Pemurnian protease dari daun mengkudu (Morinda citrifolia L )

PEMURNIAN PROTEASE DARI DAUN
MENGKUDU (Morinda citrifolia L.)

ELFI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
1

2

PERNYATAAN MENGENAI TESIS
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul : “Pemurnian
Protease dari Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.)”,

adalah benar

merupakan karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum

pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Maret 2011

Elfi
F 251070221/IPN

3

4

ABSTRACT
ELFI. Purification of Proteases from Noni (Morinda citrifolia L.) Leaves. Under
guidance of NURI ANDARWULAN and DAHRUL SYAH
It has been proved that protease could tenderize meat and octopuses. One of
the protease sources is noni (Morinda citrifolias L.) leaves. Yet, the study of
proteases in noni leaves has not been reported. The research was aimed to

characterize physic and chemistry of noni leaves and purify the protease of noni
leaves both from base and shoot part.
The physic and chemistry characterization of noni leaves was done by
observation and proximate analysis, respectively. The purification of noni leaves
proteases was conducted by several steps consisting of extraction, centrifugation,
precipitation using saturated ammonium sulfate (100%), dialysis and
electrophoresis also zymography.
The noni leaves used in this research have facing position, large and thick
size, single, flat edge, pinnate veins, green-shiny color, and hairless. Base leaves
are dark green dan shoot leaves are light green. The proximate analysis showed
that the protein content of base noni leaves (2.92%dry base) was lower than shoot
leaves (2.98% dry base). Purification of noni leaves proteases showed that the
crude extract of base leaves had higher enzyme specific activity (0.46U/mg
protein) than the crude extract of shoot leaves (0.43U/mg protein). Protein content
of base leaves (11.29%) was lower than the other (11.47%). Noni leaves
purification steps decreased protease specific activity. SDS-PAGE of shoot and
base leaves dialysates showed the polypeptides molecular weights were 5861.5kDa and 70kDa respectively; whereas zymogram showed the molecular
weight of the enzymes are 39kDa and 50kDa.

Keywords: noni leaves, protein, purification, protease specific activity

5

6

RINGKASAN
ELFI. Pemurnian Protease dari Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.).
Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan DAHRUL SYAH.
Daun mengkudu telah digunakan secara tradisional untuk mengempukkan
daging dan gurita. Sama halnya dengan penggunaan daun papaya untuk
mengempukkan daging.
Penelitian telah membuktikan bahwa aktifitas
pengempukan daging berkaitan dengan aktifitas enzim protease. Selama ini
penelitian protease pada daun mengkudu belum pernah dilaporkan. Penelitian ini
bertujuan untuk memurnikan protease dari daun mengkudu dari dua tingkat
ketuaan yang berbeda yaitu daun pangkal yang berwarna hijau tua dan daun pucuk
yang berwarna hijau agak muda, mengetahui aktifitas protease dan kadar protein
serta bobot molekul enzim protease yang dimurnikan.
Tahap pertama adalah mengkarakterisasi daun mengkudu baik sifat fisik
(pengamatan)

maupun kimia (analisa proksimat).
Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa daun mengkudu terletak berhadapan, ukuran daun besar,
tebal dan tunggal, tepi daun rata, urat daun menyirip dan warna hijau mengkilap
serta tidak berbulu. Hasil analisa proksimat menunjukkan bahwa kadar protein
daun pucuk sebesar 2.98% (db) lebih besar dari kadar protein daun pangkal
sebesar 2.92% (db).
Tahap kedua adalah memurnikan protease pada daun mengkudu. Pemurnian
protease daun mengkudu dilakukan dengan cara ekstraksi, sentrifugasi,
pengendapan protein (enzim) dan elektroforesis (SDS-PAGE) dan Zymografi.
Setiap tahap pemurnian dilakukan pada suhu dingin (4-6oC). Ekstraksi daun
mengkudu dilakukan menggunakan blender dengan penambahan buffer asetat
yang mengandung EDTA, polivinilpirolidon (PVP K30), β-merkaptoetanol dan
gliserol. Ekstrak daun mengkudu kemudian disaring dan disentrifus sehingga
didapatkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar ditambah silika 1.4% dan disentrifus
sehingga didapatkan ekstrak silika. Ekstrak silika yang diperoleh diendapkan
menggunakan ammonium sulfat 100% jenuh dan dilanjutkan dengan dialisis
menggunakan membran selulosa ber-MWCO 12kDa. Dialisat protein dipisahkan
dengan SDS-PAGE dan diwarnai dengan comassie brilliant blue dan protease
dipisahkan dengan zimografi (SDS-PAGE dengan kasein sebagai substrat enzim)

dan juga diwarnai dengan comassie brilliant blue. Analisa kadar protein dan
aktiftas proteolitik enzim dilakukan pada setiap tahap pemurnian.
Ekstrak kasar daun pangkal memiliki aktifitas protease sebesar 0.46U/mg
lebih tinggi bila dibandingkan dengan aktifitas protease daun pucuk sebesar
0.43U/mg dan kadar protein daun pangkal (11.29%)
lebih kecil bila
dibandingkan dengan daun pucuk (11.47%). Tahapan pemurnian enzim pada
daun mengkudu (daun pangkal dan daun pucuk) menurunkan aktifitas protease.

7

Analisis SDS-PAGE pada dialisat daun mengkudu (daun pangkal dan daun
pucuk) menunjukkan beberapa pita protein berukuran 58-61.5 kDa dan 70 kDa
dan analisis zimogram pada dialisat (daun pangkal dan daun pucuk) menunjukkan
beberapa pita enzim berberat molekul 29 kDa dan 50 kDa.
Kemiripan penggunaan papain (daun papaya) dan daun mengkudu sebagai
pengempuk daging dan penyembuh luka, diduga protease daun mengkudu sama
dengan papain dan bromelain yaitu termasuk protease sistein.
Kata kunci: daun mengkudu, protein, pemurnian, aktivitas spesifik protease

8

© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya,
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah.
b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

9

10

PEMURNIAN PROTEASE DARI DAUN
MENGKUDU (Morinda citrifolia L.)

ELFI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
11

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Didah Nur Faridah, STP., MSi.

12

Judul

:

Nama
NRP

:
:

Pemurnian Protease
(Morinda citrifolia L.)
Elfi
F251070221

dari

Daun

Mengkudu

Disetujui,
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M. Si.
Ketua

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.
Anggota

Diketahui,

Ketua Program Studi
Ilmu Pangan

Dr. Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc.

Tanggal Ujian :

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.

Tanggal Lulus :

13

14

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas berkat rahmat-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Pemurnian Protease
dari Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.)”. Pada kesempatan ini, penulis
ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1.

Suami: Jimmi Anka, anak-anak, Apa, Amak(alm), mertua (alm) dan adikadik serta seluruh keluarga besar untuk segala doa, dukungan materil dan
immaterial yang tiada henti.

