Telaah Biokimiawi Proses Asosiasi Shorea selanica dan Scleroderma columnare : Suatu Pendekatan Biosintesis
PENDEKATAN BIOSINTESIS
r*-+*
Oleh:
LATIFAH KOSIiil DARUSMAK
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITU'I' PERTANLAN BOGOR
1995
SUMMARY
LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
Biochemical Study on the Associ-
ation Process of S h o r e a s e l a n i c a and S c l e r o d e r m a c o l u m -
nare
:
A Biosynthetical Approach; supervised by Djoko S.
Moel johardjo (chairman), G.A. Wattimena, Siti Soetarmi
Tjitrosomo, Yahya Fakuara Ts, and Muhamad Wirahadikusumah .
Mycorrhiza is a
symbiotic, non-pathogenic associa-
tion of a fungus and the roots of a plant. This association could be searched either through the plant activities as a host, or the fungous activities as a mycosymbiont. This dissertation is based on the research mentioned above, which had been conducted from 1992 until
1995. The objectives of the research are
:
(1) to compare
plant growth, nutrient proportion, specific activity and
kinetic characteristics of acid-phosphatase in the rhizot
sphere area as a result of the inoculation of a mycosymbiont; (2) to discover secondary metabolites resulted
from the association process in the mycorrhizal roots;
(3) to compare the specific activity and kinetic charac-
teristics of acid-phosphatase and chitinase, patterns of
lipid, carbohydrate and protein; between the mycorrhizal
and
non-mycorrhizal roots;
(4) to study the
in vitro.
antagonistic
effects of
S. columnare Berk.
&
Br. to
pathogenic microbes. This research covered four experiments: preliminary research, nursery experiment in Darmaga, h vitro mycorrhizal synthesis and
microbial study
experiments in the Laboratory of Chemistry Faculty of
Mathematics and Natural Sciences and in the Laboratory of
Silviculture Faculty of Forestry. The preliminary research was conducted in order to find the suitable growth
medium in terms of microbial growth and extracellular
metabolite production.
The nursery experiment was de-
signed to analyze growth variables, root structures, antimicrobial compounds and plant growth regulators. The
vitro mycorrhiza
synthesis experiment was conducted to
prove the association in the
vitro condition and to
find possible phytoalexin-analog compounds in the mycorrhizal roots. While microbial study experiment were
conducted to test the antagonistic characteristics
of
mycorrhizal fungi, the antibacterial characteristics of
extracellular metabolites, and the ability of the fungi
to produce plant growth regulators.
S. columnare isolates were obtained from the basidi-
ocarps collected from the Dipterocarp Forest at Haur
Bentes Experimental Station, while the S. s e l a n i c a cuttings were prepared from the 1-year-old saplings under
the 40-year-old stand at Darmaga Experimental Station. In
the preliminary research, S. columnare isolates were
grown in Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract Agar
(MEA), Modified Melin-Norkarns (MMN) and Malt Extract
(ME) media.
In the nursery experiment, the soil used as
7
ray from Co nucleus.
There were four treatments in the
in vitro mycorrhizal
a medium was sterilized by the
synthesis experiment: (1) control, (2) inoculated, (3)
root exudate added and (4) inoculated and root exudate
added.
Instead of soil, vermiculite was used as a medi-
um, and the MS liquid medium was prepared for nutrient
source. PDA and MEA media and ME and MMN liquid cultures
were used in the microbial study experiment.
Staphylo-
coccus aureus (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853) and P. solanacearum were used in the bacterial
test,
while Fusarium s p . and Rhizoctonia solani were
used in the fungal test.
The preliminary research showed that both
PDA and
MEA media could produce good mycelial growth, but in
terms of dry weight ME medium produced higher than PDA
medium did.
The highest antibacterial activity against
S. aureus (ATCC 25922)
was found in the hexane extract
of PDA and MEA media, with the clear diameter zone ( d )
formed of 23.4 and 23.0 mrn respectively.
iii
The results of the nursery experiment showed that
inoculation could improve the quality of plant growth
with 18.08% height increment and 20.25% increase of root
weight.
The growth improvement also showed the increase
of phosphate uptake, caused by 21.85% increase of activity and 27.25% maximum rate of root acid- phosphatase.
Inoculation could also increase the content of phosphate
in the stem of plants of 36 week after planting (wap) by
14.04%. While available phosphate in the soil was increased by 9.38% after the experiment was done.
The in-
crease of available P caused by the increase of activity
and maximum rate of soil acid-phosphatase were 32.30 and
65.08%, respectively.
The improvement of growth due to the increase of IAA
and IBA in the mycorrhizal root were 326.76 and 505.12%,
respectively, and BTP identified from the mycorrhizal
root was 0.077/ug/g root.
S. columnare was shown to be a good symbiont for S.
selanica, indicated by the infection rate of 84.5
+
4.2%
and the increase of chitin content of 261.69%.
There were indications of macromolecular change
caused by inoculation, although it was not significant (P
>
0.05). Total lipid content was significantly increased
by 27.96% and one characteristic polypeptide band
could
be
detected in the region of
14,400 molecular weight,
c
while the extract showed chitinase activity.
Inocula-
tion could change the properties of chitinase of the 16
wap (8 weeks after inoculation, wai) root, but the
changes were not significant for the 36 wap (28 wai)
root.
Activity, specific activity, maximum rate and Mi-
chaelies constant at the 16 wap (8 wai) were increased by
12.72, 6.07, 116.23 and 37.90%, respectively; showed the
existence of the uncompetitive inhibition of enzyme.
S. s e l a n i c a and S . columnare could form association
in the in vitro condition, this was shown by the formation of Hartig net and mycelial mantle, through structural analysis.
There were radially elongated epidermis
cells in the root of 28 wai, but these cell could not be
identified in the root of 16 wai.
.
The plant-produced antimicrobial compound, identified by antibacterial activity of the root extracts
showed that
either control or inoculated of 28 wai root
resulted some antibacterial activity against P. s o l a n a -
cearum.
Non mycorrhizal root of 16 wai did not show the
antibacterial activity.
However, it was enhanced by the
addition of root exudate to the rhizosphere area and
reached the highest activity of
formed against P. solanacearum.
11.3 A 1.3 mm zone (d)
This
result showed the
indication of interaction between root exudate and fungal
inoculation in producing the plant antimicrobial cornpounds.
There was also indication of the role of flavo-
noid compounds in
the association process.
Flavanone,
flavone, flavonol, malvidin, pelargonidin and cyanidin
were identified from the root extracts.
S.
columnare metabolites gave an antifungal activity
against R. s o l a n i and antibacterial
solanacearum.
The antifungal
activity against P.
activity shown by the re-
tardation of mycelial growth,for the ME and MMN buthanol.
extracts were 56.81
ly.
f
2.49 and 53.62
+
4.13%, respective-
The antifungal compound was identified as one of
pelargonidin or malvidin group. The strongest antibacterial activity found in the third fraction of PDA and MEA
hexane extracts toward P. s o l a n a c e a r m with zone formed
were 8.4
+ 0.7 and 13.4 +
1.7 mrn
respectively. While
antibacterial activity in the phenol fraction was shown
in the third
fraction from the MMN extract, with zone.
formed was 12.7
+
0.1 mm. The antibacterial compound was
identified as one of sesquiterpene and flavanone group.
IAA,
IBA and BTP could be identified from the extracellu-
lar metabolites of S. columnare grown in ME medium, with
their concentration
of 0.977,
extract, respectively. IAA
0.326
was
and
identified
0.011 ug/g
from the
extracellular metabolite of S. columnare grown in
MMN
medium with a concentration of 1.069 ,ug/g extract. There
is indication that S.columnare could synthesize the IAA
compound from tryptophan which acted as a precursor.
vii
RINGXASAN
LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
Telaah Biokimiawi Proses Asosia-
si S h o r e a sel a n i c a Dan S c l e r o d e r m a c o l u m n a r e : Suatu
Pendekatan Biosintesis; di bawah bimbingan Djoko S. Moeljohardjo sebagai Ketua; G .A. Wattimena, Siti Soetarmi
Tjitrosomo, Yahya Fakuara Ts, dan Muhamad Wirahadikusmah
sebagai anggota.
Mikoriza ialah suatu asosiasi simbiosis antara cendawan non patogen dengan akar tumbuhan.
Asosiasi ini
dapat ditelaah melalui aktivitas tumbuhan sebagai tanaman
inang atau melalui aktivitas cendawan sebagai mikosimbion. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang dilakukan dari tahun 1992 sampai 1995.
yang dilakukan bertujuan
untuk
Penelitian
(1) membandingkan ting-
kat pertumbuhan tanaman tersebut akibat inokulasi mikosimbion, proporsi hara, aktivitas spesifik serta karakteristik kinetik enzim fosfatase-asam di daerah rizosfer;
(2) mencari metabolit sekunder hasil proses asosiasi pada
akar bermikoriza;
(3) membandingkan aktivitas spesifik
dan karakteristik kinetik enzim fosfatase-asam dan kitinase, pola lipid, karbohidrat serta protein akar bermikoriza dan tidak bermikoriza;
tagonistik in vitro
:
S.
(4)
mempelajari gejala an-
columnare Berk.
&
Br.
terhadap
mikroba patogen.
Penelitian ini terdiri atas penelitian pendahuluan,
percobaan di persemaian Darmaga, percobaan sintesis mikoriza in vitro dan percobaan telaahan mikroba, di laboratorium Kimia FMIPA IPB dan laboratorium Silvikultur
Fahutan IPB.
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk
memperoleh media biakan yang baik yang dikaitkan dengan
kemampuali tumbuh mikroba dan produksi metabolit ekstraseluler.
Percobaan di persemaian untuk menelaah peubah
pertumbuhan, analisis anatomis akar, analisis senyawa
antimikroba dan analisis zat pengatur tumbuh.
Percobaan
sintesis mikoriza untuk membuktikan terjadinya asosiasi
dalam situasi in vitro, dan menelaah kemungkinan adanya
senyawa analog fitoaleksin pada akar bermikoriza. Percobaan telaah mikroba dilaksanakan untuk menguji sifat antagonistik cendawan, adanya metabolit ekstraseluler yang
bersifat antibakterial, dan kemampuan cendawan tersebut
untuk memproduksi zat pengatur tumbuh.
Isolat S. columnare berasal dari basidioma cendawan
yang dikoleksi dari tegakan hutan Dipterocarpaceae di
Kebun Percobaan Haur Bentes, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan,
Departemen
Kehutanan.
Setek pucuk
S.selanica B1. diambil dari anakan yang berumur
di sekitar pohon induk yang berumur
+
I tahun
40 tahun yang ber-
lokasi di Kebun Percobaan Darmaga, Puslitbanghut, Departemen Kehutanan. Untuk penelitian pendahuluan isolat
S. columnare dibiakkan pada media PDA, MEA, MMN, dan ME.
Pada percobaan di persemaian digunakan media tanah yang
telah disterilisasi dengan sinar
8 dari inti Co.
Perla-
kuan yang diberikan pada percobaan sintesis mikoriza in
vitro terdiri atas
:
a) kontrol, b) diinokulasi, c) dibu-
buhi eksudat, d) dibubuhi eksudat dan diinokulasi. Media
tanam yang digunakan adalah vermikulit yang dibubuhi media cair Murashige dan Skoog (MS). Pada percobaan telaahan mikroba digunakan media PDA dan MEA dan media cair ME
dan MMN.
Bakteri uji yang digunakan adalah S t a p h y l o c o c -
c u s a u r e u s (ATCC 25922) , Pseudomonas a e r u g i n o s a (ATCC
27853) dan P. solanacearum,
sedangkan cendawan uji yang
digunakan adalah Fusarium sp. dan R h i z o c t o n i a s o l a n i .
Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa pertumbuhan miselia terbaik diperoleh pada media PDA dan
MEA, sedangkan berat kering cendawan tertinggi diperoleh
pada media ME.
Aktivitas antibakteri tertinggi terhadap
S. a u r e u s (ATCC 25922) diperoleh pada ekstrak heksan PDA
dan MEA dengan diameter
zona bening yang terbentuk ber-
turut-turut 23.4 dan 23.0 mm.
Penelitian di persemaian menunjukkan bahwa
mampu
meningkatkan kualitas pertumbuhan
inokulasi
tanaman yang
ditunjukkan oleh penambahan tinggi bibit dan kenaikan
berat basah akar sebesar 18.08 dan 20.25%. Peningkatan
pertumbuhan ini didukung oleh meningkatnya serapan fosfat, yang disebabkan oleh peningkatan
aktivitas dan laju
maksimum enzim fosfatase-asam akar sebesar 21.85 dan
27.25%.
Inokulasi juga meningkatkan kandungan P pada
batang yang berumur 36 minggu setelah tanam (mst) sebesar
14.04%. P tersedia tanah yang diinokulasi setelah percobaan meningkat
9.38% dibandingkan dengan P tersedia ta-
nah sebelum percobaan.
Hal ini didukung oleh adanya pe-
ningkatan aktivitas dan laju maksimum enzim fosfataseasam tanah yang diinokulasi sebesar 32.30 dan 65.08%.
Perbaikan pertumbuhan tanaman juga disebabkan oleh
meningkatnya kandungan IAA dan IBA pada akar bermikoriza
sebesar 326.78 dan 505.12% dan dapat didentifikasi senyawa BTP dengan kadar 0.077/ug/g akar, pada akar bermikoriza.
Cendawan S. columnare merupakan simbion yang baik
untuk S. s e l a n i c a bila dilihat dari persentase infeksi
sebesar 84.5 + 4.23% dan peningkatan kandungan kitin pada
akar yang mencapai 261.69%.
Terdapat indikasi adanya perubahan makromolekul akar
akibat inokulasi namun kurang berarti
(P > 0.05) .
Peru-
bahan nyata diperoleh pada peningkatan kadar lemak total
sebesar 27.96% dan
terdapat satu pita polipeptida pem-
beda yang dapat dideteksi yaitu pada
BM
ekstrak proteinnya menunjukkan aktivitas
e
14,400 yang
kitinase.
