Bejana kultur Faktor Eksternal

10

2. Faktor Eksternal

a. Bejana kultur

Ukuran dan bentuk bejana kultur dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan. Bejana yang digunakan antara lain dapat berupa cawan petri Gambar 3A, botol bermulut sempit dengan volume 100 ml Gambar 3B, atau botol bermulut lebar dengan volume 350 ml Gambar 3C. Pilihan penggunaan bejana didasarkan pada ukuran awal eksplan dan prediksi ukuran akhir yang diharapkan. Pilihan yang tepat perlu dilakukan agar eksplan dapat tumbuh optimal karena ukuran bejana dan eksplan menentukan rasio eksplan:medium dan eksplan:udara. Hal ini mengakibatkan perbedaan konsentrasi oksigen, karbon dioksida, etilena dan senyawa volatil lainnya di ruang udara di dalam bejana Tisserat Silman, 2000. Gambar 3. Berbagai ukuran bejana kultur dan bahan penutup. A. Cawan petri diameter 9 cm dengan penutup kaca Rahayu et al., 2009; B. Botol volume 100 ml bermulut sempit dengan penutup aluminium foil Rahayu, 2007; C. Botol volume 300 ml bermulut lebar dengan penutup lembaran plastik Rahayu Sumadi, 2015. A C B C 11 Pertumbuhan berlangsung tidak optimal dalam bejana yang sangat kecil. Pada Lactuca sativa L. dan Mentha spicata L. terdapat korelasi positif antara ukuran bejana dengan berat segar, jumlah daun, jumlah akar dan jumlah tunas plantlet. Parameter pertumbuhan yang dicapai pada penggunaan bejana kultur 100 ml dan 150 ml lebih tinggi dibandingkan pada 25 ml atau 50 ml Tisserat Sillmann, 2000. Bentuk bejana juga dapat mempengaruhi laju pertumbuhan kultur berat segar, morfogenesis, dan tingkat proliferasi tunas aksiler karena memodifikasi laju difusi gas. Tisserat Silmann 2000 menunjukkan bahwa di tabung dengan volume yang sama, pertumbuhan eksplan lebih cepat bila perbandingan panjang dan diameter bejana relatif pendek, dan sebaliknya akan melambat apabila panjang bejana meningkat terhadap diameternya. Hal ini diduga berkait dengan jarak dan laju difusi gas. Semakin pendek jarak, semakin tinggi laju difusi, dan semakin tinggi kecepatan metabolisme eksplan. Ukuran dan bentuk wadah terbaik bervariasi dari satu spesies ke spesies lain, dan tergantung pada faktor-faktor lain seperti jenis penutup yang digunakan, volume medium, dan kepadatan inokulasi. Jenis penutup antara lain kaca Gambar 3A, aluminium foil Gambar 3B, plastik Gambar 3C, kapas dan sebagainya. b. Medium kultur Ada beberapa macam medium kultur in vitro, yaitu medium fase padat, fase cair, dan dua fase medium cair di atas medium padat. Setiap jenis medium cocok untuk tujuan tertentu, namun sebagian besar jenis kultur menggunakan medium padat. Medium fase padat memerlukan bahan pemadat yang harus memenuhi beberapa kriteria, yaitu 1 tidak rusak oleh sterilisasipemanasan, 2 tidak dapat diurai enzim, dan 3 tidak bereaksi dengan dengan komponen medium. Senyawa pemadat dan metode pemadatan yang digunakan tergantung pada jenis kultur dan tujuannya. Jenis bahan pemadat antara lain agar, 12 gelrite, dan phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar 7, sedangkan konsentrasi gelrite biasanya berkisar 3. Konsentrasi bahan pemadat yang terlalu tinggi mengakibatkan media menjadi sangat keras sehingga difusi hara ke eksplan menjadi berkurang. Bila menggunakan medium padat kontak eksplan dengan medium hanya pada bagian permukaan bawah. Hal ini dapat mengakibatkan eksplan kekurangan nutrisi dan ZPT. Selain itu difusi gas ke dalam dan ke luar sel-sel di dasar eksplan juga menjadi terbatas. Gambar 4. Medium cair dan bahan penunjang pada medium cair. A. Kultur suspensi sel daun dalam medium cair Rahayu, 2007. B. Kultur kalus dalam medium cair dengan kertas saring sebagai penunjang Rahayu, 2007, C. Kultur tunas pada medium cair dengan spons sebagai penunjang Rahayu, 2007, Medium cair sangat cocok untuk kultur suspensi sel, Gambar 4A, protoplas, organ yang sangat kecil seperti kepala sari, serta untuk diferensiasi kalus. Eksplan yang sangat kecil sering melayang pada permukaan atas medium cair sehingga dapat mengalami difusi gas secara memadai. Organ yang lebih besar seperti tunas dapat pula tumbuh dengan baik dalam medium cair apabila ada bagian tunas yang menonjol di atas permukaan medium. Eksplan yang tenggelam dalam medium statis dapat mati karena kekurangan aerasi. Untuk membantu agar organ atau potongan kecil jaringan tidak tenggelam di bawah permukaan medium cair yang statis diperlukan materi penunjang. Bahan A B C 13 penunjang dapat berupa kertas saring Gambar 4B atau spons Gambar 4C. Selain menggunakan bahan penunjang, untuk menyediakan aerasi dapat pula dilakukan penggojokan. Cara ini juga dapat mencegah sel dan agregat sel mengendap, mengurangi polaritas tumbuhan, dan memungkinkan distribusi nutrisi yang seragam. Fase medium berpengaruh terhadap pertumbuhan eksplan. plantlet Persea americana yang dikembangkan dari medium dua fase bersifat hyperhidric, stomata tidak normal, dan kapasitas pengakaran rendah; sedangkan yang dikembangkan pada medium padat mempunyai karakteristik normal de la Vina et al., 2001.

c. Lingkungan fisik kultur