Keragaman Komunitas Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah Sawah di Sukabumi

KERAGAMAN KOMUNITAS BAKTERI PEMFIKSASI
NITROGEN PADA TANAH SAWAH DI SUKABUMI

MUNJIATI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Komunitas
Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah Sawah di Sukabumi adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Munjiati
NIM G34090011

ABSTRAK
MUNJIATI. Keragaman Komunitas Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah
Sawah di Sukabumi. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA
AKHDIYA.
Dinitrogenase merupakan enzim penting dalam proses fiksasi nitrogen.
Enzim tersebut memiliki 2 subunit protein, yaitu protein Fe dan protein MoFe
yang masing-masing secara berurutan disandikan oleh gen nifH dan nifD. DGGE
merupakan salah satu teknik metagenom yang dapat merepresentasikan
keragaman dan kelimpahan spesies mikrob yang mendiami suatu lingkungan
berdasarkan perbedaan melting point dari tiap-tiap sekuen DNA pada gradien
senyawa denaturan. Penelitian ini bertujuan mengetahui keragaman bakteri
pemfiksasi nitrogen pada tanah sawah. Sampel tanah sawah yang telah diberi
perlakuan pupuk NPK 100% takaran (250 kg/ha) (K), pupuk NPK 25% takaran
(62.5 kg/ha) dengan penambahan pupuk hayati (C), dan pupuk NPK 25% takaran
(62.5 kg/ha) tanpa pupuk hayati (TC) diambil untuk diekstraksi DNA-nya,

kemudian diamplifikasi dan dianalisis menggunakan gel DGGE. Diversitas gen
nifH lebih banyak dibandingkan dengan nifD. Hasil pendugaan ialah terdapat
minimal 7 jenis bakteri pemfiksasi nitrogen pada sampel C, 5 jenis pada sampel
TC, dan 1 jenis pada sampel K. Gen nifH lebih dapat membedakan keragaman
sekuen daripada gen nifD.
Kata kunci: nifH, nifD, DGGE, fiksasi nitrogen.

ABSTRACT
MUNJIATI. Diversity of Nitrogen Fixing-Bacteria Community on Rice Field in
Sukabumi. Supervised by IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Dinitrogenase is an important enzyme in nitrogen fixation. The enzyme has
2 sub unit proteins, Fe Protein and MoFe protein, each encoded by nifH and nifD.
DGGE is one of metagenomic analysis technique that can represent the abundance
of specieses in environment, based on melting behavior of amplicones in linearly
increasing denaturant in polyacrylamide gel. The aim of this research was to assay
diversity of nitrogen fixing-bacteria on rice field. The soil samples of rice field
treated with inorganic fertilizer NPK 15:15:15 250 kg/ha (100% dosage) (K),
biofertilizer and NPK 62.5 kg/ha (25% dosage) (C), and NPK only 62.5 kg/ha
(25% dosage) without biofertilizer application (TC), were extracted for DNA.
Those DNA were amplified using primer-GC, hence, analyzed using DGGE. The

nifH gene had high variability more than nifD gene. It was expected that there
were at least 7 kinds of nifH gene in sample C, 5 in sample TC, and 1 in sample K.
High genetic variability of nifH genes was caused evolutionary line. In the other
hand, nifD genes tended to be conserved.
Keyword: nifH, nifD, DGGE, nitrogen fixation.

KERAGAMAN KOMUNITAS BAKTERI PEMFIKSASI
NITROGEN PADA TANAH SAWAH DI SUKABUMI

MUNJIATI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2013

Judul Skripsi: Keragaman Komunitas Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah
Sawah di Sukabumi
:
Munjiati
Nama
: G34090011
NIM

Disetujui oleh

Dr Ir II

usmana MSi
bimbing I

Pembimbing II

tRusmana, MSi

Ketu.a Departemen

Tanggal Lulus:

Judul Skripsi : Keragaman Komunitas Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah
Sawah di Sukabumi
Nama
: Munjiati
NIM
: G34090011

Disetujui oleh

Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Pembimbing I

Ir Alina Akhdiya, MSi
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Tuhan Yang Maha Esa,
karena dengan rahmat dan petunjuk-Nya karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Topik penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini ialah keragaman,
dengan judul Keragaman Komunitas Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Tanah
Sawah di Sukabumi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Iman Rusmana, MSi dan
Ibu Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing, serta Ibu Dr Sri Listiyowati, M.Si
selaku penguji, atas bimbingan dan perbaikan skripsi ini. Ucapan terima kasih tak
lupa penulis sampaikan kepada Ibunda tercinta dan keluarga besar atas segala
dukungan baik materi maupun moril. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan pada Kak Lena Novita, S.Si atas saran dan kerja samanya, rekan-rekan

Biologi 46, rekan se-almamater Smast, serta teman-teman di laboratorium
Mikrobiologi yang telah banyak membantu pelaksanaan penelitian ini.
Penulis berharap agar karya ilmiah ini bermanfaat bagi penulis khususnya
dan para pembaca umumnya.