Terjadi perubahan sifat enzim kitinase akibat inokulasi
pada umur 16 mst
(8 minggu setelah inokulasi, rnsi), se-
dangkan pada umur 36 mst (28 msi) perubahan tidak nyata.
Aktivitas, aktivitas spesifik, laju maksimum dan konstanta Michaelis pada umur 16 mst (8 msi) meningkat berturut-turut 12.72, 6.07, 116.23 dan 37.90%, yang menunjukkan adanya proses penghambatan tidak bersaing.
S . s e l a n i c a dan S . columnare mampu berasosiasi pada
keadaan in vitro yang ditunjukkan pada hasil analisis
anatomis akar oleh terbentuknya jala Hartig dan adanya
selubung miselia .
Pada akar 28 msi, terjadi pemanjangan
sel epidermis secara radial, sedangkan pada akar 16 msi
ha1 tersebut tidak tampak.
Pembentukan senyawa yang bersifat antimikroba yang
diukur oleh aktivitas antibakteri pada ekstrak akar 36
mst (28 msi) baik pada akar kontrol maupun inokulasi menunjukkan adanya aktivitas terhadap P. s o l anacearum.
Sedangkan pada akar yang berumur 24 mst (16 rnsi),
akar
kontrol tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri terbesar diperoleh bila ditambahkan eksudat akar ke daerah rizosfer dengan zona (d) yaitu 11.3
1.3
mm terhadap P. solanacearum. Hasil
xii
+
ini menunjukkan
adanya kemungkinan interaksi antara eksudat akar dan inokulasi cendawan untuk menghasilkan senyawa antimikrobial.
Selain itu terdapat indikasi peranan senyawa flavonoid
pada proses asosiasi ini dan dapat diidentifikasi adanya
senyawa flavanon, flavon, flavonol, malvidin, pelargonidin, dan sianidin.
Metabolit S. columnare
bersifat
antifungal terha-
dap R. s o l a n i dan bersifat antibakterial terhadap P.
solanacearum.
Sifat antifungal ditunjukkan oleh persen-
tase hambatan pertumbuhan miselia dari ekstrak butanol ME:
dan MMN berturut-turut 56.81
+
2.49 dan 53.62
+ 4.13%.
Senyawa antifungal diidentifikasi sebagai salah satu dari
senyawa pelargonidin atau malvidin.
Sifat antibakterial
terbesar diperoleh pada fraksi 3 ekstrak heksan PDA dan
fraksi
turut
3 ekstrak heksan MEA
dengan zona (d) berturut-
8.4 + 0.7 mm dan 13.4
+ 1.7 mm terhadap P. sola-
nacearum.
Sedangkan dari fraksi fen01 aktivitas terbesar
diperoleh pada fraksi 3 dari media MMN dengan zona (d)
12.7
+ 0.1 mm terhadap
P. solanacearum.
Senyawa anti-
bakterial diidentifikasi sebagai salah satu dari senyawa
seskuiterpena dan flavanon. Dari metabolit ekstraseluler
S. columnare yang dibiakkan pada media ME dapat diidenti-
f ikasi adanya senyawa IAA, IBA, dan BTP berturut-turut
0.977, 0.326 dan O.Oll/ug/g ekstrak.
xiii
Sedangkan pada
metabolit ekstraseluler dari media MMN
dapat diidenti-
fikasi adanya IAA dengan kadar 1.0668/rg/g ekstrak.
Ter-
dapat indikasi bahwa S. columnare mampu mensintesis senyawa IAA dari triptofan yang berfungsi sebagai prazat.
xiv
TELAAH BIOKI&UA99I PROSES ASOSIASI
Shorea selanica DAN Sclerodenm coltnirnare
:
SUATU PgM)ZKATAN BIOSINTgSIS
Oleh
:
LATIFAH KOSIM DARUSMAN
Disertasi Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar
Doktor
Pada
Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITCST PERTANIAN BOGOR
J 11di11Disertasi
: TELAAH BIOKIMIAWI PROSES ASOSIASI
Nama Mahasiswa
: LATIFAH KOSIM DARUSMAN
Nomor Pokok
: 91534
Shorea sefanica DAN Scferodenna columnare :
SUATU PENDEKATAN BIOSINTESIS
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
Prof Dr Djoko S. Moeljohmdjo
Ketua
n
-
--
--
Prof Dr Ir H Siti Soetarmi Tjitrosomo
Anggota
Prof Dr I r G. A. Wattimena
Anggota
--
U
_
_
-
Dr Ir Yahya Fakuara Ts.MSc
Anggota
2. Ketua Program studi
%L
------
Prof Dr Reviany Widjajakusuma
.t........
6 ocr
...1995
Tanggal ~ U ~ U:S
-
Prof Dr Muhamad Wirahadikusumah (alm.)
Anggota
RIWAYAT HIDUP
Penulis adalah putri dari 1U. Kosim Usman dengan Zubaidah Daud (almarhumah), dilahirkan pada tanggal 24
Agustus 1953 di Kuningan.
Pada tanggal 3 April 1977
penulis menikah dengan Dudung Darusman dan dikaruniai dua
orang anak yaitu Dani Hanifah Darusman dan Huda Shalahudin Darusman.
Pendidikan Sekolah Dasar, Sekolah Menengah Pertama
dan Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di Kuningan,
dan lulus SMA pada tahun 1972.
Pada tahun 1972 diterima
di Fakultas Pertanian dan pada tahun 1976 memperoleh gelar Sarjana dari Departemen
Pertanian.
Ilrnu-Ilmu Tanah, Fakultas
Pada tahun 1980 memperoleh gelar Magister
Sains dari Program Studi Ilmu-Ilmu Tanah, Fakultas Pascasarjana IPB.
Pada tahun 1983 selama 15 bulan penulis
mengikuti kuliah dan praktikum mata
ajaran Kimia di
Chemistry Department, University of Wisconsin, Madison.
Pada tahun 1991 penulis melanjutkan program Doktor dan
mernilih Program Studi Biologi, Sub Program Biokimia.
Tahun 1977, penulis mulai bekerja di Departemen IPA,
Fakultas Pertanian IPB, yang pada tahun 1983 menjadi Jurusan Kimia FMIPA IPB. Sampai saat ini penulis bekerja
di Laboratorium Kimia Analitik Jurusan Kimia FMIPA IPB.
KATA PENGANTAR
Disertasi yang berjudul lfTelaah Biokimiawi Proses
Asosiasi Shorea sela n i ca Dan S c l erodenna col umnare
:
Sua-
tu Pendekatan Biosintesisll ini, disusun dalam rangka
memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor, Program
Studi Biologi, Sub Program Biokimia. Puji syukur penulis
panjatkan ke hadirat Allah s .w.t, yang atas berkat dan
karuniaNya disertasi ini dapat diselesaikan.
Penulis merasa terdorong untuk mengambil
judul di-
sertasi tersebut di atas mengingat input bioteknologi
seperti cendawan mikoriza diharapkan dapat berfungsi
sebagai alternatif pupuk hayati atau sebagai pengendali
hayati.
Sedangkan digunakannya Shorea s e l a n i c a sebagai
tanaman inang, diharapkan dapat digunakan sebagai model
asosiasi mikoriza dari famili Dipterocarpaceae. Kesulitan
pengadaan bibit famili Dipterocarpaceae akibat kesulitan
penyediaan dan sifat biji, mendorong penulis untuk menggunakan setek pada penelitian ini.
Pertanyaan apakah
tanaman selalu perlu diinokulasi dan apakah manfaat terhadap pertumbuhan selalu diperoleh pada semua sistem asosiasi merupakan ha1 yang menarik bagi penulis untuk menelaahnya. Penulis memilih menelaah aspek biokimiawi dari
xvi
asosiasi kedua organisme tersebut.
Pelaksanaan penelitian dari sejak persiapan, pemantapan metode dan analisis laboratorium, pengolahan data
sampai penulisan dirasakan berjalan lancar berkat
bim-
bingan dan bantuan berbagai pihak. Ucapan terimakasih dan
penghargaan pertama-tama disampaikan kepada Prof Dr Djoko
S. Moeljohardjo, Prof Dr Ir G.A. Wattimena, Prof Dr Ir
Siti Soetarmi Tjitrosomo, Dr Ir Yahya Fakuara Ts. MSc,
dan Prof Dr Muhamad Wirahadikusumah, yang telah memberi
bimbingan yang sangat bermanfaat dalam perencanaan penelitian dan penulisan disertasi ini.
Kepada Rektor Institut Pertanian Bogor, beserta Pimpinan Program Pascasarjana IPB,
Dekan FMIPA IPB dan Ke-
tua Jurusan Kimia FMIPA IPB, penulis menyampaikan ucapan
terimakasih atas kesempatan yang telah diberikan untuk
mengikuti program pendidikan S3 di PPS-IPB. Kepada Direktur Tim Manajemen Program Doktor Depdikbud yang telah
memberikan bantuan dana beasiswa disampaikan ucapan terimakasih .
Ucapan terimakasih tidak lupa disampaikan kepada Ir
Syafii Manan MSc, Dr Ir Supriyanto, Ir Achmad MS, Ir Arum
Wulandari MS,
Ir Omon Moelyana MS, dan Drs Iwan Setiawan
yang telah membantu menyediakan berbagai fasilitas penelitian di Laboratorium Silvikultur BIOTROP, Laboratorium
xvii
Silvikultur Fahutan dan Persemaian di Pusat Penelitian
Pengembangan Hutan Departemen Kehutanan, serta membantu
kelancaran penelitian.
Kepada rekan-rekan staf pengajar
di Laboratorium Kimia Analitik, semua pegawai dan laboran
di Laboratorium Kimia Analitik, Anorganik dan Biokimia
FMIPA IPB, Laboratorium Terpadu UPT IPB, Laboratorium
Silvikultur BIOTROP dan Fahutan, serta berbagai pihak
yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini diucapkan
terimakasih.
Secara khusus, penulis menyampaikan terimakasih
kepada kedua orang tua, suami dan kedua putra kami Dani
dan Huda tercinta, yang dengan sabar dan terus menerus
memberikan dorongan moral, sehingga penulis
dapat
me-
nyelesaikan pendidikan ini dengan tenang dan menyenangkan .
Akhirnya, penulis berharap semoga hasil-hasil penelitian yang dikemukakan dalam disertasi ini dapat dimanfaatkan dan ditelaah lebih lanjut dalam rangka usaha peningkatan pertumbuhan tanaman untuk menunjang pembangunan
pertanian dalam arti luas.
Bogor,
September 1995
Penulis
xviii
DAFTAR IS1
.....................................
RIWAYAT HIDUP ..................................
KATA PENGANTAR .................................
DAFTAR IS1 .....................................
RINGKASAN
DAFTAR
DAFTAR
xv
xvi
xix
...................................
xxi
GAMBAR ..................................
xxiv
TABEL LAMPIRAN .......................... xxvii
GAMBAR LAMPIRAN ......................... xxviii
DAFTAR TABEL
DAFTAR
viii
PENDAHULUAN
.
Latar Belakang
..............................
...........................
Hipotesis ...................................
Kegunaan Penelitian .........................
Tujuan Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Simbiosis dan Simbion
.......................
Metabolit Sekunder Yang Berkaitan
Dengan Proses Simbiosis Mikoriza ............
Perubahan Protein dan Enzim Pada Asosiasi
Mikoriza ....................................
DAFTAR IS1
(Lanjutan)
BAHAM DAN METODE
.................
Bahan dan'~1at ..............................
Metode Penelitian ...........................
Tempat dan Waktu Penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan
......................
...............
Sintesis Mikoriza in vitro ..................
Telaahan Mikroba ............................
Pembahasan Umum .............................
Hasil Percobaan di Persemaian
KESIMPULAN DAN SARAN
...................................
.......................................
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
.................................
DAFTAR TABEL
Keterangan
Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit
Ekstraseluler S. columnare Pada Berbagai
Media ...................................
Analisis Kualitatif Ekstrak Kasar
Metabolit S. col m a r e Yang Mempunyai
Aktivitas Antibakteri ...................
Rataan Pertumbuhan Tanaman Dan Rataan
Hasil Analisis Jaringan S. columnare
(36 mst) ................................
Hasil Analisis Unsur Jaringan Total
.....
Rataan Hasil Analisis Tanah Sebelum Dan
Sesudah Percobaan .......................
Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Laju
Maksimum, Dan
Enzim Fosfatase-asam
Akar S. s e l a n i c a (36 mst) dan Tanah .....
Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Laju
Maksimum, K, Enzim Kitinase Akar
S . s e l a n i c a .............................
Pola Asam Lemak Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) ................................
Pola Karbohidrat Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) ................................
Rataan Hasil Analisis Protein Akar
S . s e l a n i c a (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rataan Hasil Analisis Komposisi Asam
Amino Akar S. s e l a n i c a (36 mst) .........
Rataan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Fraksi Fenol Akar S. s e l a n i c a (36 mst)
13
..
Waktu Retensi Ekstrak Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) Fraksi Fenol A dan Fenol B .....
92
DAFTAR TABEL
(Lanjutan)
Waktu Retensi Senyawaan Indol Dari Ekstrak
Kasar S. s e l a n i c a (36mst) ...............
95
Waktu Retensi Senyawaan Indol Dari Hasil
Kromatografi Lapis Tipis Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) .................................
95
Rataan Persentase Tanaman Hidup dan
Rataan Berat Kering Akar Hasil Sintesis
Mikoriza in vitro ........................
102
Rataan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Fraksi Fenol Akar S. s e l a n i c a (24 mst)
Hasil Sintesis in vitro ..................
105
Waktu Retensi ISkstrak Akar S. s e l a n i c a
(24 mst) Fraksi Fenol B Hasil Sintesis
in
- vitro .................................
108
Persentase Penghambatan Tumbuh Miselia
Pada Berbagai Media ......................
111
Hasil Uji Antagonis Tidak Langsung
S. columnare Terhadap R . s o l a n i dan
Fusarium sp. .............................
112
Hasil Uji Antagonis Tidak Langsung
Fraksi Butanol ME dan MMN Dari
S. columnare .............................
115
Rataan Hasil U j i Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Metabolit Ekstraseluler ..........
