Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen Pada Sawah Dataran Rendah Berdasarkan Gen Nifh

KERAGAMAN BAKTERI PEMFIKSASI NITROGEN PADA
SAWAH DATARAN RENDAH BERDASARKAN GEN nifH

MASRUKHIN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Bakteri
Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah Dataran Rendah Berdasarkan Gen nifH adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, September 2016
Masrukhin
NIM G351140151

RINGKASAN
MASRUKHIN. Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah Dataran
Rendah berdasarkan Gen nifH. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA
RACHMANIA MUBARIK.
Pupuk hayati merupakan pupuk yang mengandung mikroorganisme hidup
yang mampu mengkolonisasi rhizosfer tanaman dan dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan cara meningkatkan asupan maupun ketersediaan
hara bagi tanaman. Berbagai macam bakteri yang digunakan dalam konsorsium
bakterinya antara lain mikrob pemfiksasi N2, pelarut unsur P dan K, pereduksi
nitrous oksida (N2O) dan pengoksidasi metan (CH4). Berdasarkan penelitian
sebelumnya, penggunaan pupuk hayati yang menggandung konsorsium bakteri
metanotrof dan bakteri pereduksi N2O dapat meningkatkan pertumbuhan dan
produktivitas padi yang ditunjukkan dengan peningkatan tinggi, bobot kering,
banyaknya bulir, dan jumlah anakan padi.
Penelitian ini diawali dengan aplikasi pupuk hayati yang terdiri atas
konsorsium bakteri metanotrof Methylocystis rosea BGM1, M. parvus BGM3,

Methylococcus capsulatus BGM9, Methylobacter SKM14 dan bakteri pereduksi
N2O Ochrobactrum anthropi BL2. Lahan sawah dibagi menjadi dua perlakuan
yaitu perlakuan pupuk hayati (20% NPK + pupuk hayati) dan kontrol (100% NPK).
Pada penelitian ini analisis keragaman bakteri dilakukan dengan pendekatan
metagenomik, yakni dengan teknik Denaturing Gel Gradient Electrophoresis
(DGGE). Sampel tanah dari tiap perlakuan diambil pada 0 hari setelah tanam
(0HST), 60 HST dan 120 HST. Total genom diekstraksi dari sampel tanah tersebut
dan dlakukan amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan gen spesifik
nifH dan 16S rRNA. nifH merupakan gen pengkode enzim dinitrogenase reduktase
(Fe protein) yang bersifat conserved sehingga umum digunakan sebagai gen
spesifik untuk menganalisis keragaman mikrob pemfiksasi nitrogen. Hasil
amplikon nifH maupun 16S rRNA kemudian dilakukan elektroforesis dengan
menggunakan teknik DGGE.
Berdasarkan hasi penelitian, secara umum perlakuan kontrol memiliki
keragaman bakteri yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan pupuk hayati
yang ditunjukkan dengan banyaknya jumlah pita DGGE. Tingginya keragaman
bakteri pada kontrol diduga karena penggunaan pupuk kimia (NPK) yang membuat
tanah lebih kaya nutrisi dibandingkan pada perlakuan pupuk hayati. Berdasarkan
analisis pengelompokan (clustering analysis) menggunakan gen nifH secara umum
didapatkan terdapat 2 cluster yaitu P0, P60, K120 dan K0, K60, P120. Terpisahnya

2 cluster tersebut disebabkan adanya perbedaan keragaman bakteri pamfiksasi
nitrogen yang disebabkan oleh kebutuhan nitrogen tanaman dan ketersediaanya.
Adapun berdasarkan 16S rRNA secara umum P60 berada 1 cluster dengan K60,
P0, K0 dan P120, K120. Pengelompokan tersebut diduga disebabkan oleh
ketersediaan nutrisi pada tanah yang salah berasal dari eksudat akar. Sekresi
eksudat akar tersbut dipengaruhi oleh fase pertumbuhan tanaman.
Sebanyak 9 pita DNA nifH yang berbeda dari hasil DGGE berhasil
diamplifikasi ulang dan dilakukan pembacaan sekuen (sequencing). Analisis
filogenetik berdasarkan BLAST-N menunjukkan mayoritas bakteri pemfiksasi

nitrogen yang didapatkan berkerabat dekat dengan uncultured bacterium. Namun
terdapat 3 pita yang terdeteksi sebagai bakteri Sphingomonas sp., Ideonella
dechloratans dan Magnetospirillum sp. Adapun pada DGGE dengan menggunakan
gen 16S rRNA didapatkan 20 pita DNA yang berhasil diamplifikasi ulang. Hasil
analisis filogenetik gen 16S rRNA menunjukkan terdapat 5 filum bakteri pada lahan
sawah, yaitu Proteobacteria, Clostridia, Bacteroidetes, Chlorofexi, dan
Gemmatimonadetes. Pada filum Proteobacteria, terdapat 2 kelas bakteri yang
berbeda yaitu Alphaproteobacteria dan Gammaproteobacteria. Alphaproteobacteria
menjadi kelompok bakteri yang paling dominan ditemukan, diikuti
Gammaproteobacteria, Chlorofexi, Clostridia, Gemmatimonadetes dan

Bacteroides. Sekuen gen nifH hasil DGGE dikonfirmasi kembali menggunakan
BLAST-X, hasil dari BLAST-X menunjukkan semua sekuen merupakan pengkode
enzim dinitrogenase reduktase (Fe protein)
Kata kunci: Pupuk hayati, fiksasi nitrogen, metagenomik, DGGE, gen nifH.

SUMMARY

MASRUKHIN. Diversity of Nitrogen- Fixing Bacteria in Lowland Paddy Field
based on nifH Gene. Supervised by IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Biofertilizer is a fetilizer contain living microorganism which able to
colonize rhizosphere of the plant and has ability to promote plant growth by
increasing nutrients uptake of the plant and nutrients availability in the soil. Some
bacteria which commonly used as consortium of biofertilizer are nitrogen fixing
bacteria, phosphate and pottasium solubilizer bacteria, N2O reducing bacteria and
methanotrophic bacteria. According to previous research the application of
biofertilizer which contain consortium of methanotrophic bacteria and N2O
reducing bacteria was able to promote the plant growth and productivity.
This research was started by the application of biofetilizer which contain
consortium of methanotrophic bacteria Methylocystis rosea BGM1, M. parvus

