Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi Galaktosa Terhadap Hidrolisat Rumput Laut
KARAKTERISASI SIFAT FERMENTASI BEBERAPA
KHAMIR HASIL ADAPTASI GALAKTOSA TERHADAP
HIDROLISAT RUMPUT LAUT
AHMAD FAUZI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Sifat
Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi Galaktosa terhadap Hidrolisat
Rumput Laut adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Ahmad Fauzi
NIM G34090041
ii
ABSTRAK
AHMAD FAUZI. Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa terhadap Hidrolisat Rumput Laut. Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan
DWI SETYANINGSIH.
Kappaphycus alvarezii mengandung polisakarida yang terdiri dari galaktosa
sebagai monomernya. Setelah hidrolisis asam, galaktosa dapat digunakan oleh
Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149 dan Saccharomyces cerevisiae IPBCC
Y03545 sebagai sumber karbon dan sumber energi, namun kemampuan khamirkhamir itu dalam mengkonversi hidrolisat K. alvarezii menjadi bioetanol masih
rendah. Oleh sebab itu kemampuan fermentasinya perlu diperbaiki dengan cara
proses adaptasi. Penelitian ini bertujuan memperoleh galur-galur baru P. tannophilus
IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545 melalui adaptasi berulang pada
galaktosa dan mengkarakterisasi galur-galur teradapatasi galaktosa berdasarkan sifat
fermentasinya pada hidrolisat K. alvarezii. Adaptasi dilakukan sebanyak 264 kali
pada medium Yeast Malt Peptone Galactose. Masa 1 kali adaptasi adalah 4 jam.
Galur hasil adaptasi P. tannophilus memiliki kemampuan fermentasi galaktosa yang
bervariasi, sedangkan galur S. cerevisiae lebih baik dengan semakin lama
adaptasinya. Sifat fermentasi galur baru pada hidrolisat K. alvarezii ini berkorelasi
dengan sifat fermentasi galaktosanya. Galur P. tannophilus hasil adaptasi ke-88
memiliki sifat fermentasi hidrolisat yang lebih baik dari galur hasil adaptasi lain dan
galur liarnya, sedangkan galur-galur S. cerevisiae terus meningkat dari adaptasi ke-88
hingga ke-264 yang melebihi galur liarnya, kecuali efisiensi substrat. Adaptasi tidak
mengubah bentuk sel P. tannophilus, sebaliknya mengubah bentuk sel S. cerevisiae
menjadi agak lonjong dan membesar.
Kata kunci: adaptasi, bioetanol, hidrolisat K. alvarezii, P. tannophilus, S. cerevisiae
ABSTRACT
AHMAD FAUZI. Fermentation Traits of Galactose Adapted of Yeast toward
Seaweed Hydrolysates. Supervised by GAYUH RAHAYU and DWI
SETYANINGSIH.
Kappaphycus alvarezii has polysaccharides which consist of galactose as
monomer unit. After acid hydrolysis, galactose can be used as carbon and energy source
by Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149 and Saccharomyces cerevisiae IPBCC
Y03545. Yet, the ability of these strains to convert K. alvarezii hydrolysates into
bioethanol was low. Therefore, improvement of their fermentation characteristics needs
to be pursued. An effort to obtain galactose adapted of P. tannophilus IPBCC Y111149
and S. cerevisiae IPBCC Y03545 and further characterized the fermentation traits of
those towards K. alvarezii hydrolysates were carried out in this research. Adaptation was
done for 264 times in fresh Yeast Malt Peptone Galactose medium. One cycle of
adaptation is about 4 hours. Strains of P. tannophilus adaptation process varied in their
galactose fermentation ability, meanwhile S. cerevisiae increased with longer adaptation
process. The fermentation characteristics of yeasts in K. alvarezii hydrolysates correlated
with their galactose fermentation ability. Fermentation characters of P. tannophilus 88th
adaptation towards K. alvarezii hydrolysates was better than wild strain, while S.
cerevisiae, except their substrate efficiency, were better than its wild strain. Adaptation
process did not modify the shape of P. tannophilus cell, but modified the shape and size
of S. cerevisiae cell to become oval-like and bigger.
Key words: adaptation, bioethanol, K. alvarezii hydrolysates, P. tannophilus, S.cerevisiae
iii
KARAKTERISASI SIFAT FERMENTASI BEBERAPA
KHAMIR HASIL ADAPTASI GALAKTOSA TERHADAP
HIDROLISAT RUMPUT LAUT
AHMAD FAUZI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
iv
Judul Skripsi : Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa Terhadap Hidrolisat Rurnput Laut
Nama
Ahmad Fauzi
NIM
G34090041
Disetujui oleh
MSi
Diketahui oleh
Tanggal Lulus:
r 6 SEP 2013
v
Judul Skripsi : Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa Terhadap Hidrolisat Rumput Laut
Nama
: terhadap
Ahmad Fauzi
Hidrolisat Rumput Laut
NIM
: G34090041
Disetujui oleh
Dr Ir Gayuh Rahayu
Pembimbing I
Dr Ir Dwi Setyaningsih, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana. MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
vi
PRAKATA
Alhamdulillah puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang
telah memberikan rahmat-Nya kepada penulis sehingga karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Adapun judul yang dipilih dalam karya ilmiah yang dilaksanakan
sejak bulan Februari 2013 hingga Mei 2013 adalah Karakterisasi Sifat Fermentasi
Beberapa Khamir Hasil Adaptasi Galaktosa terhadap Hidrolisat Rumput Laut.
Pelaksanaan karya ilmiah bertempat di laboratorium Surfactant and Bioenergy
Research Center (SBRC) dan laboratorium IPB Culture Collection (IPBCC).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Gayuh Rahayu selaku
pembimbing pertama dan Dr Ir Dwi Setyaningsih, MSi selaku pembimbing kedua
yang telah sepenuh hati memberikan bimbingan dan arahan yang berarti sehingga
karya ilmiah ini dapat selesai. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr
Tri Atmowidi, MSi selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji dan
memberikan saran saat ujian dan penulisan karya ilmiah. Terima kasih pula
kepada direktur dan karyawan SBRC khususnya Kak Indah, dan Kak Nely yang
telah membantu dan memberi fasilitas selama penulis melakukan penelitian.
Penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada keluarga tercinta
bapak, mama, serta bang Okis, kak Fera dan adik Liska atas doa, dukungan, cinta,
dan perhatiannya yang tak pernah berakhir. Tidak lupa juga penulis ucapkan
terima kasih kepada teman-teman Biologi angkatan 46 khususnya Dheasinta,
Fajar, Dwi, Riana, Puji, Feni atas kebersamaan serta rasa kekeluargaan yang
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, September 2013
Ahmad Fauzi
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
1
Waktu dan Tempat
1
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
3
PEMBAHASAN
8
SIMPULAN
11
SARAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
RIWAYAT HIDUP
15
viii
DAFTAR TABEL
1 Gelembung gas dan populasi sel khamir sebelum dan setelah 48 jam inkubasi
pada YMP Galaktosa cair
4
2 Ukuran sel P. tannophilus dan S. cerevisiae sebelum adaptasi dan setelah
adaptasi ke 264
5
DAFTAR GAMBAR
1 Populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae selama 360 menit
2 Sel-sel Khamir sebelum dan sesudah adaptasi
3 Volume etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
4 Efisiensi substrat P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
5 Produksi etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii berdasarkan gula yang dikonsumsi
6 Efisiensi fermentasi P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
3
5
hidrolisat
6
hidrolisat
7
hidrolisat
8
hidrolisat
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi berbagai medium yang digunakan dalam penelitian ..................... 13
2 Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah
fermentasi oleh khamir ................................................................................... 13
3 Efisiensi fermentasi dan efisiensi substrat ....................................................... 14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia sudah memasuki tahapan krisis bahan bakar energi tak
terbaharukan seperti minyak bumi, batubara, dan gas alam sehingga sumber
energi alternatif harus segera dicari. Salah satu alternatif sumber bahan bakar
energi terbaharukan ialah bioetanol. Bioetanol kebanyakan bersumber bahan baku
pati yang pemanfaatannya berkompetisi dengan sumber pangan dan pakan
(Kartika 1992). Oleh sebab itu bioetanol sebaiknya berbahan baku yang belum
banyak dimanfaatkan, ketersediannya melimpah, mudah dibudidayakan dengan
masa panen cepat, harga murah, dan mengandung struktur gula sederhana yang
dapat diubah menjadi etanol seperti bahan-bahan berlignoselulosa, contohnya
rumput laut (Harvey 2009).
Produksi bioetanol dari bahan baku galaktosa sudah pernah diteliti, namun
agen fermentasinya seperti khamir masih dalam proses pengembangan. Pada saat
ini, 2 galur khamir koleksi IPBCC yaitu Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149
dan Saccharomyces cerevisiae IPBCC Y03545 dapat menggunakan galaktosa
untuk memproduksi bioetanol (Radesiyani 2012). Namun kadar bioetanol dan
efesiensi fermentasinya masih rendah. Oleh sebab itu perbaikan galur agen
fermentasi galaktosa perlu dilakukan. Salah satu cara perbaikan sifat khamir
produsen bioetanol adalah melalui proses adaptasi berulang-ulang yang akan
mendorong terjadinya proses mikroevolusi. Menurut Adams et al. (1985) karakter
fisiologi galur S. cerevisiae berubah setelah 264 generasi adaptasi. Hong et al.
(2011) juga menyatakan bahwa rekayasa evolusi merupakan salah satu cara
perbaikan galur.
Salah satu galur S. cerevisiae yaitu AL IX baru diadaptasi sebanyak 9 kali
pada hidrolisat rumput laut. Hasil adaptasi ini belum menunjukkan perubahan
kemampuan produksi bioetanolnya (Abimanyu 2013). Oleh sebab itu adaptasi
masih diperlukan untuk memperoleh galur-galur baru yang sesuai dengan karakter
yang diinginkan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan memperoleh galur-galur baru P. tannophilus
IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545 melalui adaptasi berulang
pada galaktosa dan mengkarakterisasi galur-galur teradapatasi galaktosa tersebut
berdasarkan sifat fermentasinya pada hidrolisat Kapphapychus alvarezii.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2013 hingga Mei 2013, di
Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC) Institut
Pertanian Bogor dan Laboratrium IPB Culture Collection (IPBCC).
2
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium Yeast Malt
Peptone (YMP) galaktosa 0.1% cair (Lampiran 1A), YMP galaktosa 0.1% agar
(Lampiran 1B), hidrolisat K. alvarezii, larutan DNS, dua spesies khamir, yaitu P.
tannophilus IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545. Alat yang
digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, mikroskop majemuk,
autoklaf, pH universal, destilator, densitometer, spektrofotometer, dan
seperangkat alat inokulasi.