116
Rataan Hasil Uji Aktivitas antibakteri
Fraksi Fenol Metabolit Ekstraseluler
S. columnare .............................
117
Rataan Hasil Uji Aktivitas antibakteri
Fraksi MEA dan PDA Metabolit Ekstraseluler
S. columnare ............................. 121
Uji Kualitatif Ekstrak Yang Memiliki
Aktivitas antibakteri ....................
xxii
122
DAFTAR TABEL
(Lanjutan)
26
27
28
29
30
31
32
Serapan W Fraksi Aktif Metabolit
Ekstraseluler S. columnare . . . . . . . . . . . . . . .
123
Serapan Infra Merah Dari Fraksi Aktif
Metabolit Ekstraseluler S. columnare . . . . .
124
Hasil analisis Zat Pengatur Tumbuh
Esktrak Kasar Metabolit Ekstraseluler . . . .
125
Hasil Analisis Zat Pengatur Tumbuh
Ekstrak Kasar Metabolit Ekstraseluler . . . .
127
Hasil Analisis Zat Pengatur Tumbuh Ekstrak
Metabolit Hasil KLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
128
Rataan Kadar Asam Amino Ekstrak Malt
Dan Metabolit Ekstraseluler S. columnare..
130
Rataan Kadar Triptofan Metabolit
Ekstraseluler S. columnare Setelah
Diperkaya Oleh Triptofan . . . . . . . . . . . . . . . . .
132
xxiii
DAFTAR GAMBAR
Nomor
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Keterangan
Skema Kemungkinan Mekanisme Transfer
Karbohidrat Dari Inang Autotropik Ke
Cendawan Pada Sistem Mikoriza ...........
15
Skema Transfer Fosfat Dan Heksosa
Antara Sel Cendawan Dan Sel Inang
.......
17
Skema Hubungan Metabolisme Primer
Dan Sekunder ............................
21
Skema Jalur Biosintesis Utama
Pada Tanaman ............................
23
Skema Pembentukan Isopentinil Pirofosfat
Pada Jalur Asam Mevalonat ...............
24
Skema Keterkaitan Biosintesis
Fitohormon Pada Tanaman .................
26
Skema Pemisahan Skematik Letak Eksudat
Akar Dan Aktivitas Mikroba Di Daerah
Rizosfer ................................
28
Peran Senyawa Eksudat Akar Yang Berberat
Molekul Rendah Dengan Mikroorganisme .....
30
....
62
4.1
Pertumbuhan Perakaran Tanaman Kontrol
4.2
Pertumbuhan Perakaran Tanaman Yang
Diinokulasi ..............................
63
Kurva Lineweaver-Burk Enzim fosfataseAsam Akar (36 mst) .......................
70
Kurva Lineweaver-Burk Enzim FosfataseAsam Tanah (36 mst) ......................
71
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar (16 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
DAFTAR GAMBAR
(Lanjutan)
4.7.
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar Yang Diinokulasi (16 mst dan
36 mst)
.......................
76
.....................
81
4.8
Pola Fosfolipid Akar
4.9
Elektroforesis SDS-PAGE Konsentrasi
gel 15% Pengendapan Amonium Sulfat
......
85
Elektroforesis SDS-PAGE Konsentrasi
Gel 15% Pengendapan Aseton ...............
86
.4.11 Uji Ekstrak Petroleum Eter Akar Terhadap
P . solanacearum ..........................
89
Uji Ekstrak Fenol B Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) Terhadap P. solanacearum ........
93
Pola Anatomis Akar Pada Saat Tanaman
Berumur 4 msi ............................
98
Perkembangan Pola Anatomis Akar
s e l d n i c a Sejalan Dengan Waktu
Inokulasi ................................
99
4.10
4.12
4.13
4.14
S.
4.15
Kolonisasi Akar Oleh Miselia Cendawan
Pada 28 msi .............................. 100
4.16
Keadaan Umum Tanaman Hasil Sintesis
Mikoriza in vitro 24 mst . . . . . . . . . . . . . . . . .
101
4.17
Analisis Anatomis Akar S. s e l a n i c a (24 mst)
Hasil Sintesis Mikoriza in vitro ......... 103
4.18
U j i aktivitas Antibakteri Ekstrak Fenol B
Akar Terhadap P. solanacearum ...........
107
Uji antagonis Langsung Pada Media MMN
S . columnare vs R . s o l a n i ................
113
4.19
DAFTAR GAMBAR
(Lanjutan)
Uji Antagonis Langsung Pada Media MEA
S. columnare vs Fusarium sp. . . . . . . . . . . . . .
113
Uj i Ekstrak Heksan PDA S. columnare vs
S. aureus Dan L. bacillus . . . . . . . . . . . . . . . .
118
Uji Ekstrak Fenol B S. columnare vs
P. solanacearum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
118
U j i Ekstrak Fraksi Heksan PDA vs
P. solanacearum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
120
Uji Fraksi Heksan MEA vs P. solanacearum .
121
Skema Mekanisme Peningkatan Pertumbuhan
Tanaman Akibat Adanya Asosiasi . . . . . . . . . . .
133
Skema Mekanisme Serapan Hara Berdasarkan
Teori Pembawa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
135
Skema Biosintesis IA (Moore, 1979) Dan
(Salisbury dan Ross, 1991). . . . . . . . . . . . . . . .
138
Skema Biosintesis IAA (Davis, 1987) . . . . . .
139
Transformasi Serin Menjadi Triptofan Pada
E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
140
Dugaan Biosintesis IAA Oleh S. columnare..
141
Skema Pendugaan Mekanisme Pengendali
Hayati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
142
xxvi
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
Nomor
1
2
Keterangan
EaIdkmtml
Perbandingan Pertumbuhan Setek Pucuk
Shorea s e l a n i c a ( 36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . .
154
Hasil Analisis Jaringan Shorea
s e l a n i c a (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
155
3
Hasil analisis Tanah Setelah Percobaan
...
156
4
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Enzim
Fosfatase-Asam Akar Shorea s e l a n i c a ......
157
Aktivitas, Laju Maksimum Dan K, Enzim
Fosfatase-Asam Tanah .....................
158
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Kitinase Akar Shorea s e l a n i c a
...
159
...
160
Analisis Komposisi Asam Amino Akar
(36 mst) .................................
161
Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi
Fenol Akar (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
162
5
6
7
8
9
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Kitinase Akar S h o r e a s e l a n i c a
516Enzim
mst)
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
Hal-
Keterangan
......
p-Npp ....................
Glukosamin . . . . . . . . . . . . . . .
Kurva Standar bovin Serum Albumin
163
Kurva Standar
163
Kurva Standar
164
Spektra IR Fraksi aktif (No.3) Ekstrak
Heksan PDA ............................
165
Spektra IR Fraksi Aktif (No.3) Ekstrak
Heksan MEA .............................
166
.....
167
...
168
Pola Anatomi Setek Batang S. s e l a n i c a
(42 ~ t ...............................
)
169
Cendawan S. c o l umnare Bahan
Percobaan ..............................
170
Anakan S. s e l a n i c a (1 tahun) Bahan
Setek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
170
Kromatogram Senyawa Indol Akar 36 mst
Hasil K.L.T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
171
Kromatogram Senyawa Indol Metabolit
Ekstraseluler ..........................
172
Kromatogram Asam Amino Metabolit
Ekstraseluler ..........................
173
Spektra IR Fraksi Aktif Fen01 B ME
Spektra IR Fraksi Aktif Fenol B MMN4
Latar Belakang
Pembangunan pertanian berwawasan lingkungan dan gerakan untuk kembali menggunakan bahan alam hayati telah
mengangkat kembali penelitian dan penggunaan bahan alam
hayati sebagai masukan (input) yang digunakan untuk meningkatkan produksi hasil pertanian.
Penggunaan pupuk
biologis dalam ha1 ini penggunaan cendawan mikoriza merupakan pilihan untuk dikembangkan dan ditelaah.
Mikoriza adalah asosiasi simbiosis antara cendawan
non patogen dengan sel-sel hidup akar suatu tumbuhan.
Asosiasi ini dapat ditelaah melalui aktivitas tumbuhan
sebagai tanaman inangnya atau melalui aktivitas cendawan
mikoriza. Dengan berkembangnya ilmu dan teknologi biokimia yang pesat dewasa ini, dimungkinkan untuk melakukan
penelaahan mengenai aspek molekuler dari berbagai organisme dengan lebih rinci.
Tumbuhan
multiselular yang aktivitas
merupakan organisme
serta mekanisme molekuler-
nya kompleks. Mekanisme sekresi yang berbeda dari manusia
dan hewan, serta kemampuan biosintesisnya menjadikan jaringan tumbuhan sebagai tempat bertumpuknya berbagai
metabolit sekunder. Metabolit tersebut dihasilkan oleh
siklus hidupnya, akibat adanya pengaruh lingkungan yang
dialami tumbuhan, serta akibat adanya kerjasama antar
tumbuhan, tumbuhan dengan hewan dan tumbuhan dengan mik
.
roorganisme.
Sedangkan cendawan secara selular dapat
mempunyai kemiripan dengan hewan atau dengan tumbuhan
(Bilgrami dan Verma, 1978).
Kemampuan parasitisme
dan
simbiosis suatu cendawan dapat dipelajari untuk mendapatkan gambaran rinci mekanisme aktivitas
molekuler dari
tumbuhan tinggi sebagai inangnya.
Semai yang kuat dan
sehat untuk tanaman kehutanan
merupakan salah satu faktor yang akan menjamin keberhasilan tanaman tersebut untuk bertahan tumbuh di lapangan.
Pembangunan Hutan Tanaman Industri, usaha penghijauan
kembali hutan alam bekas tebangan dan tanah-tanah marginal memerlukan semai dalam jumlah yang cukup banyak.
Dipterocarpaceae yang telah terbukti merupakan tumbuhan
yang cocok untuk Indonesia dan
menghasilkan .kayu dengan
berbagai manfaat, antara lain sebagai bahan kayu lapis
dan penggergajian, merupakan pilihan untuk d-itelaahdan
dikembangkan (Yasman dan Smits, 1987) .
Shorea selanica
adalah salah satu spesies dari famili Dipterocarpaceae
yang memiliki pertumbuhan riap diameter tergolong cepat.
Masano et al. (1979) menyatakan bahwa Shorea steroptera,
S. leprosula, S. selanica dan S. mecistopteryx menunjuk-
kan pertumbuhan potensial tertinggi bila ditanam di luar
habitat aslinya, asalkan kondisi tanah dan iklim tidak
berbeda. Kesulitan menyimpan biji dan masa panen yang sering terganggu oleh keadaan lingkungan menyebabkan bibit
yang tersedia tidak dapat memenuhi kebutuhan. Hal ini
mendorong berkembangnya berbagai penelitian baik mengenai
perbanyakan tanaman maupun mengenai perbaikan sifat genetiknya. Pembiakan vegetatif merupakan salah satu pilihan
yang baik karena selain aspek perbanyakan tanaman yang
lebih terjamin ketersediaannya juga dapat memperbanyak
genotipe yang baik dari suatu jenis pohon.
Untuk menda-
patkan semai yang kuat dan sehat usaha memasukkan input
mikroorganisme seperti cendawan mikoriza merupakan suatu
pilihan untuk digunakan.
Peningkatan pertumbuhan
tanaman inang yang terjadi
sebagai akibat adanya mikoriza merupakan
fenomena kimia
dan biokimia yang menarik. Fortin (1990) menyatakan bahwa
pengaruh kimia lebih dominan dibandingkan dengan pengaruh
fisik, bila dikaitkan dengan adanya sekresi metabolit
yang mempunyai aktivitas antifungal. Akan tetagi beberapa
penelitian menunjukkan adanya kemungkinan pengaruh fisik,
yaitu bertambahnya volume dan luas permukaan akar. Selain
itu berbagai penelitian menunjukkan perbaikan pertumbuhan
yang dikaitkan dengan terjadinya perbaikan serapan unsur
hara dan air serta dihasilkannya zat pengatur tumbuh tanaman. Selain itu berbagai penelitian juga menduga bahwa
mikoriza mempunyai efek antagonistik terhadap mikroba patogen dan sinergistik terhadap bakteri bintil akar.
Ke-
mampuan dan manfaat asosiasi cendawan mikoriza tersebut
menarik untuk ditelaah, untuk menjawab berbagai pertanyaan, antara lain apakah sifat-sifat tersebut berlaku
'
pada semua sistem asosiasi, ataukah hanya berlaku pada
sistem asosiasi tertentu.
Diketahuinya mekanisme bioak-
tivitas dari mikoriza diharapkan akan memperkaya pembuktian teoritis terhadap aspek biokimiawi proses asosiasi
yang terjadi dan dapat mengetahui sejauh mana manfaat
cendawan mikoriza tersebut dapat diharapkan. Dari telaah
pustaka dapat dikemukakan bahwa aspek biokimiawi asosiasi
cendawan dan akar tanaman inang dapat didekati melalui
:
(1) adanya perubahan biokimiawi daerah rizosfer yang di-
mungkinkan oleh proses-proses antagonistik dan sinergistik dan proses-proses lain yang bersifat enzimatik, dan
( 2 ) adanya peranan metabolit spesifik yang berperan seba-
gai penciri adanya proses simbiosis, senyawa antimikroba,
fitohomon ataupun senyawa yang berfungsi sebagai pengubahsuaian ("modifiern)terhadap keseimbangan-honnon pada
tanaman inangnya.
Pada penelitian ini digunakan
Shorea s e l a n i c a B1. ,
sebagai tanaman inang sedangkan cendawan mikoriza yang
dipilih adalah S c l e r o d e m a columnare Berk.
&
Br. yang me-
rupakan cendawan yang secara alami berada pada tegakan
famili Dipterocarpaceae.