Bogor, September 2013
Munjiati

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Tujuan

1

METODE

1

Waktu dan Tempat

1

Alat dan Bahan

2

Prosedur Penelitian

2

HASIL

4

Hasil Ekstraksi dan Kuantifikasi DNA

4

Amplifikasi Gen nifH dan nifD

4

Running DGGE Gen nif

5

Nested PCR, Sekuensing dan Analisis Blast

5

PEMBAHASAN

6

SIMPULAN DAN SARAN

8

Simpulan

8

Saran

8

DAFTAR PUSTAKA

9

LAMPIRAN

11

RIWAYAT HIDUP

13

DAFTAR TABEL
1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen nifH dan nifD
2 Kondisi reaksi PCR untuk amplifikasi gen nifH dan nifD
3 Konsentrasi DNA total (ng/µL) hasil ekstraksi
4 Perbandingan ukuran hasil PCR awal dan nested PCR (pb)

3
3
4
6

DAFTAR GAMBAR
Visualisasi elektroforesis amplikon menggunakan primer nifH dan
nifD.
2 Visualisasi hasil PCR-DGGE gen nifD
3 Hasil elektroforesis DGGE gen nifH
4 Visualisasi hasil nested PCR
1

4
5
5
6

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil blast sekuen dari 8 sampel hasil nested PCR

11

PENDAHULUAN
Siklus biogeokimia di alam berkontribusi pada penggunaan dan penyediaan
kembali unsur hara, contohnya nitrogen. Siklus nitrogen meliputi fiksasi nitrogen,
denitrifikasi dan nitrifikasi yang seluruhnya dilakukan secara aerob maupun
anaerob, artifisial maupun biologis. Fiksasi nitrogen merupakan proses kunci
dalam kaitannya dengan siklus nitrogen. Fiksasi nitrogen secara biologis,
menyumbang sekitar 70% dari total penambatan nitrogen di alam, sedangkan 30%
sisanya terjadi secara alami dengan petir sebagai sumber energinya maupun
dilakukan secara artifisial. Fiksasi nitrogen secara biologis hanya dapat dilakukan
oleh prokariot yang memiliki kompleks enzim dinitrogenase (Auman et al. 2001).
Enzim dinitrogenase terdiri atas dua sub unit protein, yakni kompleks
protein pengoksidasi feredoksin (Fe protein) dan kompleks protein pereduksi N2
menjadi NH3 (MoFe protein). Protein Fe dan protein MoFe masing-masing
disandikan oleh gen nifH dan nifD (Mevarech et al. 1980). Kedua gen tersebut
dapat digunakan sebagai biomarker untuk analisis komunitas bakteri pemfiksasi
nitrogen pendekatan non kultur. Bank data sekuen dari gen tersebut digunakan
dalam identifikasi spesies bakteri pemfiksasi nitrogen secara metagenomik.
Salah satu teknik metagenom yang digunakan dalam analisis komunitas
mikroorganisme pada suatu lingkungan ialah Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE). Perilaku denaturasi DNA pada suhu tinggi menjadi
dasar dari metode ini. Suhu denaturasi (melting point) fragmen DNA dipengaruhi
oleh perbandingan komponen basa GC dan AT. Semakin banyak jumlah GC pada
sekuen DNA, semakin tinggi suhu yang diperlukan untuk mendenaturasinya.
Amplifikasi pada PCR-DGGE menggunakan primer yang mengandung GC-clamp
(GC rich sequence) yang berfungsi sebagai clamp saat elektroforesis (Muyzer et
al. 1993). Gradien konsentrasi denaturan sepanjang gel akrilamida berfungsi
menaikkan suhu denaturasi saat elektroforesis. Oleh karena itu, amplikon hasil
PCR-DGGE yang dielektroforesis pada gel bergradien denaturan akan terpisah
berdasarkan urutan nukleotidanya. Teknik ini diharapkan mampu
merepresentasikan komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah sawah di
Sukabumi.

Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengetahui keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen
pada tanah sawah di Sukabumi berdasarkan analisis PCR-DGGE gen nifH dan
nifD.

METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2013 sampai bulan Juni 2013 di
Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

2
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sampel tanah dari
sawah percobaan di Sukabumi, kit isolasi DNA, kit PCR, serta alat dan bahan
yang digunakan pada teknik DGGE. Sampel tanah diambil dari petak dengan tiga
perlakuan, yaitu pemupukan dengan pupuk anorganik berupa NPK (nitrogen,
fosfat, kalium) 15:15:15 sebanyak 250 kg/ha (takaran 100% pupuk normal yang
dianjurkan) (K), 62.5 kg/ha (takaran 25% dari normal yang dianjurkan) dengan
aplikasi pupuk hayati yang terdiri atas kombinasi isolat bakteri Metanotrof BGM1,
BGM5, BGM9 dan SKM14 (Hapsari 2008), Ochrobactrum anthropi BL1 dan
BL2 (Setyaningsih et al. 2010), Azotobacter dan Azospirillum koleksi Departemen
Biologi FMIPA IPB (C); dan 62.5 kg/ha (takaran 25% dari normal yang
dianjurkan) tanpa pupuk hayati (TC).

Prosedur Penelitian
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan Ultra Clean Soil DNA
Isolation Kit (MoBio Laboratories). Prosedur ekstraksi DNA yang dilakukan
sesuai dengan protokol yang diberikan oleh produsennya. Ekstraksi DNA dari
masing-masing sampel dilakukan tiga ulangan, kecuali sampel K yang dibuat dua
ulangan. Sampel dengan konsentrasi DNA tertinggi digunakan sebagai template
reaksi PCR.
Kuantifikasi DNA
DNA diukur konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan
Nanodrop.
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
DNA hasil ekstraksi dan amplifikasi dicek dengan cara elektroforesis pada
gel agarosa dalam Tris-Acetic acid-EDTA (TAE) 1X (1% agarosa untuk DNA
genom; 1.25% agarosa untuk DNA amplikon). Elektroforesis dilakukan pada
tegangan 80 volt selama 1 jam. Pita DNA pada gel agarosa diwarnai
menggunakan 0.1% etidium bromida (EtBr) kemudian divisualisasi menggunakan
UV transiluminator.
Amplifikasi Genom
Amplifikasi DNA atau polymerase chain reaction (PCR) dilakukan dengan
komposisi campuran reaksi sebagai berikut: 33.7 ng DNA template, 10 pmol
masing-masing primer forward-GC dan primer reverse, 25 µL 2x Phusion Master
Mix, 2 µL DMSO, dan ddH2O untuk menggenapkan volume campuran reaksi
menjadi 50 µL. Runutan sekuen primer yang digunakan sebagaimana dipaparkan
oleh Dedysh et al. (2004). Kondisi proses PCR untuk kedua gen tersebut disajikan
pada Tabel 2. Amplifikasi dilakukan dalam 35 siklus.

3
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen nifH dan nifD
Primer
Sekuen
nifD F*
5‟-GYGGYTGCGCCTAYGCCGG-3‟
nifD R
5‟-TCCCANGARTGCATCTGRCGGA-3‟
nifH F*
5‟-TAYGGNAARGGNGGNATYGGNAARTC-3‟
nifH R
5‟-ADNGCCATCATYCTNCC -3‟
Y = T atau C; N = A, C, G, atau T; R = A atau G; and D = A, G, atau T
*sekuen GC-clamp (5‟- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-„3)
(Rosado et al. 1998) dihibridisasi pada ujung 5‟ primer forward nifH dan nifD