Prosedur Penelitian
Persiapan Biakan Kerja
Sebanyak masing-masing 1 ose biakan khamir pada medium YMP
galaktosa padat dan berumur 48 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang berisi 5 mL medium YMP galaktosa 0.1% cair steril. Biakan
diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Jumlah populasi sel khamir dihitung
dengan hemasitometer pada saat masa inkubasi berakhir. Biakan ini selanjutnya
dijadikan biakan kerja.
Penetapan Jangka Waktu Inkubasi Satu Kali Adaptasi
Sebanyak masing-masing 2 ose biakan khamir pada medium YMP
galaktosa padat diambil dan dimasukkan ke dalam 10 mL medium YMP galaktosa
0.1% cair steril. Biakan diinkubasi pada suhu ruang. Populasi sel khamir dihitung
menggunakan hemasitometer setiap 30 menit mulai menit ke-0 hingga menit ke360. Jangka waktu inkubasi satu kali adaptasi adalah jangka waktu inkubasi yang
diperlukan oleh khamir untuk pertumbuhan populasinya sampai dengan
pertengahan fase generasi ke tiga.
Proses Adaptasi
Sebanyak 1 mL suspensi khamir diambil dari biakan kerja dan dipindahkan
kedalam tabung reaksi yang berisi 4 mL YMP galaktosa cair. Kemudian biakan
pada YMP galaktosa cair diinkubasi selama jangka waktu inkubasi yang telah
ditetapkan. Setelah jangka waktu satu kali adaptasi berakhir, 1 mL suspensi
dipindahkan kembali kedalam 4 mL media YMP galaktosa cair baru. Adaptasi ini
dilakukan sebanyak 264 kali. Biakan hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 diuji
kemampuan fermentasi galaktosanya. Biakan-biakan tersebut dikulturkan kembali
pada YMP galaktosa agar cawan dan diinkubasi selama 48 jam. Sebanyak 1 ose
dari masing-masing biakan tersebut diambil dan dipindahkan ke dalam 5 mL
YMP galaktosa cair yang berisi tabung Durham dan diinkubasi selama 48 jam.
Setelah masa inkubasi berakhir, ukuran gelembung CO2 yang terbentuk pada
tabung Durham diamati, dan dihitung pula populasi selnya. Percobaan dilakukan
dengan 3 ulangan. Biakan hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 dijadikan inokulum
bagi produksi bioetanol. Bentuk dan ukuran sel khamir pada adaptasi ke-264
diamati di bawah mikroskop majemuk.
3
Produksi Bioetanol pada Hidrolisat K. alvarezii
Sebanyak 10 mL inokulum khamir hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264
masing-masing dimasukkan kedalam 90 mL larutan hidrolisat K. alvarezii. Biakan
diinkubasi dalam labu erlenmeyer 250 mL pada suhu ruang selama 96 jam untuk
P. tannophilus dan 144 jam untuk S. cerevisiae, karena pada waktu tersebut
adalah waktu fermentasi optimum bagi masing-masing khamir. Produksi
bioetanol ditetapkan berdasarkan volume dan kadar etanol yang dihasilkan. Etanol
dipisahkan dari air dengan cara destilasi pada suhu 780C. Kadar etanol diukur
menggunakan densitometer. Kadar gula pereduksi dihitung (Lampiran 2Adan 2B)
dengan metode DNS. Selain itu ditetapkan pula efisiensi substrat dan efisiensi
fermentasinya (Lampiran 3Adan 3B).
HASIL
Penetapan Jangka Waktu Inkubasi Satu Kali Adaptasi
Populasi sel pada inokulan P. tannophilus dan S. cerevisiae berturut-turut
adalah 1.10x107 sel mL-1 dan 1.05x107 sel mL-1. Pada menit ke-30, beberapa selsel khamir telah bereproduksi. Jumlah sel P. tannophilus dan S. cerevisiae
meningkat sedikit melebihi 2 kali lipat populasi sel awalnya pada menit ke-90,
yaitu berturut-turut sebesar 2.40x107 sel mL-1 dan 2.15x107 sel mL-1. Fase lag
terjadi sebelum menit ke-90 dan setelah itu populasi khamir mulai meningkat
cepat dan mulai memasuki fase eksponensialnya. Fase eksponensial adalah fase
pertumbuhan cepat pada sel karena sel telah mensintesis enzim-enzim yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan selnya. Awal fase eksponensial terjadi saat jumlah
sel telah melebihi 2x lipat dari jumlah awalnya dan terus meningkat selama nutrisi
pada medium masih tersedia (Singh 2006).
14.00
11.85
12.00
9.55
Populasi khamir
x 107 sel mL-1
10.00
8.35
8.00
6.00
3.25
4.00
2.00
0.00
1.15
2.00 2.05 2.40
1.05 1.15
0
30
1.40
60
4.50
4.35
5.30
5.10
5.75
5.75
6.05
5.90
9.65
8.95
7.05
7.60
6.60
3.35
2.15
90
P. tannophilus
120
150
180
menit ke-
210
240
270
300
330
360
S. cerevisiae
Gambar 1 Populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae selama 360 menit.
4
Dari pola pertumbuhan populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae
diketahui bahwa menit ke-90 adalah waktu yang diperlukan oleh generasi pertama
bagi kedua khamir untuk melengkapi siklus hidupnya. Generasi ke-2 melengkapi
siklus hidupnya sekitar menit ke-150, sedangkan generasi ke-3 lengkap siklus
hidupnya pada menit ke-330. Waktu regenerasi ke-3 ini lebih panjang daripada
waktu regenerasi sebelumnya dan diduga periode adaptasi generasi ke-3 juga
lebih panjang. Berdasarkan pola pertumbuhan ini, masa inkubasi 1 kali adaptasi
ditetapkan 240 menit dengan harapan setiap 240 menit ada 3 generasi khamir
yang telah melewati periode adaptasinya.
Perubahan Fisiologi Biakan dan Morfologi Sel
Evaluasi terhadap kemampuan fermentasi galaktosa dari biakan hasil
adaptasi ke-88, 176, dan 264 diuji secara kualitatif dalam kemampuan fermentasi
galaktosanya. S. cerevisiae lebih adaptif dibandingkan P. tannophillus karena
semakin lama proses adaptasi kemampuan membentuk gelembung dan
pertumbuhan sel S. cerevisiae lebih baik (Tabel 1). P. tannophilus tidak
memperlihatkan perkembangan adaptasi yang baik karena kemampuan
pembentukan gelembung dan kemampuan sel untuk tumbuh berfluktuasi dengan
semakin lama proses adaptasinya.
Tabel 1 Gelembung gas CO2 dan populasi sel khamir sebelum dan setelah 48 jam
inkubasi pada YMP Galaktosa cair
Sebelum adaptasi
Jenis khamir
Gg
Ps
P. tannophilus
+
S. cerevisiae
+
Setelah adaptasi ke88
176
264
Gg
Ps
Gg
Ps
Gg
Ps
-
+++
3.50
+
2.93
++
3.35
-
+
2.35
++
3.28
+++
3.78
Keterangan: Gg = gelembung gas CO2; Ps= populasi sel ( x 109 sel mL-1); - =
tidak dihitung; ukuran gelembung gas : +++ = besar; ++ = sedang;
+ = kecil
Setelah proses adaptasi berakhir yaitu adaptasi ke-264, sel P. tannophilus
tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran secara signifikan, sedangkan S.
cerevisiae mengalami perubahan bentuk dan ukuran signifikan yang menjadi agak
oval dan lebih besar (Gambar 2) dibandingkan dengan galur liarnya. P.
tannophilus galur liar memiliki rata-rata panjang 14.11µm dan lebar 7.29µm,
setelah diadaptasi 264 kali rata-rata panjang menjadi 14.65µm dan lebar 7.58µm.
Sedangkan, S. cerevisiae galur liar memiliki rata-rata panjang sebesar 10.03µm
dan lebar 5.30µm dan setelah diadaptasi 264 kali rata-rata panjang menjadi
16.02µm dan lebar 8.73µm. Ukuran sel P. tannophilus hasil adaptasi ke-264
sekitar 1.03x ukuran sel galur liarnya, sedangkan ukuran sel S. cerevisiae hasil
adaptasi yang sama sekitar 1.6x ukuran sel galur liarnya (Tabel 2).
5
Tabel 2 Ukuran sel P. tannophilus dan S. cerevisiae sebelum adaptasi dan setelah
adaptasi ke-264
Spesies khamir
Ukuran rata-rata (µm)
Rasio sebelum adaptasi :
Spesies khamir Sebelum adaptasi Setelah adaptasi ke-264
: setelah adaptasi 264
kali
Panjang
Lebar
Panjang
Lebar
Panjang
Lebar
P. tannophilus
14.11
7.29
14.65
7.58
1:1.04
1:1.04
S. cerevisiae
10.03
5.30
16.02
8.73
1:1.60
1:1.65
20 µm
perbesaran: 20x
20 µm
perbesaran: 20x
20 µm
perbesaran: 30x
20 µm
perbesaran: 30x
Gambar 2 Sel-sel khamir sebelum dan sesudah adaptasi. Sel-sel P. tannophilus
sebelum diadaptasi (kiri atas), dan setelah 264 kali adaptasi (kanan
atas), serta sel-sel S. cerevisiae sebelum diadaptasi (kiri bawah) dan
setelah 264 kali adaptasi (kanan bawah).
6
Produksi bioetanol pada hidrolisat K. alvarezii
Ketika khamir-khamir hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 dianalisis
kemampuannya dalam menggunakan hidrolisat K. alvarezii dalam membentuk
bioetanol, beberapa galur-galur hasil adaptasi ini menunjukan sifat fermentasi
yang lebih baik daripada galur liarnya. Volume (Gambar 3) kedua khamir tersebut
lebih tinggi dari galur liarnya. Galur-galur P. tannophilus hasil adapatasi
menghasilkan etanol dengan volume (0.03-0.06 %v/v) yang lebih tinggi
dibandingkan dengan galur liarnya (0.02 %v/v). Demikian pula semua galur S.
cerevisiae hasil adaptasi menghasilkan etanol dengan volume (0.02- 0.10 %v/v)
lebih tinggi dibandingkan dengan galur liarnya (0.01 %v/v).
Berbeda dari volume dan kadar etanolnya, hanya beberapa galur hasil
adaptasi yang menunjukkan efisiensi substrat lebih baik dari galur liarnya. P.
tannophilus hasil adaptasi ke-176 dan ke-264 lebih efisien dalam memanfaatkan
substrat dibandingkan dengan galur liarnya. Nilai efisiensi substrat P. tannophilus
hasil adaptasi itu berturut-turut 26.99% dan 30.92%, lebih tinggi dari galur liarnya
yaitu sebesar 24.31%, sedangkan nilai efisiensi subtrat S. cerevisiae, hanya hasil
adaptasi ke-88 (31.21%) yang relatif lebih tinggi daripada galur liarnya sebesar
30.07 % (Gambar 4).