Model asosiasi ini dipilih
untuk menjelaskan berbagai perubahan biokimiawi yang terjadi pada proses asosiasi, sehingga pemakaian input
dapat digunakan pada saat dan
keadaan yang tepat.
ini
Per-
tanyaan apakah semai selalu h a m s diinokulasi oleh cendawan mikoriza dan apakah manfaat peningkatan pertumbuhan
tanaman selalu akan diperoleh adalah merupakan masalah
terapan yang memerlukan jawaban melalui penelaahan dari
aspek-aspek dasarnya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini mempunyai tujuan sebagai berikut
:
1. Membandingkan tingkat pertumbuhan tanaman tersebut
akibat inokulasi mikosimbion, proporsi hara, dan
aktivitas spesifik serta karakteristik kinetik enzim
fosfatase-asam di daerah rizosfer.
2. Mencari metabolit sekunder hasil proses simbiosis pada
akar bermikoriza.
3. Membandingkan
aktivitas spesifik
dan karakteristik
kinetik enzim fosfatase-asam dan kitinase, pola lipid, karbohidrat serta protein akar bermikoriza dan
tidak bermikoriza.
4. Mempelajari gejala antagonistik
nare Berk.
&
in vitro
:
S. colum-
Br. terhadap mikroba patogen.
Hipotesis
1. Terdapat perubahan
aktivitas
spesifik dan karakter-
istik kinetik enzim kitinase dan fosfatase-asam akibat proses asosiasi.
2. Terjadi perubahan serapan unsur hara (N, P, K, Ca, Mg)
dan peningkatan pertumbuhan tanaman akibat adanya
asosiasi.
3. Terdapat sekresi senyawa dari golongan fenilpropanoid
selama proses tumbuh cendawan dan aktivitas simbiosis.
4. Terdapat gejala antagonistik
in vitro dari cendawan
mikoriza terhadap mikroba patogen.
5. Terdapat sekresi senyawa yang mempunyai aktivitas an-
tifungal/antimikroba sebagai hasil proses asosiasi.
Kegunaan Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai rincian aspek biokimiawi dan mekanisme proses
asosiasi, serta memperoleh metabolit sekunder yang terjadi sebagai akibat adanya mikoriza.
Senyawa 'tersebut
dapat berperan antara lain sebagai zat pengatur tumbuh
atau pengubahsuaian zat pengatur tumbuh dan senyawa antimikroba.
Diperolehnya ha1 tersebut diharapkan dapat memberikan rincian keterkaitan proses biokimia dalam suatu pola
biosintesis tertentu dan dapat membuka jalan untuk penelitian lain yang lebih mendasar dalam bidang genetika
molekuler.
TINJAUAN PUSTAKA
SIMBIOSIS DAN SIMEbION
Simbiosis
Istilah simbiosis pada awalnya digunakan secara terbatas untuk menjelaskan mengenai keadaan "hidup bersaman
antara dua organisme, dalam ha1 ini cendawan dan inangnya, de Barry (1887) (dalam Cooke, 1977). Pengertian simbiosis ini kemudian berkembang, yang pada dasarnya dikaitkan dengan gradasi interaksi antara cendawan dan
inangnya.
Cooke (1977) memberikan arti bahwa simbiosis
mencakup pengertian yang berkenaan dengan seluruh asosiasi yang memungkinkan cendawan bersentuhan dengan inangnya, untuk memperoleh hara makro maupun mikro dengan berbagai cara. Berdasarkan derajat ketergantungan dan
pe-
ngaruh terhadap inangnya, cendawan simbiotik dibagi menjadi 6 kelompok simbion.
lah
: (1)
Kelompok simbion tersebut ada-
fakultatif antagonistik,
(2) obligat antago-
nistik, (3) fakultatif netral, (4) obligat netral, (5)
fakultatif mutualistik, dan
(6) obligat mutualistik.
Asosiasi cendawan mikoriza dengan tumbuhan termasuk ke
dalam kelompok ( 5 ) dan (6).
Mikoriza adalah asosiasi simbiosis antara cendawan
non patogen atau patogenik lemah dengan sel-sel hidup
akar suatu tumbuhan.
Harley dan Smith (1983) menyatakan
bahwa mikoriza adalah suatu asosiasi yang sepenuhnya sim-
biosis dan menghasilkan suatu sifat morfologi yang baru
dan konsisten dalam proses asosiasinya serta mendatangkan
keuntungan untuk kedua organisme tersebut, pernyataan ini
mendukung pembagian dari Cooke (1977).
Pada umumnya mi-
koriza terbentuk bila cendawan melakukan penetrasi terhadap sel akar yang hidup, terutama pada bagian korteks dan
epidermis. Slankis (1963) (dalam Harley dan Smith, 1983)
mengamati bahwa pembentukan mikoriza akan tergantung pada
keadaan fisiologis spesifik akar tumbuhan.
Berbagai pe-
nelitian menunjukkan bahwa zona infeksi mikoriza tidak
bersifat statis tetapi bergerak dengan penyebaran ke arah
puncak (akropetal) yaitu dari ujung akar ke dasar batang.
Proses pergerakan tersebut terjadi bersamaan dengan pertumbuhan akar. Umumnya, hanya akar muda yang 'dapatdiinfeksi oleh cendawan.
Dikenal tiga tipe mikoriza yaitu endomikoriza, ektomikoriza dan ektendomikoriza. Ektomikoriza dapat diamati
secara visual karena akar-akar yang "terinfeksim umumnya
akan membesar atau menggembung.
tidak menjadi lebih besar.
Pada endomikoriza akar
Hawksworth et al. (1983) me-
nyatakan bahwa ektomikoriza dicirikan oleh adanya cendawan di permukaan akar dan membentuk jala Hartig.
Pada
ektomikoriza, hifa cendawan membentuk suatu mantel baik
di luar akar maupun di dalam akar yaitu pada daerah interselular epidermis dan
korteks. Sedangkan penetrasi
intraselular ke dalam sel-sel epidermis dan korteks tidak
terjadi. Jala Hartig umumnya terbentuk di antara sel-sel
tersebut. Cendawan yang mampu membentuk
riza menurut Alexopoulus dan
simbiosis miko-
Mims (1979) adalah
:
(1)
endomikoriza biasanya fungi tingkat rendah, sering termasuk ke dalam ordo Endogonales dari kelas Zygomycetes
dan beberapa termasuk Basidiomycetes seperti R h i z o c t o n i a
dan A r m i l l a r i e l l a m e l l e a dan ( 2) ektomikoriza paling banyak ditemukan pada Basidiomycetes dan beberapa dari Ascomycetes.
Dari Basidiomycotina umumnya berasal dari
ordo Agaricales dan dari kelas Gasteromycetes.
Cruz (1981) menyatakan bahwa keuntungan yang diperoleh dari proses simbiosis tersebut adalah
:
(1) mening-
katkan absorpsi hara mineral, (2) meningkatkan resistensi
tanaman inang terhadap kekeringan,
(3) meningkatkan ke-
tahanan biologis terhadap infeksi akar oleh patogen,
produksi hormon tumbuh tanaman, dan
(4)
(5) interaksi siner-
gistik antara mikoriza dengan organisme lain yang menguntungkan yang terdapat di permukaan akar. Tipe mikoriza
yang terbentuk akan mempengaruhi manfaat tersebut di atas
terhadap tanaman inang. Ektomikoriza secara umum dijumpai
pada pohon-pohon hutan seperti berbagai spesies Pinus,
Eucalyptus, dan Dipterocarpaceae.
Tujuh genus dari Basidiomycetes, yaitu R u s s u l a , Lact a r i u s , Scleroderma, Amanita, B o l e t u s , P a x i l l u s dan Cant h a r e l l u s dapat ditemukan di bawah tegakan hutan Dipterocarpaceae di Filipina
(Pampolina e t a l .
1994) .
Sedangkan Yasman (1993) menyatakan bahwa terdapat 172
spesies fungi ektomikoriza dari 32 genus yang dapat diamati selama 7 tahun pengamatan, yang terdapat pada 2 hektar plot perma- nen Dipterocarpaceae di hutan Kalimantan
Timur. Terdapat 3 spesies dominan yang berasosiasi dengan
Dipterocarpaceae yaitu Amani ta spp., Boletus spp., dan
Russula spp . , sedangkan Sclerodema spp . terdapat di antara genus yang sering dijumpai.
S. columnare dan S.
d i c t y o s p o r u m merupakan cendawan penting untuk digunakan
pada hutan hujan tropis. Berbagai sistem inokulasi telah
dicoba dimodifikasi seperti dalam bentuk kapsul,
dan bubuk spora
larso, 1990
;
tablet
serta suspensi miselia (Fakuara dan WiSupriyanto, 1992) (dalam Supriyanto et
al., 1994).
Simbion ydng digunakan pada penelitian ini adalah
S h o r e a selanica B1. dan S. col umnare Berk
&
Br .
A1
Rasyid et al. (1991) menyatakan bahwa S. selanica adalah
salah satu spesies dari kelompok Meranti Merah yang
termasuk ke dalam famili Dipterocarpaceae yang dapat
hidup pada iklim kering dengan jumlah bulan kering 3-5
bulan/tahun.
Kebutuhan cahaya tanaman muda berkisar dari
50-75% dari cahaya total.
Pada umumnya Dipterocarpaceae
turnbuh baik pada tanah kering bereaksi masam, tanah bersolum tebal dan banyak mengandung liat.
Masano et al.
(1979) menyatakan bahwa untuk memperoleh suplai yang kontinu bagi industri perkayuan diperlukan penanaman famili
Dipterocarpaceae di luar habitat aslinya. Dari percobaan
di Haur Bentes, Bogor, ternyata S. s e l a n i c a merupakan
salah satu dari empat spesies yang menunjukkan potensi
pertumbuhan tertinggi. S . s e l a n i c a pada umur 6 bulan mencapai persentase tanaman hidup sebanyak 97.3% dan tinggi
tanaman mencapai 69 cm.
Rifai (1979) menyatakan bahwa S c l e r o d e r m a adalah
suatu marga (genus) Gasteromycetes yang secara pasti terdapat di kawasan Malesia.
Terdapat sedikitnya 7 S c l e r o -
d e m a spp . yang ternyata berbeda dengan jenis-jenis yang
ada di daerah beriklim sedang.
S . columnare merupakan
salah satu jenis yang dapat ditemukan dengan pertelaan
cirinya, ialah permukaan basidiospora berduri-duri, tubuh
buah jelas bertangkai dan spora berwarna coklat pucat .
Jenis ini berasosiasi dengan pohon-pohon Dipterocarpaceae
di Jawa, Singapura, Semenanjung Malaya dan Srilanka.
Transfer letabolit Antar Simbion
Eksudasi atau kehilangan molekul organik dari sel
akar merupakan proses yang normal.
Senyawa yang hilang
meliputi gula terlarut, asam amino, asam organik dan
senyawa-senyawa lain dalam keragaman yang cukup besar.
Musigel dapat membentuk lapisan sampai ketebalan 50 um di
permukaan akar (Waisel e t al. 1991). Mikroorganisme yang
ada di daerah rizosfer dan sel-sel di permukaan akar akan
selalu siap pada posisi untuk mengabsorpsi hara yang ber-
asal dari eksudat yang dapat larut yang merupakan bagian
dari musigel. Jumlah bahan organik yang dikeluarkan akan
tergantung kepada aktivitas mikroorganisme, keadaan tanah
dan tingkat fisiologi tanaman.
Interaksi inang dan cen-
dawan diduga dapat memproduksi salah satu faktor yang
akan meningkatkan proses eksudasi. Sebagai contoh, Olsen
(1971) (dalam Harley dan Smith, 1983)
menunjukkan bahwa
glikosida triterpena seperti avenasin dan aesin dapat
menghambat pengambilan hara ,'K
M ~ ~ *dan
, fosfat anorga-
nik, dan memperlancar pengeluaran ion-ion lain dari miselia berbagai cendawan, misalnya Ophiobolus graminis.
Terdapat berbagai macam toksin cendawan yang mengubah
permeabilitas plasmalemma inang.
Mekanisme transfer ba-
han secara aktif dimungkinkan karena secara umum permeabilitas membran simbion relatif tidak meningkat.
Akhir-akhir ini enzim ATP-ase yang terikat pada membran telah dipelajari secara sitokimia pada mikoriza
vesikular-arbuskular dan pada asosiasi Erysiphe dengan
inangnya.
ATP-ase mengalami redistribusi selama pemben-
tukan arbuskular, sehingga aktivitasnya terkonsentrasi
pada membran yang bersebelahan dengan arbuscula dewasa.
Plasmalema yang mengelilingi arbuskula muda atau bagian
yang memunculkan cabang-cabang arbuskula tidak menunjukkan aktivitas ATP-ase.
Infeksi akar oleh cendawan miko-
riza juga berhubungan dengan perkembangan enzim fosfatase
alkalin.
Aktivitas enzim tersebut berkaitan sangat erat
13
baik dengan fase perkembangan arbuskular maupun dengan
keberadaan stimulasi pertumbuhan cendawan mikoriza pada
tanaman inang.
Perubahan karbohidrat larut yang ada di dalam sel
tanaman sering berkaitan dengan infeksi cendawan.
runan kandungan pati
terinfeksi atau
yang dapat
Penu-
sering teramati di dalam sel yang
di dalam jala Hartig.
Perubahan utama
terdeteksi adalah meningkatnya konsentrasi
heksosa yang sering berkaitan dengan peningkatan aktivitas enzim invertase dan pengurangan sukrosa. Pada proses
infeksi mikoriza
telah dapat diamati adanya peningkatan
konsentrasi heksosa yang diimbangi oleh penurunan konsentrasi sukrosa, tetapi tidak merupakan fenomena umum pada
sistem mikoriza.
Transpor
fotosintat ke arah lapisan
cendawan ektomikoriza sering dapat dijelaskan oleh adanya
bahan-bahan hormonal yang dilepaskan oleh cendawan yang
bekerja terhadap sel inang. .Pengaruh ini secara teoretis
dimungkinkan, tetapi bukti secara percobaan sulit dilakukan. Kesulitan pembuktian adanya bahan hormonal terutama
disebabkan oleh rendahnya konsentrasi bahan hormonal,
sehingga diperlukan teknik pengukuran yang mempunyai sensitivitas tinggi.
Selain itu pembuktian bahan hormonal
juga harus dilakukan melalui
uji hayati (bioesai).