2.

Dr. Ir. Nuri Andarwulan M.Si. dan Dr. Ir. Darul Syah M.Sc. selaku komisi
pembimbing atas waktu, perhatian, pikiran, dan motivasi yang diberikan

selama pembimbingan dalam menyelesaikan program magister di IPB.

3.

Dr. Didah Nur Faridah, STP. MSi. atas kesediaannya sebagai dosen penguji
luar komisi.

4.

Bapak Sawaludin atas hibah PVPP untuk penelitian

5.

SEAFAST CENTRE IPB atas bantuan dana penelitian dan fasilitas untuk
melakukan penelitian

6.

Dwi Ishartani sebagai teman seperjuangan baik suka maupun duka selama
penyusunan proposal, penelitian maupun penyusunan tesis

7.

Abah (Tubagus B) atas pinjaman pH meter, Mba Iceu, Diah, Dian, Rita, Fidi,
Desti dan teman-teman IPN angkatan 2007 atas masukan dan kebersamaan

8.

Dila dan “ tahu ranger” (Dita, Viktor dan Yogi) selama di Laboratorarium
Bioteknologi SEAFAST serta segenap teman dan kerabat yang tidak dapat
penulis sebutkan satu per satu.
Penulis berharap semoga karya tulis ilmiah ini dapat memberikan manfaat

yang sebesar-besarnya bagi semua pihak yang memerlukan.

Bogor, Maret 2011

ELFI

15

16

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bukittinggi Sumatera Barat pada tanggal 25
September 1975 sebagai putri tertua dari 5 bersaudara dari pasangan Syafri dan
Asniarti (Alm). Tahun 2001 penulis menikah dengan Jimmi Anka dan mempunyai
tiga orang putra (Haritsah S. Y, Ahmad Dzikri F. dan Naufal Khalid S.).
Penulis menyelesaikan pendidikan Srata 1 dari Jurusan Teknologi Pangan
dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian IPB pada tahun 1999. Tahun 2001-2003
penulis berkesempatan menjadi dosen honorer di jurusan Teknologi Pangan dan
Gizi IPB sebagai Penanggung Jawab Praktikum.

Pada tahun 2007 penulis

melanjutkan pendidikan Srata 2 pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah
Pascasarjana IPB dengan dukungan dana dari suami tercinta. Sebagai syarat
untuk memperoleh gelar Magister Sains pada program Ilmu Pangan IPB, penulis
menyelesaikan tesis dengan judul Pemurnian Protease dari Daun Mengkudu
(Morinda citrifolia L).

17

18

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI..................................................................................................... i
DAFTAR TABEL ............................................................................................. iii
DAFTAR GAMBAR......................................................................................... v
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... vii
PENDAHULUAN ........................................................................................ 1
Latar Belakang....................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ................................................................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA................................................................................ 5
Mengkudu (Morinda citrifolia L.).......................................................... 5
Protease Tumbuhan............................................................................... 7
Klasifikasi Protease................................................................................ 8
Pemurnian Enzim................................................................................... 12
Ekstraksi Enzim ............................................................................. 12
Pemekatan Enzim........................................................................... 12
Fraksinasi Enzim............................................................................ 13
Aplikasi Protease .................................................................................. 14
Pembuatan keju ............................................................................. 14
Pengempuk daging ......................................................................... 15
Penjernih Bir .................................................................................. 16
Pembuatan Hidrolisa Protein Kedele .............................................. 16
Penyembuh Luka............................................................................ 16
Terapi untuk Pencernaan dan Kanker ............................................. 16
Terapi Inflamasi dan Blood Clotting (Pembekan Darah)................. 17
BAHAN DAN METODE ............................................................................ 19
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................ 19
Bahan dan Alat ...................................................................................... 19
Metode Penelitian .................................................................................. 19
Karakterisasi Sifat Fisik dan Kimia Daun Mengkudu .................... 20
Pemurnian Enzim........................................................................... 22

i

Pengamatan.................................................................................... 23
Pendugaan Kelas Protease Mengkudu ............................................ 31
HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 33
Karakterisasi Daun Mengkudu ............................................................... 33
Pemurnian Protease Daun Mengkudu..................................................... 34
Penentuan Berat Molekul Protease ......................................................... 40
Pendugaan Kelas Protease Daun Mengkudu.......................................... 41
SIMPULAN dan SARAN.............................................................................. 45
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 47
LAMPIRAN...................................................................................................... 53

ii

DAFTAR TABEL
Tabel 1.

Komposisi Kimia Daun Mengkudu (mentah) ................................... 7

Tabel 2.

Beberapa Sistein Protease Tanaman ................................................. 10

Tabel 3.

Berbagai Serin Protease dari Tumbuhan .......................................... 11

Tabel 4.

Pengujian Aktivitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (1983).... 27

Tabel 5.

Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan ........................................ 28

Tabel 6.

Kadar Proksimat Daun Mengkudu.................................................... 33

Tabel 7.

Pemurnian Protease pada Daun Mengkudu....................................... 38

Tabel 8.

Pemurnian Protease dari Berbagai Daun Tanaman ........................... 39

iii

iv

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.

Pohon Mengkudu............................................................................. 6

Gambar 2.

Daun Pucuk dan Daun Pangkal ........................................................ 20

Gambar 3.

Garis Besar Kerja Penelitian............................................................. 21

Gambar 4.

Diagram Neraca Massa selama Tahapan Pemurnian......................... 24

Gambar 5.

Hasil SDS-PAGE Dialisat Daun Mengkudu..................................... 41

Gambar 6.

Zimogram dengan Substrat Kasein 1%............................................. 42

v

vi

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1.

Pembuatan pereaksi Aktivitas enzim ......................................... 53

Lampiran 2.

Pembuatan Pereaksi Bradford ................................................... 54

Lampiran 3.

Aktivitas Protease Daun Pucuk Selama Tahapan Pemurnian ..... 55

Lampiran 4.

Aktivitas Protease Daun Pangkal Selama Tahapan Pemurnian .. 56

Lampiran 5a.

Standar BSA untuk Ekstraksi dan Pengendapan Daun Pucuk .... 57

Lampiran 5b. Standar BSA untuk Dialisat Protein Daun Pucuk ..................... 57
Lampiran 5c.

Kadar Protein Daun Pucuk Selama Tahapan Pemurnian............ 58

Lampiran 6a.

Standar BSA untuk Ekstraksi dan Pengendapan Daun Pangkal . 59

Lampiran 6b. Standar BSA untuk Dialisat Daun Pangkal ............................... 59
Lampiran 6c.

Kadar Protein Daun Pangkal Selama Tahapan Pemurnian ......... 60

Lampiran 7.

Larutan-Larutan untuk SDS-PAGE dan Zimogram ................... 61

Lampiran 8a.