0.12
0.10
Volume etanol (% v/v)
0.10
0.08
0.06
0.06
0.05
0.04
0.04
0.03
0.02
0.02
0.02
0.01
Adaptasi
0.00
galur liar
galur
ke-88
ke-176
ke-264
liar
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 3 Volume etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii.
7
35.00
Efisiensi Substrat (%)
30.00
25.00
30.92
31.21
30.07
26.99
26.27
24.31
22.79
21.80
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
galurliar
galur
liar
P. tannophilus
ke-88
ke-176
ke-264
Adaptasi
S. cerevisiae
Gambar 4 Efisiensi substrat galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii.
Berdasarkan gula yang dikonsumsi, produksi bioetanol P. tannophilus dan
S. cerevisiae hasil adaptasi lebih tinggi dibandingkan galur liarnya. Semua galur
adaptasi P. tannophilus memproduksi bioetanol (1.09-3.05% b/b gula) lebih tinggi
dari galur liarnya sebesar 0.94% (b/b gula). Produksi bioetanol pada semua galur
adaptasi S. cerevisiae berkisar dari 0.73-4.39% (b/b gula) dan juga lebih tinggi
dari produksi bioetanol galur liarnya sebesar 0.49% (b/b gula) (Gambar 5).
Produksi bioetanol berdasarkan gula yang dikonsumsi ini setara dengan efisiensi
fermentasinya (Gambar 6).
Galur-galur adaptasi menunjukkan kemampuan produksi bioetanol yang
bervariasi. Diantara galur-galur adaptasi, P. tannophilus hasil adaptasi ke-88
menunjukkan semua parameter produksi etanol yang lebih baik dibandingkan
galur liar dan galur adaptasi lainnya, sedangkan S. cerevisiae hasil adaptasi ke264 menunjukkan karakter yang lebih baik daripada galur liarnya kecuali dalam
efisiensi substratnya.
8
5.00
4.39
Produksi etanol (% b/b gula)
4.50
4.00
3.50
3.05
3.00
2.43
2.50
2.11
2.00
1.50
0.94
1.00
1.09
0.73
0.49
0.50
0.00
galur
galur
liar
ke-88
Adaptasi
liar
ke-176
ke-264
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 5 Produksi etanol galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii berdasarkan gula yang dikonsumsi.
3.00
2.48
Efisiensi Fermentasi (%)
2.50
2.00
1.49
1.50
1.24
1.01
1.00
0.50
0.73
0.50
0.50
0.32
0.00
galur liar
galur
liar
ke-88
ke-176
ke-264
Adaptasi
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 6 Efisiensi fermentasi galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
hidrolisat K. alvarezii.
PEMBAHASAN
Proses adaptasi dan uji fermentasi galaktosa pada penelitian ini
menunjukkan bahwa P. tannophilus dan S. cerevisiae dapat menggunakan
galaktosa sebagai sumber karbon dan sumber energi, meskipun kedua khamir
tersebut (Kurztman & Fell 2000) atau S. cerevisiae (Timson 2007) saja lebih
menyukai glukosa. Galaktosa merupakan nutrisi non-konvensional untuk khamir
9
dan akan digunakan sebagai satu-satunya sumber karbon saat glukosa tidak
tersedia dalam medium (Frey 1996). Pada khamir, galaktosa tidak dapat masuk ke
dalam jalur metabolisme primer untuk menghasilkan energi, melainkan harus
diubah dulu menjadi glukosa-6P (Timson 2007). S. cerevisiae mengonversi
galaktosa menjadi glukosa-6P melalui jalur Laloir dengan bantuan 5 enzim, yaitu
galactose mutarotase, galactokinase, galactose-1-phosphate uridylyltransferase
UDP-galactose 4-epimerase, dan pospoglukomutase (Timson 2007). Gen-gen
yang terlibat dalam metabolisme galaktosa akan terinduksi jika dalam lingkungan
tumbuh tersedia galaktosa sebagai sumber karbon tunggal (Brink et al. 2009).
Gen-gen tersebut ialah galaktokinase (GAL1), galaktosa permease (GAL2),
galaktosa-1-phosphate uridylyltransferase (GAL7) dan uridine-diphosphoglukosa
4-epimerase (GAL10). Induksi gen-gen tersebut akan menyebabkan sel
membentuk protein yang dibutuhkan dalam metabolisme galaktosa. Oleh sebab
itu dalam proses adaptasi pada penelitian ini, galaktosa dijadikan satu-satunya
sumber karbon pada medium yang digunakan.
Dari pola pertumbuhannya pada medium YMP Galaktosa 0.1%, fase lag
bagi P. tannophilus dan S. cerevisiae diperkirakan terjadi pada 30 menit pertama
masa inkubasinya. Fase lag ialah fase awal pada kurva pertumbuhan saat mikrob
pada umumnya tidak mengalami pembelahan sel (Nasim et al. 1989). Pada fase
ini sel mempersiapkan enzim-enzim yang diperlukan dalam proses metabolisme.
Singh et al. (2006) menyatakan fase lag merupakan periode menyesuaikan diri
dengan lingkungan atau medium baru yang dicirikan dengan tidak terjadi
perbanyakan sel melebihi 2 kali dari jumlah awalnya.
Waktu regenerasi khamir dipengaruhi oleh medium tumbuhnya.
Pertumbuhan P. tannophilus dan S. cerevisiae pada medium YMP Galaktosa
0.1% menunjukkan bahwa pada menit ke-90 populasi sel P. tannophilus dan S.
cerevisiae meningkat menjadi sekitar 2 x populasi awalnya. Hal ini berbeda
dengan penemuan Adams et al. (1985). Mereka menemukan bahwa waktu yang
dibutuhkan sel S. cerevisiae untuk meningkatkan populasinya 2 x dari populasi
awalnya adalah sekitar 115-120 menit pada medium minimal dengan glukosa
0.08% sebagai sumber karbon tunggal. Hong et al. (2010) memperoleh 400
generasi S. cerevsiae dalam 62 hari adaptasi, berarti satu generasi membutuhkan
waktu sekitar 3-4 jam pada medium minimal galaktosa 2%. Perbedaan waktu
regenerasi yang diperoleh ini disebabkan oleh perbedaan metode dan medium
tumbuh yang digunakan.
Penetapan periode adaptasi dilakukan berdasarkan pola tumbuhnya. Dalam
periode 4 jam diharapkan terbentuk 3 generasi sel yang mengalami adaptasi
terhadap galaktosa. Sel-sel yang setiap 4 jam terus dihadapkan pada medium
galaktosa baru diharapkan dapat membentuk generasi baru yang terbiasa dalam
mengonsumsi galaktosa. Waktu satu kali adaptasi ini kurang dari yang ditetapkan
oleh Hong et al. (2010) yaitu 1 hari dalam penelitiannya yang bertujuan untuk
memperoleh mutan yang mampu menggunakan galaktosa. Waktu satu kali
adaptasi ini juga berbeda dari Guimarães et al. (2008). Mereka melakukan 12 kali
pemberian medium baru setiap 2-5 hari dalam jangka waktu 41 hari.
10
Proses adaptasi P. tannophillus dan S. cerevisiae telah menghasilkan
galur-galur baru dengan sifat fermentasi yang lebih baik dari galur liarnya. Proses
adaptasi telah dilakukan oleh beberapa peneliti untuk menghasilkan mutan-mutan
baru, misal Adams et al. (1985) menyatakan bahwa proses adaptasi sebanyak 264
generasi pada media galaktosa dapat mengakibatkan perubahan fisiologi pada S.
cerevisiae. Mutan-mutan hasil adaptasi menggunakan galaktosa lebih baik.
Guimarães et al. (2008) memperoleh mutan S. cerevisiae yang dapat
menggunakan laktosa lebih baik dan menghasilkan bioetanol 30% lebih tinggi
dari galur asalnya. Adaptasi juga dapat mengakibatkan perubahan bentuk sel.
Adams et al. (1985) menemukan adanya perubahan bentuk sel S. cerevisiae
setelah 264 generasi adaptasi. Pada penelitian ini, perubahan bentuk sel dan
ukuran juga ditemukan pada sel S. cerevisiae yang diadaptasi sebanyak 264 kali.
Ukuran sel pada mutan hasil adaptasi ke-264 sebesar 1.60 kali lebih besar dari
galur liarnya. Sebaliknya setelah proses adaptasi ke-264, P. tannophilus tidak
mengalami perubahan bentuk dan ukuran yang signifikan.
P. tannophilus hasil adaptasi ke-88 menunjukkan kemampuan fermentasi
galaktosa yang relatif lebih baik dibandingkan mutan-mutan lainnya, sebaliknya S.
cerevisiae hasil adapatasi ke-264 menunjukkan kemampuan fermentasi galaktosa
yang lebih baik daripada mutan-mutan lainnya. Hasil ini menunjukkan bahwa
respon sel P. tannophilus terhadap adaptasi galaktosa berbeda dari S. cerevisiae.
Kemampuan fermentasi dan populasi sel P. tannophilus pada tahapan adaptasi
tertentu berfluktuasi, sedangkan S. cerevisiae terus berkembang lebih baik sejalan
dengan proses adaptasi. Perubahan pertumbuhan yang terjadi pada sel khamir
karena kemampuan dalam pertumbuhan tunas terjadi pada fase G1 akhir atau awal
fase S (Singh et al. 2006). Sehingga jumlah populasi sel P. tannophilus dan S.
cerevisiae pada akhir fermentasi berbeda-beda pada setiap hasil adaptasi. Hasil
penelitian Lee et al. (1986) menunjukkan bahwa mutan P. tannophilus hasil
radiasi sinar-UV menunjukkan kemampuan fermentasi galaktosa yang paling
rendah dibandingkan fermentasi gula-gula lainnya seperti glukosa, manosa, dan
xylosa. Dengan demikian, pada kondisi yang sama P. tannophilus lebih menyukai
mengonsumsi gula-gula lainnya dibandingkan mengonsumsi galaktosa. Oleh
sebab itu proses adaptasi berulang pada penelitian ini dilakukan untuk
meningkatkan kemampuan konsumsi galaktosa untuk diubah menjadi bioetanol.
Pada penelitian ini hidrolisat K. alvarezii dijadikan bahan baku produksi
bioetanol. Kim et al. (2008) menyatakan bahwa K. alvarezii mengandung
karagenan sebesar 43.4%. Menurut Winarno (1996) karagenan tersusun dari
perulangan unit-unit D-galaktosa dan 3,6-anhidro-D-galaktosa. Hasil uji
fermentasi galaktosa dari mutan-mutan hasil penelitian ini juga berhubungan
dengan kemampuan mengonversi hidrolisat K. alvarezii menjadi bioetanol.