Skema kemungkinan mekanisme transfer karbohidrat terdapat
pa
r*-+*
Oleh:
LATIFAH KOSIiil DARUSMAK
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITU'I' PERTANLAN BOGOR
1995
SUMMARY
LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
Biochemical Study on the Associ-
ation Process of S h o r e a s e l a n i c a and S c l e r o d e r m a c o l u m -
nare
:
A Biosynthetical Approach; supervised by Djoko S.
Moel johardjo (chairman), G.A. Wattimena, Siti Soetarmi
Tjitrosomo, Yahya Fakuara Ts, and Muhamad Wirahadikusumah .
Mycorrhiza is a
symbiotic, non-pathogenic associa-
tion of a fungus and the roots of a plant. This association could be searched either through the plant activities as a host, or the fungous activities as a mycosymbiont. This dissertation is based on the research mentioned above, which had been conducted from 1992 until
1995. The objectives of the research are
:
(1) to compare
plant growth, nutrient proportion, specific activity and
kinetic characteristics of acid-phosphatase in the rhizot
sphere area as a result of the inoculation of a mycosymbiont; (2) to discover secondary metabolites resulted
from the association process in the mycorrhizal roots;
(3) to compare the specific activity and kinetic charac-
teristics of acid-phosphatase and chitinase, patterns of
lipid, carbohydrate and protein; between the mycorrhizal
and
non-mycorrhizal roots;
(4) to study the
in vitro.
antagonistic
effects of
S. columnare Berk.
&
Br. to
pathogenic microbes. This research covered four experiments: preliminary research, nursery experiment in Darmaga, h vitro mycorrhizal synthesis and
microbial study
experiments in the Laboratory of Chemistry Faculty of
Mathematics and Natural Sciences and in the Laboratory of
Silviculture Faculty of Forestry. The preliminary research was conducted in order to find the suitable growth
medium in terms of microbial growth and extracellular
metabolite production.
The nursery experiment was de-
signed to analyze growth variables, root structures, antimicrobial compounds and plant growth regulators. The
vitro mycorrhiza
synthesis experiment was conducted to
prove the association in the
vitro condition and to
find possible phytoalexin-analog compounds in the mycorrhizal roots. While microbial study experiment were
conducted to test the antagonistic characteristics
of
mycorrhizal fungi, the antibacterial characteristics of
extracellular metabolites, and the ability of the fungi
to produce plant growth regulators.
S. columnare isolates were obtained from the basidi-
ocarps collected from the Dipterocarp Forest at Haur
Bentes Experimental Station, while the S. s e l a n i c a cuttings were prepared from the 1-year-old saplings under
the 40-year-old stand at Darmaga Experimental Station. In
the preliminary research, S. columnare isolates were
grown in Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract Agar
(MEA), Modified Melin-Norkarns (MMN) and Malt Extract
(ME) media.
In the nursery experiment, the soil used as
7
ray from Co nucleus.
There were four treatments in the
in vitro mycorrhizal
a medium was sterilized by the
synthesis experiment: (1) control, (2) inoculated, (3)
root exudate added and (4) inoculated and root exudate
added.
Instead of soil, vermiculite was used as a medi-
um, and the MS liquid medium was prepared for nutrient
source. PDA and MEA media and ME and MMN liquid cultures
were used in the microbial study experiment.
Staphylo-
coccus aureus (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853) and P. solanacearum were used in the bacterial
test,
while Fusarium s p . and Rhizoctonia solani were
used in the fungal test.
The preliminary research showed that both
PDA and
MEA media could produce good mycelial growth, but in
terms of dry weight ME medium produced higher than PDA
medium did.
The highest antibacterial activity against
S. aureus (ATCC 25922)
was found in the hexane extract
of PDA and MEA media, with the clear diameter zone ( d )
formed of 23.4 and 23.0 mrn respectively.
iii
The results of the nursery experiment showed that
inoculation could improve the quality of plant growth
with 18.08% height increment and 20.25% increase of root
weight.
The growth improvement also showed the increase
of phosphate uptake, caused by 21.85% increase of activity and 27.25% maximum rate of root acid- phosphatase.
Inoculation could also increase the content of phosphate
in the stem of plants of 36 week after planting (wap) by
14.04%. While available phosphate in the soil was increased by 9.38% after the experiment was done.
The in-
crease of available P caused by the increase of activity
and maximum rate of soil acid-phosphatase were 32.30 and
65.08%, respectively.
The improvement of growth due to the increase of IAA
and IBA in the mycorrhizal root were 326.76 and 505.12%,
respectively, and BTP identified from the mycorrhizal
root was 0.077/ug/g root.
S. columnare was shown to be a good symbiont for S.
selanica, indicated by the infection rate of 84.5
+
4.2%
and the increase of chitin content of 261.69%.
There were indications of macromolecular change
caused by inoculation, although it was not significant (P
>
0.05). Total lipid content was significantly increased
by 27.96% and one characteristic polypeptide band
could
be
detected in the region of
14,400 molecular weight,
c
while the extract showed chitinase activity.
Inocula-
tion could change the properties of chitinase of the 16
wap (8 weeks after inoculation, wai) root, but the
changes were not significant for the 36 wap (28 wai)
root.
Activity, specific activity, maximum rate and Mi-
chaelies constant at the 16 wap (8 wai) were increased by
12.72, 6.07, 116.23 and 37.90%, respectively; showed the
existence of the uncompetitive inhibition of enzyme.
S. s e l a n i c a and S . columnare could form association
in the in vitro condition, this was shown by the formation of Hartig net and mycelial mantle, through structural analysis.
There were radially elongated epidermis
cells in the root of 28 wai, but these cell could not be
identified in the root of 16 wai.
.
The plant-produced antimicrobial compound, identified by antibacterial activity of the root extracts
showed that
either control or inoculated of 28 wai root
resulted some antibacterial activity against P. s o l a n a -
cearum.
Non mycorrhizal root of 16 wai did not show the
antibacterial activity.
However, it was enhanced by the
addition of root exudate to the rhizosphere area and
reached the highest activity of
formed against P. solanacearum.
11.3 A 1.3 mm zone (d)
This
result showed the
indication of interaction between root exudate and fungal
inoculation in producing the plant antimicrobial cornpounds.
There was also indication of the role of flavo-
noid compounds in
the association process.
Flavanone,
flavone, flavonol, malvidin, pelargonidin and cyanidin
were identified from the root extracts.
S.
columnare metabolites gave an antifungal activity
against R. s o l a n i and antibacterial
solanacearum.
The antifungal
activity against P.
activity shown by the re-
tardation of mycelial growth,for the ME and MMN buthanol.
extracts were 56.81
ly.
f
2.49 and 53.62
+
4.13%, respective-
The antifungal compound was identified as one of
pelargonidin or malvidin group. The strongest antibacterial activity found in the third fraction of PDA and MEA
hexane extracts toward P. s o l a n a c e a r m with zone formed
were 8.4
+ 0.7 and 13.4 +
1.7 mrn
respectively. While
antibacterial activity in the phenol fraction was shown
in the third
fraction from the MMN extract, with zone.
formed was 12.7
+
0.1 mm. The antibacterial compound was
identified as one of sesquiterpene and flavanone group.
IAA,
IBA and BTP could be identified from the extracellu-
lar metabolites of S. columnare grown in ME medium, with
their concentration
of 0.977,
extract, respectively. IAA
0.326
was
and
identified
0.011 ug/g
from the
extracellular metabolite of S. columnare grown in
MMN
medium with a concentration of 1.069 ,ug/g extract. There
is indication that S.columnare could synthesize the IAA
compound from tryptophan which acted as a precursor.
vii
RINGXASAN
LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
Telaah Biokimiawi Proses Asosia-
si S h o r e a sel a n i c a Dan S c l e r o d e r m a c o l u m n a r e : Suatu
Pendekatan Biosintesis; di bawah bimbingan Djoko S. Moeljohardjo sebagai Ketua; G .A. Wattimena, Siti Soetarmi
Tjitrosomo, Yahya Fakuara Ts, dan Muhamad Wirahadikusmah
sebagai anggota.
Mikoriza ialah suatu asosiasi simbiosis antara cendawan non patogen dengan akar tumbuhan.
Asosiasi ini
dapat ditelaah melalui aktivitas tumbuhan sebagai tanaman
inang atau melalui aktivitas cendawan sebagai mikosimbion. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang dilakukan dari tahun 1992 sampai 1995.
yang dilakukan bertujuan
untuk
Penelitian
(1) membandingkan ting-
kat pertumbuhan tanaman tersebut akibat inokulasi mikosimbion, proporsi hara, aktivitas spesifik serta karakteristik kinetik enzim fosfatase-asam di daerah rizosfer;
(2) mencari metabolit sekunder hasil proses asosiasi pada
akar bermikoriza;
(3) membandingkan aktivitas spesifik
dan karakteristik kinetik enzim fosfatase-asam dan kitinase, pola lipid, karbohidrat serta protein akar bermikoriza dan tidak bermikoriza;
tagonistik in vitro
:
S.
(4)
mempelajari gejala an-
columnare Berk.
&
Br.
terhadap
mikroba patogen.
Penelitian ini terdiri atas penelitian pendahuluan,
percobaan di persemaian Darmaga, percobaan sintesis mikoriza in vitro dan percobaan telaahan mikroba, di laboratorium Kimia FMIPA IPB dan laboratorium Silvikultur
Fahutan IPB.
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk
memperoleh media biakan yang baik yang dikaitkan dengan
kemampuali tumbuh mikroba dan produksi metabolit ekstraseluler.
Percobaan di persemaian untuk menelaah peubah
pertumbuhan, analisis anatomis akar, analisis senyawa
antimikroba dan analisis zat pengatur tumbuh.
Percobaan
sintesis mikoriza untuk membuktikan terjadinya asosiasi
dalam situasi in vitro, dan menelaah kemungkinan adanya
senyawa analog fitoaleksin pada akar bermikoriza. Percobaan telaah mikroba dilaksanakan untuk menguji sifat antagonistik cendawan, adanya metabolit ekstraseluler yang
bersifat antibakterial, dan kemampuan cendawan tersebut
untuk memproduksi zat pengatur tumbuh.
Isolat S. columnare berasal dari basidioma cendawan
yang dikoleksi dari tegakan hutan Dipterocarpaceae di
Kebun Percobaan Haur Bentes, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan,
Departemen
Kehutanan.
Setek pucuk
S.selanica B1. diambil dari anakan yang berumur
di sekitar pohon induk yang berumur
+
I tahun
40 tahun yang ber-
lokasi di Kebun Percobaan Darmaga, Puslitbanghut, Departemen Kehutanan. Untuk penelitian pendahuluan isolat
S. columnare dibiakkan pada media PDA, MEA, MMN, dan ME.
Pada percobaan di persemaian digunakan media tanah yang
telah disterilisasi dengan sinar
8 dari inti Co.
Perla-
kuan yang diberikan pada percobaan sintesis mikoriza in
vitro terdiri atas
:
a) kontrol, b) diinokulasi, c) dibu-
buhi eksudat, d) dibubuhi eksudat dan diinokulasi. Media
tanam yang digunakan adalah vermikulit yang dibubuhi media cair Murashige dan Skoog (MS). Pada percobaan telaahan mikroba digunakan media PDA dan MEA dan media cair ME
dan MMN.
Bakteri uji yang digunakan adalah S t a p h y l o c o c -
c u s a u r e u s (ATCC 25922) , Pseudomonas a e r u g i n o s a (ATCC
27853) dan P. solanacearum,
sedangkan cendawan uji yang
digunakan adalah Fusarium sp. dan R h i z o c t o n i a s o l a n i .
Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa pertumbuhan miselia terbaik diperoleh pada media PDA dan
MEA, sedangkan berat kering cendawan tertinggi diperoleh
pada media ME.
Aktivitas antibakteri tertinggi terhadap
S. a u r e u s (ATCC 25922) diperoleh pada ekstrak heksan PDA
dan MEA dengan diameter
zona bening yang terbentuk ber-
turut-turut 23.4 dan 23.0 mm.
Penelitian di persemaian menunjukkan bahwa
mampu
meningkatkan kualitas pertumbuhan
inokulasi
tanaman yang
ditunjukkan oleh penambahan tinggi bibit dan kenaikan
berat basah akar sebesar 18.08 dan 20.25%. Peningkatan
pertumbuhan ini didukung oleh meningkatnya serapan fosfat, yang disebabkan oleh peningkatan
aktivitas dan laju
maksimum enzim fosfatase-asam akar sebesar 21.85 dan
27.25%.
Inokulasi juga meningkatkan kandungan P pada
batang yang berumur 36 minggu setelah tanam (mst) sebesar
14.04%. P tersedia tanah yang diinokulasi setelah percobaan meningkat
9.38% dibandingkan dengan P tersedia ta-
nah sebelum percobaan.
Hal ini didukung oleh adanya pe-
ningkatan aktivitas dan laju maksimum enzim fosfataseasam tanah yang diinokulasi sebesar 32.30 dan 65.08%.
Perbaikan pertumbuhan tanaman juga disebabkan oleh
meningkatnya kandungan IAA dan IBA pada akar bermikoriza
sebesar 326.78 dan 505.12% dan dapat didentifikasi senyawa BTP dengan kadar 0.077/ug/g akar, pada akar bermikoriza.
Cendawan S. columnare merupakan simbion yang baik
untuk S. s e l a n i c a bila dilihat dari persentase infeksi
sebesar 84.5 + 4.23% dan peningkatan kandungan kitin pada
akar yang mencapai 261.69%.
Terdapat indikasi adanya perubahan makromolekul akar
akibat inokulasi namun kurang berarti
(P > 0.05) .
Peru-
bahan nyata diperoleh pada peningkatan kadar lemak total
sebesar 27.96% dan
terdapat satu pita polipeptida pem-
beda yang dapat dideteksi yaitu pada
BM
ekstrak proteinnya menunjukkan aktivitas
e
14,400 yang
kitinase.
Terjadi perubahan sifat enzim kitinase akibat inokulasi
pada umur 16 mst
(8 minggu setelah inokulasi, rnsi), se-
dangkan pada umur 36 mst (28 msi) perubahan tidak nyata.