BGM3, Methylococcus capsulatus BGM9, Methylobacter SKM14 and nitrous
oxide (N2O) reducing bacteria Ochrobactrum anthropi BL2. The field was divided
into 2 treatments i.e biofertilizer application (20% NPK + biofertilizer) and control
(100% NPK). This research using Denaturing Gel Gradient Electrophoresis
(DGGE) as one of metagenomic approach to analyze the microbial diversity. Soil
sample was taken from each treatment at 0 day after planting (0 DAP), 60 DAP,
and 120 DAP. Total genome was extracted from soil and amplified by Polymerase
Chain Reaction (PCR) by using nifH and 16S rRNA gene. nifH is conserved gene
which encode dinitrogenase reductase (Fe protein). It was commonly used as
molecular marker to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria. The PCR
product then electrophorized using DGGE.
According to the result, generally control has higher bacterial diversity than
biofertilizer treatment, it showed by higher number of DGGE bands. High number
of DGGE bands was caused by the application 100% dose of chemical fertilizer
(NPK) which enrich the soil and support the growth of bacteria. According to
clustering analysis by using nifH gene, generally there were 2 cluster i.e P0, P60,
K120 and K0, K60, P120. Two main cluster were caused by the difference of
nitrogen fixing bacterial diversity which affected by nitrogen requirements of the
plants. According to 16S rRNA generally P60 was in a cluster with K60, P0 with
K0 and P120 with K120. The clustering was affected by nutrient availability in the

soil which one of them is root exudates. Root exudates secretion was affected by
plant growth stage.
Nine different nifH bands were excised from the DGGE gel and used as
templates for PCR amplification. The PCR products were sequenced. Phylogenetic
analysis of the sequence showed that most of the DGGE bands were closely related
to uncultured bacterium however there were 3 bands which were identified as
Sphingomonas sp., Ideonella dechloratans and Magnetospirillum sp. There were
20 different DNA bands in DGGE of 16S rRNA. Phylogenetic analysis showed 5
different phyla in soil bacteria i.e Proteobacteria, Clostridia, Bacteroidetes,
Chlorofexi dan Gemmatimonadetes. There are two class of Proteobacteria were
detected in this analysis i.e Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria. Alpha

proteobacteria was the most abundant soil bacteria which detected in paddy field,
followed by Gamaproteobacteria, Chlorofexi, Clostridia, Gemmatimonadetes, and
Bacteroides respectively. nifH sequence from DGGE bands then analyzed in
BLAST-X to confirm that the sequence is encoding dinitrogenase reductase
enzyme. BLAST-X result showed that all of nifH sequence from DGGE bands
encoded dinitrogenase reductase enzyme (Fe protein).
Keywords: Biofertilizer, nitrogen fixation, metagenomic, DGGE, nifH gene.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KERAGAMAN BAKTERI PEMFIKSASI NITROGEN PADA
SAWAH DATARAN RENDAH BERDASARKAN GEN nifH

MASRUKHIN

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Hamim, MSi

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan
hidayahnya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini.
Sholawat serta salam semoga tersampaikan kepada Nabi Muhammad SAW.
Penelitian yang berjudul Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah
Dataran Rendah Berdasarkan Gen nifH dilaksanakan pada bulan September 2015Juli 2016 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku komisi pembimbing atas arahan dan
bimbingannya selama proses penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Ir. Hamim, M.Si selaku penguji luar
komisi dan Dr. Rika Indri Astuti selaku perwakilan Program Studi Mikrobiologi
atas diskusi dan saran yang diberikan. Selain itu penulis mengucapkan terima kasih
kepada Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) selaku lembaga pemberi

beasiswa untuk program magister.
Ungkapan terima kasih kepada orang tua tercinta dan seluruh anggota
keluarga atas limpahan kasih sayang, doa dan dukungan yang tak pernah berhenti.
Kepada rekan-rekan mikrobiologi 2014, IR Crew, seluruh personel Laboratorium
Mikrobiogi dan rekan- rekan Awardee LPDP IPB, penulis mengucapkan terima
kasih atas kerjasama, dukungan serta berbagai saran yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi pembacanya.
Bogor, September 2016

Masrukhin

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN

1

Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
2 TINJAUAN PUSTAKA
Fiksasi Nitrogen
Diazotrof
Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE)
3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan Metode

Sampel Tanah dan Perlakuan Sawah
Ekstraksi DNA
Amplifikasi Gen nifH dan Gen 16S rRNA
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Elusi DNA dan Sekuensing Amplikon Gen nifH
Analisis Filogenetik dan Pengelompokan Keragaman Bakteri
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
5 SIMPULAN DAN SARAN

1
2
2
2
3
4
4
4
5
6
6
7
7
7
7
8
8
9
10
10
20
24

Simpulan
Saran

24
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

36

DAFTAR TABEL
1 Referensi isolat yang digunakan ...................................................................... 7
2 Hasil kuantifikasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit. ................. 10
3 Hasil BLAST-N dari sekuen gen nifH .......................................................... 14
4 Hasil BLAST-X dari sekuen nifH .................................................................. 15
5 Hasil BLAST-N dari 16S rRNA .................................................................... 17

DAFTAR GAMBAR
1 Reaksi fiksasi nitrogen ..................................................................................... 4
2 Diagram alir metode penelitian........................................................................ 6
3 Hasil amplifikasi PCR gen nifH dan 16S rRNA ............................................ 10
4 Profil DGGE gen nifH ................................................................................... 11
5 Profil DGGE 16S rRNA ................................................................................ 13
6 Hasil amplifikasi ulang gen nifH .................................................................. 13
7 Hasil amplifikasi ulang gen 16S rRNA ......................................................... 14
8 Pohon filogenetik gen nifH ............................................................................ 16
9 Pohon filogenetik gen 16S rRNA .................................................................. 19

DAFTAR LAMPIRAN
1 Protokol TianAmp Soil DNA kit ................................................................... 30
2 Sekuen nifH yang digunakan untuk analisis filogenetik ................................ 31
3 Sekuen 16S rRNA yang digunakan untuk analisis filogenetik ..................... 32
4 pensejajaran asam amino nifH ....................................................................... 35