Kurva Standar Marker untuk SDS-PAGE.................................. 63

Lampiran 8b. Penentuan Bobot Molekul Protein Daun Pucuk dan Pangkal ..... 63
Lampiran 9a.

Kurva Standar Marker Zimogram ............................................. 63

Lampiran 9b. Penentuan Bobot Molekul Protease Daun Pucuk dan Pangkal ... 63
Lampiran 10. Pewarnaan Silver Metode Vorum ............................................. 64
Lampiran 11. Neraca Massa Daun Pucuk Selama Tahap Pemurnian ............... 65
Lampiran 12. Neraca Massa Daun Pangkal Selama Tahap Pemurnian ............ 66
Lampiran 13. Recovery Daun Pangkal dan Pucuk Tahap Pemurnian............... 67

vii

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Makhluk hidup termasuk tumbuhan membutuhkan reaksi biokimia seluler
yang melibatkan enzim untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Salah satu enzim
yang terlibat adalah protease. Pada tanaman protease tidak hanya diperlukan
untuk degradasi protein, tetapi juga untuk pertahanan tubuh, perkembangan dan
pematangan buah, aktifasi proenzim, penguraian simpanan protein dalam biji
yang sedang berkecambah dan lain sebagainya.
Beberapa enzim dari tumbuhan, mikroba dan binatang seperti lipase,
karbohidrase dan protease sudah diisolasi, dimurnikan dan diaplikasikan pada
berbagai industri.

Menurut Aehle (2007) enzim banyak diaplikasikan untuk

keperluan medis, industri pangan, industri kosmetik, industri farmasi dan lain
sebagainya. Dalam industri pangan khususnya, enzim lipase, karbohidrase dan
protease merupakan enzim yang banyak digunakan.
Perdagangan protease mencapai 60% dari total penjualan enzim dunia yang
mencapai dua milliar US$ dengan peningkatan nilai jual mencapai enam hingga
tujuh persen pertahun, sedangkan dari kuantitasnya meningkat sebesar 10 hingga
15% pertahun

(Suhartono, 2000).

Impor enzim Indonesia pun

juga terus

meningkat dari 124,1 juta US$ pada tahun 2000 (BPS, 2000) menjadi 127.4 juta
US$ pada tahun 2001 (BPS, 2001).
Mengkudu (Morinda citrifolia L.) termasuk tumbuhan keluarga kopi-kopian
(Rubiaceae), yang pada mulanya berasal dari wilayah daratan Asia Tenggara dan
kemudian menyebar sampai ke Cina, India, Filipina, Hawai, Tahiti, Afrika,
Australia, Karibia, Haiti, Fiji, Florida dan Kuba. Secara keseluruhan mengkudu
merupakan bahan makanan yang bergizi lengkap.
Mengkudu banyak terdapat di Indonesia.
Indonesia meningkat

setiap tahun.

Produksi mengkudu pun

di

Pada tahun 2003 produksi mengkudu

mencapai 1,9 ton meningkat pesat pada tahun 2007 menjadi 14 ton (Departemen
Pertanian Republik Indonesia, 2008).
Sebagian besar adat budaya Polinesia pada masa lampau maupun sekarang,
menggunakan buah mengkudu sebagai makanan utama. Penduduk asli kepulauan

1

Pasifik Selatan mengkonsumsi buah mengkudu untuk dapat bertahan hidup pada
waktu kelaparan. Para prajurit yang menetap di kepulauan Polinesia selama
perang dunia II dianjurkan untuk mengkonsumsi buah mengkudu

untuk

menambah kekuatan dan tenaga. Zat-zat nutrisi yang dibutuhkan tubuh antara
lain: karbohidrat, protein, vitamin, dan mineral-mineral esensial juga tersedia
dalam buah maupun daun mengkudu (Nelson, 2006).
Hasil penelitian Heinicke seperti yang dikutip oleh Wang et al. (2002)
menunjukkan bahwa mengkudu

mengandung prekursor alami xeronine

(proxeronin). Proxeronine diubah menjadi xeronine di dalam tubuh oleh enzim
proxeroninase. Xeronine merupakan sejenis alkaloid yang mampu memodifikasi
struktur molekul protein. Jika protein mengalami kerusakan maka xeronine akan
berinteraksi dengan protein dan mengembalikan konformasinya ke bentuk yang
sesuai sehingga dapat berfungsi kembali. Senyawa ini juga banyak terdapat pada
bromelain (nenas). Bangun dan Sarwono (2002) juga menyebutkan bahwa dalam
jus buah mengkudu terdapat berbagai senyawa kimia dan enzim yang diduga
mampu bekerja sama secara sinergistik dalam menyembuhkan penyakit.
Daun mengkudu di Tonga digunakan sebagai pengempuk daging (Walter et
al., 2002), mirip dengan penggunaan daun papaya yang juga digunakan untuk
pengempuk daging. Penelitian pada papaya telah membuktikan protease (papain)
yang bertanggung jawab untuk pengempukkan daging. Protease pada daun
mengkudu sejauh ini belum ada yang melaporkan.
Selain hal tersebut diatas, perdagangan

protease yang terus meningkat

setiap tahun ikut melatarbelakangi penelitian tentang pemurnian protease dari
daun mengkudu. Oleh karena itu pencarian sumber enzim merupakan potensi
usaha yang sangat potensial.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengkarakterisasi sifat fisik dan kimia daun mengkudu pada dua tingkat
ketuaan yang berbeda.
2. Memurnikan protease dari daun mengkudu pada dua tingkat ketuaan yang
berbeda.
2

3. Menentukan bobot molekul protease dari mengkudu pada dua tingkat ketuaan
yang berbeda.

3

4

TINJAUAN PUSTAKA
Mengkudu (Morinda citrifolia L.)
Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dikenal secara komersial dengan sebutan
noni, banyak ditemukan di sepanjang Kepulauan Pasifik.

Mengkudu

pada

mulanya berasal dari wilayah daratan Asia Tenggara dan kemudian menyebar
sampai ke Cina, India, Filipina, Hawaii, Tahiti, Afrika, Australia, Karibia, Haiti,
Fiji dan Florida. Mengkudu dikenal dengan berbagai nama yaitu mengkudu,
pace, kemudu, kudu (Jawa), cangkudu (Sunda), kodhuk (Madura), wengkudu
(Bali), noni (Hawaii), nono (Tahiti), nonu (Tonga), ungcoikan (Myanmar) dan
ach (Hindi), indian mulberry (Inggris), kikiri di pulau Solomon, kura di Fiji dan
lain-lain (Nelson, 2006).
Pengklasifikasian mengkudu adalah :
Filum

: Angiospermae

Sub filum

: Dycotiledones

Divisi

: Lignosae

Famili

: Rubiaceae

Genus

: Morinda

Spesies

: citrifolia

Mengkudu

merupakan tanaman perdu atau pohon kecil yang tumbuh agak

membengkok dengan tinggi 3-8m, banyak bercabang dengan ranting persegi
empat. Letak daun berhadapan secara bersilang, bertangkai, bentuknya bulat telur
sampai berbentuk oval, panjang 10-40cm dengan lebar 5-17cm, tebal mengkilap,
tepi rata, ujung runcing, bagian pangkal menyempit, tulang daun menyirip dan
bewarna hijau tua (Wijayakusuma, 1998). Pohon mengkudu dapat dilihat pada
Gambar 1.
Mengkudu dapat tumbuh dalam lingkungan yang kurang subur, tanah yang
asam dan basa baik tanah kering maupun basah.