Mutan-mutan P. tannophilus dan S. cerevisiae hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264
menunjukkan bahwa P. tannophilus adaptasi ke-88 memiliki sifat fermentasi lebih
baik dari galur adaptasi lain dan galur liarnya dalam produksi etanol (3.05%),
volume etanol (0.06% v/v), dan efisiensi fermentasinya (1.49%). Sebaliknya sifat
fermentasi seperti produksi etanol (0.73%-4.39%), volume etanol (0.02%-0.10%
v/v), dan efisiensi fermentasi (0.50%-2.48%) S. cerevisiae terus meningkat dari
adaptasi ke-88 hingga ke-264 kecuali dalam hal efisiensi substrat yang tidak lebih
11
baik dari galur liarnya. S. cerevisiae IPBCC Y05548 AL IX yang telah diadaptasi
oleh Setyaningsih et al. (2012) mampu menghasilkan kadar etanol yang lebih baik
yaitu 2%.
Produksi bietanol oleh khamir ini mungkin dipengaruhi oleh kondisi
hidrolisat. Meinita et al. (2011) menganalisis hidrolisat rumput laut K. alvarezii
dan menyatakan bahwa hidrolisat mengandung senyawa inhibitor seperti 5Hydroxymethyl fulfural (HMF) dan asam levulinik (AL). Menurut Maharani
(2011), konsentrasi tinggi dari HMF dan asam levulinik dapat menghambat
produktivitas fermentasi mikroorganisme sehingga menurunkan produksi etanol.
S. cerevisiae juga diduga dapat menggunakan gula sebagai sumber energi untuk
mengilangkan inhbitor HMF dan AL daripada memproduksi bioetanol.
Pernyataan tersebut diperkuat dengan hasil penelitian ini bahwa efisiensi substrat
yang tinggi dan efisiensi fermentasi yang rendah, diduga bahwa kedua khamir
lebih memilih menggunakan energi untuk mengurangi senyawa inhibitor daripada
memproduksi bioetanol.
SIMPULAN
Adaptasi selama 264 kali menghasilkan mutan-mutan yang sifat
fermentasinya lebih baik dari galur liarnya. Selain itu, proses adaptasi selama 264
kali pada medium YMP Galaktosa juga dapat mengubah bentuk sel S. cerevisiae
menjadi lebih besar dan agak lonjong. Galur mutan P. tannophilus hasil adaptasi
ke-88 memiliki sifat fermentasi yang lebih baik dari galur adaptasi lain dan galur
liarnya. Begitu pula sifat fermentasi, kecuali efisiensi substrat, galur mutan S.
cerevisiae hasil adaptasi ke-264 lebih baik dari galur adaptasi lain dan galur
liarnya.
SARAN
Perlu dilakukan pengecekan gula pereduksi galaktosa pada setiap proses
adaptasi di medium YMP Galaktosa, supaya kemampuan P. tannophilus dan S.
cerevisiae dalam menggunakan galaktosa sebagai sumber karbon tunggal dapat
diketahui. Selain itu, kedua khamir tersebut perlu diadaptasi lagi pada medium
hidrolisat K. alvarezii.
DAFTAR PUSTAKA
Abimanyu HR. 2013. Evaluasi Saccharomyces cerevisiae Teradaptasi Hidrolisat
Kappaphycus alvarezii dalam Kemampuan Mengonversi Hidrolisat
Menjadi Bioetanol [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Adams J, Paquin C, Oeller PW, Lee LW. 1985. Physiological characterization of
adaptive clones in evolving populations of the yeast, Saccharomyces
cerevisiae. Genetics. 110:173-185.
Brink JVD, Akeroyd M, Hoeven RVD, Pronk JT, Winde JHD, Lapujade PD.
2009.
Energetic limits to metabolic flexibility: responses of
12
Saccharomyces cerevisiae to glucose–galactose transitions. Microbiology.
155:1340-1350.
Frey PA. 1996. The Leloir Pathway: mechanism imperative for three enzymes to
change the stereochemical configuration of a single carbon in galactose.
Federation of American Societies for Experimental Biology. 10:46-470.
Guimarães PMR, François J, Parrou JL, Teixeira JA, Domingues L. 2008.
Adaptive evolution of a lactose-consuming Saccharomyces cerevisiae
recombinant. Applied and Environmental Microblogy. 74:1748-1756.
Harvey F. 2009. Produksi Etanol dari Limbah Karaginan [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Hong KK, Vongsangnak W, Vemuri GN, Nielsen J. 2011. Unraveling
evolutionary strategies of yeast for improving galactose utilization through
integrated systems level analysis. Proceeding of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 108:12179-12184.
Kartika B. 1992. Petunjuk Evaluasi Produk Industri Hasil Pertanian. Yogyakarta
(INA): PAU Pangan dan Gizi UGM. hlm 55-63.
Kim GS, Myung KS, Kim YJ, Oh KK, Kim JS, Ryu HJ, Kim KH.2007. Method
of Producing Biofuel Using Sea Algae. Seoul (KOR): World Intelectual
Property Organization. hlm 103-117.
Kurtzman CW, Fell JW. 2000. The Yeast, A Taxonomy Study Fourth Edition.
Amsterdam (NED): Elvier Science B.V. hlm 64-86.
Lee H, James AP, Zahab DM, Mahmourides G, Maleszka R, Schneider H. 1986.
Mutants of Pachysolen tannophilus with improved production of ethanol
from d-xylose. Applied and Environmental Microblogy. 51(6):1252.
Maharani DM. 2011. Adaptasi Saccharomyces cerevisiae terhadap hidrolisat asam
ubi kayu untuk produksi bioetanol [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Meinita NDM, Kang YJ, Jeong TG, Koo MH, Park MS, Hong KY. 2011.
Bioethanol production from acid hydrolysate of the carrageenophyte
Kappaphycus alvarezii (cottonii). Journal of Applied Phycology. 24:857862.
Nasim A, Young P, Johnson BF. 1989. Molecular Biology of the Fission Yeast.
San Diego (US): Academic Press. hlm 567-588.
Radesiyani I. 2013. Potensi khamir dalam fermentasi hidrolisat rumput laut
(Kappaphycus alvarezii) Menjadi bioetanol [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Setyaningsih D, Windarwati S, Khayati I, Muna N, Hernowo P. 2012. Acid
hydrolysis technique and yeast adaptation to increase red macroalgae
bioetanol production. International Journal of Environment and
Bioenergy. 3(2):98-110.
Singh PG, Volpe G, Creely MC, Grotsch H, Geli MI, Petrov D. 2006. The lag
phase and G1 phase of a single yeast cell monitored by Raman
microspectroscopy. Journal Raman Spectroscopy. 37:858–864.
Timson DJ. 2007. Galactose metabolism in Saccharomyces cerevisiae: A review.
Dynamic Biochemistry. 3:63-73.
Winarno FG. 1996. Teknologi Pengolahan Rumput Laut. Jakarta (INA): Pustaka
Sinar Harapan. hlm 44-48.
13
Lampiran 1 Komposisi berbagai medium yang digunakan dalam penelitian
A. Komposisi medium Yeast Malt Peptone (YMP) Galaktosa 0.1% cair (dalam 200 mL)
Yeast extract
Malt
Peptone
Galaktosa 0.1%
Akuades
1
1
1
0.2
200
g
g
g
g
mL
B. Komposisi medium Yeast Malt Peptone (YMP) Galaktosa 0.1% agar (dalam 500 mL)
Yeast extract
Malt
Peptone
Galaktosa 0.1%
Bakto agar
Kloramfenikol
Akuades
2.5
2.5
2.5
0.5
10
250
500
g
g
g
g
g
µg
mL
Lampiran 2 Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah
fermentasi oleh khamir
A. Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah fermentasi
oleh P. tannophilus
P. tannophilus
Galur liar
Adaptasi ke-88
Adaptasi ke-176
Adaptasi ke-264
Gula pereduksi (% b/v)
Sebelum fermentasi
Setelah fermentasi
6.91
5.23
6.91
5.34
6.91
5.05
6.91
4.77
B. Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah fermentasi
oleh S. cerevisiae
S. cerevisiae
Galur liar
Adaptasi ke-88
Adaptasi ke-176
Adaptasi ke-264
Gula pereduksi (% b/v)
Sebelum fermentasi
Setelah fermentasi
6.91
4.83
6.91
4.75
6.91
5.40
6.91
5.09
14
Lampiran 3 Efisiensi fermentasi dan efisiensi substrat
A. Efisiensi fermentasi
Efisiensi fermentasi (%) = Konsentrasi etanol yang diperoleh aktual (% b/v) x 100%
Konsentrasi etanol teoritis
Konsentrasi etanol teoritis = So x 0,51*
Keterangan: *Nilai etanol yang terbentuk pada persamaan glikolisis
B. Efisiensi Substrat
Efisiensi substrat (%) = So – S x 100%
So
Keterangan: So = gula pereduksi awal/sebelum fermentasi (% b/v)
S = gula pereduksi setelah fermentasi (% b/v)
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, pada tanggal 22 Juli 1991 dengan nama
lengkap Ahmad Fauzi. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara, dari
pasangan Ismet Fasya dan Nurhayati. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri
52 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis lulus melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar
Mahasiswa (BBM) dari DIKTI pada tahun 2011-2013.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah bergabung dalam UKM CUA
(Chess Unity of Agriculture) tahun 2009 dan kepanitian Pesta Sains Nasional
(PSN) tahun 2011 sebagai anggota Divisi Tim Khusus. Penulis pernah menjadi
asisten praktikum Biologi Dasar pada tahun ajaran 2011/2012 dan 2012/2013,
asisten praktikum Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran
2012/2013, asisten praktikum Botani Umum pada tahun ajaran 2012/2013, dan
asisten praktikum Biologi Cendawan pada tahun ajaran 2012/2013. Tahun 2011
penulis melakukan Studi Lapang di Hutan Pendidikan Gunung Walat (HPGW),
Sukabumi, Jawa Barat dengan judul Serangga Pembentuk Puru di Hutan Pendidikan
Gunung Walat. Tahun 2012, penulis melakukan Praktik Lapangan di Pondok
Pesantren Darul Fallah dari bulan Juni sampai Juli dengan judul Manajemen
Pemeliharaan Terkait Status Kesehatan Sapi Perah di Unit Peternakan Darul
Fallah, Ciampea-Bogor.