Aktivitas, aktivitas spesifik, laju maksimum dan konstanta Michaelis pada umur 16 mst (8 msi) meningkat berturut-turut 12.72, 6.07, 116.23 dan 37.90%, yang menunjukkan adanya proses penghambatan tidak bersaing.
S . s e l a n i c a dan S . columnare mampu berasosiasi pada
keadaan in vitro yang ditunjukkan pada hasil analisis
anatomis akar oleh terbentuknya jala Hartig dan adanya
selubung miselia .
Pada akar 28 msi, terjadi pemanjangan
sel epidermis secara radial, sedangkan pada akar 16 msi
ha1 tersebut tidak tampak.
Pembentukan senyawa yang bersifat antimikroba yang
diukur oleh aktivitas antibakteri pada ekstrak akar 36
mst (28 msi) baik pada akar kontrol maupun inokulasi menunjukkan adanya aktivitas terhadap P. s o l anacearum.
Sedangkan pada akar yang berumur 24 mst (16 rnsi),
akar
kontrol tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri terbesar diperoleh bila ditambahkan eksudat akar ke daerah rizosfer dengan zona (d) yaitu 11.3
1.3
mm terhadap P. solanacearum. Hasil
xii
+
ini menunjukkan
adanya kemungkinan interaksi antara eksudat akar dan inokulasi cendawan untuk menghasilkan senyawa antimikrobial.
Selain itu terdapat indikasi peranan senyawa flavonoid
pada proses asosiasi ini dan dapat diidentifikasi adanya
senyawa flavanon, flavon, flavonol, malvidin, pelargonidin, dan sianidin.
Metabolit S. columnare
bersifat
antifungal terha-
dap R. s o l a n i dan bersifat antibakterial terhadap P.
solanacearum.
Sifat antifungal ditunjukkan oleh persen-
tase hambatan pertumbuhan miselia dari ekstrak butanol ME:
dan MMN berturut-turut 56.81
+
2.49 dan 53.62
+ 4.13%.
Senyawa antifungal diidentifikasi sebagai salah satu dari
senyawa pelargonidin atau malvidin.
Sifat antibakterial
terbesar diperoleh pada fraksi 3 ekstrak heksan PDA dan
fraksi
turut
3 ekstrak heksan MEA
dengan zona (d) berturut-
8.4 + 0.7 mm dan 13.4
+ 1.7 mm terhadap P. sola-
nacearum.
Sedangkan dari fraksi fen01 aktivitas terbesar
diperoleh pada fraksi 3 dari media MMN dengan zona (d)
12.7
+ 0.1 mm terhadap
P. solanacearum.
Senyawa anti-
bakterial diidentifikasi sebagai salah satu dari senyawa
seskuiterpena dan flavanon. Dari metabolit ekstraseluler
S. columnare yang dibiakkan pada media ME dapat diidenti-
f ikasi adanya senyawa IAA, IBA, dan BTP berturut-turut
0.977, 0.326 dan O.Oll/ug/g ekstrak.
xiii
Sedangkan pada
metabolit ekstraseluler dari media MMN
dapat diidenti-
fikasi adanya IAA dengan kadar 1.0668/rg/g ekstrak.
Ter-
dapat indikasi bahwa S. columnare mampu mensintesis senyawa IAA dari triptofan yang berfungsi sebagai prazat.
xiv
TELAAH BIOKI&UA99I PROSES ASOSIASI
Shorea selanica DAN Sclerodenm coltnirnare
:
SUATU PgM)ZKATAN BIOSINTgSIS
Oleh
:
LATIFAH KOSIM DARUSMAN
Disertasi Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar
Doktor
Pada
Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITCST PERTANIAN BOGOR
J 11di11Disertasi
: TELAAH BIOKIMIAWI PROSES ASOSIASI
Nama Mahasiswa
: LATIFAH KOSIM DARUSMAN
Nomor Pokok
: 91534
Shorea sefanica DAN Scferodenna columnare :
SUATU PENDEKATAN BIOSINTESIS
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
Prof Dr Djoko S. Moeljohmdjo
Ketua
n
-
--
--
Prof Dr Ir H Siti Soetarmi Tjitrosomo
Anggota
Prof Dr I r G. A. Wattimena
Anggota
--
U
_
_
-
Dr Ir Yahya Fakuara Ts.MSc
Anggota
2. Ketua Program studi
%L
------
Prof Dr Reviany Widjajakusuma
.t........
6 ocr
...1995
Tanggal ~ U ~ U:S
-
Prof Dr Muhamad Wirahadikusumah (alm.)
Anggota
RIWAYAT HIDUP
Penulis adalah putri dari 1U. Kosim Usman dengan Zubaidah Daud (almarhumah), dilahirkan pada tanggal 24
Agustus 1953 di Kuningan.
Pada tanggal 3 April 1977
penulis menikah dengan Dudung Darusman dan dikaruniai dua
orang anak yaitu Dani Hanifah Darusman dan Huda Shalahudin Darusman.
Pendidikan Sekolah Dasar, Sekolah Menengah Pertama
dan Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di Kuningan,
dan lulus SMA pada tahun 1972.
Pada tahun 1972 diterima
di Fakultas Pertanian dan pada tahun 1976 memperoleh gelar Sarjana dari Departemen
Pertanian.
Ilrnu-Ilmu Tanah, Fakultas
Pada tahun 1980 memperoleh gelar Magister
Sains dari Program Studi Ilmu-Ilmu Tanah, Fakultas Pascasarjana IPB.
Pada tahun 1983 selama 15 bulan penulis
mengikuti kuliah dan praktikum mata
ajaran Kimia di
Chemistry Department, University of Wisconsin, Madison.
Pada tahun 1991 penulis melanjutkan program Doktor dan
mernilih Program Studi Biologi, Sub Program Biokimia.
Tahun 1977, penulis mulai bekerja di Departemen IPA,
Fakultas Pertanian IPB, yang pada tahun 1983 menjadi Jurusan Kimia FMIPA IPB. Sampai saat ini penulis bekerja
di Laboratorium Kimia Analitik Jurusan Kimia FMIPA IPB.
KATA PENGANTAR
Disertasi yang berjudul lfTelaah Biokimiawi Proses
Asosiasi Shorea sela n i ca Dan S c l erodenna col umnare
:
Sua-
tu Pendekatan Biosintesisll ini, disusun dalam rangka
memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor, Program
Studi Biologi, Sub Program Biokimia. Puji syukur penulis
panjatkan ke hadirat Allah s .w.t, yang atas berkat dan
karuniaNya disertasi ini dapat diselesaikan.
Penulis merasa terdorong untuk mengambil
judul di-
sertasi tersebut di atas mengingat input bioteknologi
seperti cendawan mikoriza diharapkan dapat berfungsi
sebagai alternatif pupuk hayati atau sebagai pengendali
hayati.
Sedangkan digunakannya Shorea s e l a n i c a sebagai
tanaman inang, diharapkan dapat digunakan sebagai model
asosiasi mikoriza dari famili Dipterocarpaceae. Kesulitan
pengadaan bibit famili Dipterocarpaceae akibat kesulitan
penyediaan dan sifat biji, mendorong penulis untuk menggunakan setek pada penelitian ini.
Pertanyaan apakah
tanaman selalu perlu diinokulasi dan apakah manfaat terhadap pertumbuhan selalu diperoleh pada semua sistem asosiasi merupakan ha1 yang menarik bagi penulis untuk menelaahnya. Penulis memilih menelaah aspek biokimiawi dari
xvi
asosiasi kedua organisme tersebut.
Pelaksanaan penelitian dari sejak persiapan, pemantapan metode dan analisis laboratorium, pengolahan data
sampai penulisan dirasakan berjalan lancar berkat
bim-
bingan dan bantuan berbagai pihak. Ucapan terimakasih dan
penghargaan pertama-tama disampaikan kepada Prof Dr Djoko
S. Moeljohardjo, Prof Dr Ir G.A. Wattimena, Prof Dr Ir
Siti Soetarmi Tjitrosomo, Dr Ir Yahya Fakuara Ts. MSc,
dan Prof Dr Muhamad Wirahadikusumah, yang telah memberi
bimbingan yang sangat bermanfaat dalam perencanaan penelitian dan penulisan disertasi ini.
Kepada Rektor Institut Pertanian Bogor, beserta Pimpinan Program Pascasarjana IPB,
Dekan FMIPA IPB dan Ke-
tua Jurusan Kimia FMIPA IPB, penulis menyampaikan ucapan
terimakasih atas kesempatan yang telah diberikan untuk
mengikuti program pendidikan S3 di PPS-IPB. Kepada Direktur Tim Manajemen Program Doktor Depdikbud yang telah
memberikan bantuan dana beasiswa disampaikan ucapan terimakasih .
Ucapan terimakasih tidak lupa disampaikan kepada Ir
Syafii Manan MSc, Dr Ir Supriyanto, Ir Achmad MS, Ir Arum
Wulandari MS,
Ir Omon Moelyana MS, dan Drs Iwan Setiawan
yang telah membantu menyediakan berbagai fasilitas penelitian di Laboratorium Silvikultur BIOTROP, Laboratorium
xvii
Silvikultur Fahutan dan Persemaian di Pusat Penelitian
Pengembangan Hutan Departemen Kehutanan, serta membantu
kelancaran penelitian.
Kepada rekan-rekan staf pengajar
di Laboratorium Kimia Analitik, semua pegawai dan laboran
di Laboratorium Kimia Analitik, Anorganik dan Biokimia
FMIPA IPB, Laboratorium Terpadu UPT IPB, Laboratorium
Silvikultur BIOTROP dan Fahutan, serta berbagai pihak
yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini diucapkan
terimakasih.
Secara khusus, penulis menyampaikan terimakasih
kepada kedua orang tua, suami dan kedua putra kami Dani
dan Huda tercinta, yang dengan sabar dan terus menerus
memberikan dorongan moral, sehingga penulis
dapat
me-
nyelesaikan pendidikan ini dengan tenang dan menyenangkan .
Akhirnya, penulis berharap semoga hasil-hasil penelitian yang dikemukakan dalam disertasi ini dapat dimanfaatkan dan ditelaah lebih lanjut dalam rangka usaha peningkatan pertumbuhan tanaman untuk menunjang pembangunan
pertanian dalam arti luas.
Bogor,
September 1995
Penulis
xviii
DAFTAR IS1
.....................................
RIWAYAT HIDUP ..................................
KATA PENGANTAR .................................
DAFTAR IS1 .....................................
RINGKASAN
DAFTAR
DAFTAR
xv
xvi
xix
...................................
xxi
GAMBAR ..................................
xxiv
TABEL LAMPIRAN .......................... xxvii
GAMBAR LAMPIRAN ......................... xxviii
DAFTAR TABEL
DAFTAR
viii
PENDAHULUAN
.
Latar Belakang
..............................
...........................
Hipotesis ...................................
Kegunaan Penelitian .........................
Tujuan Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Simbiosis dan Simbion
.......................
Metabolit Sekunder Yang Berkaitan
Dengan Proses Simbiosis Mikoriza ............
Perubahan Protein dan Enzim Pada Asosiasi
Mikoriza ....................................
DAFTAR IS1
(Lanjutan)
BAHAM DAN METODE
.................
Bahan dan'~1at ..............................
Metode Penelitian ...........................
Tempat dan Waktu Penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan
......................
...............
Sintesis Mikoriza in vitro ..................
Telaahan Mikroba ............................
Pembahasan Umum .............................
Hasil Percobaan di Persemaian
KESIMPULAN DAN SARAN
...................................
.......................................
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
.................................
DAFTAR TABEL
Keterangan
Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit
Ekstraseluler S. columnare Pada Berbagai
Media ...................................
Analisis Kualitatif Ekstrak Kasar
Metabolit S. col m a r e Yang Mempunyai
Aktivitas Antibakteri ...................
Rataan Pertumbuhan Tanaman Dan Rataan
Hasil Analisis Jaringan S. columnare
(36 mst) ................................
Hasil Analisis Unsur Jaringan Total
.....
Rataan Hasil Analisis Tanah Sebelum Dan
Sesudah Percobaan .......................
Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Laju
Maksimum, Dan
Enzim Fosfatase-asam
Akar S. s e l a n i c a (36 mst) dan Tanah .....
Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Laju
Maksimum, K, Enzim Kitinase Akar
S . s e l a n i c a .............................
Pola Asam Lemak Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) ................................
Pola Karbohidrat Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) ................................
Rataan Hasil Analisis Protein Akar
S . s e l a n i c a (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rataan Hasil Analisis Komposisi Asam
Amino Akar S. s e l a n i c a (36 mst) .........
Rataan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Fraksi Fenol Akar S. s e l a n i c a (36 mst)
13
..
Waktu Retensi Ekstrak Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) Fraksi Fenol A dan Fenol B .....
92
DAFTAR TABEL
(Lanjutan)
Waktu Retensi Senyawaan Indol Dari Ekstrak
Kasar S. s e l a n i c a (36mst) ...............
95
Waktu Retensi Senyawaan Indol Dari Hasil
Kromatografi Lapis Tipis Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) .................................
95
Rataan Persentase Tanaman Hidup dan
Rataan Berat Kering Akar Hasil Sintesis
Mikoriza in vitro ........................
102
Rataan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Fraksi Fenol Akar S. s e l a n i c a (24 mst)
Hasil Sintesis in vitro ..................
105
Waktu Retensi ISkstrak Akar S. s e l a n i c a
(24 mst) Fraksi Fenol B Hasil Sintesis
in
- vitro .................................
108
Persentase Penghambatan Tumbuh Miselia
Pada Berbagai Media ......................
111
Hasil Uji Antagonis Tidak Langsung
S. columnare Terhadap R . s o l a n i dan
Fusarium sp. .............................
112
Hasil Uji Antagonis Tidak Langsung
Fraksi Butanol ME dan MMN Dari
S. columnare .............................
115
Rataan Hasil U j i Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Metabolit Ekstraseluler ..........