Tabel 2 Kondisi reaksi PCR untuk amplifikasi gen nifH dan nifD
Tahap reaksi PCR*
NifH
nifD
Denaturasi awal
950C, 2 menit
950C, 2 menit
Denaturasi
920C, 45 detik
940C, 30 detik
0
Annealing
55 C, 45 detik
600C, 30 detik
0
Elongasi
72 C, 1 menit
720C, 75 detik
Elongasi akhir
720C, 5 menit
720C, 5 menit
Preparasi dan Running Gel DGGE
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 40% dibuat dari akrilamida:bisakrilamida dengan perbandingan 37.5:1. Konsentrasi PAGE yang digunakan pada
penelitian ini ialah 6%. Larutan gel 100% denaturan dibuat dari larutan stok gel
40%, TAE 50X, urea 7M, formamida, dan akuades steril, sedangkan larutan gel
0% denaturan dibuat dari larutan stok, TAE 50X, dan akuades steril. Persentase
denaturan dibuat menurut Muyzer et al. (1993). Gradien denaturan yang
digunakan pada penelitian ini ialah 35-55% untuk gen nifH dan 40-55% untuk gen
nifD. 20-50 µL DNA amplikon dimuat pada gel kemudian dielektroforesis dalam
TAE 1X pada suhu 600C, 130 V selama 3 jam menggunakan alat DCodeTM
Universal Mutation Detection System (BIO-RAD). PAGE diwarnai menggunakan
EtBr 0.1% selama 15 menit, kemudian divisualisasi pada UV transiluminator.
Nested PCR dan Sequencing Amplikon Gen nifH dan nifD
Pita DNA amplikon pada gel DGGE dipotong menggunakan scalpel steril.
Potongan gel direndam dalam tabung mikro berisi 50 µL aqua bidestillata steril,
dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 370C selama 2 jam, kemudian disimpan
pada suhu 40C (Bodelier et al. 2005). Sebanyak 10 µL (30 ng) DNA hasil elusi
digunakan sebagai template untuk reaksi nested PCR. Amplifikasi dilakukan
menggunakan primer dan kondisi PCR seperti pada Tabel 2 tetapi tanpa GCclamp. DNA amplikon kemudian dikirim ke perusahaan jasa sequencing.
Analisis BLAST
Hasil sekuens disejajarkan menggunakan software MEGA 5 dan dilihat
kemiripannya menggunakan BLAST yang dapat diakses melalui situs
www.ncbi.nlm.nih.gov.

4

HASIL
Ekstraksi dan Kuantifikasi DNA
Hasil ekstraksi 8 sampel tanah menunjukkan konsentrasi yang berbeda-beda
(Tabel 3). Perbedaan konsentrasi pada tiap sampel mengindikasikan perbedaan
kelimpahan bakteri tiap sampel dan efektifitas ekstraksi. Konsentrasi DNA
tertinggi diperoleh dari sampel TC 3 dengan konsentrasi 29.3 ng/µL, sedangkan
konsentrasi terendah diperoleh dari sampel C 3 dengan konsentrasi 7.4 ng/µL.
Tabel 3 Konsentrasi DNA total (ng/µL) hasil ekstraksi
No
Kode Sampel Konsentrasi DNA [ng/µL]
1
K1
16.7
2
K2
7.8
3
C1
14.8
4
C2
18.3
5
C3
7.4
6
TC 1
15.4
7
TC 2
14.0
8
TC 3
29.3

Amplifikasi Gen nifH dan nifD
Visualisasi produk PCR gen nifH dan nifD pada gel agarosa menunjukkan
semua sampel menghasilkan amplikon. Pita DNA amplikon K1, C2 dan TC3
lebih tebal dibandingkan dengan amplikon sampel lainnya. Ketiga sampel tersebut
dipilih sebagai template untuk amplifikasi gen nifH dan nifD menggunakan primer
GC clamp. Ukuran amplikon gen nifH kurang dari 500 pb, sedangkan nifD lebih
dari 100 pb (Gambar 1).
1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 kb
0.5 kb

Gambar 1 Visualisasi amplikon menggunakan primer nifH dan nifD pada gel
agarosa 1%. Keterangan lajur: marker 100 pb (2), nifH C (3), nifH K
(4), nifH TC (5), nifD C (7), nifD K (8), nifD TC (9).

5
Running DGGE Gen nif
Visualisasi hasil PCR-DGGE gen nifD (Gambar 2) menunjukkan masingmasing sampel amplikon DNA sampel menghasilkan 2 pita yang seragam.
Sebaliknya, hasil analisis DGGE gen nifH (Gambar 3) menunjukkan jumlah pita
yang beragam. Sampel K menghasilkan 1 pita, sampel C menghasilkan 7 pita, dan
sampel TC menghasilkan 5 pita. Jumlah pita gen nif pada tiap lajur
mengindikasikan jumlah jenis gen nifH strain bakteri pemfiksasi nitrogen yang
mendiami habitat tanah sawah.
5

3

1

7

9

11

13

Gambar 2 Visualisasi hasil PCR-DGGE gen nifD. 1 nifD K, 3
nifD C(1), 5 nifD C(2), 7 nifD C(3), 9 nifD TC(1),
11 nifD TC(2), 13 nifD TC(3)
A
1