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pupuk hayati merupakan pupuk yang mengandung mikroorganisme hidup
yang mampu mengkolonisasi rhizosfer atau bagian internal tanaman dan dapat
meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan cara meningkatkan asupan maupun
ketersediaan hara bagi tanaman (Vessey 2003). Aplikasi pupuk hayati telah banyak
dilakukan di Indonesia. Konsorsium mikrob yang digunakan formulasinya juga
bervariasi, misalnya mikrob pemfiksasi N2, pelarut unsur P dan K (Wu et al. 2004).
Selain itu berdasarkan penelitian sebelumnya konsorsium mikrob pada pupuk
hayati juga dapat mengandung bakteri pereduksi nitrous oksida (N2O) dan
pengoksidasi metan (CH4) (Muttaqin 2012; Hadianta et al., 2014; Pingak et al.,
2014; Sukmawati et al., 2015).
Nitrogen merupakan hara esensial dalam menjaga kesuburan tanah
(Wartiainen et al. 2007). Pada pertumbuhan tanaman nitrogen menjadi unsur yang
sangat penting karena menjadi komponen penyusun sel tanaman seperti asam
amino, asam nukleat dan klorofil. Salah satu proses terbentuknya N2 di alam adalah
memlalui mekanisme yang disebut sebagai fiksasi nitrogen biologi (Biological
nitrogen fixation). Fiksasi N2 secara biologi menyumbang kurang lebih 70% dari
semua nitrogen yang difiksasi di bumi. Pada lahan pertanian padi secara umum ratarata fiksasi nitrogen mencapai 5 Tg per tahunnya, dan umumnya dilakukan oleh
simbiosis cyanobacteria- Azolla (Smil 1999; Herridge et al. 2008).
Organisme yang mampu memfiksasi nitrogen (gas N2) dan mengkonversinya
kedalam bentuk amonia disebut diazotrof (Postgate 1998). Diazotrof memanfaatkan
nitrogen gas N2 di atmosfer sebagai satu-satunya sumber nitrogen karena organisme
tersebut tidak memerlukan asupan nitrogen lain dari habitatnya (Bottomley dan
Myrold 2007). Secara umum bakteri pemfiksasi nitrogen terbagi menjadi dua, yaitu
bakteri pemfiksasi nitrogen yang bersimbiosis dan yang hidup bebas (free living).
Selain bakteri (eubakteria), beberapa jenis arkea metanogen juga mampu
melakukan fiksasi nitrogen (White 2007). Penelitian mengenai aplikasi mikrob
pemfiksasi nitrogen sebagai pupuk hayati telah banyak dilakukan (Kennedy et al.
2004).
Gen nifH merupakan gen yang mengodekan enzim nitrogenase yang
berperan dalam mengubah nitrogen bebas yang difiksasi menjadi bentuk amonium.
Pada bakteri pemfiksasi nitrogen, enzim nitrogenase tersusun atas dua subunit,
yaitu dinitrogenase dan nitrogenase reduktase. Gen nifH merupakan gen yang
umum digunakan dan terbukti akurat sebagai penanda spesifik bagi bakteri
pemfiksasi nitrogen, khususnya pada bakteri tanah (Dedysh et al. 2004).
Berdasarkan gen tersebut keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen dapat dianalisis
melalui pendekatan molekuler. Salah satu teknik analisis keragaman komunitas
bakteri ialah dengan metode DGGE (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis).
Menurut Crosby dan Criddle (2003), DGGE dapat membedakan sekuen suatu
spesies berdasarkan perbedaan melting temperature (Tm) pada DNA. Melting
termperature pada sekuen DNA dipengaruhi oleh kandungan basa G-C dalam DNA
(Muyzer et al. 1993).

2
Berdasarkan penelitian sebelumnya, penggunaan pupuk hayati yang
mengandung konsorsium bakteri metanotrof dan pereduksi N2O dapat
meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas padi yang ditunjukkan tingginya
bobot kering, banyaknya jumlah bulir dan anakan padi (Hadianta et al.2014; Pingak
et al. 2014; Sukmawati et al. 2015). Inokulasi mikrob maupun pemberian benih
yang telah terkolonisasi mikrob dapat berpengaruh pada mikrob indigenus tanah,
yang mengarah pada perubahan struktural dari komunitas mikrob tersebut (Trabelsi
dan Mhamdi 2013). Namun menurut Lerner et al. (2006) inokulasi Azospirillum
brasiliense menunjukkan tidak adanya perubahan yang menonjol terhadap
komunitas mikrob indigenus pada lahan jagung.
Sawah merupakan habitat dari banyak mikrob pemfiksasi nitrogen. namun
keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen di Indonesia umumnya dianalisis
berdasarkan metode kultivasi konvensional. Penelitian sebelumnya pada sawah
dataran tinggi, analisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen menunjukkan hasil
yang beragam antara perlakuan pupuk hayati dan kontrol (nonpupuk hayati). Pada
tanah dengan perlakuan kontrol (nonpupuk hayati), keragaman bakteri pemfiksasi
nitrogen lebih tinggi dibandingkan perlakuan pupuk hayati, hal tersebut
ditunjukkan dengan jumlah pita DGGE yang lebih banyak (Hadianta et al. 2014).

Perumusan Masalah
Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada sawah dataran rendah dengan
aplikasi pupuk hayati di lapangan, dapat mempengaruhi produktivitas padi. Namun,
keragaman bakteri yang kompleks hingga sekarang tidak semuanya dapat
ditumbuhkan pada media buatan di laboratorium. Salah satu pendekatan yang dapat
digunakan untuk menganalisis keragaman secara langsung yaitu pendekatan
molekuler dengan teknik DGGE (denaturing gel gradient electrophoresis). DGGE
dapat digunakan untuk menjawab dan mempelajari keragaman bakteri pemfiksasi
nitrogen pada lahan sawah.

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menganalisis keragaman bakteri
pemfiksasi nitrogen (diazotrof) pada lahan pertanian dataran rendah dengan metode
Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE) berdasarkan gen spesifik nifH
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait keragaman
komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen di lahan sawah, khsususnya pada lahan
sawah dataran rendah daerah Pelabuhan Ratu- Sukabumi. Penelitian ini juga
diharapkan apat menjadi salah satu acuan terkait analisis komunitas bakteri dengan
metode DGGE menggunakan gen fungsional tertentu.

3
Ruang Lingkup Penelitian
1.
2.
3.
4.

Ruang lingkup penelitian ini meliputi:
Isolasi total DNA genom pada sampel tanah dari lahan sawah.
Ampifikasi PCR dengan primer gen spesifik nifH dan 16S rRNA.
Elektroforesis amplikon nifH dan 16S rRNA dengan menggunakan DGGE.
Analisis filogenetik dari amplikon nifH dan 16S rRNA yang telah
disekuensing.

4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Fiksasi Nitrogen
Secara umum proses fiksasi nitrogen terjadi melalui tiga cara, yaitu yang
pertama terjadi secara alami denga bantuan kilat. Kedua, fiksasi nitrogen melalui
proses Haber-Bosch yang umum dilakukan pada industri pupuk. Adapun yang
ketiga adalah proses fiksasi yang terjadi secara biologis (Biological nitrogen
fixation) yang dilakukan oleh mikroorganisme pemfiksasi nitrogen (diazotrof).
Organisme tersebut dapat hidup sebagai simbion maupun hidup bebas (free-living)
(Caton 2007).
Proses fiksasi nitrogen (Biological nitrogen fixation) dimediasi oleh
kompleks enzim nitrogenase. Kompleks enzim tersebut tersusun atas dua protein,
yaitu dinitrogenase dan dinitrogenase reduktase (Bottomley dan Myrold 2007).
Enzim dinitrogenase terdiri atas protein Fe-Mo sedangkan enzim dinitrogenase
reduktase terdiri atas protein Fe (Sugitha dan Kumar 2009), (Gambar 1). Kompleks
enzim nitrogenase dikodekan oleh operon nif. Gen nifH spesifik mengkodekan
protein dinitrogenase reduktase, nifD mengkodekan subunit α protein nitrogenase
dan nifK mengkodekan subunit β dari protein MoFe pada dinitrogenase (Bottomley
dan Myrold 2007).