Semua bagian tanaman

mengkudu mempunyai manfaat dibidang kesehatan maupun industri. Akar dan
kulit pohon digunakan untuk pewarna dan obat, batang untuk kayu bakar dan
membuat peralatan, serta daun dan buah yang dijadikan sebagai makanan dan
obat-obatan (Nelson 2006).

5

serta triptofan (EFSA, 2008). Hal yang sama juga dinyatakan oleh Wijayakusuma
(1998) bahwa daun mengkudu mengandung protein, zat kapur, zat besi, karoten
dan askorbat, selain itu juga mengandung asam kapron dan kaprilat yang mudah
menguap. Komposisi kimia daun mengkudu dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi Kimia Daun Mengkudu (mentah)
Komposisi Daun Mengkudu
Air
Protein
Lemak
Karbohidrat
Serat
Abu
Kalsium
Fosfor
Besi
Beta karoten
Riboflavin
Niasin
Asam askorbat
Sumber : EFSA (2008)

Satuan
g
g
g
g
g
g
ng
mg
mg
mg
mg
mg
mg

Per 100 g
93.7
1
0.2
4.4
1.1
0.7
0.7
93
4.4
0.3
0.07
5.6
50

Protease Tumbuhan
Semua sel tumbuhan mengandung lebih dari 10.000 protein. Beberapa dari
protein ini mungkin tidak dibutuhkan lagi karena sudah tidak berfungsi. Beberapa
yang lain mungkin rusak selama sintesis atau karena kelebihan panas atau karena
stress lainnya. Lainnya beberapa enzim didisain berumur pendek karena hanya
dibutuhkan pada awal reaksi dan protein yang mengalami misfolding. Alasan ini
membuat protein merupakan subjek untuk didegradasi oleh enzim proteolitik yang
disebut protease (Hopkin dan Norman (2004).
Degradasi protein adalah bentuk kegiatan menjaga sel atau pemeliharaan sel
dimana protein yang tidak diinginkan atau rusak diurai menjadi asam amino dan
dapat digunakan kembali. Biasanya hampir separuh protein penyusun sel diganti
setiap 4-7 hari. Protein didegradasi di beberapa bagian sel seperti kloroplas,
nukleus, mitokhondria, vakuola serta sitosol (Hopkin dan Norman, 2004).
Selama proses

pelayuan tumbuhan, kadar total protein menurun seiring

dengan meningkatnya aktifitas enzim proteolitik dan menurunnya sintesa protein.
7

Degradasi protein dan

remobilisasi dari asam amino ke jaringan yang

berkembang merupakan proses metabolisme yang utama dalam proses pelayuan
(Nooden, 2004).
Klasifikasi Protease
Naz (2002)

mengklasifikasikan protease menjadi beberapa subklas.

Diantaranya yaitu serin (EC. 3.4.21) memiliki residu ser pada sisi aktif, sistein
(EC.3.4.22) yang memiliki residu cys pada sisi aktif, aspartat (EC.3.4.23)
tergantung residu Asp pada aktifitas katalitiknya dan metalloprotease (EC.3.4.24)
yang menggunakan ion metal pada mekanisme katalitiknya.
Protease sistein menghidrolisa ikatan peptida protein dan dapat dihambat
oleh peraksi sulfidril. Protease sistein yang diambil dari tumbuhan diantaranya
papain dari pepaya (EC.3.4.4.10), fisin dari fig (EC.3.4.4.12), dan bromelain dari
nenas (EC.3.4.4.24). Protease sistein dipercaya sebagai protease utama yang
terlibat dalam hidrolisis protein. Protease sistein telah diidentifikasi dari pelayuan
daun, pelayuan bunga dan pematangan buah (Nooden, 2004).
Protease sistein atau thiol protease memegang peranan penting dalam respon
tanaman menghadapi ransangan. Ransangan seperti protein rusak dan misfolded,
pathogen, suhu lingkungan seperti panas atau dingin, kekurangan

air

dan

lainnya. Protein rusak atau protein yang mengalami misfolded harus dihilangkan
dengan degradasi protein dan digantikan oleh protein yang baru. Peristiwa
degradasi atau rusaknya protein selalu diikuti oleh penyusunan protein yang baru
(Grudkowska dan Zagdanska, 2004) .
Protease sistein muncul pada daun gandum sebagai respon menghadapi
kekurangan air

seperti yang dilaporkan oleh Simova-Stoilova et al. (2010).

Forsthoefel et al. (1998) juga mengidentifikasi protease sistein yang muncul pada
daun Mesembryanthemum crystallinum dalam menghadapi tekanan lingkungan
yaitu salinitas yang tinggi.
Protease sistein juga terlibat dalam degradasi protein. Pada saat germinasi
biji barley, 42 protease terlibat dan 27 diantaranya adalah protease sistein (Zhang
dan Jones, 1996), sedangkan pada saat berkecambahnya jagung (De Baros dan

8

Larkins, 1990) dan gandum (Bottari et al., 1996), 90% protease yang terlibat
dalam degradasi prolamin (protein utama sereal) adalah protease sistein.
Programmed cell death (PCD) adalah salah satu mekanisme pertahanan
tanaman menghadapi serangan patogen (Grudkowska dan Zagdanska, 2004).
Caspase-like proteinase merupakan protease sistein yang terlibat dalam PCD yang
ditemukan pada tembakau yang terinfeksi tobacco mosaic virus (Del Pozo dan
Lam, 1998). Di bawah ini (Tabel 2) adalah beberapa protease sistein yang telah
dikenal masyarakat.
Kelas protease yang lain adalah protease serin. Protease serin pun telah
diisolasi dan dimurnikan dari berbagai tanaman dan organ tanaman. Protease
serin ada di biji, buah bahkan getah tanaman.