B
2

1

C
2

3
4
5
6

7

3
4

5

Gambar 3 Visualisasi PCR-DGGE gen nifH. Keterangan lajur:
nifH C 2 (A), nifH TC 3(B), nifH K 1 (C)

Nested PCR, Sekuensing dan Analisis BLAST
Sebanyak 8 pita DNA amplikon (3 pita amplikon nifH TC dan 5 pita
amplikon nifH C) berhasil dielusi dan digunakan sebagai template pada nested
PCR. Namun, sebanyak 5 pita DNA amplikon lainnya tidak berhasil dielusi.
Ukuran amplikon nested PCR yang diperoleh dari 8 template, lebih pendek
daripada amplikon PCR-DGGE dari DNA genom (453 pb). Hasil nested PCR
disajikan pada Gambar 4.

6

Tabel 4 Perbandingan ukuran hasil PCR awal dan nested
PCR (pb)

M
O
P
Q
R
V
W
X
1

2

Ukuran nested
PCR (pb)
360
363
357
363
356
386
369
376

Ukuran amplikon
awal (pb)
453
453
453
453
453
453
453
453

Sampel

3

4

5

6

7

8
500 pb
250 pb

Gambar 4 Visualisasi hasil nested PCR. Keterangan lajur:
1-5: nifH C (kode: M, O, P, Q, dan R), 6-8:
nifH TC (kode: V, W, dan X).
Hasil sekuensing dari 8 amplikon tersebut berukuran lebih pendek dan
memperlihatkan kromatogram dengan peak menumpuk. Data runutan nukleotida
yang diperoleh juga tidak konsisten ketika dilakukan analisis menggunakan
program BLAST dari ujung primer forward maupun reverse serta terdapat banyak
gap. Hasil BLAST dari semua sampel menunjukkan kemiripan terhadap
uncultured nitrogen-fixing bacteria nifH gene.

PEMBAHASAN
DNA amplikon yang diperoleh menggunakan primer nifH berukuran di
bawah 500 pb, dan lebih dari 1000 pb untuk gen nifD (Gambar 1). Panjang DNA
amplikon yang diperoleh tidak berbeda nyata dengan hasil amplifikasi yang
dilakukan oleh Dedysh et al. (2004) yang berukuran 453 (nifH) dan 1130 (nifD)
pb. Penggunaan primer nifH reverse yang didesain oleh Zehr & McReynold
(1989) serta primer nifH forward yang didesain oleh Boulygina et al. (2002) juga
menghasilkan amplikon berukuran 453 pb (Dedysh et al. 2004).
PCR-DGGE gen nifD menghasilkan DNA amplikon lebih sedikit daripada
gen nifH (Gambar 2). Jumlah amplikon yang dihasilkan juga seragam untuk
semua sampel. Hal ini mengindikasikan tingkat kemiripan sekuen nifD yang
sangat tinggi pada bakteri pemfiksasi nitrogen yang terdapat dalam delapan
sampel yang dianalisis. Sebaliknya, pita DNA amplikon hasil PCR-DGGE gen