Gambar 1 Reaksi fiksasi nitrogen (White 2007)
Pendekatan untuk menganalisis kergaman mikrob pemfiksasi nitrogen pada
suatu lingkungan tertentu adalah dengan menggunakan gen spesifik pengkode
kompleks enzim nitrogenase, baik nifD, nifH maupun nifK. Menurut penelitian
Dedysh et al. (2004) gen nifH lazim digunakan sebagai gen spesifik untuk analisis
keragaman komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen (diazotrof), selain itu gen nifH
memiliki keragaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan gen nifD, sehingga
pustaka gen nifH lebih banyak dibandingkan dengan nifD.
Diazotrof
Diazotrof adalah mikroorganisme baik bakteri maupun arkea, yang mampu
memfiksasi nitrogen bebas dalam bentuk gas N2 di atmosfer dan mengubahnya
menjadi bentuk amonia (Postgate 1998). Fiksasi nitrogen secara biologis terjadi
pada tiga kelompok mikroorganisme, pertama kelompok bakteri rhizosfer simbion
yang membentuk nodul akar. Umumnya bakteri tersebut bersimbiosis dengan
tanaman Legum, misalnya Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, dan
Azorhizobium. Kedua kelompok bakteri simbion pada tanaman non legum, bakteri
tersebut tidak membentuk nodul akar, contohnya bakteri Azospirillum lipoferum
yang umum ditemukan bersimbiosis dengan rumput-rumput di daerah tropis.

5
Adapun yang ketiga yaitu kelompok bakteri pemfiksasi nitrogen yang hidup bebas.
Bakteri tersebut tidak bersimbiosis dengan tanaman apapun, contohnya bakteri
Azotobacter, Clostridium, dan spesises tertentu dari Desulfovibrio. Selain bakteri,
terdapat beberapa jenis arkea metanogen juga mampu melakukan fiksasi nitrogen
(White 2007).
Menurut Carini et al. (2003) beberapa genus bakteri metanotrof
(pengoksidasi metan) dapat mengekspresikan enzim nitrogenase, sehingga mampu
memfiksasi nitrogen sebagai sumber N, misalnya pada genus Methylococcus.
Selain itu menurut Auman et al. (2001) genus Methylomonas dan bakteri
Methylobacter marinus juga memiliki kompleks gen penyandi nitrogenase,
sehingga mengindikasikan adanya kemampuan fiksasi nitrogen.
Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE)
Analisis komunitas diazotrof pada suatu lingkungan dapat dilakukan dengan
pendekatan metagenomik, dimana tidak diperlukan isolasi bakteri dari sampel
lingkungan tersebut. Menurut Chen dan Pachter (2005) metagenomik merupakan
aplikasi dari teknik genomik, untuk analisis komunitas mikrob pada suatu sampel
secara langsung, tanpa harus melakukan isolasi dan kultivasi di laboratorium. Hal
tersebut mengacu pada asumsi bahwa mikrob yang bersifat unculturable (tidak bisa
dikulturkan) lebih banyak dari mikrob yang bersifat culturable (dapat dikulturkan).
Berkembangnya berbagai teknik metagenomik memberikan suatu terobosan
baru dalam melakukan analisis keragaman komunitas mikrob pada suatu sampel
lingkungan. Hal tersebut sangat membantu dalam studi biodiversitas. Beberapa
teknik molekuler yang digunakan untuk menganalisis keragaman antara lain,
Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE), Fluorescent in-situ
Hybridization (FISH), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA),
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Length Heterogenecity PCR
(LH-PCR), Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dan
Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (RISA) (Rastogi dan Sani 2011).
DGGE merupakan elektroforesis gel poliakrilamid dengan memanfaatkan
gradien konsentrasi linear dari denaturan. Prinsip pemisahan DNA pada
elektroforesis DGGE adalah berdasarkan suhu denaturasi (melting point/ Tm).
Denaturan yang digunakan umumnya adalah campuran urea dan formamide.
Gradien konsensentrasi denatruan berfungsi meningkatkan suhu denaturasi saat
elektroforesis. Sampel yang dielektroforesis merupakan DNA dari sampel
lingkungan yang telah diampifikasi PCR dengan primer spesifik (misalnya gen nifH,
untuk bakteri pemfiksasi nitrogen). Suhu denaturasi (melting point) pada DNA
dipengaruhi oleh rasio GC dan AT, sehingga semakin banyak kandungan GC maka
semakin tinggi suhu yang diperlukan untuk mendenaturasinya (Muyzer et al. 1993).
Menurut Muyzer dan Smalla (1998) keterbatasan penggunaan DGGE yaitu
kemampuan pemisahan DNA yang cukup rendah, DGGE mampu bekerja optimal
ketika memisahkan fragmen DNA dengan panjang sampai 500bp. Analisis
keragaman diazotrof dengan menggunakan DGGE umumnya menggunakan
penanda spesifik, gen nifH. Gen nifH memiliki keragaman yang tinggi dibanding
gen nifD, selain itu pustaka gen dari gen nifH lebih banyak dibandingkan gen nifD
(Dedysh et al. 2004).

6

3 METODE
Kerangka penelitian ini terdiri atas beberapa aktivitas pokok yaitu
pengambilan sampel tanah, ekstraksi DNA genom, amplifikasi PCR gen nifH dan
16S rRNA, analisis DGGE dan analisis filogenetik (Gambar 2).
Pemberian perlakuana sawah (100% NPK dan
20% NPK + pupuk hayati)

Pengambilan sampel tanah
Ekstaksi DNA dengan soil DNA extraction kit
Amplifikasi gen nifH dengan
primer PolF- GC/ AQER

Amplifikasi gen 16s rRNA
dengan primer P338F-GC/ P518R

Elektroforesis amplikon nifH/ 16s rRNA
Denaturing gel gradient electrophoresis
(DGGE)
Pemotongan DNA dari gel poliakrilamid
(elusi DNA)

Interpretasi hasil DGGE dengan
software CLIQS 1D

Sekuensing

Analisis pengelompokan (Clustering
analysis)

Analisis filogenetik

Gambar 2 Diagram alir metode penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor. Penelitian ini berlansung dari April 2015- April 2016.

7
Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri metanotrof Methylocystis rosea
BGM 1, Methylocystis parvus BGM 3, Methylococcus capsulatus BGM 9,
Methylobacter sp. SKM 14 dan bakteri pereduksi N2O Ochrobactrum anthropi BL2
(Tabel 1). Adapun bibit yang digunakan ialah padi varietas IR64.
Tabel 1 Referensi isolat yang digunakan
Kode isolat Sumber
Spesies
BGM1
Sawah Bogor
Methylocystis rosea
BGM3

Sawah Bogor

Methylocystis parvus

BGM 9

Sawah Bogor

SKM14

Sawah di
Sukabumi
Sawah Bogor

Methylococcus
capsulatus
Methylobacter sp

BL2

Ochrobactrum anthropi

Referensi
Hapsari (2008);
Astuti (2009)
Hapsari (2008);
Astuti (2009)
Hapsari (2008);
Astuti (2009)
Hapsari (2008);
Astuti (2009)
Setyaningsih (2010)

Sampel Tanah dan Perlakuan Sawah

Sampel tanah diambil dari lahan sawah di daerah Citarik, Pelabuhan RatuJawa Barat (± 53 mdpl). Pengambilan sampel dimulai pada bulan Januari- Maret
2015. Terdapat dua petak lahan sawah dengan perlakuan pupuk hayati 50 kg/ha
NPK + pupuk hayati (20% dosis), dan perlakuan kontrol 100% NPK (15:15:15)
dengan dosis 250 kg/ha sesuai anjuran (Permentan 2007). Pengambilan sampel
dilakukan secara acak pada lima plot yang dianggap mewakili dengan
menggunakan soil core sampler. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 3 kali
yaitu pada awal penanaman (0 Hari setelah tanam/ HST), pertengahan (60 HST),
dan setelah pemanenan (120 HST).

Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan kit ekstraksi DNA sampel tanah,
TianAmp Soil DNA Kit (Tiangen Biotech, Beijing, CN). Prosedur yang digunakan
sesuai dengan manual yang disediakan oleh produsen (Lampiran 1).

Amplifikasi Gen nifH dan Gen 16S rRNA
DNA yang telah dikuantifikasi kemudian diamplifikasi dengan PCR T1Thermocycler (Biometra, Goettingen, DE). Amplifikasi dilakukan dengan primer
gen nifH yang dihibridisasi dengan GC clamps pada ujung 5’. Sekuen primer
forward PolF (5’-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3’) dan reverse AQER (5’- G
ACGATGTAGATYTCCTG-3’) (Poly et al. 2001). Sekuen GC-clamp yang
digunakan berdasarkan penelitian Rosado et al. (1998). (5’-GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-‘3). PCR mix (25 µl)

8
mengandung 1.5 µl primer forward dan 1.5 µl primer reverse dengan konsentrasi
10 pmol. 12.5 µl GoTaq Green Mastermix 2x (Promega, Madison, USA), 3 µl DNA
template (~100 ng) dan 6.5 µl nuclease free water (NFW). Adapun kondisi PCR
yang digunakan berdasarkan modifikasi dari Poly et al. (2001). Suhu pra-denaturasi
95°C, 60 detik, denaturasi 95°C, 30 detik, annealing 50°C, 60 detik, elongasi 72°C
60 detik, dan pasca-elongasi 72°C selama 5 menit.
Amplifikasi 16S rRNA dilakukan dengan primer P338F-GC (5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAG-3’) dan P518R (5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)
(Overeas et al. 1997). PCR mix yang digunakan sama dengan amplifikasi gen nifH.
Suhu annealing yang digunakan yaitu 58°C selama 30 detik. Hasil amplifikasi
kemudian divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. DNA
yang telah dielektroforesis kemudian diwarnai dengan ethidium bromide 0.1 %,
direndam selama 15 menit, kemudian divisualisasi dengan G:BOX Gel
Documentation (Syngene, Frederick, USA).

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Elektroforesis DGGE dilakukan dengan alat D Code Universal Mutation
Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, US). Sebanyak 25 µL DNA template
(20 µL amplikon PCR + 5 µL loading dye) dimigrasikan pada gel poliakrilamid 8%.
Poliakrilamid 8% dibuat dari Akrilamid- Bis akrilamid (37:5). Komposisi
denaturan yang digunakan yaitu urea dan formamida, gradien denaturan yang
digunakan ialah 35- 65%. Denaturan 100% dibuat dengan campuran 7 M urea dan
40% (v/v) formamida.
Proses elektroforesis dilakukan pada suhu 60°C, tegangan 150 V selama 5.5
jam. Gel Poliakrilamid kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium bromida
(EtBr) 0.1 % selama 15 menit. Visualisasi dilakukan dengan menggunakan G:BOX
Gel Documentation (Syngene, Frederick, USA). Hasil foto gel doc kemudian
dianalisis dengan perangkat lunak CLIQS 1D (Total Lab, GB) untuk analisis
lanjutan. Setelah didokumentasikan, pita DNA yang muncul kemudian dipotong
dan dimasukkan ke dalam 100 µL Nuclease Free Water steril untuk kemudian
dielusi.

Elusi DNA dan Sekuensing Amplikon Gen nifH
Potongan gel yang mengandung pita DNA dielusi, kemudian diamplifikasi
kembali dengan DNA tersebut sebagai template. Sebanyak ~50 ng DNA
diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer PolF/AQER (nifH) dan
P338F/518R (16S rRNA) tanpa GC clamps. Kondisi PCRdan mastermix yang
digunakan sama dengan sebelumnya. DNA yang berhasil diamplifikasi kemudian
dikirimkan ke Laboratorium penyedia jasa sequencing, guna dilakukan pembacaan
sekuen DNA.

9
Analisis Filogenetik dan Pengelompokan Keragaman Bakteri
DNA hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak
ChromasPro (Technelysium, AU) untuk dilakukan proses penggabungan
(assembly) dan trimming. Sekuens kemudian dibandingkan dengan database gene
bank dengan menggunakan perangkat lunak Basic Local Alignment Search Tool
Nucleotide (BLAST-N) (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Sekuen homolog yang didapatkan
kemudian disejajarkan menggunakan perangkat lunak MEGA 6.0 (Tamura et al.
2013) dengan metode bootstrap (nilai bootstrap 1000 X). Konstruksi pohon
filogenetik dilakukan dengan metode Neighbour Joining. Analisis pengelompokan
(Clustering) dilakukan berdasarkan profil DGGE yang telah diinterpretasi dengan
menggunakan perangkat lunak CLIQS 1D (Total Lab).

10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi dan Amplifikasi DNA
Ekstraksi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit (Tiangen Biotech,
Beijing, CN), konsentrasi DNA yang dihasilkan beragam antara 17- 23,5 (ng/µL)
(Tabel 2). Nilai kemurnian DNA yang didapatkan rendah, umumnya nilai
kemurnian DNA yang baik yakni memiliki nilai A260/280 berkisar antara 1.8- 2.0,
dan nilai A260/230 lebih dari 2.0.
Tabel 2 Hasil kuantifikasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit.
No

Kode sampel

1
2
3
4
5
6

P 0 HST
K 0 HST
P 60 HST
K 60 HST
P 120 HST
K 120 HST

Konsentrasi DNA
(ng/µL)
17,5
18
19,8
17,4
22,6
23,5

A260/280 A260/230
6,57
5,36
4,58
5,71
3,56
3,08

0,05
0,06
0,06
0,05
0,07
0,07

Keterangan: P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60
HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST).
DGGE= denaturing gel gradient electrophoresis; HST= hari setelah tanam.

Amplifikasi gen nifH dilakukan dengan menggunakan pasangan primer PolFGC/ AQER. Sebanyak 6 sampel berhasil diamplifikasi dan menghasilkan pita
tunggal dengan panjang amplikon ±343 bp (Gambar 3a). Adapun untuk 16S rRNA,
amplifikasi dilakukan dengan pasangan primer P338F-GC/ P518R dengan panjang
amplikon ±180 bp (Gambar 3b)
M

P0

K0

P60

M

K60 P120 K120

P0

K0

P60

K60 P120 K120

500 bp
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp

±343 bp

300 bp
200 bp
100 bp

±180 bp

(a)
(b)
Gambar 3 Hasil amplifikasi PCR (a) gen nifH (b) 16S rRNA (M: penanda berat
molekul DNA, P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST,
P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120
HST, K120: kontrol 120 HST, HST: hari setelah tanam).