Protease serin yang berasal dari

biji diantaranya biji barley (Hordeum vulgare L cv Morex), kacang kedele
(Glycine max L. Merr) dan padi (Oryza sativa L). Protease serin yang diisolasi
dari getah diantaranya : Euphorbia supina, dandelion (Taraxacum officinale
Webb. SI.), dan nangka (Artocarpus heterophyllus L) (Antao dan Malcata, 2005).
Di bawah ini (Tabel 3) adalah beberapa protease serin yang telah diisolasi dari
berbagai tumbuhan.
Protease serin sangat berperanan dalam perkembangan dan pertumbuhan
tanaman. Fungsi protease serin pada tanaman diantaranya adalah respon tanaman
terhadap serangan
sehingga

pathogen yang mengakibatkan nekrosis dan kematian sel

pertumbuhan pathogen terganggu, pembelahan sel jaringan pada

tanaman, proses pelayuan, mikrosporogenesis

dan sebagainya (Antao dan

Malcata, 2005).
Protease aspartat adalah kelas protease yang lain. Pepsin dan renin adalah enzim
yang tergolong ke dalam kelas protease aspartat. Pepsin mempunyai berat
molekul 35kDa dan disusun oleh rantai polipeptida tunggal yang terdiri dari 321
asam amino. Penggunaan renin dalam pembuatan keju telah dikenal luas (Naz,
2002).
Kelas protease yang lain adalah metaloprotease.
metaloprotease

adalah

termolisin.

Termolisin

Salah satu contoh

diproduksi

oleh

Bacillus

stearothermophilus yang aktif dengan adanya ion Ca. Termolisin dan juga
metaloprotease lain dapat dihambat oleh senyawa pengkelat seperti EDTA, sitrat

9

dan fosfat yang sering digunakan dalam bahan tambahan pangan. Termolisin
mempunyai berat molekul 34kDa (Naz, 2002).
Tabel 2. Beberapa Protease sistein Tanaman
Enzim

Tumbuhan

Stem Bromelain
Fruit Bromelain
Bromelain
Stem bromelain
Bromelain
Stem bromelain

Nenas
Nenas
Nenas
Nenas
Nenas
Nenas

Stem bromelain
Ananain

Nenas
Bromelain batang
nenas

Papain
Papain
Protease sistein

Carica papaya
Carica papaya
Barley

38.922
23
29-37

Protease sistein
Protease sistein

jagung
Triticum aestivum

12-36
61-62,5

Phaseolus
vulgaris leaf
cysteine
proteinase 1 dan
3

Phaseolus
vulgaris

30 dan
25,1

Sumber : *) Wharton (1974)
**)
Fahmy et al (2004)

10

Berat
Moleku
l (kDa)
22.831
39.055
34.159
33
38.823
35
23
25 &
26

Metode Pemurnian

Referensi

Sedimentasi,
ultrasentrifugasi
Analisis asam
amino
SDS-PAGE
Kromatografi
afinitas, sepharose
semi carbazone,
kromatografi
penukar kation
-

UniProt (2010)
UniProt (2010)
UniProt (2010)
Murachi et al. (1964)*)
UniProt (2010)
Ota et al. (1964)*)

Filtrasi gel, SDSPAGE
Filtrasi gel, 2
kromatografi
penukar ion,
kromatografi
kovalen pada
tioprofil-sepharose

Bobb (1972)*)
Rowan et al. (1988)

UniProt (2010)
Naz (2002)
Poulle dan Jones
Zhang
(1996)**),
&Jones (1996)**)
Abe et al. (1977)**)
Fahmy et al. (2004)
Popovic et al. (1998)

Tabel 3. Berbagai Protease serin dari Tumbuhan
Enzim

Tumbuhan

Metode Pemurnian

Plantagolisis

Plantago maior

Protease serin
Cucumisin
(EC 3.4.21.25)

C.melo L.
C. melo L.var.Prince

Amm sulfat, kromatografi afinitas pada bacitrasinsepharose, kromatografi penukar ion pada mono-Q
Amm sulfat, filtrasi gel, kromatografi penukar ion
Kromatografi penukar ion pada CM-selulosa, filtrasi
gel sephadex G-75

Protease serin
Kiwano
protease
Protease B

Cucurbita ficifolia

Amm. Sulfat, filtrasi gel pada sephacryl S-300,
kromatografi penukar ion pada CM sepharose
Cucumis metuliferus Amm sulfat, kromatografi penukar ion pada CMsepharose
E. supine
Kromatografi penukar ion pada DEAE-sepharose,
Protease serin
filtrasi gel pada sepharil S-300
Triticum aestivum cv. Amm sulfat, filtrasi gel pada sepharil S-200,
Pro INTA Isla Verde kromatografi penukaranion pada kolom Q
*)
Sumber : Antao dan Malcata (2005)

Berat
Molekul
(kDa)
19

Referensi
Bogacheva (2001)*)

60

Noda et al. (1994)*)
Kaneda dan Tominaga
(1975)*), Yamagata et
al. (1989)*)
Curotto et al. (1989)*)

78

Uchikoba et al.(2001)*)

80

Arima et al. (2000)*)

110

Roberts et al. (2003)*)

26
54

11

Pemurnian Enzim
Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan
dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian bergantung
pada tujuan akhir yaitu tujuan komersial atau penelitian. Enzim kasar atau yang
dimurnikan sebagian masih dapat digunakan untuk komersial, sedangkan enzim
murni atau hampir murni dikehendaki dalam penelitian
produk analitik.Harris (1989) menyebutkan,

atau dipakai dalam

minimal ada tiga strategi dalam

pemurnian enzim yang harus diperhatikan yaitu (1) kualitas; perlu tindakan untuk
mempertahankan aktifitas protein dengan cara mengurangi proteolisis dan
denaturasi, (2) kuantitas; pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan
kuntitas enzim yang diperlukan, (3) ekonomis; merupakan hal penting bila akan
digunakan di industri atau diterapkan dalam skala laboratorium. Secara umum
pemurnian enzim dapat dibagi menjadi ekstraksi, pemekatan dan fraksinasi.
Ekstraksi Enzim
Ekstraksi bertujuan untuk memisahkan enzim dari sumbernya, yaitu
tanaman, hewan maupun

mikroba.

Adapun kelebihan

enzim dari tanaman

diantaranya adalah terjaganya ketersediaan yaitu bisa dipanen berulang-ulang.
Menurut Bollag dan Edelstein (1991) metode yang bisa dipilih dalam ekstraksi
tanaman

adalah

blade

homogenization

atau

blender

maupun

grinding

(penggerusan).
Buffer digunakan dalam proses ekstraksi enzim untuk menjaga pH
lingkungan sehingga diharapkan mampu meminimalkan denaturasi dan inaktivasi
enzim. Buffer ekstraksi dapat ditambah beberapa bahan kimia dengan tujuan
untuk mencegah kerusakan enzim.

Bahan kimia yang bisa ditambahkan

diantaranya EDTA, gliserol dan lain-lain (Harris, 1989).
Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari
komponen biomolekul lainnya diantaranya karbohidrat, lemak dan asam nukleat.
Ada dua metode pemekatan enzim yaitu analitik dan preparatif (penyiapan).