116
Rataan Hasil Uji Aktivitas antibakteri
Fraksi Fenol Metabolit Ekstraseluler
S. columnare .............................
117
Rataan Hasil Uji Aktivitas antibakteri
Fraksi MEA dan PDA Metabolit Ekstraseluler
S. columnare ............................. 121
Uji Kualitatif Ekstrak Yang Memiliki
Aktivitas antibakteri ....................
xxii
122
DAFTAR TABEL
(Lanjutan)
26
27
28
29
30
31
32
Serapan W Fraksi Aktif Metabolit
Ekstraseluler S. columnare . . . . . . . . . . . . . . .
123
Serapan Infra Merah Dari Fraksi Aktif
Metabolit Ekstraseluler S. columnare . . . . .
124
Hasil analisis Zat Pengatur Tumbuh
Esktrak Kasar Metabolit Ekstraseluler . . . .
125
Hasil Analisis Zat Pengatur Tumbuh
Ekstrak Kasar Metabolit Ekstraseluler . . . .
127
Hasil Analisis Zat Pengatur Tumbuh Ekstrak
Metabolit Hasil KLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
128
Rataan Kadar Asam Amino Ekstrak Malt
Dan Metabolit Ekstraseluler S. columnare..
130
Rataan Kadar Triptofan Metabolit
Ekstraseluler S. columnare Setelah
Diperkaya Oleh Triptofan . . . . . . . . . . . . . . . . .
132
xxiii
DAFTAR GAMBAR
Nomor
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Keterangan
Skema Kemungkinan Mekanisme Transfer
Karbohidrat Dari Inang Autotropik Ke
Cendawan Pada Sistem Mikoriza ...........
15
Skema Transfer Fosfat Dan Heksosa
Antara Sel Cendawan Dan Sel Inang
.......
17
Skema Hubungan Metabolisme Primer
Dan Sekunder ............................
21
Skema Jalur Biosintesis Utama
Pada Tanaman ............................
23
Skema Pembentukan Isopentinil Pirofosfat
Pada Jalur Asam Mevalonat ...............
24
Skema Keterkaitan Biosintesis
Fitohormon Pada Tanaman .................
26
Skema Pemisahan Skematik Letak Eksudat
Akar Dan Aktivitas Mikroba Di Daerah
Rizosfer ................................
28
Peran Senyawa Eksudat Akar Yang Berberat
Molekul Rendah Dengan Mikroorganisme .....
30
....
62
4.1
Pertumbuhan Perakaran Tanaman Kontrol
4.2
Pertumbuhan Perakaran Tanaman Yang
Diinokulasi ..............................
63
Kurva Lineweaver-Burk Enzim fosfataseAsam Akar (36 mst) .......................
70
Kurva Lineweaver-Burk Enzim FosfataseAsam Tanah (36 mst) ......................
71
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar (16 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
DAFTAR GAMBAR
(Lanjutan)
4.7.
Kurva Lineweaver-Burk Enzim Kitinase
Akar Yang Diinokulasi (16 mst dan
36 mst)
.......................
76
.....................
81
4.8
Pola Fosfolipid Akar
4.9
Elektroforesis SDS-PAGE Konsentrasi
gel 15% Pengendapan Amonium Sulfat
......
85
Elektroforesis SDS-PAGE Konsentrasi
Gel 15% Pengendapan Aseton ...............
86
.4.11 Uji Ekstrak Petroleum Eter Akar Terhadap
P . solanacearum ..........................
89
Uji Ekstrak Fenol B Akar S. s e l a n i c a
(36 mst) Terhadap P. solanacearum ........
93
Pola Anatomis Akar Pada Saat Tanaman
Berumur 4 msi ............................
98
Perkembangan Pola Anatomis Akar
s e l d n i c a Sejalan Dengan Waktu
Inokulasi ................................
99
4.10
4.12
4.13
4.14
S.
4.15
Kolonisasi Akar Oleh Miselia Cendawan
Pada 28 msi .............................. 100
4.16
Keadaan Umum Tanaman Hasil Sintesis
Mikoriza in vitro 24 mst . . . . . . . . . . . . . . . . .
101
4.17
Analisis Anatomis Akar S. s e l a n i c a (24 mst)
Hasil Sintesis Mikoriza in vitro ......... 103
4.18
U j i aktivitas Antibakteri Ekstrak Fenol B
Akar Terhadap P. solanacearum ...........
107
Uji antagonis Langsung Pada Media MMN
S . columnare vs R . s o l a n i ................
113
4.19
DAFTAR GAMBAR
(Lanjutan)
Uji Antagonis Langsung Pada Media MEA
S. columnare vs Fusarium sp. . . . . . . . . . . . . .
113
Uj i Ekstrak Heksan PDA S. columnare vs
S. aureus Dan L. bacillus . . . . . . . . . . . . . . . .
118
Uji Ekstrak Fenol B S. columnare vs
P. solanacearum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
118
U j i Ekstrak Fraksi Heksan PDA vs
P. solanacearum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
120
Uji Fraksi Heksan MEA vs P. solanacearum .
121
Skema Mekanisme Peningkatan Pertumbuhan
Tanaman Akibat Adanya Asosiasi . . . . . . . . . . .
133
Skema Mekanisme Serapan Hara Berdasarkan
Teori Pembawa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
135
Skema Biosintesis IA (Moore, 1979) Dan
(Salisbury dan Ross, 1991). . . . . . . . . . . . . . . .
138
Skema Biosintesis IAA (Davis, 1987) . . . . . .
139
Transformasi Serin Menjadi Triptofan Pada
E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
140
Dugaan Biosintesis IAA Oleh S. columnare..
141
Skema Pendugaan Mekanisme Pengendali
Hayati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
142
xxvi
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
Nomor
1
2
Keterangan
EaIdkmtml
Perbandingan Pertumbuhan Setek Pucuk
Shorea s e l a n i c a ( 36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . .
154
Hasil Analisis Jaringan Shorea
s e l a n i c a (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
155
3
Hasil analisis Tanah Setelah Percobaan
...
156
4
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Enzim
Fosfatase-Asam Akar Shorea s e l a n i c a ......
157
Aktivitas, Laju Maksimum Dan K, Enzim
Fosfatase-Asam Tanah .....................
158
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Kitinase Akar Shorea s e l a n i c a
...
159
...
160
Analisis Komposisi Asam Amino Akar
(36 mst) .................................
161
Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi
Fenol Akar (36 mst) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
162
5
6
7
8
9
Aktivitas, Laju Maksimum Dan
Kitinase Akar S h o r e a s e l a n i c a
516Enzim
mst)
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
Hal-
Keterangan
......
p-Npp ....................
Glukosamin . . . . . . . . . . . . . . .
Kurva Standar bovin Serum Albumin
163
Kurva Standar
163
Kurva Standar
164
Spektra IR Fraksi aktif (No.3) Ekstrak
Heksan PDA ............................
165
Spektra IR Fraksi Aktif (No.3) Ekstrak
Heksan MEA .............................
166
.....
167
...
168
Pola Anatomi Setek Batang S. s e l a n i c a
(42 ~ t ...............................
)
169
Cendawan S. c o l umnare Bahan
Percobaan ..............................
170
Anakan S. s e l a n i c a (1 tahun) Bahan
Setek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
170
Kromatogram Senyawa Indol Akar 36 mst
Hasil K.L.T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
171
Kromatogram Senyawa Indol Metabolit
Ekstraseluler ..........................
172
Kromatogram Asam Amino Metabolit
Ekstraseluler ..........................
173
Spektra IR Fraksi Aktif Fen01 B ME
Spektra IR Fraksi Aktif Fenol B MMN4
Latar Belakang
Pembangunan pertanian berwawasan lingkungan dan gerakan untuk kembali menggunakan bahan alam hayati telah
mengangkat kembali penelitian dan penggunaan bahan alam
hayati sebagai masukan (input) yang digunakan untuk meningkatkan produksi hasil pertanian.
Penggunaan pupuk
biologis dalam ha1 ini penggunaan cendawan mikoriza merupakan pilihan untuk dikembangkan dan ditelaah.
Mikoriza adalah asosiasi simbiosis antara cendawan
non patogen dengan sel-sel hidup akar suatu tumbuhan.
Asosiasi ini dapat ditelaah melalui aktivitas tumbuhan
sebagai tanaman inangnya atau melalui aktivitas cendawan
mikoriza. Dengan berkembangnya ilmu dan teknologi biokimia yang pesat dewasa ini, dimungkinkan untuk melakukan
penelaahan mengenai aspek molekuler dari berbagai organisme dengan lebih rinci.
Tumbuhan
multiselular yang aktivitas
merupakan organisme
serta mekanisme molekuler-
nya kompleks. Mekanisme sekresi yang berbeda dari manusia
dan hewan, serta kemampuan biosintesisnya menjadikan jaringan tumbuhan sebagai tempat bertumpuknya berbagai
metabolit sekunder. Metabolit tersebut dihasilkan oleh
siklus hidupnya, akibat adanya pengaruh lingkungan yang
dialami tumbuhan, serta akibat adanya kerjasama antar
tumbuhan, tumbuhan dengan hewan dan tumbuhan dengan mik
.
roorganisme.
Sedangkan cendawan secara selular dapat
mempunyai kemiripan dengan hewan atau dengan tumbuhan
(Bilgrami dan Verma, 1978).
Kemampuan parasitisme
dan
simbiosis suatu cendawan dapat dipelajari untuk mendapatkan gambaran rinci mekanisme aktivitas
molekuler dari
tumbuhan tinggi sebagai inangnya.
Semai yang kuat dan
sehat untuk tanaman kehutanan
merupakan salah satu faktor yang akan menjamin keberhasilan tanaman tersebut untuk bertahan tumbuh di lapangan.
Pembangunan Hutan Tanaman Industri, usaha penghijauan
kembali hutan alam bekas tebangan dan tanah-tanah marginal memerlukan semai dalam jumlah yang cukup banyak.
Dipterocarpaceae yang telah terbukti merupakan tumbuhan
yang cocok untuk Indonesia dan
menghasilkan .kayu dengan
berbagai manfaat, antara lain sebagai bahan kayu lapis
dan penggergajian, merupakan pilihan untuk d-itelaahdan
dikembangkan (Yasman dan Smits, 1987) .
Shorea selanica
adalah salah satu spesies dari famili Dipterocarpaceae
yang memiliki pertumbuhan riap diameter tergolong cepat.
Masano et al. (1979) menyatakan bahwa Shorea steroptera,
S. leprosula, S. selanica dan S. mecistopteryx menunjuk-
kan pertumbuhan potensial tertinggi bila ditanam di luar
habitat aslinya, asalkan kondisi tanah dan iklim tidak
berbeda. Kesulitan menyimpan biji dan masa panen yang sering terganggu oleh keadaan lingkungan menyebabkan bibit
yang tersedia tidak dapat memenuhi kebutuhan. Hal ini
mendorong berkembangnya berbagai penelitian baik mengenai
perbanyakan tanaman maupun mengenai perbaikan sifat genetiknya. Pembiakan vegetatif merupakan salah satu pilihan
yang baik karena selain aspek perbanyakan tanaman yang
lebih terjamin ketersediaannya juga dapat memperbanyak
genotipe yang baik dari suatu jenis pohon.
Untuk menda-
patkan semai yang kuat dan sehat usaha memasukkan input
mikroorganisme seperti cendawan mikoriza merupakan suatu
pilihan untuk digunakan.
Peningkatan pertumbuhan
tanaman inang yang terjadi
sebagai akibat adanya mikoriza merupakan
fenomena kimia
dan biokimia yang menarik. Fortin (1990) menyatakan bahwa
pengaruh kimia lebih dominan dibandingkan dengan pengaruh
fisik, bila dikaitkan dengan adanya sekresi metabolit
yang mempunyai aktivitas antifungal. Akan tetagi beberapa
penelitian menunjukkan adanya kemungkinan pengaruh fisik,
yaitu bertambahnya volume dan luas permukaan akar. Selain
itu berbagai penelitian menunjukkan perbaikan pertumbuhan
yang dikaitkan dengan terjadinya perbaikan serapan unsur
hara dan air serta dihasilkannya zat pengatur tumbuh tanaman. Selain itu berbagai penelitian juga menduga bahwa
mikoriza mempunyai efek antagonistik terhadap mikroba patogen dan sinergistik terhadap bakteri bintil akar.
Ke-
mampuan dan manfaat asosiasi cendawan mikoriza tersebut
menarik untuk ditelaah, untuk menjawab berbagai pertanyaan, antara lain apakah sifat-sifat tersebut berlaku
'
pada semua sistem asosiasi, ataukah hanya berlaku pada
sistem asosiasi tertentu.
Diketahuinya mekanisme bioak-
tivitas dari mikoriza diharapkan akan memperkaya pembuktian teoritis terhadap aspek biokimiawi proses asosiasi
yang terjadi dan dapat mengetahui sejauh mana manfaat
cendawan mikoriza tersebut dapat diharapkan. Dari telaah
pustaka dapat dikemukakan bahwa aspek biokimiawi asosiasi
cendawan dan akar tanaman inang dapat didekati melalui
:
(1) adanya perubahan biokimiawi daerah rizosfer yang di-
mungkinkan oleh proses-proses antagonistik dan sinergistik dan proses-proses lain yang bersifat enzimatik, dan
( 2 ) adanya peranan metabolit spesifik yang berperan seba-
gai penciri adanya proses simbiosis, senyawa antimikroba,
fitohomon ataupun senyawa yang berfungsi sebagai pengubahsuaian ("modifiern)terhadap keseimbangan-honnon pada
tanaman inangnya.
Pada penelitian ini digunakan
Shorea s e l a n i c a B1. ,
sebagai tanaman inang sedangkan cendawan mikoriza yang
dipilih adalah S c l e r o d e m a columnare Berk.
&
Br. yang me-
rupakan cendawan yang secara alami berada pada tegakan
famili Dipterocarpaceae.