11
Profil DGGE
Secara umum penggunaan DGGE dapat memisahkan banyak pita DNA baik
nifH maupun 16S rRNA. Masing- masing pita yang terpisah menunjukkan
perbedaan spesies bakteri tanah. Analisis DGGE gen nifH pada 6 sampel tanah
menghasilkan pita DGGE yang cukup beragam. Terdapat 9 pita DGGE nifH yang
selalu muncul pada tiap waktu pengambilan sampel (Gambar 4a). Sembilan pita
tersebut kemudian dilakukan PCR ulang guna dianalisis sekuen DNAnya.

(a)
P0
P60
K120
K0
K60
P120

(b)
Gambar 4 (a) Profil DGGE gen nifH dari sampel tanah sawah (kiri). Interpretasi
hasil DGGE berdasarkan perangkat lunak CLIQS 1D (kanan). Pita no. 19 dipotong untuk analisis selanjutnya. (b) Dendrogram hasil analisis
pengelompokan (Clustering) keragaman bakter pemfiksasi nitrogen
berdasarkan gen nifH (P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0
HST, P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan
120 HST, K120: kontrol 120 HST). DGGE= denaturing gel gradient
electrophoresis; HST= hari setelah tanam.

12
Analisis pengelompokan disajikan dalam bentuk dendogram (Gambar 4b).
Data tersebut berdasarkan perbedaan keragaman bakteri pada tiap waktu
pengambilan sampel (P0, K0, P60, K60, P120 dan K120). Dendogram tersebut
menggambarkan pola keramgan bakteri berdasrkan waktu pertumbuhan padi. P0,
P60, K60 dan K120, dan K0, K60 dan P120 berada pada 2 cluster yang berbeda.
Secara umum 0 HST merupakan fase vegetatif padi, 60 HST merupakan awal fase
genereatif dan 120 HST merupakan fase pematangan.
Adapun hasil DGGE dari gen16S RNA diperoleh pita DGGE yang lebih
beragam dibandingkan DGGE gen nifH. 16S rRNA digunakan untuk menganalisa
total bakteri yang ada pada tanah sawah. Pasangan primer yang digunakan yakni
P338F/P518R menghasilkan amplikon sebesar 180 bp. Berdasarkan profil DGGE
16S rRNA, berhasil didapatkan 20 pita berbeda yang kemudian dilakukan PCR
kembali dan analisa sekuens (Gambar 5a).
Analisis pengelompokan (clustering) berdasarkan 16S rRNA menunjukkan
keragaman total bakteri pada tiap waktu pengambilan sampel memiliki kemiripan,
yakni P120- K120, P60- K60 dan P0- K0 (Gambar 5b). Ketersediaan nutrisi pada
fase tersebut menyebabkan adanya perbedaan tingkat keragaman bakteri. Misalnya
pada P0- K0, pada awal penanaman kedua petak lahan memiliki keragaman bakteri
yang tidak jauh berbeda. Pada P6- K60, fase tersebut merupakan akhir fase vegetatif
(reproduktif awal), kebutuhan nutrisi tanaman sangat tinggi, selain itu banyak
disekresikan eksudat akar yang merupakan nutrisi bagi bakteri tanah. Adapun P120K120 merupakan fase pematangan, pada fase ini kebutuhan nitrogen tanaman
semakin menurun dan eksudat akar yang dihasilkan juga semakin menurun.

(a)

13
P60
K60
P0
K0
P120
K120

(b)
Gambar 5 (a) Profil DGGE 16S rRNA dari sampel tanah sawah (kiri). Interpretasi
hasil DGGE dengan perangkat lunak CLIQS 1D (kanan). 20 pita
dipotong untuk dilakukan analisa sekuens. (b) Analisis pengelompokan
(Clustering) keragaman bakteri berdasarkan 16s rRNA (P0: Perlakuan
pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60 HST, K60:
kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST).
DGGE= denaturing gel gradient electrophoresis; HST= hari setelah
tanam.
Analisis BLAST dan Filogenetik
Pita DGGE yang dipotong kemudian dilakukan elusi guna digunakan sebgai
templat pada proses re-PCR dengan primer non GC clamp. Sebanyak 9 pita DGGE
nifH dan 20 pita DGGE 16S rRNA digunakan dalam analisis selanjutnya. Hasil rePCR didapatkan pita tunggal dengan target amplikon sesuai dengan PCR sebelum
DGGE yakni 347 bp untuk gen nifH (Gambar 4) dan 180 bp untuk 16S rRNA
(Gambar 5).
M

500 bp
400 bp
300 bp
200 bp

± 343 bp

100 bp

Gambar 6 Hasil amplifikasi ulang gen nifH dengan primer PolF/ AQER (non GC)
(M: penanda berat molekul DNA)

14
M

300 bp
200 bp

± 180 bp

100 bp

Gambar 7 Hasil amplifikasi ulang gen 16S rRNA dengan primer P338F/ P518R
(non GC) (M: penanda berat molekul DNA)
Analisis lanjutan yang dilakukan yaitu analisis sekuen menggunakan
perangkat lunak Chromas Pro. Sekuen yang telah dianalisis kemudian
dibandingkan dengan database yang terdapat pada Genebank melalui perangkat
BLAST-N (Basic Local Alignment Tools- Nucleotide). Hasil yang didapatkan yaitu
9 pita DGGE mayoritas teridentifikasi sebagai uncultured bacterium. Namun
terdapat 3 pita DGGE yang teridentifikasi sebagai Pelomonas saccahophila (pita
1) dengan persentase kesamaan 92%, Sphingomonas sp. (pita 2) dengan persentase
kesamaan 91% dan Magnetospirillum sp. BB-1 (pita 8) dengan persentase (Tabel
3).
Tabel 3 Hasil BLAST-N dari sekuen gen nifH
Query
Pita
Deskripsi
E- value
cover
1 Pelomonas saccharophila
nifH gene for iron protein of
98%
2,00E-130
nitrogenase, partial cds,
strain IAM 14368
2 Sphingomonas sp. BR12260
78%
4,00E-82
(nifH) gene, partial cds
3 Uncultured bacterium nifH
gene for nitrogenase iron
92%
6,00E-80
protein, partial cds, clone
SB06
4 Uncultured bacterium clone
N320 dinitrogenase
43%
1,00E-17
reductase gene, partial cds
5 Uncultured bacterium clone
P4 1477 dinitrogenase
99%
6,00E-80
reductase (nifH) gene,
partial cds
6 Uncultured nitrogen-fixing
bacterium clone N060
99%
3,00E-91
dinitrogenase reductase
(nifH) gene, partial cds

