Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa
POTENSI ANTIKANKER EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH
(Piper crocatum) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antikanker
Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa adalah benar
karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan dibiayai oleh DIKTI dalam
bentuk PKMP tahun 2013 dan BPOPTN 2013. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Dhian Anugerah Purnama Suci
NIM G84090073
ABSTRAK
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih
Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa dibimbing oleh MEGA SAFITHRI
dan SILMI MARIYA.
Kanker serviks merupakan kanker penyebab kematian kedua terbesar pada
wanita di Indonesia setelah kanker payudara. Salah satu upaya pengobatan kanker
dapat dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Salah satu
tanaman yang mempunyai potensi sebagai antikanker adalah daun sirih merah.
Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak methanol daun sirih merah memiliki
nilai IC50 44.25µg/mL pada sel kanker payudara (T47D). Tujuan dari penelitian
ini adalah mengetahui aktivitas antikanker ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia
daun sirih merah terhadap sel Chang dan sel HeLa secara in vitro dengan uji
Microculture Tetrazolium Technique (MTT). Hasil uji menunjukkan potensi
antikanker terbaik adalah simplisia daun sirih merah yang dapat menghambat
86 % pertumbuhan sel HeLa dibandingkan dengan ekstrak air dan etanol 30%
dengan nilai % inhibisi masing-masing 46% pada konsentrasi 800 ppm dan 39%
pada konsentrasi 400 ppm.
Kata kunci: kanker serviks, % inhibisi, MTT, sel HeLa, Sirih merah
ABSTRACT
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Anticancer Activity OfPiper
crocatum Leaves Extract In Hela Cells. Supervised by MEGA SAFITHRI and
SILMI MARIYA.
Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian
after human breast cancer. One of the efforts of cancer treatment is the utilization
of natural materials compounds. Some plants have potential as anticancer for
example leaves of Piper crocatum. Base of previous study methanol extract Piper
crocatum has IC50 values 44.25 µg/mL on breast cancer cells (T47D). The
purpose of this study was to determine inhibition activity of Piper crocatum
ethanol, waters extract and Piper crocatum leaves powder against HeLa and
Chang cells by Microculture Tetrazolium Technique (MTT) assay. The result
showed that Piper crocatum leaves powder has higher inhibition with value 86%
at 800 ppm which was higher than water and ethanol 30% with % inhibition 46%
at 800ppm and 39% at 400 ppm.
Keywords: cervical cancer, % inhibition, MTT, HeLa cells lines, Piper crocatum
POTENSI ANTIKANKER EKSTRAK DAUN
SIRIH MERAH (Piper crocatum) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum)
terhadap Sel HeLa
Nama
: Dhian Anugerah Purnama Suci
NIM
: G84090073
Disetujui oleh
Dr.Mega Safithri, S.Si, M.Si
Pembimbing I
Silmi Mariya, S.Si, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Daun Sjrih Merah (piper crocatum)
Judul Skripsi : Potensj Antik
terhadap Sel H eLa
: Dhian Anugerab P ,Tn"'''''''',,"
Nama
: G84090073
N1M
Disetuj ui oleh
Dr.Mega Safithri, S,Si, M,Si
Pembimbing I
Silmi Mariya, S,Si, MSi
,Pembimbing n
.Sc
TanggaI Lulus:
28 JAN 2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan
judul Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Sel HeLa. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan September 2012 sampai
Agustus 2013. Bertempat di Laboratorium Biokimia, FMIPA IPB untuk
persiapan ekstrak dan pengujian MTT dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi
dan Imunologi Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat Pusat Studi
Satwa Primata (LPPM-PSSP), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Mega Safithri, S.Si, M.Si dan
Silmi Mariya S.Si, M.Si selaku komisi pembimbing atas segala kesabarannya
dalam memberikan bimbingan, arahan serta masukan kepada penulis dalam
penyusunan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga dipersembahkan kepada
kedua orang tua Bapak Agus Tisna Purwana dan Ibu Siti Yenny Chodijah, dan
adik tercinta Dwi Cheppy Dharmawan atas doa, kasih sayang dan dukunganya.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Mba Iin, Yayuk, Suhe,
Nofa, Anes, dan Hana atas bantuan, saran serta semangat. Ucapan terimakasih
juga penulis berikan kepada Deni Suhendar, Zakiya, Yusti, Wuri, Utti, Inong,
Indah, Novi, Mina atas doa, semangat, kasih sayang, dukungan moril serta segala
motivasi untuk selalu berusaha membuat penulis menjadi lebih baik. Tidak lupa
ucapan terima kasih kepada teman-teman Biokimia 46 atas segala doa, nasihat dan
dukungan yang telah diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan
manfaat bagi seluruh pembaca serta dapat menjadi langkah awal penulis untuk
mencapai impiannya.
Bogor, Januari 2014
Dhian Anugerah Purnama Suci
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
DAFTAR ISI
vii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Percobaan
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
4
Pembahasan
9
SIMPULAN
11
SARAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi kontrol positif
Sel Chang
Sel HeLa
5
5
6
6
7
7
8
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Strategi penelitian
Kadar air simplisia daun sirih merah
Rendemen ekstrak daun sirih merah
Aktivitas % inhibisi pada sel Chang
Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa
Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
terhadap sel Chang menggunakan program SPSS
7 Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
terhadap sel HeLa menggunakan program SPSS
14
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan penyakit yang menjadi salah satu ancaman
utama terhadap kesehatan karena merupakan penyebab kematian kedua setelah
penyakit jantung. Setiap tahunnya sekitar 7,6 juta orang di seluruh dunia
meninggal karena kanker (WHO 2008). Kanker serviks menduduki peringkat
kedua yang diderita oleh perempuan. Setiap tahunnya sekitar 53.000 kasus kanker
serviks terjadi, 85% kasus kanker serviks berasal dari negara berkembang
(Asiancancer 2012). Menurut Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2008,
kanker serviks merupakan jenis kanker tertinggi kedua di Indonesia dengan
persentasi pasien rawat inap sebesar 10,3 %. Berdasarkan Yayasan Kanker
Indonesia tahun 2006 kanker serviks menempati urutan pertama dengan angka 16
persen, yang kemudian disusul dengan kanker payudara 15 persen.
Pengobatan konvensional yang paling sering digunakan untuk mengobati
kanker serviks diantaranya adalah histerektomi, radiasi dan kemoterapi.