KHAMIR HASIL ADAPTASI GALAKTOSA TERHADAP
HIDROLISAT RUMPUT LAUT
AHMAD FAUZI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Sifat
Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi Galaktosa terhadap Hidrolisat
Rumput Laut adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Ahmad Fauzi
NIM G34090041
ii
ABSTRAK
AHMAD FAUZI. Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa terhadap Hidrolisat Rumput Laut. Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan
DWI SETYANINGSIH.
Kappaphycus alvarezii mengandung polisakarida yang terdiri dari galaktosa
sebagai monomernya. Setelah hidrolisis asam, galaktosa dapat digunakan oleh
Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149 dan Saccharomyces cerevisiae IPBCC
Y03545 sebagai sumber karbon dan sumber energi, namun kemampuan khamirkhamir itu dalam mengkonversi hidrolisat K. alvarezii menjadi bioetanol masih
rendah. Oleh sebab itu kemampuan fermentasinya perlu diperbaiki dengan cara
proses adaptasi. Penelitian ini bertujuan memperoleh galur-galur baru P. tannophilus
IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545 melalui adaptasi berulang pada
galaktosa dan mengkarakterisasi galur-galur teradapatasi galaktosa berdasarkan sifat
fermentasinya pada hidrolisat K. alvarezii. Adaptasi dilakukan sebanyak 264 kali
pada medium Yeast Malt Peptone Galactose. Masa 1 kali adaptasi adalah 4 jam.
Galur hasil adaptasi P. tannophilus memiliki kemampuan fermentasi galaktosa yang
bervariasi, sedangkan galur S. cerevisiae lebih baik dengan semakin lama
adaptasinya. Sifat fermentasi galur baru pada hidrolisat K. alvarezii ini berkorelasi
dengan sifat fermentasi galaktosanya. Galur P. tannophilus hasil adaptasi ke-88
memiliki sifat fermentasi hidrolisat yang lebih baik dari galur hasil adaptasi lain dan
galur liarnya, sedangkan galur-galur S. cerevisiae terus meningkat dari adaptasi ke-88
hingga ke-264 yang melebihi galur liarnya, kecuali efisiensi substrat. Adaptasi tidak
mengubah bentuk sel P. tannophilus, sebaliknya mengubah bentuk sel S. cerevisiae
menjadi agak lonjong dan membesar.
Kata kunci: adaptasi, bioetanol, hidrolisat K. alvarezii, P. tannophilus, S. cerevisiae
ABSTRACT
AHMAD FAUZI. Fermentation Traits of Galactose Adapted of Yeast toward
Seaweed Hydrolysates. Supervised by GAYUH RAHAYU and DWI
SETYANINGSIH.
Kappaphycus alvarezii has polysaccharides which consist of galactose as
monomer unit. After acid hydrolysis, galactose can be used as carbon and energy source
by Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149 and Saccharomyces cerevisiae IPBCC
Y03545. Yet, the ability of these strains to convert K. alvarezii hydrolysates into
bioethanol was low. Therefore, improvement of their fermentation characteristics needs
to be pursued. An effort to obtain galactose adapted of P. tannophilus IPBCC Y111149
and S. cerevisiae IPBCC Y03545 and further characterized the fermentation traits of
those towards K. alvarezii hydrolysates were carried out in this research. Adaptation was
done for 264 times in fresh Yeast Malt Peptone Galactose medium. One cycle of
adaptation is about 4 hours. Strains of P. tannophilus adaptation process varied in their
galactose fermentation ability, meanwhile S. cerevisiae increased with longer adaptation
process. The fermentation characteristics of yeasts in K. alvarezii hydrolysates correlated
with their galactose fermentation ability. Fermentation characters of P. tannophilus 88th
adaptation towards K. alvarezii hydrolysates was better than wild strain, while S.
cerevisiae, except their substrate efficiency, were better than its wild strain. Adaptation
process did not modify the shape of P. tannophilus cell, but modified the shape and size
of S. cerevisiae cell to become oval-like and bigger.
Key words: adaptation, bioethanol, K. alvarezii hydrolysates, P. tannophilus, S.cerevisiae
iii
KARAKTERISASI SIFAT FERMENTASI BEBERAPA
KHAMIR HASIL ADAPTASI GALAKTOSA TERHADAP
HIDROLISAT RUMPUT LAUT
AHMAD FAUZI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
iv
Judul Skripsi : Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa Terhadap Hidrolisat Rurnput Laut
Nama
Ahmad Fauzi
NIM
G34090041
Disetujui oleh
MSi
Diketahui oleh
Tanggal Lulus:
r 6 SEP 2013
v
Judul Skripsi : Karakterisasi Sifat Fermentasi Beberapa Khamir Hasil Adaptasi
Galaktosa Terhadap Hidrolisat Rumput Laut
Nama
: terhadap
Ahmad Fauzi
Hidrolisat Rumput Laut
NIM
: G34090041
Disetujui oleh
Dr Ir Gayuh Rahayu
Pembimbing I
Dr Ir Dwi Setyaningsih, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana. MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
vi
PRAKATA
Alhamdulillah puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang
telah memberikan rahmat-Nya kepada penulis sehingga karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Adapun judul yang dipilih dalam karya ilmiah yang dilaksanakan
sejak bulan Februari 2013 hingga Mei 2013 adalah Karakterisasi Sifat Fermentasi
Beberapa Khamir Hasil Adaptasi Galaktosa terhadap Hidrolisat Rumput Laut.
Pelaksanaan karya ilmiah bertempat di laboratorium Surfactant and Bioenergy
Research Center (SBRC) dan laboratorium IPB Culture Collection (IPBCC).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Gayuh Rahayu selaku
pembimbing pertama dan Dr Ir Dwi Setyaningsih, MSi selaku pembimbing kedua
yang telah sepenuh hati memberikan bimbingan dan arahan yang berarti sehingga
karya ilmiah ini dapat selesai. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr
Tri Atmowidi, MSi selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji dan
memberikan saran saat ujian dan penulisan karya ilmiah. Terima kasih pula
kepada direktur dan karyawan SBRC khususnya Kak Indah, dan Kak Nely yang
telah membantu dan memberi fasilitas selama penulis melakukan penelitian.
Penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada keluarga tercinta
bapak, mama, serta bang Okis, kak Fera dan adik Liska atas doa, dukungan, cinta,
dan perhatiannya yang tak pernah berakhir. Tidak lupa juga penulis ucapkan
terima kasih kepada teman-teman Biologi angkatan 46 khususnya Dheasinta,
Fajar, Dwi, Riana, Puji, Feni atas kebersamaan serta rasa kekeluargaan yang
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, September 2013
Ahmad Fauzi
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
1
Waktu dan Tempat
1
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
3
PEMBAHASAN
8
SIMPULAN
11
SARAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
RIWAYAT HIDUP
15
viii
DAFTAR TABEL
1 Gelembung gas dan populasi sel khamir sebelum dan setelah 48 jam inkubasi
pada YMP Galaktosa cair
4
2 Ukuran sel P. tannophilus dan S. cerevisiae sebelum adaptasi dan setelah
adaptasi ke 264
5
DAFTAR GAMBAR
1 Populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae selama 360 menit
2 Sel-sel Khamir sebelum dan sesudah adaptasi
3 Volume etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
4 Efisiensi substrat P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
5 Produksi etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii berdasarkan gula yang dikonsumsi
6 Efisiensi fermentasi P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
K. alvarezii
3
5
hidrolisat
6
hidrolisat
7
hidrolisat
8
hidrolisat
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi berbagai medium yang digunakan dalam penelitian ..................... 13
2 Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah
fermentasi oleh khamir ................................................................................... 13
3 Efisiensi fermentasi dan efisiensi substrat ....................................................... 14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia sudah memasuki tahapan krisis bahan bakar energi tak
terbaharukan seperti minyak bumi, batubara, dan gas alam sehingga sumber
energi alternatif harus segera dicari. Salah satu alternatif sumber bahan bakar
energi terbaharukan ialah bioetanol. Bioetanol kebanyakan bersumber bahan baku
pati yang pemanfaatannya berkompetisi dengan sumber pangan dan pakan
(Kartika 1992). Oleh sebab itu bioetanol sebaiknya berbahan baku yang belum
banyak dimanfaatkan, ketersediannya melimpah, mudah dibudidayakan dengan
masa panen cepat, harga murah, dan mengandung struktur gula sederhana yang
dapat diubah menjadi etanol seperti bahan-bahan berlignoselulosa, contohnya
rumput laut (Harvey 2009).
Produksi bioetanol dari bahan baku galaktosa sudah pernah diteliti, namun
agen fermentasinya seperti khamir masih dalam proses pengembangan. Pada saat
ini, 2 galur khamir koleksi IPBCC yaitu Pachysolen tannophilus IPBCC Y111149
dan Saccharomyces cerevisiae IPBCC Y03545 dapat menggunakan galaktosa
untuk memproduksi bioetanol (Radesiyani 2012). Namun kadar bioetanol dan
efesiensi fermentasinya masih rendah. Oleh sebab itu perbaikan galur agen
fermentasi galaktosa perlu dilakukan. Salah satu cara perbaikan sifat khamir
produsen bioetanol adalah melalui proses adaptasi berulang-ulang yang akan
mendorong terjadinya proses mikroevolusi. Menurut Adams et al. (1985) karakter
fisiologi galur S. cerevisiae berubah setelah 264 generasi adaptasi. Hong et al.
(2011) juga menyatakan bahwa rekayasa evolusi merupakan salah satu cara
perbaikan galur.
Salah satu galur S. cerevisiae yaitu AL IX baru diadaptasi sebanyak 9 kali
pada hidrolisat rumput laut. Hasil adaptasi ini belum menunjukkan perubahan
kemampuan produksi bioetanolnya (Abimanyu 2013). Oleh sebab itu adaptasi
masih diperlukan untuk memperoleh galur-galur baru yang sesuai dengan karakter
yang diinginkan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan memperoleh galur-galur baru P. tannophilus
IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545 melalui adaptasi berulang
pada galaktosa dan mengkarakterisasi galur-galur teradapatasi galaktosa tersebut
berdasarkan sifat fermentasinya pada hidrolisat Kapphapychus alvarezii.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2013 hingga Mei 2013, di
Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC) Institut
Pertanian Bogor dan Laboratrium IPB Culture Collection (IPBCC).
2
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium Yeast Malt
Peptone (YMP) galaktosa 0.1% cair (Lampiran 1A), YMP galaktosa 0.1% agar
(Lampiran 1B), hidrolisat K. alvarezii, larutan DNS, dua spesies khamir, yaitu P.
tannophilus IPBCC Y111149 dan S. cerevisiae IPBCC Y03545. Alat yang
digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, mikroskop majemuk,
autoklaf, pH universal, destilator, densitometer, spektrofotometer, dan
seperangkat alat inokulasi.