12

Metode analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat),
pengendapan organik (misalnya aseton atau etanol), dan imunopresipitasi yang
dapat menyebabkan denaturasi protein. Metode preparatif bertujuan untuk tetap
mempertahankan aktifitas enzim, misalnya menggunakan garam, pelarut organik,
polimer organik, ultrafiltrasi dan liofilisasi (Bollag dan Edelstein, 1991).
Prinsip presipitasi dengan garam adalah

mengendapkan protein sehingga

protein terpisah dari komponen terlarut lainnya. Garam yang dapat digunakan
untuk presipitasi diantaranya ammonium sulfat dan sodium sulfat. Ammonium
sulfat lebih disukai karena solubilitasnya tinggi, harga murah, non toksik dan
tidak mempengaruhi struktur protein (Suhartono, 1989).
Sisa garam dari proses presipitasi enzim dihilangkan dengan cara dialisis
menggunakan kantong selofan dan ultrafiltrasi. Dengan demikian, konsentrat
enzim bebas garam dapat dimurnikan lebih lanjut dengan fraksinasi enzim (Bollag
dan Edelstein, 1991).
Fraksinasi enzim
Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim, yang bertujuan
untuk memisahkan enzim dari protein non enzim lainnya. Metode fraksinasi
umum untuk pemurnian enzim, meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis.
Elektroforesis

adalah

suatu

teknik

untuk

memisahkan

molekul-molekul

berdasarkan muatan dan berat molekul.
Elektroforesis

gel

poliakrilamid

(PAGE

=

Poly

Acrylamide

Gel

Electrophoresis) merupakan metode yang sering digunakan dalam analisis sampel
biologis karena kemampuannya dalam memisahkan campuran protein yang
kompleks dengan baik dan resolusi yang tinggi (Bollag dan Edelstein, 1991).
Elektroforesis pada gel poliakrilamida adalah metode yang paling sering
digunakan untuk karakterisasi protein dan campuran protein, karena prosedur ini
relatif cepat dan sensitif.
Elektroforesis didefnisikan sebagai perpindahan partikel-partikel bermuatan
karena pengaruh muatan medan listrik.

Mekanisme pada elektroforesis gel

poliakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) adalah protein akan bereaksi
dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks berikatan

13

dengan SDS.

Kompleks protein yang bermuatan negatif ini kemudian akan

terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam
matriks gel. Berat molekul protein dapat diukur menggunakan protein standar
yang telah diketahui berat molekulnya

dengan cara membandingkan nilai

mobilitas relatifnya (Rf) (Bollag dan Edelstein 1991).
Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktifitas enzim
secara in situ. Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah zimografi mengandung
substrat enzim yang akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Enzim
dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi.
Penambahan deterjen Triton X-100 akan melepaskan SDS sehingga protein
kembali melipat (renaturasi). Gel selanjutnya diwarnai sehingga molekul protein
yang memiliki aktifitas tampak sebagai pita bening. Metode zimografi bersifat
mudah, sensitif dan kualitatif dalam menganalisis aktifitas enzim. Adapun substrat
yang bisa digunakan untuk zimogram diantaranya kasein, gelatin dan lain-lain
(Leber dan Balkwill 1997).
Aplikasi Protease
Keunggulan utama penggunaan enzim pada proses industri adalah (a)
kespesifikan enzim terhadap substrat sehingga mampu menghasilkan produk
dalam jumlah maksimal dengan produk samping yang minimal, (b) enzim mampu
mereduksi konsumsi energi yang akan menurunkan Greenhouse Gas Emission
(GGE), (c) enzim juga mampu mereduksi konsumsi air dan produk limbah selama
proses industri berlangsung.

Keunggulan enzim tersebut akan meminimalkan

resiko dan dampak proses indutri bagi kehidupan manusia dan lingkungan.
Enzim protease dimanfaatkan diantaranya untuk pembuatan keju, pengempuk
daging, penjernih bir, pembuatan hidrolisa protein kedele, penyembuh luka serta
terapi untuk tumor, pembengkakan dan penggumpalan darah.
Pembuatan keju
Contoh klasik penggunaan protease adalah untuk pembuatan keju (Naz,
2002). Pengolahan susu menjadi keju menggunakan enzim protease. Contoh
protease yang bisa digunakan untuk mengolah keju adalah renin atau kimosin.
14

Renin

bisa diperoleh dari lambung anak sapi dan mikroba.

Aktifitas

penggumpalan kasein susu oleh renin berlangsung dengan hasil optimum
dibandingkan dengan protease lain seperti pepsin.
Kasein merupakan kompleks fosfoprotein yang membentuk suspensi koloid
yang terdiri dari α, β, γ dan kapa kasein. Renin menghidrolisa kapa kasein
hingga menimbulkan destabilisasi struktur koloid dan menimbulkan proses
penggumpalan α dan β kasein bila terdapat kalsium dan fosfat pada lingkungan.
Gumpalan ini merupakan jalinan molekul para kapa kasein dan makropeptida, air,
laktosa, mineral, globula lemak, vitamin dan sejumlah senyawa terlarut lainnya di
dalam

gumpalan tersebut (Suhartono, 1989) dan (Naz, 2002). Enzim renin

mempunyai berat molekul sebesar 31kDa.

Renin paling menonjol dalam

menggumpalkan kasein dibandingkan dengan protease lain (Suhartono, 1989).
Pengempuk daging
Penggunaan potease untuk pengempuk daging telah dilakukan dari zaman
dulu, yaitu menggunakan daun pepaya untuk mengempukkan daging. Setelah
diisolasi dan diteliti diketahui bahwa enzim yang berperanan dalam menguraikan
protein daging adalah protease. Protease yang diisolasi dari pepaya dikenal
dengan papain. Papain terdiri dari 102 asam amino berberat molekul 21kDa
dengan sisi aktif yang melibatkan histidin 159 dan sistein 25 (Suhartono, 1989).
Papain cocok digunakan untuk pengempuk daging karena aktif pada pH
daging. Enzim ini memotong protein daging pada sisi karboksil valin, lisin dan
arginin. Komponen yang paling aktif dari getah pepaya adalah kimopapain yang
aktif dalam lingkungan asam, optimum kimopapain adalah pH 5 dan sesuai
dengan pH daging.
Enzim protease yang diisolasi dari tanaman lain pun dapat juga digunakan
untuk melunakkan daging. Penelitian yang dilakukan oleh Naveena et al. (2004)
yang memanfaatkan protease dari Cucumis trigonus Roxb (kachri) dan Zingiber
officinale Roscoe (jahe) untuk mengempukkan daging kerbau.