Histerektomi adalah cara yang paling sering digunakan. Terdapat dua jenis
histerektomi yaitu histerektomi pengangkatan leher rahim dan rahim dan
histerektomi radikal yaitu pengangkatan leher rahim, rahim, vagina bagian atas,
ovarium, saluran telur, kelenjar getah bening yang terkena. Radioterapi adalah
terapi dengan sinar radiasi yang dapat merusakan sel kanker. Kekurangan
radioterapi adalah efek radiasinya dapat merusak fungsi dari ovarium terutama
pada wanita yang belum menopause. Kemoterapi pada pasien kanker serviks lebih
dianjurkan bagi para penderita kanker serviks stadium lanjut maupun pasien
dengan kasus kekambuhan. Namun dampak negatif yang dihasilkan kemoterapi
sangatlah besar, bagi pasien kanker serviks dengan kondisi tubuh yang lemah
umumnya tidak tahan dengan pengobatan seperti ini (Asiancancer 2012). Efek
samping dari kemoterapi dan radioterapi diantaranya adalah mual, muntah, dan
rambut rontok, masalah kulit, dan kelelahan (Semuel 2008).
Berbagai kendala dan efek samping yang ditimbulkan dari berbagai cara
pengobatan kanker memicu perlunya suatu terobosan cara pengobatan kanker
dengan efektifitas tinggi dan efek samping yang minimal. Salah satu upaya untuk
mengatasi penyakit kanker ini adalah mengembangkan pembuatan obat herbal
dari tumbuh-tumbuhan yang memiliki senyawa antikanker. Indonesia sebagai
negara dengan kekayaan biodiversitas yang tinggi memiliki banyak tumbuhan
yang dapat digunakan sebagai obat-obatan. Departemen Perdagangan Indonesia
(2011) menyebutkan Indonesia memiliki sebanyak 30.000 tanaman obat dari total
40.000 tanaman obat di dunia. Eksplorasi tumbuhan yang berpotensi sebagai
antikanker perlu terus dikembangkan karena ancaman penyait kanker yang
semakin hari semakin meningkat dan semakin tingginya biaya yang harus
dikeluarkan untuk pengobatan kanker.
Salah satu tanaman yang berkhasiat antikanker adalah sirih merah (Piper
crocatum). Menurut Safithri dan Fahma (2005), daun sirih merah mengandung
senyawa bioaktif flavonoid, alkaloid, dan tanin dalam ekstrak air. Berbagai
penelitian mengenai khasiat sirih merah telah banyak dilakukan, diantaranya
penelitian yang dilakukan oleh Safithri (2012) formula ekstrak daun sirih merah
dan kulit kayu manis dengan perbandingan (5:3) memiliki aktivitas
antihiperglikemik yang diukur secara in vitro. Penelitian Alfarabi (2010)
2
menyatakan bahwa ektrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan
dengan menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat 80.40%, selain itu
juga memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Penelitian Wicaksono
(2009) ekstrak methanol daun sirih merah dapat menghambat proliferasi sel
kanker payudara (T47D).
Penelitian ini diharapkan bisa dijadikan sebagai informasi penting tehadap
khasiat ekstrak air, etanol 30%, dan serbuk simplisia sirih merah sebagai
antikanker. Penelitian ini juga diharapkan dapat dikembangkan dan diaplikasikan
untuk dijadikan sebagai obat tradisional antikanker. Sampai saat ini belum ada
laporan penelitian tentang aktivitas ekstrak air dan etanol 30% sirihmerah (Piper
crocatum) terhadap sel kanker serviks baik secara in vitro maupun in vivo.
Penelitian ini bertujuan menguji potensi antikanker terbaik dari ekstrak air, etanol
30% dan simplisia daun sirih merah terhadap sel hati (Chang) sebagai kontrol sel
normal dan sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro dengan metode MTT assay.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2012 hingga Agustus 2013
yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi
Satwa Primata LPPM IPB, Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper
crocatum), etanol 30%, akuades, sel kanker servik (HeLa, ATCC-CCL 2) dan sel
hati normal (Chang, ATCC-CCL 13) didapat dari American Type Culture
Collection., Doxorubicin dan Cisplatin sebagai kontrol positif, Fetal Bovine
Serum (FBS), Media Dulbecco’s Modifed Eagle Medium (D-MEM), kanamisin,
3-(4-,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), larutan SDS
10%, HCl, kristal formazan, kertas saring Whatmann No.1.
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah, penggiling, pipet tetes, pipet volumetrik,
pipet mikro, neraca analitik, blender, rotavapor, microplate, Biosafety cabinet
class II, sentrifuse, inkubator CO2, perangkat sumur kultur, mikropipet,
microplate reader, dan alat gelas.
Prosedur Percobaan
Pengeringan bahan uji
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air yang
mengalir dan ditiriskan. Selanjutnya tanaman dirajang dan dijemur di bawah sinar
matahari pada jam 10.00-13.00 selama 3 hari. Daun sirih merah yang sudah
kering dilakukan penggilingan untuk mendapatkan serbuk dengan ukuran 60
mesh.
3
Penentuan Kadar air (metode SNI 01-2891-1992 yang dimodifikasi)
Cawan porselin dikeringkan dalam oven 105 °C selama 3 jam, kemudian
ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Setelah itu ditimbang dengan neraca
sartorius (a). Lalu ke dalam cawan ditambahkan sebanyak 2.0-2.5 g sampel (b).
Cawan yang berisi sampel ditempatkan dalam oven 105 °C selama 3 jam. Setelah
itu ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Bobot cawan dan sampel
ditimbang (c). Pengeringan dilakukan beberapa kali sampai bobot sampel yang
diperoleh konstan. Analisis dilakukan 3 kali ulangan untuk masing-masing
sampel.
% Bobot kering (BK) =
x 100%
% Kadar air = 100 - %BK
Pembuatan ekstrak daun sirih merah (Depkes RI 2000)
Serbuk kering daun sirih merah diekstrak dengan metode refluks. Serbuk
kering daun sirih merah sebanyak 20 g diekstrasi dengan 200 ml akuades dan 200
ml etanol 30% selama 2 jam pada suhu 100 °C untuk ekstrak air dan 70 °C untuk
ekstrak etanol 30% menggunakan refluks. Ekstrak yang diperoleh kemudian
disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali selama 6 jam. Kemudian
ekstrak dilakukan freeze dry sehingga diperoleh ekstrak kasar.
Uji Sitotoksisitas dan Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah terhadap Sel
Chang dan Sel Hela (Hsu et al.. 2010).
Pengujian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi
Pusat Studi Satwa Primata LPPM-IPB, Bogor.
Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke
dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik
penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan
ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel (Li et al.. 2011). Sel Chang dan sel HeLa ditumbuhkan
menggunakan flask dalam media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada
dinding flask), medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan
PBS. Setelah itu, ditambahkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan
selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media penumbuh. Suspensi tersebut
disentrifus pada kecepatan 700g selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh
dibuang dan pellet (sel) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah
itu, dilakukan perhitungan jumlah sel. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing
sumur ditumbuhkan 5.000 sel dalam 100 μL kultur sel tiap sumur sebanyak 96
sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (overnight) dalam inkubator
CO2 5% pada suhu 37oC.
Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel diinkubasi selama 24 jam
medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang
diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 30%, dan simplisia. Masing-masing
larutan ekstrak terdiri atas 5 konsentrasi akhir pada microplate. Tahap awal
perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak dengan konsentrasi
masing-masing 10000 ppm, yang dibuat dengan cara melarutkan 10 mg ekstrak
dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950 μL DMEM. Masingmasing larutan ekstrak kemudian diencerkan dengan menambahkan DMEM untuk
4
mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate. Konsentrasi akhir yang
digunakan pada ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia adalah 6.25, 12.5, 25, 50,
dan 100, 200, 400, dan 800 ppm. Sumur microplate yang berisi sel dari tahap
sebelumnya (kultur sel), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji di atas sebagai
perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai kontrol negatif. Campuran
dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 5%
pada suhu 37oC.
Uji MTT assay (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam, dimasukkan
garam tetrazolium 5mg/ml sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi
kuning. Inkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Setelah
diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal
formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur.
Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur
dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan
dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai
absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi %
inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al.. 2005):
% Inhibisi =
x100%.
Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak dilakukan
dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat perbedaan
yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program
SPSS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa rata-rata kadar air simplisia
daun sirih merah yang didapat adalah 8.41%. Daun sirih merah diekstraksi dengan
metode refluks menggunakan dua jenis pelarut yaitu air dan etanol 30 %.
Ekstraksi simplisia daun sirih merah menghasilkan ekstrak yang berbentuk kristal
setelah dilakukan freezedry. Ekstrak air dan etanol 30% yang diperoleh berwarna
coklat kemerahan. Nilai rendemen ekstrak daun sirih merah yang diperoleh dapat
dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstrak etanol 30% daun
sirih merah menghasilkan rendemen terbesar yaitu sebesar 31.42%.
5
Tabel 1 Rendemen ekstrak daun sirih merah
Pelarut
Rendemen
(%)
31.42
17.42
Etanol 30 %
Air
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih
Merah
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk simplisia daun sirih merah dapat
dilihat pada Gambar 1 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang
dan Gambar 2 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Baik hasil uji
sitotoksisitas maupun hasil aktivitas antikanker daun sirih merah ditandai dengan
% inhibisi sel. Hasil uji % inhibisi simplisia daun sirih merah terhadap sel Chang
menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang.
Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800 ppm
dengan % inhibisi 84.11%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang
lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif
antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 2). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel
HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi 85.74%.
120
84.11 ± 13.01d
Inhibisi
100
40.39 ± 37.05b,c
80
47.31 ± 2.30c
36.91 ± 2.25a,b,c
16.62 ± 12.54b,c
24.42 ± 7.15a,b,c
b,c
a
15.89
±
4.24
9.37 ± 5.68
60
40
20
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
Konsentrasi (ppm)
Gambar 1 Inhibisi simplisia pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
100
85.74 ± 1.71e
80
40.25 ± 14.33d
32.19 ± 14.84c,d
Inhibisi
60
40
19.27 ± 5.77b,c,d
11.95 ± 18.36b,c
1.87 ± 10.78a,b
10.38 ± 1.03a,b
20
-9.86 ± 12.84 a
0
-20
-40
6.25
12.5
25
50
100
200
400
Konsentrasi (ppm)
Gambar 2 Inhibisi simplisia pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
800
6
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak etanol 30% daun sirih merah
dapat dilihat pada Gambar 3 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel
Chang dan Gambar 4 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji
% inhibisi etanol 30% daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan nilai
yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat
pada Gambar 3. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi
800 ppm dengan % inhibisi 84.30%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi
yang lainnya. Hasil % inhibisi etanol 30% pada sel HeLa juga menunjukan hasil
yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 4). Hasil % inhibisi
tertinggi pada sel HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi
38.09%.
100
84.30 ± 1.53b
80
22.11 ± 36.50a
Inhibisi
60
22.28 ± 26.80a
31.42 ± 2.15a
40
20
6.95 ± 13.58a
10.69 ± 5.22a
0.53 ± 3.84a
-0.79 ± 2.07a
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
-20
Konsentrasi (ppm)
Gambar 3 Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang pada variasi
konsentrasi (%)
38.09 ± 4.45b
39.28 ± 2.36b
50
40
15.38 ± 18.76a
16.06 ± 11.14a
15.91 ± 5.08a
Inhibisi
30
a
20 0.37 ± 17.94
-1.72 ± 15.75a
7.47 ± 4.85a
10
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
-10
-20
-30
Konsentrasi (ppm)
Gambar 4 Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel HeLa pada variasi
konsentrasi (%)
800
7
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak air daun sirih merah dapat
dilihat pada Gambar 5 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang
dan Gambar 6 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji %
inhibisi ekstrak air daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan hasil yang
fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat pada
Gambar 5. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800
ppm dengan % inhibisi 39.21%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang
lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif
antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 6). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel
HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 45.56%.
50
39.21 ± 3.80d
45
40
22.78 ± 7.57c
35
Inhibisi
30
14.60 ± 11.13a,b,c
25
17.69 ± 2.14b,c
13.39 ± 8.49a,b,c
20 8.64 ± 6.10a,b
6.05 ± 4.97a,b
3.57 ± 5.52a
15
10
5
0
-5
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
Konsentrasi (ppm)
Gambar 5 Inhibisi ekstrak air pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
60
45.56 ± 2.05d
50
40
Inhibisi
30
20
10
-1.19 ± 11.25b,c
-20.69 ± 10.85a
0
-10
-4.26 ± 17.15a
6.25
12.5
15.46 ± 10.66c
5.53 ± 10.32b,c
16.73 ± 1.49c
-1.57 ± 2.02b,c
25
50
100
200
400
-20
-30
-40
Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
800
8
Inhibisi
Aktivitas % inhibisi pada kontrol positif dapat dilihat pada Gambar 7.