Prosedur Penelitian
Persiapan Biakan Kerja
Sebanyak masing-masing 1 ose biakan khamir pada medium YMP
galaktosa padat dan berumur 48 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang berisi 5 mL medium YMP galaktosa 0.1% cair steril. Biakan
diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Jumlah populasi sel khamir dihitung
dengan hemasitometer pada saat masa inkubasi berakhir. Biakan ini selanjutnya
dijadikan biakan kerja.
Penetapan Jangka Waktu Inkubasi Satu Kali Adaptasi
Sebanyak masing-masing 2 ose biakan khamir pada medium YMP
galaktosa padat diambil dan dimasukkan ke dalam 10 mL medium YMP galaktosa
0.1% cair steril. Biakan diinkubasi pada suhu ruang. Populasi sel khamir dihitung
menggunakan hemasitometer setiap 30 menit mulai menit ke-0 hingga menit ke360. Jangka waktu inkubasi satu kali adaptasi adalah jangka waktu inkubasi yang
diperlukan oleh khamir untuk pertumbuhan populasinya sampai dengan
pertengahan fase generasi ke tiga.
Proses Adaptasi
Sebanyak 1 mL suspensi khamir diambil dari biakan kerja dan dipindahkan
kedalam tabung reaksi yang berisi 4 mL YMP galaktosa cair. Kemudian biakan
pada YMP galaktosa cair diinkubasi selama jangka waktu inkubasi yang telah
ditetapkan. Setelah jangka waktu satu kali adaptasi berakhir, 1 mL suspensi
dipindahkan kembali kedalam 4 mL media YMP galaktosa cair baru. Adaptasi ini
dilakukan sebanyak 264 kali. Biakan hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 diuji
kemampuan fermentasi galaktosanya. Biakan-biakan tersebut dikulturkan kembali
pada YMP galaktosa agar cawan dan diinkubasi selama 48 jam. Sebanyak 1 ose
dari masing-masing biakan tersebut diambil dan dipindahkan ke dalam 5 mL
YMP galaktosa cair yang berisi tabung Durham dan diinkubasi selama 48 jam.
Setelah masa inkubasi berakhir, ukuran gelembung CO2 yang terbentuk pada
tabung Durham diamati, dan dihitung pula populasi selnya. Percobaan dilakukan
dengan 3 ulangan. Biakan hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 dijadikan inokulum
bagi produksi bioetanol. Bentuk dan ukuran sel khamir pada adaptasi ke-264
diamati di bawah mikroskop majemuk.
3
Produksi Bioetanol pada Hidrolisat K. alvarezii
Sebanyak 10 mL inokulum khamir hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264
masing-masing dimasukkan kedalam 90 mL larutan hidrolisat K. alvarezii. Biakan
diinkubasi dalam labu erlenmeyer 250 mL pada suhu ruang selama 96 jam untuk
P. tannophilus dan 144 jam untuk S. cerevisiae, karena pada waktu tersebut
adalah waktu fermentasi optimum bagi masing-masing khamir. Produksi
bioetanol ditetapkan berdasarkan volume dan kadar etanol yang dihasilkan. Etanol
dipisahkan dari air dengan cara destilasi pada suhu 780C. Kadar etanol diukur
menggunakan densitometer. Kadar gula pereduksi dihitung (Lampiran 2Adan 2B)
dengan metode DNS. Selain itu ditetapkan pula efisiensi substrat dan efisiensi
fermentasinya (Lampiran 3Adan 3B).
HASIL
Penetapan Jangka Waktu Inkubasi Satu Kali Adaptasi
Populasi sel pada inokulan P. tannophilus dan S. cerevisiae berturut-turut
adalah 1.10x107 sel mL-1 dan 1.05x107 sel mL-1. Pada menit ke-30, beberapa selsel khamir telah bereproduksi. Jumlah sel P. tannophilus dan S. cerevisiae
meningkat sedikit melebihi 2 kali lipat populasi sel awalnya pada menit ke-90,
yaitu berturut-turut sebesar 2.40x107 sel mL-1 dan 2.15x107 sel mL-1. Fase lag
terjadi sebelum menit ke-90 dan setelah itu populasi khamir mulai meningkat
cepat dan mulai memasuki fase eksponensialnya. Fase eksponensial adalah fase
pertumbuhan cepat pada sel karena sel telah mensintesis enzim-enzim yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan selnya. Awal fase eksponensial terjadi saat jumlah
sel telah melebihi 2x lipat dari jumlah awalnya dan terus meningkat selama nutrisi
pada medium masih tersedia (Singh 2006).
14.00
11.85
12.00
9.55
Populasi khamir
x 107 sel mL-1
10.00
8.35
8.00
6.00
3.25
4.00
2.00
0.00
1.15
2.00 2.05 2.40
1.05 1.15
0
30
1.40
60
4.50
4.35
5.30
5.10
5.75
5.75
6.05
5.90
9.65
8.95
7.05
7.60
6.60
3.35
2.15
90
P. tannophilus
120
150
180
menit ke-
210
240
270
300
330
360
S. cerevisiae
Gambar 1 Populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae selama 360 menit.
4
Dari pola pertumbuhan populasi sel P. tannophilus dan S. cerevisiae
diketahui bahwa menit ke-90 adalah waktu yang diperlukan oleh generasi pertama
bagi kedua khamir untuk melengkapi siklus hidupnya. Generasi ke-2 melengkapi
siklus hidupnya sekitar menit ke-150, sedangkan generasi ke-3 lengkap siklus
hidupnya pada menit ke-330. Waktu regenerasi ke-3 ini lebih panjang daripada
waktu regenerasi sebelumnya dan diduga periode adaptasi generasi ke-3 juga
lebih panjang. Berdasarkan pola pertumbuhan ini, masa inkubasi 1 kali adaptasi
ditetapkan 240 menit dengan harapan setiap 240 menit ada 3 generasi khamir
yang telah melewati periode adaptasinya.
Perubahan Fisiologi Biakan dan Morfologi Sel
Evaluasi terhadap kemampuan fermentasi galaktosa dari biakan hasil
adaptasi ke-88, 176, dan 264 diuji secara kualitatif dalam kemampuan fermentasi
galaktosanya. S. cerevisiae lebih adaptif dibandingkan P. tannophillus karena
semakin lama proses adaptasi kemampuan membentuk gelembung dan
pertumbuhan sel S. cerevisiae lebih baik (Tabel 1). P. tannophilus tidak
memperlihatkan perkembangan adaptasi yang baik karena kemampuan
pembentukan gelembung dan kemampuan sel untuk tumbuh berfluktuasi dengan
semakin lama proses adaptasinya.
Tabel 1 Gelembung gas CO2 dan populasi sel khamir sebelum dan setelah 48 jam
inkubasi pada YMP Galaktosa cair
Sebelum adaptasi
Jenis khamir
Gg
Ps
P. tannophilus
+
S. cerevisiae
+
Setelah adaptasi ke88
176
264
Gg
Ps
Gg
Ps
Gg
Ps
-
+++
3.50
+
2.93
++
3.35
-
+
2.35
++
3.28
+++
3.78
Keterangan: Gg = gelembung gas CO2; Ps= populasi sel ( x 109 sel mL-1); - =
tidak dihitung; ukuran gelembung gas : +++ = besar; ++ = sedang;
+ = kecil
Setelah proses adaptasi berakhir yaitu adaptasi ke-264, sel P. tannophilus
tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran secara signifikan, sedangkan S.
cerevisiae mengalami perubahan bentuk dan ukuran signifikan yang menjadi agak
oval dan lebih besar (Gambar 2) dibandingkan dengan galur liarnya. P.
tannophilus galur liar memiliki rata-rata panjang 14.11µm dan lebar 7.29µm,
setelah diadaptasi 264 kali rata-rata panjang menjadi 14.65µm dan lebar 7.58µm.
Sedangkan, S. cerevisiae galur liar memiliki rata-rata panjang sebesar 10.03µm
dan lebar 5.30µm dan setelah diadaptasi 264 kali rata-rata panjang menjadi
16.02µm dan lebar 8.73µm. Ukuran sel P. tannophilus hasil adaptasi ke-264
sekitar 1.03x ukuran sel galur liarnya, sedangkan ukuran sel S. cerevisiae hasil
adaptasi yang sama sekitar 1.6x ukuran sel galur liarnya (Tabel 2).
5
Tabel 2 Ukuran sel P. tannophilus dan S. cerevisiae sebelum adaptasi dan setelah
adaptasi ke-264
Spesies khamir
Ukuran rata-rata (µm)
Rasio sebelum adaptasi :
Spesies khamir Sebelum adaptasi Setelah adaptasi ke-264
: setelah adaptasi 264
kali
Panjang
Lebar
Panjang
Lebar
Panjang
Lebar
P. tannophilus
14.11
7.29
14.65
7.58
1:1.04
1:1.04
S. cerevisiae
10.03
5.30
16.02
8.73
1:1.60
1:1.65
20 µm
perbesaran: 20x
20 µm
perbesaran: 20x
20 µm
perbesaran: 30x
20 µm
perbesaran: 30x
Gambar 2 Sel-sel khamir sebelum dan sesudah adaptasi. Sel-sel P. tannophilus
sebelum diadaptasi (kiri atas), dan setelah 264 kali adaptasi (kanan
atas), serta sel-sel S. cerevisiae sebelum diadaptasi (kiri bawah) dan
setelah 264 kali adaptasi (kanan bawah).
6
Produksi bioetanol pada hidrolisat K. alvarezii
Ketika khamir-khamir hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264 dianalisis
kemampuannya dalam menggunakan hidrolisat K. alvarezii dalam membentuk
bioetanol, beberapa galur-galur hasil adaptasi ini menunjukan sifat fermentasi
yang lebih baik daripada galur liarnya. Volume (Gambar 3) kedua khamir tersebut
lebih tinggi dari galur liarnya. Galur-galur P. tannophilus hasil adapatasi
menghasilkan etanol dengan volume (0.03-0.06 %v/v) yang lebih tinggi
dibandingkan dengan galur liarnya (0.02 %v/v). Demikian pula semua galur S.
cerevisiae hasil adaptasi menghasilkan etanol dengan volume (0.02- 0.10 %v/v)
lebih tinggi dibandingkan dengan galur liarnya (0.01 %v/v).
Berbeda dari volume dan kadar etanolnya, hanya beberapa galur hasil
adaptasi yang menunjukkan efisiensi substrat lebih baik dari galur liarnya. P.
tannophilus hasil adaptasi ke-176 dan ke-264 lebih efisien dalam memanfaatkan
substrat dibandingkan dengan galur liarnya. Nilai efisiensi substrat P. tannophilus
hasil adaptasi itu berturut-turut 26.99% dan 30.92%, lebih tinggi dari galur liarnya
yaitu sebesar 24.31%, sedangkan nilai efisiensi subtrat S. cerevisiae, hanya hasil
adaptasi ke-88 (31.21%) yang relatif lebih tinggi daripada galur liarnya sebesar
30.07 % (Gambar 4).