15

Penjernih bir
Pada proses pembuatan bir, papain diperlukan untuk menghilangkan protein
penyebab kekeruhan pada bir. Kekeruhan ini disebabkan oleh komplek yang
dibentuk oleh protein dan tanin (Naz, 2002).
Pembuatan Hidrolisa Protein Kedele
Penggunaan hidrolisa protein kedele di industri pangan telah meluas,
walaupun demikian sifat fungsional protein tersebut tidak selalu diinginkan.
Modifikasi enzimatis digunakan untuk

menghasilkan protein dengan sifat

fungsional yang diinginkan (Naz, 2002). Hidrolisa protein kedele oleh protease
meningkatkan iso-electric solubility dari 5% menjadi 42%, kapasitas emulsi dari
100mL/g menjadi 280mL/g dan whipping expansion dari 20% menjadi 200% bila
dibandingkan dengan protein kedele sebelum dihidrolisa (Naz, 2002).
Penyembuh Luka
Protease dibidang kesehatan pun telah populer digunakan.
banyak digunakan dalam bidang kesehatan

Bromelain

karena dapat bertindak sebagai

penyembuh luka (Maurer, 2001). Menurut Suhartono (1989) proteolitik berfungsi
untuk mengurangi cairan luka, nanah dan jaringan nekrosa yang timbul pada luka
bakar, luka operasi maupun luka lainnya. Substrat enzim ini adalah jaringan
fibrin, mukoprotein, kolagen dan sebagainya. Enzim menguraikan jaringan ini
sehingga bekas luka menjadi bersih dan licin. Biasanya tripsin diberikan bersamasama dengan antibiotika dalam bentuk salep.
Terapi untuk Pencernaan dan Kanker
Pada sebagian orang, enzim pencernaan tidak diproduksi atau dikeluarkan
dalam jumlah yang cukup sehingga mengganggu pencernaan makanan. Oleh
karena itu dilakukan pemberian tambahan enzim dari luar untuk membantu
masalah pencernaan tersebut. Enzim yang biasa digunakan untuk mengatasi
masalah pencernaan diantaranya adalah protease (Suhartono, 1989).

16

Bromelain dapat diserap oleh usus dan tidak kehilangan aktifitas biologinya.
Castell et al. (1997) membuktikan bahwa bromelain masih ada dalam plasma
darah setelah beberapa saat terapi oral bromelain. Bromelain diambil dari batang
nenas dan diberikan secara oral pada laki-laki sehat sebanyak 3g per hari dan
dengan menggunakan immunoassay ditemukan 5.000pg bromelain dalam plasma
setelah 48 jam dan masih mempunyai aktifitas proteolitik.

Oleh karena itu

bromelain dapat dikonsumsi secara oral saat terapi enzim.
Bromelain dapat dijadikan sebagai alternatif pengobatan kanker. Bromelain
sebagai obat anti kanker bermula pada pengalaman masyarakat Asia Tenggara
dalam menyembukan kanker. Maurer (2001) menyebutkan bahwa aktifitas anti
kanker bromelain tergantung pada aktifitas proteolitiknya.
Chobotova et al. (2010) menyatakan bahwa bromelain mempunyai aktifitas
sebagai anti kanker. Hasil penelitian Mantovani et al. (2008) dan Chen et al.
2008)

seperti dikutip oleh Chobotova et al. (2010) menunjukkan bahwa

bromelain yang diuji secara in vitro pada sel tumor manusia (leukimia) dapat
menghambat aktifitas NF-kβ (neutrofil factor kappa β, sejenis darah putih).
Adapun target NF-kβ adalah cyclooxygenase (Cox-2) yang terlibat dalam sintesa
prostaglandin (PEG-2). Prostaglandin ini dapat memacu terjadinya kanker.
Bromelain dapat menghambat kanker, walaupun mekanisme detilnya belum
diketahui dengan jelas.
Terapi Inflamasi dan Blood Clotting (Pembekuan Darah)
Suhartono (1989) menyebutkan bahwa proses inflamasi (peradangan/
pembengkakan) melibatkan senyawa biogenik amin seperti histamin dan serotonin
dari sel yang mengalami kerusakan. Senyawa biogenik amin menimbulkan
pembengkakan pembuluh darah kapiler. Enzim-enzim yang dibebaskan oleh sel
yang rusak akan mengaktifkan kinin sehingga pembuluh darah tetap membesar
dan permeabilitasnya meningkat, hal ini mengakibatkan terjadinya kebocoran
cairan sehingga terjadi odema. Keadaan odema ini dipertahankan oleh senyawa
fibrin dari peredaran darah. Jadi, proses pembengkakan melibatkan jaringan
fibrin. Pengobatan pada kasus odema ditujukan untuk menguraikan fibrin.

17

Penelitian Netti et al. (1978), Smyth et al. (1962) dan Uhlig dan Seifert
(1981) seperti dikutip oleh Maurer (2001) menunjukkan bahwa bromelain paling
ampuh untuk pengobatan odema bila dibandingkan dengan pemberian obat-obatan
seperti indometasin, asam asetilsalisilat dan aescin.. Pemberian bromelain
dilakukan secara oral pada hewan percobaan.

Bromelain menyebabkan

fibrinolisis dan merangsang penyerapan kembali cairan oleh darah.
Blood clotting atau proses penggumpalan darah atau pembekuan darah
adalah proses normal ketika kulit terluka sehingga tidak terrjadi pendarahan. Saat
kulit terluka, trombosit pecah dan menghasilkan trombokinase.

Enzim

trombokinase akan merubah protrombin menjadi thrombin dengan adanya ion Ca
dan K. Trombin yang terbentuk akan merangsang fibrinogen membentuk benangbenang fibrin. Adanya benang fibrin menghambat sel-sel darah. Penyakit
trombosis atau penggumpalan darah (di luar keadaan normal) telah meningkatkan
mortalitas yang nyata di negara-negara Barat (Suhartono, 1989).
Pengobatan dapat dilakukan dengan obat anti koagulan dan pemberian
enzim protease. Pemberian enzim protease memanfaatkan daya proteolitiknya.
Bromelain yang diberikan secara oral pada tikus percobaan terbukti meningkatkan
fibrinolisis (Pirotta et al., 1978).