Aktivitas % inhibisi yang dihasilkan oleh doxorubicin pada sel Chang dengan
konsentrasi 1 dan 3 ppm adalah 81.01% dan 94. 79% sedangkan untuk cisplatin
pada konsentrasi 1 dan 3 ppm nilai % inhibisinya adalah 20.34%, dan 55. 13%
pada sel Chang. Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa untuk doxorubicin 1 dan 3
ppm adalah 34.06% dan 70.13%, sedangkan cisplatin pada 1 dan 3 ppm nilai %
inhibisinya 16.28% dan 42.84% Berdasarkan data tersebut dapat terlihat bahwa
baik doxorubicin ataupun cisplatin lebih banyak membunuh sel Chang daripada
sel HeLa.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
94.79 ± 0.02
81.01 ± 0.005
70.13 ± 0.007
55.13 ± 0.013
42.87 ± 0.013
34.06 ± 0.054
20.34 ± 0.012
16.28 ± 0.059
Doxorubicin 1
ppm
Doxorubicin 3
ppm
Chang
Cisplatin 1ppm
Cisplatin 3 ppm
HeLa
Gambar 7 Inhibisi kontrol positif (%)
Morfologi sel Chang dan sel HeLa diamati dibawah mikroskop (Gambar 1
dan 2). Bentuk sel Chang dan sel HeLa yang tanpa perlakuan tampak melekat
pada bagian permukaan tempat tumbuh sel, selain itu sel juga masih berbentuk
epithelial-like (CLS 2013). Sedangkan sel Chang dan sel HeLa yang telah
mendapat perlakuan dan mengalami inhibisi 50% akan jelas terlihat perubahan
morfologinya diantaranya sel sudah tidak lagi terlihat berkoloni dan telah terlepas
dari tempat tumbuhnya.
1
2
(a)
(b)
(c)
Gambar 8 Sel Chang (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi 50% ;
1: sel hidup, 2: sel mati
9
2
1
(a)
(b)
(c)
Gambar 9 Sel HeLa (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi 50%;
1: sel hidup, 2: sel mati
Pembahasan
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan adalah daun sirih merah segar yang
telah dicuci, dikeringkan, lalu digiling sehingga diperoleh ukuran 60 mesh.
Selanjutnya dilakukan analisis kadar air. Analisis kadar air dilakukan untuk
menentukan masa simpan dari serbuk simplisa. Berdasarkan Keputusan Menteri
Kesehatan RI nomor 661/MENKES/SK/VII/1994 tentang persyaratan obat
tradisional, kadar air simplisia yang diperbolehkan adalah kurang dari 10%.
Rerata kadar air simplisia daun sirih merah yang diperoleh sebesar 8.41%. Hasil
tersebut menunjukan bahwa simplisia daun sirih merah dapat digunakan sebagai
obat tradisional. Kadar air juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam
perhitungan rendemen ekstrak.
Ekstraksi daun sirih merah dilakukan dengan dua macam pelarut yaitu
etanol 30% dan air. Pelarut etanol 30% dan air dipilih karena menurut BPOM
(2004) pelarut tersebut aman untuk pangan. Metode ekstraksi yang digunakan
adalah refluks. Penggunaan refluks didasari atas kebiasan masyarakat dalam
penggunaan daun sirih merah sebagai obat yaitu dengan pemanasan melalui
proses perebusan. Berdasarkan penelitian Safithri (2005) rebusan air daun sirih
merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tanin. Flavonoid merupakan
senyawa aktif yang dapat menghambat pertumbuhan sel kanker (Harlen et al..
2011). Berdasarkan hasil rendemen tertinggi diperoleh oleh ekstrak etanol 30%
yaitu sebesar 31.42%. Hasil ini mengindikasikan bahwa komponen-komponen
bioaktif dalam daun sirih merah banyak terdapat pada etanol 30%.
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih
Merah
Aktivitas sitotoksisitas sel Chang dan antikanker sel HeLa menggunakan
metode MTT assay. Metode ini dilakukan dalam sebuah microplate (96 sumur)
dengan mengukur viabilitas sel berdasarkan prinsip kolorimetri dengan
menggunakan microplate reader. Prinsip kerja dari metode MTT assay didasari
oleh reduksi garam tetrazolium oleh enzim suksinat dehidrogenase yang berada
pada mitokondria sel hidup (Willey 2010). Reaksi tersebut akan menghasilkan
kristal formazan yang tidak dapat larut dalam air, oleh karena itu digunakan etanol
10
96% untuk melarutkannya sehingga membentuk warna ungu pada sel yang hidup.
Pengukuran inhibisi sel didasari pada pengukuran absorban kristal formazan yang
terlarut pada panjang gelombang 595 nm. Absorban yang terukur sebanding
dengan jumlah sel yang hidup pada sumur.
Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu doxorubicin dan
cisplastin. Kedua obat tersebut merupakan obat yang digunakan untuk kemoterapi.
Kemoterapi merupakan terapi sistematik yang dapat digunakan untuk
menghambat pertumbuhan kanker atau untuk membunuh sel sel kanker dengan
obat-obat anti kanker yang disebut sitostatika (Sukardja 2000). Kontrol positif
diujikan pada sel Chang yang merupakan sel normal dan juga pada sel HeLa yang
merupakan sek kanker serviks. Kontrol digunakan sebagai pembanding
selektifitas dari simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel HeLa. Hasil
pengujian kontrol positif menunjukan bahwa baik doxorubicin ataupun cisplatin
lebih banyak menghambat pertumbuhan sel Chang daripada sel HeLa.
Pengujian antikanker pada penelitian ini diawali dengan pengujian
sitotoksisitas simplisia ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal dengan
metode MTT assay. Pengujian sitotoksisitas bertujuan untuk mengetahui
keamanan simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal. Sel normal
yang digunakan pada penelitian ini adalah sel Chang. Sel Chang adalah sel liver
manusia dan berbentuk epithelial. Hasil uji sitotoksisitas pada sel chang
menunjukan bahwa terdapat hasil yang fluktuatif antara konsentrasi sampel
dengan % inhibisi. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan senyawa yang
terdapat terkandung pada setiap konsentrasinya baik pada ekstrak maupun
simplisia karena masih banyaknya senyawa yang terdapat dalam simplisia ataupun
ekstrak daun sirih merah. Persen inhibisi tertinggi terdapat pada ekstrak etanol
30% dan simplisia daun sirih merah menghambat >80% pertumbuhan populasi sel
Chang pada konsentrasi 800 ppm. Nilai ini masih diatas persen inhibisi cisplatin
dan doxorubicin 1 ppm. Ekstrak air sendiri pada konsentrasi yang sama hanya
menghambat
(Piper crocatum) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antikanker
Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa adalah benar
karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan dibiayai oleh DIKTI dalam
bentuk PKMP tahun 2013 dan BPOPTN 2013. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Dhian Anugerah Purnama Suci
NIM G84090073
ABSTRAK
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih
Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa dibimbing oleh MEGA SAFITHRI
dan SILMI MARIYA.