7
nifH (Gambar 3) lebih beragam jumlahnya. Keragaman gen nifH yang dimiliki
oleh bakteri pemfiksasi nitrogen yang terdapat dalam ketiga jenis sampel tanah
yang dianalisis lebih tinggi dari gen nifD-nya. Keseragaman pita DNA amplikon
gen nifD menandakan bahwa gen tersebut tidak dapat digunakan sebagai markah
dalam analisis molekular keragaman gen nitrogenase. Oleh karena itu, analisis
keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen lebih baik dilakukan berdasarkan gen
nifH-nya. Berbagai laporan penelitian juga menyebutkan bahwa gen nifH sering
digunakan sebagai bioprobe untuk analisis keragaman maupun identifikasi
mikroorganisme pemfiksasi nitrogen (Zehr & McReynold 1989, Boulygina et al.
2002, Quok et al.2003, Dedysh et al. 2004).
Keragaman gen nifH pada sampel C lebih banyak dari sampel TC dan K.
Ketiga sampel tersebut berturut-turut menghasilkan 7, 5 dan 1 amplikon. Hal ini
mengindikasikan bahwa keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang terdapat
pada tanah yang diberi pupuk hayati dan NPK dosis rendah (25% takaran) lebih
tinggi dibandingkan tanah yang hanya diberi NPK dengan dosis rendah (25%) dan
tanah kontrol (K) yang diberi dosis lebih tinggi (100%). Sampel K hanya
menampilkan satu pita DNA amplikon gen nifH, sehingga diduga bakteri-bakteri
pemfiksasi nitrogen yang terdapat pada sampel tersebut hanya memiliki 1 jenis
gen nifH yang sama. Pasokan pupuk nitrogen yang tinggi pada tanah akan
menghambat aktivitas bakteri pemfiksasi nitrogen (Simanungkalit et al. 1995).
Konsentrasi pupuk nitrogen yang tinggi di dalam tanah akan meningkatkan
pertumbuhan bakteri lain (bukan pemfiksasi nitrogen), sehingga menjadi dominan
di dalam komunitas tersebut. Dominasi bakteri non pemfiksasi nitrogen akan
memengaruhi komposisi DNA hasil ekstraksi. Dominasi genom bakteri non
pemfiksasi nitrogen mengakibatkan jumlah jenis gen nifH yang diperoleh juga
sedikit.
Amplikon PCR-DGGE yang diperoleh dari sampel C lebih tinggi
keragamannya dibandingkan TC. Hal ini diduga disebabkan oleh aplikasi bakteri
pemfiksasi nitrogen (yang terkandung pada komponen pupuk hayati) ke lahan
sawah yang sebelumnya tidak terdapat secara alami atau sudah menghilang dari
lahan sawah tersebut. Berdasarkan jumlah DNA amplikon gen nifH yang tampak
pada gel DGGE, sampel C diduga mengandung minimal 7 jenis bakteri
pemfiksasi nitrogen yang memiliki 7 jenis gen nifH. Sampel TC diduga
mengandung minimal 5 jenis bakteri pemfiksasi nitrogen yang memiliki 5 jenis
gen nifH. Beberapa bakteri pemfiksasi nitrogen yang terdapat dalam sampel C
diduga sama atau memiliki gen nifH yang sama dengan bakteri pemfiksasi
nitrogen pada sampel TC. Jenis-jenis bakteri yang menghasilkan amplikon gen
nifH sama pada kedua sampel tersebut diduga secara alami sudah ada di tanah
sawah. Selain itu, pita tunggal gen nifH pada sampel K yang juga dimiliki oleh
sampel TC dan C, berada pada posisi paling bawah pada gel DGGE. Posisi pita
terbawah menunjukkan stabilitas migrasi amplikon pada saat elektroforesis suhu
tinggi DGGE. Stabilitas amplikon pada suhu tinggi disebabkan konten GC yang
tinggi pada runutan gennya. Pita tunggal gen nifH pada sampel K diduga
merupakan bakteri tanah yang memiliki aktivitas nitrogenase, serta memiliki high
GC content pada genomnya.
Laporan hasil penelitian Pingak (2013) menyebutkan bahwa perlakuan C
menghasilkan jumlah anakan padi dan jumlah gabah paling banyak, serta
persentase gabah hampa paling kecil dibandingkan perlakuan TC dan K. Hal ini

8
menunjukkan bahwa aplikasi bakteri pemfiksasi nitrogen yang telah teruji
kemampuannya ke lahan pertanian dapat meningkatkan produktivitas tanaman
padi. Selain itu, aplikasi pupuk hayati yang diimbangi dengan penurunan
penggunaan pupuk dapat meningkatkan kembali keragaman bakteri pemfiksasi
nitrogen di lahan sawah.
Hasil sekuensing amplikon pita-pita hasil elusi gel DGGE memperlihatkan
peak menumpuk yang kemungkinan diakibatkan oleh jumlah basa degenerate
pada primer yang digunakan. Ukuran amplikon lebih pendek kemungkinan
diakibatkan oleh sebagian basa terdegradasi akibat paparan UV ketika
divisualisasi. Di samping itu, hasil alignment sekuen dari arah forward dan
reverse tidak konsisten dan memperlihatkan banyak gap. Analisis BLAST
menunjukkan semua sekuen amplikon memiliki kemiripan dengan gen nifH dari
uncultured nitrogen-fixing bacteria (Lampiran 1). Hasil analisis ini tidak dapat
digunakan untuk menentukan jenis atau identitas bakteri pemfiksasi nitrogen yang
terkandung pada sampel tanah.
Hasil sekuensing yang kurang baik dapat disebabkan oleh ketidakmurnian
template, sehingga mengganggu proses sekuensing. Masalah ini dapat diatasi
dengan melakukan kloning produk PCR yang akan disekuensing. Beberapa
laporan penelitian mengenai keragaman gen nifH menggunakan teknik DGGE
juga melakukan kloning amplikon DGGE (Tan 2011). Selain itu, penggunaan
primer tanpa basa degenerate pada proses nested PCR juga dapat menjadi solusi
(Bodelier et al. 2005).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada sampel tanah dengan
perlakuan NPK 25% takaran dengan aplikasi pupuk hayati (C) lebih tinggi
daripada sampel TC (NPK 25% takaran) dan K (NPK 100% takaran). Sampel C
diduga mengandung minimal 7 jenis bakteri pemfiksasi nitrogen yang memiliki 7
jenis gen nifH. Sampel TC diduga mengandung minimal 5 jenis bakteri
pemfiksasi nitrogen yang memiliki 5 jenis gen nifH. Bakteri pemfiksasi nitrogen
yang terdapat pada sampel K hanya memiliki 1 jenis gen nifH yang sama.