Model asosiasi ini dipilih
untuk menjelaskan berbagai perubahan biokimiawi yang terjadi pada proses asosiasi, sehingga pemakaian input
dapat digunakan pada saat dan
keadaan yang tepat.
ini
Per-
tanyaan apakah semai selalu h a m s diinokulasi oleh cendawan mikoriza dan apakah manfaat peningkatan pertumbuhan
tanaman selalu akan diperoleh adalah merupakan masalah
terapan yang memerlukan jawaban melalui penelaahan dari
aspek-aspek dasarnya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini mempunyai tujuan sebagai berikut
:
1. Membandingkan tingkat pertumbuhan tanaman tersebut
akibat inokulasi mikosimbion, proporsi hara, dan
aktivitas spesifik serta karakteristik kinetik enzim
fosfatase-asam di daerah rizosfer.
2. Mencari metabolit sekunder hasil proses simbiosis pada
akar bermikoriza.
3. Membandingkan
aktivitas spesifik
dan karakteristik
kinetik enzim fosfatase-asam dan kitinase, pola lipid, karbohidrat serta protein akar bermikoriza dan
tidak bermikoriza.
4. Mempelajari gejala antagonistik
nare Berk.
&
in vitro
:
S. colum-
Br. terhadap mikroba patogen.
Hipotesis
1. Terdapat perubahan
aktivitas
spesifik dan karakter-
istik kinetik enzim kitinase dan fosfatase-asam akibat proses asosiasi.
2. Terjadi perubahan serapan unsur hara (N, P, K, Ca, Mg)
dan peningkatan pertumbuhan tanaman akibat adanya
asosiasi.
3. Terdapat sekresi senyawa dari golongan fenilpropanoid
selama proses tumbuh cendawan dan aktivitas simbiosis.
4. Terdapat gejala antagonistik
in vitro dari cendawan
mikoriza terhadap mikroba patogen.
5. Terdapat sekresi senyawa yang mempunyai aktivitas an-
tifungal/antimikroba sebagai hasil proses asosiasi.
Kegunaan Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai rincian aspek biokimiawi dan mekanisme proses
asosiasi, serta memperoleh metabolit sekunder yang terjadi sebagai akibat adanya mikoriza.
Senyawa 'tersebut
dapat berperan antara lain sebagai zat pengatur tumbuh
atau pengubahsuaian zat pengatur tumbuh dan senyawa antimikroba.
Diperolehnya ha1 tersebut diharapkan dapat memberikan rincian keterkaitan proses biokimia dalam suatu pola
biosintesis tertentu dan dapat membuka jalan untuk penelitian lain yang lebih mendasar dalam bidang genetika
molekuler.
TINJAUAN PUSTAKA
SIMBIOSIS DAN SIMEbION
Simbiosis
Istilah simbiosis pada awalnya digunakan secara terbatas untuk menjelaskan mengenai keadaan "hidup bersaman
antara dua organisme, dalam ha1 ini cendawan dan inangnya, de Barry (1887) (dalam Cooke, 1977). Pengertian simbiosis ini kemudian berkembang, yang pada dasarnya dikaitkan dengan gradasi interaksi antara cendawan dan
inangnya.
Cooke (1977) memberikan arti bahwa simbiosis
mencakup pengertian yang berkenaan dengan seluruh asosiasi yang memungkinkan cendawan bersentuhan dengan inangnya, untuk memperoleh hara makro maupun mikro dengan berbagai cara. Berdasarkan derajat ketergantungan dan
pe-
ngaruh terhadap inangnya, cendawan simbiotik dibagi menjadi 6 kelompok simbion.
lah
: (1)
Kelompok simbion tersebut ada-
fakultatif antagonistik,
(2) obligat antago-
nistik, (3) fakultatif netral, (4) obligat netral, (5)
fakultatif mutualistik, dan
(6) obligat mutualistik.
Asosiasi cendawan mikoriza dengan tumbuhan termasuk ke
dalam kelompok ( 5 ) dan (6).
Mikoriza adalah asosiasi simbiosis antara cendawan
non patogen atau patogenik lemah dengan sel-sel hidup
akar suatu tumbuhan.
Harley dan Smith (1983) menyatakan
bahwa mikoriza adalah suatu asosiasi yang sepenuhnya sim-
biosis dan menghasilkan suatu sifat morfologi yang baru
dan konsisten dalam proses asosiasinya serta mendatangkan
keuntungan untuk kedua organisme tersebut, pernyataan ini
mendukung pembagian dari Cooke (1977).
Pada umumnya mi-
koriza terbentuk bila cendawan melakukan penetrasi terhadap sel akar yang hidup, terutama pada bagian korteks dan
epidermis. Slankis (1963) (dalam Harley dan Smith, 1983)
mengamati bahwa pembentukan mikoriza akan tergantung pada
keadaan fisiologis spesifik akar tumbuhan.
Berbagai pe-
nelitian menunjukkan bahwa zona infeksi mikoriza tidak
bersifat statis tetapi bergerak dengan penyebaran ke arah
puncak (akropetal) yaitu dari ujung akar ke dasar batang.
Proses pergerakan tersebut terjadi bersamaan dengan pertumbuhan akar. Umumnya, hanya akar muda yang 'dapatdiinfeksi oleh cendawan.
Dikenal tiga tipe mikoriza yaitu endomikoriza, ektomikoriza dan ektendomikoriza. Ektomikoriza dapat diamati
secara visual karena akar-akar yang "terinfeksim umumnya
akan membesar atau menggembung.
tidak menjadi lebih besar.
Pada endomikoriza akar
Hawksworth et al. (1983) me-
nyatakan bahwa ektomikoriza dicirikan oleh adanya cendawan di permukaan akar dan membentuk jala Hartig.
Pada
ektomikoriza, hifa cendawan membentuk suatu mantel baik
di luar akar maupun di dalam akar yaitu pada daerah interselular epidermis dan
korteks. Sedangkan penetrasi
intraselular ke dalam sel-sel epidermis dan korteks tidak
terjadi. Jala Hartig umumnya terbentuk di antara sel-sel
tersebut. Cendawan yang mampu membentuk
riza menurut Alexopoulus dan
simbiosis miko-
Mims (1979) adalah
:
(1)
endomikoriza biasanya fungi tingkat rendah, sering termasuk ke dalam ordo Endogonales dari kelas Zygomycetes
dan beberapa termasuk Basidiomycetes seperti R h i z o c t o n i a
dan A r m i l l a r i e l l a m e l l e a dan ( 2) ektomikoriza paling banyak ditemukan pada Basidiomycetes dan beberapa dari Ascomycetes.
Dari Basidiomycotina umumnya berasal dari
ordo Agaricales dan dari kelas Gasteromycetes.
Cruz (1981) menyatakan bahwa keuntungan yang diperoleh dari proses simbiosis tersebut adalah
:
(1) mening-
katkan absorpsi hara mineral, (2) meningkatkan resistensi
tanaman inang terhadap kekeringan,
(3) meningkatkan ke-
tahanan biologis terhadap infeksi akar oleh patogen,
produksi hormon tumbuh tanaman, dan
(4)
(5) interaksi siner-
gistik antara mikoriza dengan organisme lain yang menguntungkan yang terdapat di permukaan akar. Tipe mikoriza
yang terbentuk akan mempengaruhi manfaat tersebut di atas
terhadap tanaman inang. Ektomikoriza secara umum dijumpai
pada pohon-pohon hutan seperti berbagai spesies Pinus,
Eucalyptus, dan Dipterocarpaceae.
Tujuh genus dari Basidiomycetes, yaitu R u s s u l a , Lact a r i u s , Scleroderma, Amanita, B o l e t u s , P a x i l l u s dan Cant h a r e l l u s dapat ditemukan di bawah tegakan hutan Dipterocarpaceae di Filipina
(Pampolina e t a l .
1994) .
Sedangkan Yasman (1993) menyatakan bahwa terdapat 172
spesies fungi ektomikoriza dari 32 genus yang dapat diamati selama 7 tahun pengamatan, yang terdapat pada 2 hektar plot perma- nen Dipterocarpaceae di hutan Kalimantan
Timur. Terdapat 3 spesies dominan yang berasosiasi dengan
Dipterocarpaceae yaitu Amani ta spp., Boletus spp., dan
Russula spp . , sedangkan Sclerodema spp . terdapat di antara genus yang sering dijumpai.
S. columnare dan S.
d i c t y o s p o r u m merupakan cendawan penting untuk digunakan
pada hutan hujan tropis. Berbagai sistem inokulasi telah
dicoba dimodifikasi seperti dalam bentuk kapsul,
dan bubuk spora
larso, 1990
;
tablet
serta suspensi miselia (Fakuara dan WiSupriyanto, 1992) (dalam Supriyanto et
al., 1994).
Simbion ydng digunakan pada penelitian ini adalah
S h o r e a selanica B1. dan S. col umnare Berk
&
Br .
A1
Rasyid et al. (1991) menyatakan bahwa S. selanica adalah
salah satu spesies dari kelompok Meranti Merah yang
termasuk ke dalam famili Dipterocarpaceae yang dapat
hidup pada iklim kering dengan jumlah bulan kering 3-5
bulan/tahun.
Kebutuhan cahaya tanaman muda berkisar dari
50-75% dari cahaya total.
Pada umumnya Dipterocarpaceae
turnbuh baik pada tanah kering bereaksi masam, tanah bersolum tebal dan banyak mengandung liat.
Masano et al.
(1979) menyatakan bahwa untuk memperoleh suplai yang kontinu bagi industri perkayuan diperlukan penanaman famili
Dipterocarpaceae di luar habitat aslinya. Dari percobaan
di Haur Bentes, Bogor, ternyata S. s e l a n i c a merupakan
salah satu dari empat spesies yang menunjukkan potensi
pertumbuhan tertinggi. S . s e l a n i c a pada umur 6 bulan mencapai persentase tanaman hidup sebanyak 97.3% dan tinggi
tanaman mencapai 69 cm.
Rifai (1979) menyatakan bahwa S c l e r o d e r m a adalah
suatu marga (genus) Gasteromycetes yang secara pasti terdapat di kawasan Malesia.
Terdapat sedikitnya 7 S c l e r o -
d e m a spp . yang ternyata berbeda dengan jenis-jenis yang
ada di daerah beriklim sedang.
S . columnare merupakan
salah satu jenis yang dapat ditemukan dengan pertelaan
cirinya, ialah permukaan basidiospora berduri-duri, tubuh
buah jelas bertangkai dan spora berwarna coklat pucat .
Jenis ini berasosiasi dengan pohon-pohon Dipterocarpaceae
di Jawa, Singapura, Semenanjung Malaya dan Srilanka.
Transfer letabolit Antar Simbion
Eksudasi atau kehilangan molekul organik dari sel
akar merupakan proses yang normal.
Senyawa yang hilang
meliputi gula terlarut, asam amino, asam organik dan
senyawa-senyawa lain dalam keragaman yang cukup besar.
Musigel dapat membentuk lapisan sampai ketebalan 50 um di
permukaan akar (Waisel e t al. 1991). Mikroorganisme yang
ada di daerah rizosfer dan sel-sel di permukaan akar akan
selalu siap pada posisi untuk mengabsorpsi hara yang ber-
asal dari eksudat yang dapat larut yang merupakan bagian
dari musigel. Jumlah bahan organik yang dikeluarkan akan
tergantung kepada aktivitas mikroorganisme, keadaan tanah
dan tingkat fisiologi tanaman.
Interaksi inang dan cen-
dawan diduga dapat memproduksi salah satu faktor yang
akan meningkatkan proses eksudasi. Sebagai contoh, Olsen
(1971) (dalam Harley dan Smith, 1983)
menunjukkan bahwa
glikosida triterpena seperti avenasin dan aesin dapat
menghambat pengambilan hara ,'K
M ~ ~ *dan
, fosfat anorga-
nik, dan memperlancar pengeluaran ion-ion lain dari miselia berbagai cendawan, misalnya Ophiobolus graminis.
Terdapat berbagai macam toksin cendawan yang mengubah
permeabilitas plasmalemma inang.
Mekanisme transfer ba-
han secara aktif dimungkinkan karena secara umum permeabilitas membran simbion relatif tidak meningkat.
Akhir-akhir ini enzim ATP-ase yang terikat pada membran telah dipelajari secara sitokimia pada mikoriza
vesikular-arbuskular dan pada asosiasi Erysiphe dengan
inangnya.
ATP-ase mengalami redistribusi selama pemben-
tukan arbuskular, sehingga aktivitasnya terkonsentrasi
pada membran yang bersebelahan dengan arbuscula dewasa.
Plasmalema yang mengelilingi arbuskula muda atau bagian
yang memunculkan cabang-cabang arbuskula tidak menunjukkan aktivitas ATP-ase.
Infeksi akar oleh cendawan miko-
riza juga berhubungan dengan perkembangan enzim fosfatase
alkalin.
Aktivitas enzim tersebut berkaitan sangat erat
13
baik dengan fase perkembangan arbuskular maupun dengan
keberadaan stimulasi pertumbuhan cendawan mikoriza pada
tanaman inang.
Perubahan karbohidrat larut yang ada di dalam sel
tanaman sering berkaitan dengan infeksi cendawan.
runan kandungan pati
terinfeksi atau
yang dapat
Penu-
sering teramati di dalam sel yang
di dalam jala Hartig.
Perubahan utama
terdeteksi adalah meningkatnya konsentrasi
heksosa yang sering berkaitan dengan peningkatan aktivitas enzim invertase dan pengurangan sukrosa. Pada proses
infeksi mikoriza
telah dapat diamati adanya peningkatan
konsentrasi heksosa yang diimbangi oleh penurunan konsentrasi sukrosa, tetapi tidak merupakan fenomena umum pada
sistem mikoriza.
Transpor
fotosintat ke arah lapisan
cendawan ektomikoriza sering dapat dijelaskan oleh adanya
bahan-bahan hormonal yang dilepaskan oleh cendawan yang
bekerja terhadap sel inang. .Pengaruh ini secara teoretis
dimungkinkan, tetapi bukti secara percobaan sulit dilakukan. Kesulitan pembuktian adanya bahan hormonal terutama
disebabkan oleh rendahnya konsentrasi bahan hormonal,
sehingga diperlukan teknik pengukuran yang mempunyai sensitivitas tinggi.
Selain itu pembuktian bahan hormonal
juga harus dilakukan melalui
uji hayati (bioesai).
Skema kemungkinan mekanisme transfer karbohidrat terdapat
pa