.4 Produksi Enzim Kitinase ..................................................
11
a. Produksi dan Ekstraksi Enzim .......................................
11
b. Presipitasi menggunakan Amonium Sulfat ...................
12
c. Dialisis ...........................................................................
12
3.4.5 Pengukuran Aktivitas Enzim .............................................
13
3.4.6 Penentuan Standar N-asetilglukosamin .............................
14
3.4.7 Penentuan Aktivitas Spesifik Kitinase ...............................
14
3.4.8 Karakterisasi Kitinase ........................................................
14
a. pH Optimum ...................................................................
14
b. Suhu Optimum ................................................................
14
c. Pengaruh Ion Logam .......................................................
15
d. Kinetika Enzim ...............................................................
15
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................
16
1.1 Pengaruh
Waktu
Produksi
Terhadap
Aktivitas
Kitinase Isolat 26 .......................................................................
16
4.2 pH Optimum Kitinase Isolat 26...................................................
19
4.3 Suhu Optimum Enzim Kitinase Isolat 26 ..............................
20
4.4 Pengaruh Ion Logam Terhadap Kitinase Isolat 26 ...............
21
4.5 Kinetika Kitinase Isolat 26 ....................................................... `
23
BAB 5. PENUTUP..........................................................................................
25
5.1 Kesimpulan ...............................................................................
25
x
5.2 Saran .........................................................................................
25
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
26
LAMPIRAN ....................................................................................................
31
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
4.1 Tingkat kemurnian pada setiap pemurnian kitinase isolat 26 ....................
xii
18
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.1 Skema lintasan degradasi kitin..................................................................
3
2.2 Jenis-jenis enzim kitinase..........................................................................
4
2.3 Struktur enzim dengan kofaktor................................................................
7
2.4 Hubungan antara Km dan Vmaks .............................................................
9
4.1 Pengaruh waktu produksi terhadap aktivitas kitinase isolat 26 ................
16
4.2 Pengaruh pH terhadap aktivitas kitinase isolat 26 ....................................
19
4.3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas kitinase isolat 26..................................
21
4.4 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas kitinase isolat 26 .........................
22
a. Ion logam konsentrasi 1 mM.................................................................
22
b. Ion logam konsentrasi 5 mM ................................................................
22
4.5 Kurva transformasi Lineweaver-Burk kitinase isolat 26 ...........................
23
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
A.
Diagram Alir Penelitian .................................................................
31
B.
Komposisi media nutrient agar .......................................................
32
C.
Komposisi Media LB (Luria Broth) ................................................
32
D.
Komposisi Mineral Basal ...............................................................
32
E.
Komposisi Reagen Schale ...............................................................
32
F.
Komposisi buffer asam sitrat ..........................................................
33
G.
Komposisi buffer fosfat ..................................................................
33
H.
Kurva standar N-asetil glukosamin.................................................
33
I.
Hasil kurva standar Protein Metode Bradford .............................
34
J.
Pengaruh Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26
34
K.
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26 .....................
34
L.
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26 ................
35
M.
Pengaruh Ion Logam Terhadap Aktivitas Kitinase Isolat 26......
35
N.
Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Aktivitas Kitinase
Isolat 26 .............................................................................................
O.
P.
35
Grafik Hubungan Antara Konsentrasi Substrat dan
Aktivitas Kitinase isolat 26 ..............................................................
36
Grafik Hubungan antara 1/[S] dan 1/V kitinase Isolat 26 ...........
36
xiv