Kanker serviks merupakan kanker penyebab kematian kedua terbesar pada
wanita di Indonesia setelah kanker payudara. Salah satu upaya pengobatan kanker
dapat dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Salah satu
tanaman yang mempunyai potensi sebagai antikanker adalah daun sirih merah.
Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak methanol daun sirih merah memiliki
nilai IC50 44.25µg/mL pada sel kanker payudara (T47D). Tujuan dari penelitian
ini adalah mengetahui aktivitas antikanker ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia
daun sirih merah terhadap sel Chang dan sel HeLa secara in vitro dengan uji
Microculture Tetrazolium Technique (MTT). Hasil uji menunjukkan potensi
antikanker terbaik adalah simplisia daun sirih merah yang dapat menghambat
86 % pertumbuhan sel HeLa dibandingkan dengan ekstrak air dan etanol 30%
dengan nilai % inhibisi masing-masing 46% pada konsentrasi 800 ppm dan 39%
pada konsentrasi 400 ppm.
Kata kunci: kanker serviks, % inhibisi, MTT, sel HeLa, Sirih merah
ABSTRACT
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Anticancer Activity OfPiper
crocatum Leaves Extract In Hela Cells. Supervised by MEGA SAFITHRI and
SILMI MARIYA.
Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian
after human breast cancer. One of the efforts of cancer treatment is the utilization
of natural materials compounds. Some plants have potential as anticancer for
example leaves of Piper crocatum. Base of previous study methanol extract Piper
crocatum has IC50 values 44.25 µg/mL on breast cancer cells (T47D). The
purpose of this study was to determine inhibition activity of Piper crocatum
ethanol, waters extract and Piper crocatum leaves powder against HeLa and
Chang cells by Microculture Tetrazolium Technique (MTT) assay. The result
showed that Piper crocatum leaves powder has higher inhibition with value 86%
at 800 ppm which was higher than water and ethanol 30% with % inhibition 46%
at 800ppm and 39% at 400 ppm.
Keywords: cervical cancer, % inhibition, MTT, HeLa cells lines, Piper crocatum
POTENSI ANTIKANKER EKSTRAK DAUN
SIRIH MERAH (Piper crocatum) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum)
terhadap Sel HeLa
Nama
: Dhian Anugerah Purnama Suci
NIM
: G84090073
Disetujui oleh
Dr.Mega Safithri, S.Si, M.Si
Pembimbing I
Silmi Mariya, S.Si, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Daun Sjrih Merah (piper crocatum)
Judul Skripsi : Potensj Antik
terhadap Sel H eLa
: Dhian Anugerab P ,Tn"'''''''',,"
Nama
: G84090073
N1M
Disetuj ui oleh
Dr.Mega Safithri, S,Si, M,Si
Pembimbing I
Silmi Mariya, S,Si, MSi
,Pembimbing n
.Sc
TanggaI Lulus:
28 JAN 2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan
judul Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Sel HeLa. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan September 2012 sampai
Agustus 2013. Bertempat di Laboratorium Biokimia, FMIPA IPB untuk
persiapan ekstrak dan pengujian MTT dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi
dan Imunologi Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat Pusat Studi
Satwa Primata (LPPM-PSSP), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Mega Safithri, S.Si, M.Si dan
Silmi Mariya S.Si, M.Si selaku komisi pembimbing atas segala kesabarannya
dalam memberikan bimbingan, arahan serta masukan kepada penulis dalam
penyusunan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga dipersembahkan kepada
kedua orang tua Bapak Agus Tisna Purwana dan Ibu Siti Yenny Chodijah, dan
adik tercinta Dwi Cheppy Dharmawan atas doa, kasih sayang dan dukunganya.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Mba Iin, Yayuk, Suhe,
Nofa, Anes, dan Hana atas bantuan, saran serta semangat. Ucapan terimakasih
juga penulis berikan kepada Deni Suhendar, Zakiya, Yusti, Wuri, Utti, Inong,
Indah, Novi, Mina atas doa, semangat, kasih sayang, dukungan moril serta segala
motivasi untuk selalu berusaha membuat penulis menjadi lebih baik. Tidak lupa
ucapan terima kasih kepada teman-teman Biokimia 46 atas segala doa, nasihat dan
dukungan yang telah diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan
manfaat bagi seluruh pembaca serta dapat menjadi langkah awal penulis untuk
mencapai impiannya.
Bogor, Januari 2014
Dhian Anugerah Purnama Suci
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
DAFTAR ISI
vii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Percobaan
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
4
Pembahasan
9
SIMPULAN
11
SARAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel Chang
Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa
Aktivitas Inhibisi kontrol positif
Sel Chang
Sel HeLa
5
5
6
6
7
7
8
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Strategi penelitian
Kadar air simplisia daun sirih merah
Rendemen ekstrak daun sirih merah
Aktivitas % inhibisi pada sel Chang
Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa
Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
terhadap sel Chang menggunakan program SPSS
7 Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
terhadap sel HeLa menggunakan program SPSS
14
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan penyakit yang menjadi salah satu ancaman
utama terhadap kesehatan karena merupakan penyebab kematian kedua setelah
penyakit jantung. Setiap tahunnya sekitar 7,6 juta orang di seluruh dunia
meninggal karena kanker (WHO 2008). Kanker serviks menduduki peringkat
kedua yang diderita oleh perempuan. Setiap tahunnya sekitar 53.000 kasus kanker
serviks terjadi, 85% kasus kanker serviks berasal dari negara berkembang
(Asiancancer 2012). Menurut Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2008,
kanker serviks merupakan jenis kanker tertinggi kedua di Indonesia dengan
persentasi pasien rawat inap sebesar 10,3 %. Berdasarkan Yayasan Kanker
Indonesia tahun 2006 kanker serviks menempati urutan pertama dengan angka 16
persen, yang kemudian disusul dengan kanker payudara 15 persen.
Pengobatan konvensional yang paling sering digunakan untuk mengobati
kanker serviks diantaranya adalah histerektomi, radiasi dan kemoterapi.