Identitas

No. Akses

92%

AB188120.1

91%

FJ455052.1

89%

AB471269.1

81%

KR819437.1

85%

JX865992.1

83%

DQ402856.1

15
Lanjutan Tabel 3
Pita

Deskripsi

7

Ideonella dechloratans
nitrogenase Fe protein
(nifH) gene, partial cds
Magnetospirillum sp. BB-1
nitrogenase (nifH) gene,
complete cds
Uncultured soil bacterium
clone CY8-35 nitrogenase
iron protein (nifH) gene,
partial cds

8

9

Query
cover

E- value

Identitas

No. Akses

99%

2,00E-131

92%

EU542578.1

99%

1,00E-134

93%

KP886488.1

99%

1,00E-147

95%

GU727709.1

Selain BLAST-N, sekuen DNA nifH dikonfirmasi kembali menggunakan
BLAST-X. Perangkat lunak BLAST- X digunakan guna membandingkan sekuen
DNA hasil DGGE dengan database protein yang ada pada Genebank. Berdasarkan
hasil BLAST-X diketahui secara umum sekuen DNA hasil DGGE merupakan
pengkode protein dinitrogenase reduktase (Fe- protein) (Tabel 4). Sesuai dengan
analisis menggunakan BLAST-N, hasil yang didapatkan pada BLAST-X mayoritas
sekuen nifH merupakan uncultured bacterium. Nilai persentase kesamaan yang
didapatkan sangat bervariasi yakni 67%- 100%.
Analisis pensejajaran (alignment) berdasarkan asam amino dilakukan guna
mengetahui bagian yang bersifat conserved antara pita DNA gen nifH hasil DGGE
dengan hasil yang didapatkan pada Genebank. Sekuen yang digunakan merupakan
sekuen nukeleotida hasil BLAST-N yang kemudian ditranslasikan. Hasil
pensejajaran menunjukkan adanya daerah yang memiliki kesamaan sekuen asam
amino antara pita DNA nifH hasil DGGE dengan database dari Genebank
(Lampiran 4). Hasil pensejajaran tersebut kemudian dikonfirmasi pada Conserved
Domain Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) (Bauer
et al. 2015). Guna mengetahui domain yang bersifar conserved tersebut.

Pita
1

2
3
4
5

Tabel 4 Hasil BLAST-X dari sekuen nifH
Query
Deskripsi
E value
cover
dinitrogenase reductase
99% 6,00E-45
[uncultured nitrogen-fixing
bacterium]
nitrogenase iron protein
80% 1,00E-39
[uncultured bacterium]
dinitrogenase reductase
53% 8,00E-22
[uncultured bacterium]
dinitrogenase reductase
27%
4,6
[uncultured prokaryote]
nitrogenase iron protein
99% 5,00E-55
[uncultured bacterium]

Identitas

No. Akses

67%

AAU05757.1

86%

AFP19251.1

94%

AGR40211.1

78%

ADD69787.1

96%

ACI32142.1

16
Lanjutan Tabel 4
Pita

Deskripsi

6

dinitrogenase reductase
[uncultured nitrogen-fixing
bacterium]
nitrogenase reductase
[Sphaerotilus natans]
nitrogenase iron protein,
dinitrogenase reductase
[Magnetospirillum sp. XM1]
dinitrogenase reductase
[temperate forest soil
bacterium AC06]

7
8

9

Query
cover

E value

Identitas

No. Akses

99%

9,00E-71

94%

ABD74338.1

99%

4,00E-49

100%

WP_037482871.1

98%

1,00E-33

98%

CUW40999.1

99%

1,00E-74

98%

AAL73097.1

Analisis filogenetik menggunakan perangkat lunak Mega 6.0 (Tamura et al.
2013), dengan metode neighbour joining, penentuan jenis pohon dilakukan
berdasarkan nilai BIC (Bayesian Information Criterion) yang paling rendah.

Gambar 8 Pohon filogenetik gen nifH (neighbour joining tree) menggunakan
Tamura- 3 parameter model (Bootstrap 1000x)
Berdasarkan analisis filogenetik tersebut terdapat 3 pita DNA yang
teridentifikasi pada jenis bakteri tertentu yaitu pita 2 yang diduga sebagai
Sphingomonas sp., pita 7 yang teridentifikasi sebagai Ideonella dechloratans dan
pita ke-8 yang teridentifikasi sebagai Magnetospirillum sp. Nilai bootstrap support
yang terdapat pada pita ke-7 dan ke-8 di atas 50, sehingga tingkat kemiripannya
tinggi. Adapun nilai bootstrap support pada pita ke 2 di bawah 50 (tidak
ditampilkan).

17
Selain gen nifH digunakan juga 16S rRNA guna mengetahui total komunitas
bakteri tanah pada lahan padi. Analisis sekuen DNA dilakukan terhadap 20 pita
berbeda dari hasil DGGE. Hasil BLAST-N menunjukkan berbagai jenis bakteri
yang berkerabat dekat. Tingkat kesamaan yang didapatkan juga bervariasi dengan
query coverage yang cukup tinggi (Tabel 5).
Tabel 5 Hasil BLAST-N dari 16S rRNA
Query
cover
Pita
Deskripsi
1
Uncultured bacterium isolate
DGGE gel band A28 16S
99%
ribosomal RNA gene, partial
sequence
2
Uncultured Methylocystis sp.
isolate DGGE gel band b1-1
92%
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
3
Thioploca ingrica partial 16S
99%
rRNA gene and ITS1, isolate
DEN002
4
Uncultured gamma
proteobacterium clone P-B262
100%
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
5
Shigella sp. FC13 16S
ribosomal RNA gene, partial
99%
sequence
6
Uncultured Bacteroidetes
bacterium clone 1HP1-L22
94%
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
7
Clostridium sp. enrichment
culture isolate DGGE gel band
Mn-40.2-IRE24-Co 16S
96%
ribosomal RNA gene, partial
sequence
8
Uncultured Bacteroidetes
bacterium clone Paddy 40
68%
1621 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
9
Uncultured Chloroflexi
bacterium clone BTM22 16S
99%
ribosomal RNA gene, partial
sequence
10 Uncultured Chloroflexi
bacterium clone RUGL1-67
96%
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence

E- value

Identitas

No. Akses

3,00E-48

91%

GQ463185.1

2,00E-31

88%

GU227561.1

1,00E-87

98%

FR690998.1

5,00E-85

98%

JN038982.1

2,00E-95

100%

KU942525.1

8,00E-18

77%

EU780415.1

5,00E-39

86%

KR095419.1

9,00E-36

94%

JF982336.1

4,00E-72

97%

KF483720.1

5,00E-38

92%

GQ420887.1

18
Lanjutan Tabel 5
Pita
Deskripsi
11 Uncultured Chloroflexi
bacterium clone 222BC 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
12 Phaeospirillum sp. JA815
partial 16S rRNA gene, strain
JA815
13 Uncultured alpha
proteobacterium clone GASP16KB-350-F08 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
14 Magnetospirillum sp.
enrichment culture clone
Van20 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
15 Azospirillum brasilense strain
UENF 411211 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
16 Azospirillum oryzae strain
UENF 114511 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
17 Uncultured bacterium clone
SPA-6 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
18 Uncultured
Gemmatimonadetes bacterium
clone S3-020 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
19 Uncultured bacterium isolate
DGGE gel band 61 16S
ribosomal RNA gene, partial
20 Uncultured Rhizobiales
bacterium clone CNY_02266
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence

Query
cover

E- value

Identitas

No. Akses

100%

3,00E-67

95%

EU816819.1

96%

2,00E-49

97%

HG417064.1

98%

3,00E-68

95%

EU044015.1

99%

8,00E-82

100%

HQ222267.1

99%

9,00E-82

100%

KU836625.1

99%

8,00E-82

100%

KU836606.1

95%

6,00E-38

88%

JQ978387.1

95%

6,00E-71

95%

KF183149.1

99%

7,00E-43

89%

JF910069.1

90%

9,00E-29

85%

JQ402010.1

Secara umum persentase kesamaan sekuen hasil DGGE dengan target pada
database Genebank yaitu 77-100 %. Sebanyak 13 sekuen DGGE memiliki
kesamaan dengan uncultured bacterium sedangkan 7 sekuen yang lain memiliki
kesamaan dengan Shigella sp., Clostridium sp., Magnetospirillum sp. Azospirillum
brasilense, Azospirillum oryzae, Thioploca ingrica dan Phaeospirillum sp. (Tabel
5).
Adapun analisis filogenetik berdasarkan gen pengkode 16S rRNA
didapatkan hasil pengelompokan jenis bakteri berdasarkan filumnya. Pohon
filogenetik dikonstruksi dengan neighbour joining tree model Jukes Cantor model

19
dengan bootstrap 1000x. Mayoritas bakteri yang teramplifikasi merupakan filum
Proteobacteria, Chlorofexi, Gemmatimonadetes, Clostridia, dan Bacteroidetes
(Gambar 9). Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, merupakan 2 subfilum
yang muncul pada hasil DGGE dari tanah sawah. Selain itu Alphaproteobacteria
menjadi kelompok yang paling banyak muncul pada tanah sawah.

Gambar 9 Pohon filogenetik (neighbour joining tree) 16S rRNA menggunakan
Jukes-Cantor model dengan bootstrap 1000x.

20
Pembahasan
Ekstraksi DNA dan Amplifikasi DNA nifH dan 16 s rRNA
Ekstrasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA kit (Tiangen Biotech,
Beijing, CN) menghasilkan produk total DNA dengan kemurnian yang rendah,
DNA maupun RNA murni memiliki nilai A260/A80 berkisar 1.8- 2.0 dan nilai
A260/230 lebih dari 2.0 (Yeates et al. 1998; Sambrook dan Russell 2001). A280
merupakan panjang gelombang untuk untuk protein, A260 untuk DNA dan A230
untuk phenol, maupun humic acid. Nilai A260/280 pada ekstrak DNA lahan sawah
melebihi 3.0 (Tabel 2) yang mengindikasikan adanya kontaminan pada hasil ekstrak
DNA. Kontaminasi asam humat (humic acid) pada tanah dapat mengganggu proses
kuantifikasi DNA, karena asam humat juga terbaca baik pada A230 nm maupun
A260 nm (Yeates et al. 1998). Selain itu nilai A260/A30 sangat rendah yaitu 0.050.07, nilai tersebut menunjukkan adanya molekul- molekul asam humat atau yang
semacamnya (Humic acid-like) yang terdeteksi pada serapan panjang gelombang
A230.
Amplifikasi DNA gen nifH menggunakan pasangan primer PolF/AQER
menghasilkan target 343 bp. Gen nifH merupakan gen yang umum dalam analisis
komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen (diazotrof), selain itu gen nifH memiliki
keragaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan gen nifD, sehingga pustaka gen
nifH lebih banyak dibandingkan dengan nifD (Dedysh et al. 2004). Menurut Diallo
et al. (2004) diazotrof aktif yang ada pada tanah umumnya sedikit, sehingga untuk
analisis diazotrof menggunakan gen nifH disarankan menggunakan pendekatan
nested PCR dibandingkan direct PCR
Adapun primer yang digunakan untuk mengamplifikasi 16S rRNA yaitu
P338F/ P518R (Ovreas et al. 1997). Primer ini mengamplifikasi region V3 pada
16S rRNA. 16S rRNA memiliki 9 region (V1- V9). Secara umum region V2 dan
V3 merupakan region yang paling tepat untuk membedakan berbagai jenis bakteri
pada tingkat genus. Region V2 memiliki panjang basa 106 nukleotida sedangkan
V3 memiliki panjang 65 nukleotida (Chakravorty et al. 2007). Pada penelitian ini
digunakan region V3 karena region V3 lebih dapat membedakan berbagai jenis
bakteri dibandingkan region V2. Pada pengujian terhadap 110 spesies bakteri
region V3 menghasilkan single nucleotide polimorphism (SNIPs) yang lebih
banyak dibandingkan V2. Selain itu region V3 yang lebih pendek lebih cocok
digunakan dalam analisis menggunakan real time PCR (Chakravorty et al. 2006;
2007).
Profil DGGE dan Analisis Filogenetik nifH
Profil DGGE (Gambar 4) menunjukkan keragaman bakteri pemfiksasi
nitrogen pada tiap- tiap fase pertumbuhan padi. Menurut Zhan dan Sun (2011) fase
pertumbuhan padi, eksudat akar dan perubahan iklim dapat mempengaruhi suksesi
komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen. Berdasarkan dendogram analisis
pengelompokan (clustering) diketahui pola keramgan bakteri berdasrkan waktu
pertumbuhan padi. P0, P60, dan K120, dan K0, K60 dan P120 berada pada 2 cluster
yang berbeda. Secara umum 0 HST merupakan fase vegetatif padi, 60 HST
merupakan awal fase genereatif dan 120 HST merupakan fase pematangan. P0- P60
berada pada 1 cluster mengindikasikan kemiripan tingkat keragman bakteri pada
fase vegetatif. Kebutuhan nitrogen pada fase tersebut (fase vegetatif) merupakan

21
yang paling tinggi. Menurut Ramanathan dan Krishnamoorthy (1973) kebutuhan
nitrogen tanaman paling tinggi yaitu pada fase vegetatif, fase semai dan yang paling
rendah yaitu pada fase pematangan. Jika dilihat pada pita DGGE (gambar 3a) P0
dan P60 memiliki pita DGGE lebih sedikit dibandingkan pada P120, diduga hal
tersebut dipengaruhi oleh dua faktor, yaitu adanya 20% dosis pupuk NPK yang
dapat dimanfaatkan tanaman sehingga keragaman bakteri pada P0 dan P60 lebih
rendah. Selain itu aktivitas fiksasi N yang lebih tinggi meskipun keragaman
bakterinya lebih rendah.
Adapun K120 menjadi 1 kelompok dengan P0 dan P60 disebabkan karena
terdapat kemiripan pita DGGE yang hanya muncul pada K120, P0 dan P60. Hal
tersebut diduga disebabkan pada fase pematangan nitrogen dari pupuk kimia yang
diaplikasikan pada perlakuan kontrol sudah mulai habis,