0.12
0.10
Volume etanol (% v/v)
0.10
0.08
0.06
0.06
0.05
0.04
0.04
0.03
0.02
0.02
0.02
0.01
Adaptasi
0.00
galur liar
galur
ke-88
ke-176
ke-264
liar
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 3 Volume etanol P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii.
7
35.00
Efisiensi Substrat (%)
30.00
25.00
30.92
31.21
30.07
26.99
26.27
24.31
22.79
21.80
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
galurliar
galur
liar
P. tannophilus
ke-88
ke-176
ke-264
Adaptasi
S. cerevisiae
Gambar 4 Efisiensi substrat galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii.
Berdasarkan gula yang dikonsumsi, produksi bioetanol P. tannophilus dan
S. cerevisiae hasil adaptasi lebih tinggi dibandingkan galur liarnya. Semua galur
adaptasi P. tannophilus memproduksi bioetanol (1.09-3.05% b/b gula) lebih tinggi
dari galur liarnya sebesar 0.94% (b/b gula). Produksi bioetanol pada semua galur
adaptasi S. cerevisiae berkisar dari 0.73-4.39% (b/b gula) dan juga lebih tinggi
dari produksi bioetanol galur liarnya sebesar 0.49% (b/b gula) (Gambar 5).
Produksi bioetanol berdasarkan gula yang dikonsumsi ini setara dengan efisiensi
fermentasinya (Gambar 6).
Galur-galur adaptasi menunjukkan kemampuan produksi bioetanol yang
bervariasi. Diantara galur-galur adaptasi, P. tannophilus hasil adaptasi ke-88
menunjukkan semua parameter produksi etanol yang lebih baik dibandingkan
galur liar dan galur adaptasi lainnya, sedangkan S. cerevisiae hasil adaptasi ke264 menunjukkan karakter yang lebih baik daripada galur liarnya kecuali dalam
efisiensi substratnya.
8
5.00
4.39
Produksi etanol (% b/b gula)
4.50
4.00
3.50
3.05
3.00
2.43
2.50
2.11
2.00
1.50
0.94
1.00
1.09
0.73
0.49
0.50
0.00
galur
galur
liar
ke-88
Adaptasi
liar
ke-176
ke-264
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 5 Produksi etanol galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada hidrolisat
K. alvarezii berdasarkan gula yang dikonsumsi.
3.00
2.48
Efisiensi Fermentasi (%)
2.50
2.00
1.49
1.50
1.24
1.01
1.00
0.50
0.73
0.50
0.50
0.32
0.00
galur liar
galur
liar
ke-88
ke-176
ke-264
Adaptasi
P. tannophilus
S. cerevisiae
Gambar 6 Efisiensi fermentasi galur P. tannophilus dan S. cerevisiae pada
hidrolisat K. alvarezii.
PEMBAHASAN
Proses adaptasi dan uji fermentasi galaktosa pada penelitian ini
menunjukkan bahwa P. tannophilus dan S. cerevisiae dapat menggunakan
galaktosa sebagai sumber karbon dan sumber energi, meskipun kedua khamir
tersebut (Kurztman & Fell 2000) atau S. cerevisiae (Timson 2007) saja lebih
menyukai glukosa. Galaktosa merupakan nutrisi non-konvensional untuk khamir
9
dan akan digunakan sebagai satu-satunya sumber karbon saat glukosa tidak
tersedia dalam medium (Frey 1996). Pada khamir, galaktosa tidak dapat masuk ke
dalam jalur metabolisme primer untuk menghasilkan energi, melainkan harus
diubah dulu menjadi glukosa-6P (Timson 2007). S. cerevisiae mengonversi
galaktosa menjadi glukosa-6P melalui jalur Laloir dengan bantuan 5 enzim, yaitu
galactose mutarotase, galactokinase, galactose-1-phosphate uridylyltransferase
UDP-galactose 4-epimerase, dan pospoglukomutase (Timson 2007). Gen-gen
yang terlibat dalam metabolisme galaktosa akan terinduksi jika dalam lingkungan
tumbuh tersedia galaktosa sebagai sumber karbon tunggal (Brink et al. 2009).
Gen-gen tersebut ialah galaktokinase (GAL1), galaktosa permease (GAL2),
galaktosa-1-phosphate uridylyltransferase (GAL7) dan uridine-diphosphoglukosa
4-epimerase (GAL10). Induksi gen-gen tersebut akan menyebabkan sel
membentuk protein yang dibutuhkan dalam metabolisme galaktosa. Oleh sebab
itu dalam proses adaptasi pada penelitian ini, galaktosa dijadikan satu-satunya
sumber karbon pada medium yang digunakan.
Dari pola pertumbuhannya pada medium YMP Galaktosa 0.1%, fase lag
bagi P. tannophilus dan S. cerevisiae diperkirakan terjadi pada 30 menit pertama
masa inkubasinya. Fase lag ialah fase awal pada kurva pertumbuhan saat mikrob
pada umumnya tidak mengalami pembelahan sel (Nasim et al. 1989). Pada fase
ini sel mempersiapkan enzim-enzim yang diperlukan dalam proses metabolisme.
Singh et al. (2006) menyatakan fase lag merupakan periode menyesuaikan diri
dengan lingkungan atau medium baru yang dicirikan dengan tidak terjadi
perbanyakan sel melebihi 2 kali dari jumlah awalnya.
Waktu regenerasi khamir dipengaruhi oleh medium tumbuhnya.
Pertumbuhan P. tannophilus dan S. cerevisiae pada medium YMP Galaktosa
0.1% menunjukkan bahwa pada menit ke-90 populasi sel P. tannophilus dan S.
cerevisiae meningkat menjadi sekitar 2 x populasi awalnya. Hal ini berbeda
dengan penemuan Adams et al. (1985). Mereka menemukan bahwa waktu yang
dibutuhkan sel S. cerevisiae untuk meningkatkan populasinya 2 x dari populasi
awalnya adalah sekitar 115-120 menit pada medium minimal dengan glukosa
0.08% sebagai sumber karbon tunggal. Hong et al. (2010) memperoleh 400
generasi S. cerevsiae dalam 62 hari adaptasi, berarti satu generasi membutuhkan
waktu sekitar 3-4 jam pada medium minimal galaktosa 2%. Perbedaan waktu
regenerasi yang diperoleh ini disebabkan oleh perbedaan metode dan medium
tumbuh yang digunakan.
Penetapan periode adaptasi dilakukan berdasarkan pola tumbuhnya. Dalam
periode 4 jam diharapkan terbentuk 3 generasi sel yang mengalami adaptasi
terhadap galaktosa. Sel-sel yang setiap 4 jam terus dihadapkan pada medium
galaktosa baru diharapkan dapat membentuk generasi baru yang terbiasa dalam
mengonsumsi galaktosa. Waktu satu kali adaptasi ini kurang dari yang ditetapkan
oleh Hong et al. (2010) yaitu 1 hari dalam penelitiannya yang bertujuan untuk
memperoleh mutan yang mampu menggunakan galaktosa. Waktu satu kali
adaptasi ini juga berbeda dari Guimarães et al. (2008). Mereka melakukan 12 kali
pemberian medium baru setiap 2-5 hari dalam jangka waktu 41 hari.
10
Proses adaptasi P. tannophillus dan S. cerevisiae telah menghasilkan
galur-galur baru dengan sifat fermentasi yang lebih baik dari galur liarnya. Proses
adaptasi telah dilakukan oleh beberapa peneliti untuk menghasilkan mutan-mutan
baru, misal Adams et al. (1985) menyatakan bahwa proses adaptasi sebanyak 264
generasi pada media galaktosa dapat mengakibatkan perubahan fisiologi pada S.
cerevisiae. Mutan-mutan hasil adaptasi menggunakan galaktosa lebih baik.
Guimarães et al. (2008) memperoleh mutan S. cerevisiae yang dapat
menggunakan laktosa lebih baik dan menghasilkan bioetanol 30% lebih tinggi
dari galur asalnya. Adaptasi juga dapat mengakibatkan perubahan bentuk sel.
Adams et al. (1985) menemukan adanya perubahan bentuk sel S. cerevisiae
setelah 264 generasi adaptasi. Pada penelitian ini, perubahan bentuk sel dan
ukuran juga ditemukan pada sel S. cerevisiae yang diadaptasi sebanyak 264 kali.
Ukuran sel pada mutan hasil adaptasi ke-264 sebesar 1.60 kali lebih besar dari
galur liarnya. Sebaliknya setelah proses adaptasi ke-264, P. tannophilus tidak
mengalami perubahan bentuk dan ukuran yang signifikan.
P. tannophilus hasil adaptasi ke-88 menunjukkan kemampuan fermentasi
galaktosa yang relatif lebih baik dibandingkan mutan-mutan lainnya, sebaliknya S.
cerevisiae hasil adapatasi ke-264 menunjukkan kemampuan fermentasi galaktosa
yang lebih baik daripada mutan-mutan lainnya. Hasil ini menunjukkan bahwa
respon sel P. tannophilus terhadap adaptasi galaktosa berbeda dari S. cerevisiae.
Kemampuan fermentasi dan populasi sel P. tannophilus pada tahapan adaptasi
tertentu berfluktuasi, sedangkan S. cerevisiae terus berkembang lebih baik sejalan
dengan proses adaptasi. Perubahan pertumbuhan yang terjadi pada sel khamir
karena kemampuan dalam pertumbuhan tunas terjadi pada fase G1 akhir atau awal
fase S (Singh et al. 2006). Sehingga jumlah populasi sel P. tannophilus dan S.
cerevisiae pada akhir fermentasi berbeda-beda pada setiap hasil adaptasi. Hasil
penelitian Lee et al. (1986) menunjukkan bahwa mutan P. tannophilus hasil
radiasi sinar-UV menunjukkan kemampuan fermentasi galaktosa yang paling
rendah dibandingkan fermentasi gula-gula lainnya seperti glukosa, manosa, dan
xylosa. Dengan demikian, pada kondisi yang sama P. tannophilus lebih menyukai
mengonsumsi gula-gula lainnya dibandingkan mengonsumsi galaktosa. Oleh
sebab itu proses adaptasi berulang pada penelitian ini dilakukan untuk
meningkatkan kemampuan konsumsi galaktosa untuk diubah menjadi bioetanol.
Pada penelitian ini hidrolisat K. alvarezii dijadikan bahan baku produksi
bioetanol. Kim et al. (2008) menyatakan bahwa K. alvarezii mengandung
karagenan sebesar 43.4%. Menurut Winarno (1996) karagenan tersusun dari
perulangan unit-unit D-galaktosa dan 3,6-anhidro-D-galaktosa. Hasil uji
fermentasi galaktosa dari mutan-mutan hasil penelitian ini juga berhubungan
dengan kemampuan mengonversi hidrolisat K. alvarezii menjadi bioetanol.