Histerektomi adalah cara yang paling sering digunakan. Terdapat dua jenis
histerektomi yaitu histerektomi pengangkatan leher rahim dan rahim dan
histerektomi radikal yaitu pengangkatan leher rahim, rahim, vagina bagian atas,
ovarium, saluran telur, kelenjar getah bening yang terkena. Radioterapi adalah
terapi dengan sinar radiasi yang dapat merusakan sel kanker. Kekurangan
radioterapi adalah efek radiasinya dapat merusak fungsi dari ovarium terutama
pada wanita yang belum menopause. Kemoterapi pada pasien kanker serviks lebih
dianjurkan bagi para penderita kanker serviks stadium lanjut maupun pasien
dengan kasus kekambuhan. Namun dampak negatif yang dihasilkan kemoterapi
sangatlah besar, bagi pasien kanker serviks dengan kondisi tubuh yang lemah
umumnya tidak tahan dengan pengobatan seperti ini (Asiancancer 2012). Efek
samping dari kemoterapi dan radioterapi diantaranya adalah mual, muntah, dan
rambut rontok, masalah kulit, dan kelelahan (Semuel 2008).
Berbagai kendala dan efek samping yang ditimbulkan dari berbagai cara
pengobatan kanker memicu perlunya suatu terobosan cara pengobatan kanker
dengan efektifitas tinggi dan efek samping yang minimal. Salah satu upaya untuk
mengatasi penyakit kanker ini adalah mengembangkan pembuatan obat herbal
dari tumbuh-tumbuhan yang memiliki senyawa antikanker. Indonesia sebagai
negara dengan kekayaan biodiversitas yang tinggi memiliki banyak tumbuhan
yang dapat digunakan sebagai obat-obatan. Departemen Perdagangan Indonesia
(2011) menyebutkan Indonesia memiliki sebanyak 30.000 tanaman obat dari total
40.000 tanaman obat di dunia. Eksplorasi tumbuhan yang berpotensi sebagai
antikanker perlu terus dikembangkan karena ancaman penyait kanker yang
semakin hari semakin meningkat dan semakin tingginya biaya yang harus
dikeluarkan untuk pengobatan kanker.
Salah satu tanaman yang berkhasiat antikanker adalah sirih merah (Piper
crocatum). Menurut Safithri dan Fahma (2005), daun sirih merah mengandung
senyawa bioaktif flavonoid, alkaloid, dan tanin dalam ekstrak air. Berbagai
penelitian mengenai khasiat sirih merah telah banyak dilakukan, diantaranya
penelitian yang dilakukan oleh Safithri (2012) formula ekstrak daun sirih merah
dan kulit kayu manis dengan perbandingan (5:3) memiliki aktivitas
antihiperglikemik yang diukur secara in vitro. Penelitian Alfarabi (2010)
2
menyatakan bahwa ektrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan
dengan menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat 80.40%, selain itu
juga memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Penelitian Wicaksono
(2009) ekstrak methanol daun sirih merah dapat menghambat proliferasi sel
kanker payudara (T47D).
Penelitian ini diharapkan bisa dijadikan sebagai informasi penting tehadap
khasiat ekstrak air, etanol 30%, dan serbuk simplisia sirih merah sebagai
antikanker. Penelitian ini juga diharapkan dapat dikembangkan dan diaplikasikan
untuk dijadikan sebagai obat tradisional antikanker. Sampai saat ini belum ada
laporan penelitian tentang aktivitas ekstrak air dan etanol 30% sirihmerah (Piper
crocatum) terhadap sel kanker serviks baik secara in vitro maupun in vivo.
Penelitian ini bertujuan menguji potensi antikanker terbaik dari ekstrak air, etanol
30% dan simplisia daun sirih merah terhadap sel hati (Chang) sebagai kontrol sel
normal dan sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro dengan metode MTT assay.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2012 hingga Agustus 2013
yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi
Satwa Primata LPPM IPB, Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper
crocatum), etanol 30%, akuades, sel kanker servik (HeLa, ATCC-CCL 2) dan sel
hati normal (Chang, ATCC-CCL 13) didapat dari American Type Culture
Collection., Doxorubicin dan Cisplatin sebagai kontrol positif, Fetal Bovine
Serum (FBS), Media Dulbecco’s Modifed Eagle Medium (D-MEM), kanamisin,
3-(4-,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), larutan SDS
10%, HCl, kristal formazan, kertas saring Whatmann No.1.
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah, penggiling, pipet tetes, pipet volumetrik,
pipet mikro, neraca analitik, blender, rotavapor, microplate, Biosafety cabinet
class II, sentrifuse, inkubator CO2, perangkat sumur kultur, mikropipet,
microplate reader, dan alat gelas.
Prosedur Percobaan
Pengeringan bahan uji
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air yang
mengalir dan ditiriskan. Selanjutnya tanaman dirajang dan dijemur di bawah sinar
matahari pada jam 10.00-13.00 selama 3 hari. Daun sirih merah yang sudah
kering dilakukan penggilingan untuk mendapatkan serbuk dengan ukuran 60
mesh.
3
Penentuan Kadar air (metode SNI 01-2891-1992 yang dimodifikasi)
Cawan porselin dikeringkan dalam oven 105 °C selama 3 jam, kemudian
ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Setelah itu ditimbang dengan neraca
sartorius (a). Lalu ke dalam cawan ditambahkan sebanyak 2.0-2.5 g sampel (b).
Cawan yang berisi sampel ditempatkan dalam oven 105 °C selama 3 jam. Setelah
itu ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Bobot cawan dan sampel
ditimbang (c). Pengeringan dilakukan beberapa kali sampai bobot sampel yang
diperoleh konstan. Analisis dilakukan 3 kali ulangan untuk masing-masing
sampel.
% Bobot kering (BK) =
x 100%
% Kadar air = 100 - %BK
Pembuatan ekstrak daun sirih merah (Depkes RI 2000)
Serbuk kering daun sirih merah diekstrak dengan metode refluks. Serbuk
kering daun sirih merah sebanyak 20 g diekstrasi dengan 200 ml akuades dan 200
ml etanol 30% selama 2 jam pada suhu 100 °C untuk ekstrak air dan 70 °C untuk
ekstrak etanol 30% menggunakan refluks. Ekstrak yang diperoleh kemudian
disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali selama 6 jam. Kemudian
ekstrak dilakukan freeze dry sehingga diperoleh ekstrak kasar.
Uji Sitotoksisitas dan Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah terhadap Sel
Chang dan Sel Hela (Hsu et al.. 2010).
Pengujian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi
Pusat Studi Satwa Primata LPPM-IPB, Bogor.
Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke
dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik
penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan
ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel (Li et al.. 2011). Sel Chang dan sel HeLa ditumbuhkan
menggunakan flask dalam media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada
dinding flask), medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan
PBS. Setelah itu, ditambahkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan
selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media penumbuh. Suspensi tersebut
disentrifus pada kecepatan 700g selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh
dibuang dan pellet (sel) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah
itu, dilakukan perhitungan jumlah sel. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing
sumur ditumbuhkan 5.000 sel dalam 100 μL kultur sel tiap sumur sebanyak 96
sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (overnight) dalam inkubator
CO2 5% pada suhu 37oC.
Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel diinkubasi selama 24 jam
medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang
diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 30%, dan simplisia. Masing-masing
larutan ekstrak terdiri atas 5 konsentrasi akhir pada microplate. Tahap awal
perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak dengan konsentrasi
masing-masing 10000 ppm, yang dibuat dengan cara melarutkan 10 mg ekstrak
dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950 μL DMEM. Masingmasing larutan ekstrak kemudian diencerkan dengan menambahkan DMEM untuk
4
mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate. Konsentrasi akhir yang
digunakan pada ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia adalah 6.25, 12.5, 25, 50,
dan 100, 200, 400, dan 800 ppm. Sumur microplate yang berisi sel dari tahap
sebelumnya (kultur sel), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji di atas sebagai
perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai kontrol negatif. Campuran
dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 5%
pada suhu 37oC.
Uji MTT assay (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam, dimasukkan
garam tetrazolium 5mg/ml sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi
kuning. Inkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Setelah
diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal
formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur.
Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur
dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan
dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai
absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi %
inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al.. 2005):
% Inhibisi =
x100%.
Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak dilakukan
dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat perbedaan
yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program
SPSS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa rata-rata kadar air simplisia
daun sirih merah yang didapat adalah 8.41%. Daun sirih merah diekstraksi dengan
metode refluks menggunakan dua jenis pelarut yaitu air dan etanol 30 %.
Ekstraksi simplisia daun sirih merah menghasilkan ekstrak yang berbentuk kristal
setelah dilakukan freezedry. Ekstrak air dan etanol 30% yang diperoleh berwarna
coklat kemerahan. Nilai rendemen ekstrak daun sirih merah yang diperoleh dapat
dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstrak etanol 30% daun
sirih merah menghasilkan rendemen terbesar yaitu sebesar 31.42%.
5
Tabel 1 Rendemen ekstrak daun sirih merah
Pelarut
Rendemen
(%)
31.42
17.42
Etanol 30 %
Air
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih
Merah
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk simplisia daun sirih merah dapat
dilihat pada Gambar 1 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang
dan Gambar 2 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Baik hasil uji
sitotoksisitas maupun hasil aktivitas antikanker daun sirih merah ditandai dengan
% inhibisi sel. Hasil uji % inhibisi simplisia daun sirih merah terhadap sel Chang
menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang.
Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800 ppm
dengan % inhibisi 84.11%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang
lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif
antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 2). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel
HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi 85.74%.
120
84.11 ± 13.01d
Inhibisi
100
40.39 ± 37.05b,c
80
47.31 ± 2.30c
36.91 ± 2.25a,b,c
16.62 ± 12.54b,c
24.42 ± 7.15a,b,c
b,c
a
15.89
±
4.24
9.37 ± 5.68
60
40
20
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
Konsentrasi (ppm)
Gambar 1 Inhibisi simplisia pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
100
85.74 ± 1.71e
80
40.25 ± 14.33d
32.19 ± 14.84c,d
Inhibisi
60
40
19.27 ± 5.77b,c,d
11.95 ± 18.36b,c
1.87 ± 10.78a,b
10.38 ± 1.03a,b
20
-9.86 ± 12.84 a
0
-20
-40
6.25
12.5
25
50
100
200
400
Konsentrasi (ppm)
Gambar 2 Inhibisi simplisia pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
800
6
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak etanol 30% daun sirih merah
dapat dilihat pada Gambar 3 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel
Chang dan Gambar 4 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji
% inhibisi etanol 30% daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan nilai
yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat
pada Gambar 3. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi
800 ppm dengan % inhibisi 84.30%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi
yang lainnya. Hasil % inhibisi etanol 30% pada sel HeLa juga menunjukan hasil
yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 4). Hasil % inhibisi
tertinggi pada sel HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi
38.09%.
100
84.30 ± 1.53b
80
22.11 ± 36.50a
Inhibisi
60
22.28 ± 26.80a
31.42 ± 2.15a
40
20
6.95 ± 13.58a
10.69 ± 5.22a
0.53 ± 3.84a
-0.79 ± 2.07a
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
-20
Konsentrasi (ppm)
Gambar 3 Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang pada variasi
konsentrasi (%)
38.09 ± 4.45b
39.28 ± 2.36b
50
40
15.38 ± 18.76a
16.06 ± 11.14a
15.91 ± 5.08a
Inhibisi
30
a
20 0.37 ± 17.94
-1.72 ± 15.75a
7.47 ± 4.85a
10
0
6.25
12.5
25
50
100
200
400
-10
-20
-30
Konsentrasi (ppm)
Gambar 4 Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel HeLa pada variasi
konsentrasi (%)
800
7
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak air daun sirih merah dapat
dilihat pada Gambar 5 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang
dan Gambar 6 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji %
inhibisi ekstrak air daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan hasil yang
fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat pada
Gambar 5. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800
ppm dengan % inhibisi 39.21%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang
lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif
antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 6). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel
HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 45.56%.
50
39.21 ± 3.80d
45
40
22.78 ± 7.57c
35
Inhibisi
30
14.60 ± 11.13a,b,c
25
17.69 ± 2.14b,c
13.39 ± 8.49a,b,c
20 8.64 ± 6.10a,b
6.05 ± 4.97a,b
3.57 ± 5.52a
15
10
5
0
-5
6.25
12.5
25
50
100
200
400
800
Konsentrasi (ppm)
Gambar 5 Inhibisi ekstrak air pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
60
45.56 ± 2.05d
50
40
Inhibisi
30
20
10
-1.19 ± 11.25b,c
-20.69 ± 10.85a
0
-10
-4.26 ± 17.15a
6.25
12.5
15.46 ± 10.66c
5.53 ± 10.32b,c
16.73 ± 1.49c
-1.57 ± 2.02b,c
25
50
100
200
400
-20
-30
-40
Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
800
8
Inhibisi
Aktivitas % inhibisi pada kontrol positif dapat dilihat pada Gambar 7.