18

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi SEAFAST Centre,
Laboratorium Biokimia Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen
Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB pada bulan Februari hingga Juli 2010.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun mengkudu (Morinda
citrifolia L.) dengan 2 tingkat ketuaan yaitu daun pangkal berwarna hijau tua dan
daun pucuk yang berwarna hijau agak muda (Gambar 1). Bahan kimia diantaranya
Na asetat (Merck), asam asetat (Merck), EDTA (Amersham Biosciences), gliserol
(Bio Basic Inc), polivinilpirolidon (PVP K 30), , β-mercaptoetanol (Bio Basic
Inc), es batu, akuades, akuabides (Ikapharmindo Putramas), silika gel 60 H
(Merck), ammonium sulfat (Merck), etanol (Merck), asam fosfat (Merck), asam
borat (Amersham Biosciences), boraks (Merck), kasein (Merck), NaOH (Merck),
HCl (Merck), tirosin (Merck), TCA (Merck), Na sulfit (Merck), asam sulfat
(Merck), CaCl2 (Merck), Na2CO3 (Merck), pereaksi folin ciocalteau (Sigma
Aldrich),

marker BM rendah (Fermentas SM-0431), yaitu beta galaktosidase

116kDa, bovin serum albumin 66.2kDa, ovalbumin 45kda, laktat dehidrogenase
35kDa, RE ase Bsp 25kDa, beta laktoglobulin 18.4kDa dan lisozim 14.4kDa,
akrilamid (Applichem), buffer tris-HCL (Amersham Biosciences-Merck), SDS
(Bio Basic Inc), TEMED (N,N,N,N-tetrametilenetilen-diamina), APS (ammonium
persulfat), bromophenol blue, BSA serta kasein Hammerstein (Merck),
bromophenol blue (Bio Basic Inc), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Applichem),
Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio Basic Inc).
Peralatan yang digunakan adalah hand blender Aletta A746, sentrifus
Hermle Z383K, oven, neraca analitik, seperangkat alat elektroforesis gel mini
protean 3 sel (Biorad), kantong dialisis Sigma D9652, freezer, spektrofotometer
UV-Vis, Shimadzu seri UV-2450, Quantity one (Biorad), penangas air, pengaduk
magnetik, tabung eppendorf, pipet mikro dan alat-alat gelas.

19

A

B

Daun mengkudu
↓
Penyortasian
↓
Pengering-anginan → analisa proksimat
↓
Penambahan buffer sodium asetat pH 5 ( 5mM EDTA, 14mM 2mercaptoetanol, 10% PVPP dan 10% gliserol (daun :buffer = 1:5 ; berat daun
10g)
↓
Penggilingan menggunakan blender (4 kali @ 15detik pada kecepatan tinggi)
↓
Penyaringan→ Ampas
↓
Sentrifugasi filtrat pada 3775g (4oC), 30 menit → Ampas
↓
Supernatan (Ekstrak enzim kasar) *
↓
Penambahan silika gel 60 H 1.4%, divorteks 5 menit
↓
Sentrifugasi 3775g (4oC), 15 menit → Ampas
↓
Supernatan (Ekstrak Silika) *
↓
Penambahan ammonium sulfat 100% jenuh,diaduk dengan magnetic stirrer, 30
menit
↓
o
Sentrifugasi 1972g (4 C), 30 menit
→ Supernatan*
↓
Endapan*
↓
Pelarutan dalam jumlah pelarut minimal
↓
Dialisis
↓
Dialisat*
↓
Elektroforesis SDS-PAGE, Zimogram
↓
Pendugaan Kelas Protease
Gambar 3. Garis besar kerja penelitian
Ket: *Analisa kadar protein (Bradford, 1976) ) dan aktifitas protease (Bergmeyer dan Grassl,
1983)

21

Pemurnian Enzim
Tahap pemurnian enzim meliputi ekstraksi enzim kasar, penambahan silika,
pemekatan menggunakan garam ammonium sulfat jenuh, dialisis serta fraksinasi
enzim menggunakan Sodium Dodecil Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(SDS-PAGE) dan zimogram untuk mengetahui bobot molekul enzim protease.
Penelitian ini menggunakan buffer asetat pH 5, dicampur dengan EDTA
5mM, Polyvinyl pyrrolydone (PVP K 30) 10%, gliserol 10% dan βmerkaptoethanol 14mM. Buffer yang diperlukan untuk ekstraksi disiapkan pada
hari yang sama dengan hari ekstraksi.
Sampel daun (10g) dipotong-potong dan ditambah buffer ekstraksi bersuhu
o

4 C (daun : buffer ekstraksi = 1 : 5), kemudian diblender dengan kecepatan tinggi
(4 x 15 detik) dengan wadah yang dikelilingi oleh es batu, selanjutnya disaring
menggunakan kain saring (2 lapis) dan filtrat disentrifus dingin 4oC 3775g (5900
rpm) selama 30 menit sehingga dihasilkan supernatan ekstrak enzim kasar.
Supernatan yang didapat ditambah dengan silika 1,4% dan divorteks selama 5
menit dan disentrifus 4oC pada 3775g (5900 rpm) selama 15 menit. Supernatan
yang dihasilkan adalah ekstrak hasil penambahan silika (ekstrak silika).
Supernatan yang didapat selanjutnya diendapkan menggunakan ammonium
sulfat 100% jenuh. Ammonium sulfat yang ditambahkan 100% dengan tujuan
untuk mengendapkan semua protein yang ada. Endapan enzim dipisahkan
menggunakan sentrifus dingin 4oC 1972,2g (3500 rpm). Endapan enzim
selanjutnya didialisis menggunakan kantung dialisis

atau membran selulosa

Sigma seri D9652 dengan diameter 21mm, panjang 10cm.
Sebelum melakukan dialisis, kantung selulosa dipersiapkan terlebih dahulu.
Sepanjang 10cm kantung dialisis dicuci dengan air mengalir selama 3-4 jam,
kemudian direndam dalam larutan Na sulfit 0.3% selama 1 menit pada suhu 80oC.
Kantung dialisis dicuci menggunakan air bersuhu 60oC selama 2 menit dan
diasamkan dengan larutan asam sulfat 0,2%.

Sisa asam dihilangkan dengan cara

membilas kantung dialisis menggunakan air bersuhu 60oC.

Dialisis endapan

enzim dilakukan selama 5 jam dengan wadah dikelilingi dengan es batu. Setiap 1
jam buffernya diganti dan selanjutnya sampel difraksinasi dengan SDS-PAGE dan

22

zimogram untuk mengetahui bobot molekul protease

(Bollag dan Edestein,

1991).
Setiap tahap pemurnian diukur massa yang masuk dan massa keluar dan
massa yang hilang (Gambar 4). Kehilangan massa terbesar terjadi pada saat
pemblenderan dan penyaringan karena ampas tertinggal di dalam blender dan
kertas saring.
Pengamatan
Kadar Air (AOAC, 1999)
Sejumlah sampel (1-2g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui
beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105oC hingga
diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat
basah dengan menggunakan rumus :
Kadar air (%b/ b) =

a− b
× 100%
c

Dimana :
a = berat cawan dan sampel awal (g)
b = berat cawan dan sampel akhir (g)
c = berat sampel awal (g)
Kadar Protein (AOAC, 1999)
Sejumlah sampel (100-250mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian
ditambahkan 1.9 ± 0.1g K2SO4 , 40 ± 10mg HgO dan 2 ± 0.1ml H2SO4. Sampel
dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan
menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara
perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang
terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi
dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 8-10ml
larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3ke dalam alat destilasi. Erlenm