Mutan-mutan P. tannophilus dan S. cerevisiae hasil adaptasi ke-88, 176, dan 264
menunjukkan bahwa P. tannophilus adaptasi ke-88 memiliki sifat fermentasi lebih
baik dari galur adaptasi lain dan galur liarnya dalam produksi etanol (3.05%),
volume etanol (0.06% v/v), dan efisiensi fermentasinya (1.49%). Sebaliknya sifat
fermentasi seperti produksi etanol (0.73%-4.39%), volume etanol (0.02%-0.10%
v/v), dan efisiensi fermentasi (0.50%-2.48%) S. cerevisiae terus meningkat dari
adaptasi ke-88 hingga ke-264 kecuali dalam hal efisiensi substrat yang tidak lebih
11
baik dari galur liarnya. S. cerevisiae IPBCC Y05548 AL IX yang telah diadaptasi
oleh Setyaningsih et al. (2012) mampu menghasilkan kadar etanol yang lebih baik
yaitu 2%.
Produksi bietanol oleh khamir ini mungkin dipengaruhi oleh kondisi
hidrolisat. Meinita et al. (2011) menganalisis hidrolisat rumput laut K. alvarezii
dan menyatakan bahwa hidrolisat mengandung senyawa inhibitor seperti 5Hydroxymethyl fulfural (HMF) dan asam levulinik (AL). Menurut Maharani
(2011), konsentrasi tinggi dari HMF dan asam levulinik dapat menghambat
produktivitas fermentasi mikroorganisme sehingga menurunkan produksi etanol.
S. cerevisiae juga diduga dapat menggunakan gula sebagai sumber energi untuk
mengilangkan inhbitor HMF dan AL daripada memproduksi bioetanol.
Pernyataan tersebut diperkuat dengan hasil penelitian ini bahwa efisiensi substrat
yang tinggi dan efisiensi fermentasi yang rendah, diduga bahwa kedua khamir
lebih memilih menggunakan energi untuk mengurangi senyawa inhibitor daripada
memproduksi bioetanol.
SIMPULAN
Adaptasi selama 264 kali menghasilkan mutan-mutan yang sifat
fermentasinya lebih baik dari galur liarnya. Selain itu, proses adaptasi selama 264
kali pada medium YMP Galaktosa juga dapat mengubah bentuk sel S. cerevisiae
menjadi lebih besar dan agak lonjong. Galur mutan P. tannophilus hasil adaptasi
ke-88 memiliki sifat fermentasi yang lebih baik dari galur adaptasi lain dan galur
liarnya. Begitu pula sifat fermentasi, kecuali efisiensi substrat, galur mutan S.
cerevisiae hasil adaptasi ke-264 lebih baik dari galur adaptasi lain dan galur
liarnya.
SARAN
Perlu dilakukan pengecekan gula pereduksi galaktosa pada setiap proses
adaptasi di medium YMP Galaktosa, supaya kemampuan P. tannophilus dan S.
cerevisiae dalam menggunakan galaktosa sebagai sumber karbon tunggal dapat
diketahui. Selain itu, kedua khamir tersebut perlu diadaptasi lagi pada medium
hidrolisat K. alvarezii.
DAFTAR PUSTAKA
Abimanyu HR. 2013. Evaluasi Saccharomyces cerevisiae Teradaptasi Hidrolisat
Kappaphycus alvarezii dalam Kemampuan Mengonversi Hidrolisat
Menjadi Bioetanol [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Adams J, Paquin C, Oeller PW, Lee LW. 1985. Physiological characterization of
adaptive clones in evolving populations of the yeast, Saccharomyces
cerevisiae. Genetics. 110:173-185.
Brink JVD, Akeroyd M, Hoeven RVD, Pronk JT, Winde JHD, Lapujade PD.
2009.
Energetic limits to metabolic flexibility: responses of
12
Saccharomyces cerevisiae to glucose–galactose transitions. Microbiology.
155:1340-1350.
Frey PA. 1996. The Leloir Pathway: mechanism imperative for three enzymes to
change the stereochemical configuration of a single carbon in galactose.
Federation of American Societies for Experimental Biology. 10:46-470.
Guimarães PMR, François J, Parrou JL, Teixeira JA, Domingues L. 2008.
Adaptive evolution of a lactose-consuming Saccharomyces cerevisiae
recombinant. Applied and Environmental Microblogy. 74:1748-1756.
Harvey F. 2009. Produksi Etanol dari Limbah Karaginan [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Hong KK, Vongsangnak W, Vemuri GN, Nielsen J. 2011. Unraveling
evolutionary strategies of yeast for improving galactose utilization through
integrated systems level analysis. Proceeding of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 108:12179-12184.
Kartika B. 1992. Petunjuk Evaluasi Produk Industri Hasil Pertanian. Yogyakarta
(INA): PAU Pangan dan Gizi UGM. hlm 55-63.
Kim GS, Myung KS, Kim YJ, Oh KK, Kim JS, Ryu HJ, Kim KH.2007. Method
of Producing Biofuel Using Sea Algae. Seoul (KOR): World Intelectual
Property Organization. hlm 103-117.
Kurtzman CW, Fell JW. 2000. The Yeast, A Taxonomy Study Fourth Edition.
Amsterdam (NED): Elvier Science B.V. hlm 64-86.
Lee H, James AP, Zahab DM, Mahmourides G, Maleszka R, Schneider H. 1986.
Mutants of Pachysolen tannophilus with improved production of ethanol
from d-xylose. Applied and Environmental Microblogy. 51(6):1252.
Maharani DM. 2011. Adaptasi Saccharomyces cerevisiae terhadap hidrolisat asam
ubi kayu untuk produksi bioetanol [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Meinita NDM, Kang YJ, Jeong TG, Koo MH, Park MS, Hong KY. 2011.
Bioethanol production from acid hydrolysate of the carrageenophyte
Kappaphycus alvarezii (cottonii). Journal of Applied Phycology. 24:857862.
Nasim A, Young P, Johnson BF. 1989. Molecular Biology of the Fission Yeast.
San Diego (US): Academic Press. hlm 567-588.
Radesiyani I. 2013. Potensi khamir dalam fermentasi hidrolisat rumput laut
(Kappaphycus alvarezii) Menjadi bioetanol [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Setyaningsih D, Windarwati S, Khayati I, Muna N, Hernowo P. 2012. Acid
hydrolysis technique and yeast adaptation to increase red macroalgae
bioetanol production. International Journal of Environment and
Bioenergy. 3(2):98-110.
Singh PG, Volpe G, Creely MC, Grotsch H, Geli MI, Petrov D. 2006. The lag
phase and G1 phase of a single yeast cell monitored by Raman
microspectroscopy. Journal Raman Spectroscopy. 37:858–864.
Timson DJ. 2007. Galactose metabolism in Saccharomyces cerevisiae: A review.
Dynamic Biochemistry. 3:63-73.
Winarno FG. 1996. Teknologi Pengolahan Rumput Laut. Jakarta (INA): Pustaka
Sinar Harapan. hlm 44-48.
13
Lampiran 1 Komposisi berbagai medium yang digunakan dalam penelitian
A. Komposisi medium Yeast Malt Peptone (YMP) Galaktosa 0.1% cair (dalam 200 mL)
Yeast extract
Malt
Peptone
Galaktosa 0.1%
Akuades
1
1
1
0.2
200
g
g
g
g
mL
B. Komposisi medium Yeast Malt Peptone (YMP) Galaktosa 0.1% agar (dalam 500 mL)
Yeast extract
Malt
Peptone
Galaktosa 0.1%
Bakto agar
Kloramfenikol
Akuades
2.5
2.5
2.5
0.5
10
250
500
g
g
g
g
g
µg
mL
Lampiran 2 Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah
fermentasi oleh khamir
A. Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah fermentasi
oleh P. tannophilus
P. tannophilus
Galur liar
Adaptasi ke-88
Adaptasi ke-176
Adaptasi ke-264
Gula pereduksi (% b/v)
Sebelum fermentasi
Setelah fermentasi
6.91
5.23
6.91
5.34
6.91
5.05
6.91
4.77
B. Rata-rata gula pereduksi hidrolisat K. alvarezii sebelum dan setelah fermentasi
oleh S. cerevisiae
S. cerevisiae
Galur liar
Adaptasi ke-88
Adaptasi ke-176
Adaptasi ke-264
Gula pereduksi (% b/v)
Sebelum fermentasi
Setelah fermentasi
6.91
4.83
6.91
4.75
6.91
5.40
6.91
5.09
14
Lampiran 3 Efisiensi fermentasi dan efisiensi substrat
A. Efisiensi fermentasi
Efisiensi fermentasi (%) = Konsentrasi etanol yang diperoleh aktual (% b/v) x 100%
Konsentrasi etanol teoritis
Konsentrasi etanol teoritis = So x 0,51*
Keterangan: *Nilai etanol yang terbentuk pada persamaan glikolisis
B. Efisiensi Substrat
Efisiensi substrat (%) = So – S x 100%
So
Keterangan: So = gula pereduksi awal/sebelum fermentasi (% b/v)
S = gula pereduksi setelah fermentasi (% b/v)
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, pada tanggal 22 Juli 1991 dengan nama
lengkap Ahmad Fauzi. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara, dari
pasangan Ismet Fasya dan Nurhayati. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri
52 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis lulus melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar
Mahasiswa (BBM) dari DIKTI pada tahun 2011-2013.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah bergabung dalam UKM CUA
(Chess Unity of Agriculture) tahun 2009 dan kepanitian Pesta Sains Nasional
(PSN) tahun 2011 sebagai anggota Divisi Tim Khusus. Penulis pernah menjadi
asisten praktikum Biologi Dasar pada tahun ajaran 2011/2012 dan 2012/2013,
asisten praktikum Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran
2012/2013, asisten praktikum Botani Umum pada tahun ajaran 2012/2013, dan
asisten praktikum Biologi Cendawan pada tahun ajaran 2012/2013. Tahun 2011
penulis melakukan Studi Lapang di Hutan Pendidikan Gunung Walat (HPGW),
Sukabumi, Jawa Barat dengan judul Serangga Pembentuk Puru di Hutan Pendidikan
Gunung Walat. Tahun 2012, penulis melakukan Praktik Lapangan di Pondok
Pesantren Darul Fallah dari bulan Juni sampai Juli dengan judul Manajemen
Pemeliharaan Terkait Status Kesehatan Sapi Perah di Unit Peternakan Darul
Fallah, Ciampea-Bogor.