Saran
Penelitian ini menggunakan sampel dari penelitian sebelumnya, sehingga
diperlukan kontrol lapang serta kerja sama agar hasil kedua penelitian saling
berkaitan. Selain itu, optimasi preparasi gel dan elektroforesis harus dilakukan
agar diperoleh kondisi yang sesuai. Primer degenerate juga tidak dianjurkan untuk
digunakan dalam amplifikasi PCR-DGGE.

9

DAFTAR PUSTAKA
Auman AJ, Speake CC, Lidstrom ME. 2001. NifH sequences and nitrogen
fixation in type I and type II methanotrophs. Appl.Environ.Microbiol 67(9):
4009–4016.doi: 10.1128/AEM.67.9.4009-4016.2001
Bodelier PLE, Franke MM, Zwart G, Laanbroek HJ.2005. New DGGE strategies
for the analyses of methanotrophic microbial communities using different
combinations of existing 16S rRNA-based primers. FEMS Microbiol. Ecol.
52: 163–174.
Boulygina ES, Kuznetsov BB, Marusina AI, Tourova TP, Kravchenko IK,
Bykova SA, Kolganova TV, Galchenko VF.2002. A study of nucleotide
sequences of nifH genes of some methanotrophic bacteria. Microbiology 71:
500–508.
Dedysh SN, Ricke P, Liesack W. 2004. NifH and nifD phylogenies: an
evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of
methanotrophic bacteria. Microbiology 150: 1301–1313.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri metanotrof asal sawah di Bogor
dan Sukabumi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Mevarech M, Rice D, Haselkorn R.1980. Nucleotide sequence of a cyanobacterial
nifH gene coding for nitrogenase reductase. Proc. Natl. Acad. Sci
77(11):6476-6480.
Muyzer G, de Waal EC , Uitterlinden AG. 1993. Profiling of complex microbial
populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.
Environ. Microbiol. 59 (3): 695-700.
Pingak GMF. 2013. Efektivitas bakteri metanotrof dan Ochrobactrum anthropi
sebagai pupuk hayati dan pereduksi emisi gas CH4 serta N2O di sawah
anorganik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Quok CC, Samian MR, Najimudin N. 2003. Phylogeny and characterization of
three nifH-homologous genes from Paenibacillus azotofixans. Appl. Environ.
Microbiol. 69: 3658-3662.
Rosado AS, Duarte GF, Seldin L, Elsas JD. 1998. Genetic diversity of nifH gene
sequences in Paenibacillus azotofixans strains and soil samples analyzed by
denaturing gradient gel electrophoresis of pcr-amplified gene fragments.
Appl. Environ. Microbiol. 64: 2770–2779.
Setyaningsih R, Rusmana I, Setyanto P, Suwanto A. 2010. Physiological
characterization and molecular identification of denitrifying bacteria
possessing nitrous oxide high reduction activity isolated from rice soils.
Microbiol. Indones. 4:75-78.
Simanungkalit RDM, Hastuti RD, Indrasumunar A, Pratiwi E, Roughley RJ.1995.
Soybean response on nodulation to starter nitrogen and inoculation with
Bradyrhizobium japonicum. J.Crop. Science 10: 25-32
Tan KY.2011. Phylogenetic diversity of nitrogenase (NifH) gene within the
rhizosphere of Colocasia esculenta of extin mining land [skripsi]. Petaling
Jaya (MY): Universiti Tunku Abdul Rahman.

10
Zehr JP, McReynolds LA.1989. Use of degenerate oligonucleotides for
amplification of nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodesmium
thiebautii. Appl. Environ. Microbiol. 55: 2522–2526.

LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil BLAST sekuen dari 8 sampel hasil nested PCR
No
1

Sample

Blast result

M-Forward

Uncultured bacterium clone hytp-77-11
dinitrogenase reductase (nifH) gene partial cds
Uncultured nitrogen-fixing bacterium mRNA
for dinitrogenase reductase, partial cds
Uncultured nitrogen-fixing bacterium mRNA
for dinitrogenase reductase, partial cds, clone
Sp STR 16
Uncultured bacterium isolate DGGE gel band
N4 dinitrogenase reductas-like (nifH), partial
sequences
Uncultured nitrogen-fixing bacterium mRNA
for dinitrogenase reductase, partial cds, clone
NE5U-ROR06
No significant similarity found
Uncultured bacterium clone S2T4F423203
nitrogenase (nifH) gene, partial cds
No significant similarity found

M-Reverse
2

O-Forward

O-Reverse

3

P-Forward

4

P-Reverse
Q-Forward
Q-Reverse

Maximal
Score
110

Total
Score
110

Query
Cover
37%

Identity

Accession

82%

JQ928220.1

226

226

73%

83%

AB208403.1

143

143

95%

75%

AB208894.1

165

165

64%

80%

HM021144.1

331

331

92%

80%

AB208404.1

73.1

73.1

24%

80%

JN122957.1

-

-

-

-

-

11

12

No

Sample

5

R-Forward

6

R-Reverse
V-Forward

7
8

V-Reverse
W-Forward
W-Reverse
X-Forward
X-Reverse

Blast result
Uncultured bacterium clone clo A 42
dinitrogenase iron protein (nifH) gene, partial
cds
No significant similarity found
Uncultured bacterium clone BN nif23
nitrogenase component 11 (nifH) gene, partial
cds
No significant similarity found
Geobacter daltonii FRC32 complete genome
No significant similarity found
Uncultured bacterium clone JPS 12-6
dinitrogenase reductase (nifH) gene, partial cds
No significant similarity found

Maximal
Score
399

Total
Score
399

Query
Cover
83%

Identity

Accession

91%

JX628272.1

340

340

86%

86%

HQ190134.1

233
368

233
368

82%
90%

81%
87%

CP001390.1
HM750483.1

-

-

-

-

-

13

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kediri, pada tanggal 30 Oktober 1991 dari Ayahanda
Masduri dan Ibunda Siti Aminah. Penulis merupakan anak bungsu dari delapan
bersaudara. Penulis lulus dari SMAN 1 Kediri pada tahun 2009. Pada tahun yang
sama, penulis diterima sebagai mahasiswa program studi Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada tahun 2009-2010 penulis memperoleh
beasiswa BBM, kemudian pada tahun 2010-2013 penulis memperoleh beasiswa
Tanoto Foundation. Pada tahun 2012 penulis memperoleh kesempatan mengikuti
program magang yang diadakan oleh Tanoto Foundation Internship Program di
Asian Agri Sumatera.
Penulis aktif mengikuti beberapa kegiatan dalam masa studi seperti kegiatan
Leadership Training of Dormitory dan menjadi ketua lorong salah satu gedung
asrama, menjadi reporter dan penulis untuk majalah HIMABIO, Chepalos, Organisasi
Mahasiswa Daerah (OMDA) Kediri, menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah
Genetika Dasar, Botani Umum, dan Genetika Molekular. Penulis juga aktif mengikuti
kompetisi olimpiade Biologi untuk tingkat propinsi (OSN Pertamina) dan tingkat
nasional (ON MIPA PT) berturut-turut pada tahun 2012 dan 2013.
Selama menjadi mahasiswa, penulis mengikuti beberapa kegiatan penelitian
dan praktik kerja lapang. Penulis mengikuti kegiatan studi lapangan pada bulan Juli
2011 di Hutan Pendidikan Gunung Walat, Sukabumi, Jawa Barat dengan judul
laporan “Anatomi Daun Tumbuhan Herba yang Terpapar Cahaya dan yang Ternaung
di Hutan Pendidikan Gunung Walat”. Penulis juga mengikuti kegiatan Praktik
Lapang pada bulan Juni sampai Agustus tahun 2012 di Asian Agri bagian Researches
& Development di Laboratorium Oil Palm Tissue Culture Kebun Buatan COPPU,
Pangkalan Kerinci, Kabupaten Pelalawan, Riau dengan judul laporan “Aplikasi
Kultur Jaringan pada Pembibitan Tanaman Kelapa Sawit di PT Tunggal Yunus Estate
(Asian Agri Sumatera), Kabupaten Pelalawan-Riau”.