Aktivitas % inhibisi yang dihasilkan oleh doxorubicin pada sel Chang dengan
konsentrasi 1 dan 3 ppm adalah 81.01% dan 94. 79% sedangkan untuk cisplatin
pada konsentrasi 1 dan 3 ppm nilai % inhibisinya adalah 20.34%, dan 55. 13%
pada sel Chang. Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa untuk doxorubicin 1 dan 3
ppm adalah 34.06% dan 70.13%, sedangkan cisplatin pada 1 dan 3 ppm nilai %
inhibisinya 16.28% dan 42.84% Berdasarkan data tersebut dapat terlihat bahwa
baik doxorubicin ataupun cisplatin lebih banyak membunuh sel Chang daripada
sel HeLa.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
94.79 ± 0.02
81.01 ± 0.005
70.13 ± 0.007
55.13 ± 0.013
42.87 ± 0.013
34.06 ± 0.054
20.34 ± 0.012
16.28 ± 0.059
Doxorubicin 1
ppm
Doxorubicin 3
ppm
Chang
Cisplatin 1ppm
Cisplatin 3 ppm
HeLa
Gambar 7 Inhibisi kontrol positif (%)
Morfologi sel Chang dan sel HeLa diamati dibawah mikroskop (Gambar 1
dan 2). Bentuk sel Chang dan sel HeLa yang tanpa perlakuan tampak melekat
pada bagian permukaan tempat tumbuh sel, selain itu sel juga masih berbentuk
epithelial-like (CLS 2013). Sedangkan sel Chang dan sel HeLa yang telah
mendapat perlakuan dan mengalami inhibisi 50% akan jelas terlihat perubahan
morfologinya diantaranya sel sudah tidak lagi terlihat berkoloni dan telah terlepas
dari tempat tumbuhnya.
1
2
(a)
(b)
(c)
Gambar 8 Sel Chang (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi 50% ;
1: sel hidup, 2: sel mati
9
2
1
(a)
(b)
(c)
Gambar 9 Sel HeLa (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi 50%;
1: sel hidup, 2: sel mati
Pembahasan
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan adalah daun sirih merah segar yang
telah dicuci, dikeringkan, lalu digiling sehingga diperoleh ukuran 60 mesh.
Selanjutnya dilakukan analisis kadar air. Analisis kadar air dilakukan untuk
menentukan masa simpan dari serbuk simplisa. Berdasarkan Keputusan Menteri
Kesehatan RI nomor 661/MENKES/SK/VII/1994 tentang persyaratan obat
tradisional, kadar air simplisia yang diperbolehkan adalah kurang dari 10%.
Rerata kadar air simplisia daun sirih merah yang diperoleh sebesar 8.41%. Hasil
tersebut menunjukan bahwa simplisia daun sirih merah dapat digunakan sebagai
obat tradisional. Kadar air juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam
perhitungan rendemen ekstrak.
Ekstraksi daun sirih merah dilakukan dengan dua macam pelarut yaitu
etanol 30% dan air. Pelarut etanol 30% dan air dipilih karena menurut BPOM
(2004) pelarut tersebut aman untuk pangan. Metode ekstraksi yang digunakan
adalah refluks. Penggunaan refluks didasari atas kebiasan masyarakat dalam
penggunaan daun sirih merah sebagai obat yaitu dengan pemanasan melalui
proses perebusan. Berdasarkan penelitian Safithri (2005) rebusan air daun sirih
merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tanin. Flavonoid merupakan
senyawa aktif yang dapat menghambat pertumbuhan sel kanker (Harlen et al..
2011). Berdasarkan hasil rendemen tertinggi diperoleh oleh ekstrak etanol 30%
yaitu sebesar 31.42%. Hasil ini mengindikasikan bahwa komponen-komponen
bioaktif dalam daun sirih merah banyak terdapat pada etanol 30%.
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih
Merah
Aktivitas sitotoksisitas sel Chang dan antikanker sel HeLa menggunakan
metode MTT assay. Metode ini dilakukan dalam sebuah microplate (96 sumur)
dengan mengukur viabilitas sel berdasarkan prinsip kolorimetri dengan
menggunakan microplate reader. Prinsip kerja dari metode MTT assay didasari
oleh reduksi garam tetrazolium oleh enzim suksinat dehidrogenase yang berada
pada mitokondria sel hidup (Willey 2010). Reaksi tersebut akan menghasilkan
kristal formazan yang tidak dapat larut dalam air, oleh karena itu digunakan etanol
10
96% untuk melarutkannya sehingga membentuk warna ungu pada sel yang hidup.
Pengukuran inhibisi sel didasari pada pengukuran absorban kristal formazan yang
terlarut pada panjang gelombang 595 nm. Absorban yang terukur sebanding
dengan jumlah sel yang hidup pada sumur.
Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu doxorubicin dan
cisplastin. Kedua obat tersebut merupakan obat yang digunakan untuk kemoterapi.
Kemoterapi merupakan terapi sistematik yang dapat digunakan untuk
menghambat pertumbuhan kanker atau untuk membunuh sel sel kanker dengan
obat-obat anti kanker yang disebut sitostatika (Sukardja 2000). Kontrol positif
diujikan pada sel Chang yang merupakan sel normal dan juga pada sel HeLa yang
merupakan sek kanker serviks. Kontrol digunakan sebagai pembanding
selektifitas dari simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel HeLa. Hasil
pengujian kontrol positif menunjukan bahwa baik doxorubicin ataupun cisplatin
lebih banyak menghambat pertumbuhan sel Chang daripada sel HeLa.
Pengujian antikanker pada penelitian ini diawali dengan pengujian
sitotoksisitas simplisia ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal dengan
metode MTT assay. Pengujian sitotoksisitas bertujuan untuk mengetahui
keamanan simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal. Sel normal
yang digunakan pada penelitian ini adalah sel Chang. Sel Chang adalah sel liver
manusia dan berbentuk epithelial. Hasil uji sitotoksisitas pada sel chang
menunjukan bahwa terdapat hasil yang fluktuatif antara konsentrasi sampel
dengan % inhibisi. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan senyawa yang
terdapat terkandung pada setiap konsentrasinya baik pada ekstrak maupun
simplisia karena masih banyaknya senyawa yang terdapat dalam simplisia ataupun
ekstrak daun sirih merah. Persen inhibisi tertinggi terdapat pada ekstrak etanol
30% dan simplisia daun sirih merah menghambat >80% pertumbuhan populasi sel
Chang pada konsentrasi 800 ppm. Nilai ini masih diatas persen inhibisi cisplatin
dan doxorubicin 1 ppm. Ekstrak air sendiri pada konsentrasi yang sama hanya
menghambat