Verifikasi Potongan DNA Penyandi Protease Pada Plasmid pMTs1 dengan Hibridisasi Southern
T[T?4
1Y'jy
*
s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh
M A R D I
F 27. 0387
1 9 9 4
FAKULTAS
INSTITUT
TEKNOLOGI
PERTANIAN
B O G O R
PERTANIAN
BOGOR
Mardi .
Protease
Di bawah
Antonius
F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi
pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern.
bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir.
Suwanto .
RINGKASAN
Fragmen-f ragmen
DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escherichia coli DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya
1993) .
(Candra,
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan
dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni.
Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrnophilus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2
%
menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
terklonkan dalam pMTS1.
Potongan DNA tersebut berukuran
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder).
Konsentrasi agarosa yang tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency.
Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS).
Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~
(percobaan I) dan 30°c
(percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS).
Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin.
Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
pelacaknya.
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh
:
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi
pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen
Pembimbing I
i'
Dosen Pembimbing I1
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan
bagian dari
rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk
Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan
untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam
produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari
isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk
memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media
fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut
dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang
dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan
gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli . Kedua penelitian ini dimaksudkan
sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa
genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal
Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian,
kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan
teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitankesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan
informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang
membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk
menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam
rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Penulis
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat
dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan
skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis
sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T. Suhartono, atas
bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi
ini .
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan
kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan,
pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang
telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler
kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir . Budiatman Satiawihardja, yang
telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan
untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs.
Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti,
MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi
serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan
masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung
dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta
teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
Keluarga Eks Kolese Loyola, pihak keluarga serta semua
pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i
..............................
DAFTAR IS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR GAMBAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
UCAPAN TERIMAKASIH
. DAFTAR LAMPIRAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
v
vi
I.
PENDAHULUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
I1 .
TINJAUAN PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A . Gen Protease dari B . stearothermophilus,
B . subtilis dan E. coli . . . . . . . . . . . . . . .
3
B . Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
C . Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa
Inang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
12
E . Hibridisasi Southern . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
...................
14
2 . Hibridisasi Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
.............................
18
...............
21
A . Bahan dan Alat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
B . Metode Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1 . Teori Hibridisasi
3 . Deteksi
111 .
10
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
1. Isolasi DNA Plasmid
2
.
.....
Isolasi DNA Kromosom .
iii
23
24
3 . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi
4. Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . .
5 . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 . Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan
Pelacak
.............................
7 . Pelabelan DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . .
8 . Pemurnian DNA Pelacak
...............
9 . Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :
10 . Deteksi Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV .
HASIL DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA . . . .
B . Isolasi DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
D . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E . Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian
DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F.
Hibridisasi dan Deteksi . . . . . . . . . . . . . . . .
G . Analisis Hasil Pengklonan Gen B . stearo-
thermophilus DSM297 ke dalam E . coli
DH5a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V.
KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Kesimpulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B . Saran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LAMPIRAN
T[T?4
1Y'jy
*
s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh
M A R D I
F 27. 0387
1 9 9 4
FAKULTAS
INSTITUT
TEKNOLOGI
PERTANIAN
B O G O R
PERTANIAN
BOGOR
Mardi .
Protease
Di bawah
Antonius
F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi
pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern.
bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir.
Suwanto .
RINGKASAN
Fragmen-f ragmen
DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escherichia coli DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya
1993) .
(Candra,
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan
dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni.
Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrnophilus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2
%
menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
terklonkan dalam pMTS1.
Potongan DNA tersebut berukuran
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder).
Konsentrasi agarosa yang tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency.
Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS).
Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~
(percobaan I) dan 30°c
(percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS).
Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin.
Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
pelacaknya.
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh
:
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi
pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen
Pembimbing I
i'
Dosen Pembimbing I1
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan
bagian dari
rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk
Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan
untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam
produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari
isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk
memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media
fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut
dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang
dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan
gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli . Kedua penelitian ini dimaksudkan
sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa
genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal
Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian,
kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan
teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitankesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan
informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang
membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk
menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam
rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Penulis
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat
dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan
skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis
sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T. Suhartono, atas
bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi
ini .
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan
kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan,
pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang
telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler
kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir . Budiatman Satiawihardja, yang
telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan
untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs.
Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti,
MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi
serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan
masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung
dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta
teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
Keluarga Eks Kolese Loyola, pihak keluarga serta semua
pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i
..............................
DAFTAR IS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR GAMBAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
UCAPAN TERIMAKASIH
. DAFTAR LAMPIRAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
v
vi
I.
PENDAHULUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
I1 .
TINJAUAN PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A . Gen Protease dari B . stearothermophilus,
B . subtilis dan E. coli . . . . . . . . . . . . . . .
3
B . Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
C . Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa
Inang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
12
E . Hibridisasi Southern . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
...................
14
2 . Hibridisasi Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
.............................
18
...............
21
A . Bahan dan Alat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
B . Metode Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1 . Teori Hibridisasi
3 . Deteksi
111 .
10
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
1. Isolasi DNA Plasmid
2
.
.....
Isolasi DNA Kromosom .
iii
23
24
3 . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi
4. Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . .
5 . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 . Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan
Pelacak
.............................
7 . Pelabelan DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . .
8 . Pemurnian DNA Pelacak
...............
9 . Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :
10 . Deteksi Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV .
HASIL DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA . . . .
B . Isolasi DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
D . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E . Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian
DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F.
Hibridisasi dan Deteksi . . . . . . . . . . . . . . . .
G . Analisis Hasil Pengklonan Gen B . stearo-
thermophilus DSM297 ke dalam E . coli
DH5a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V.
KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Kesimpulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B . Saran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LAMPIRAN
1Y'jy
*
s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh
M A R D I
F 27. 0387
1 9 9 4
FAKULTAS
INSTITUT
TEKNOLOGI
PERTANIAN
B O G O R
PERTANIAN
BOGOR
Mardi .
Protease
Di bawah
Antonius
F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi
pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern.
bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir.
Suwanto .
RINGKASAN
Fragmen-f ragmen
DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escherichia coli DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya
1993) .
(Candra,
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan
dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni.
Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrnophilus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2
%
menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
terklonkan dalam pMTS1.
Potongan DNA tersebut berukuran
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder).
Konsentrasi agarosa yang tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency.
Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS).
Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~
(percobaan I) dan 30°c
(percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS).
Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin.
Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
pelacaknya.
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh
:
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi
pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen
Pembimbing I
i'
Dosen Pembimbing I1
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan
bagian dari
rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk
Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan
untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam
produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari
isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk
memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media
fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut
dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang
dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan
gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli . Kedua penelitian ini dimaksudkan
sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa
genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal
Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian,
kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan
teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitankesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan
informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang
membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk
menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam
rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Penulis
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat
dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan
skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis
sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T. Suhartono, atas
bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi
ini .
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan
kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan,
pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang
telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler
kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir . Budiatman Satiawihardja, yang
telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan
untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs.
Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti,
MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi
serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan
masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung
dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta
teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
Keluarga Eks Kolese Loyola, pihak keluarga serta semua
pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i
..............................
DAFTAR IS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR GAMBAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
UCAPAN TERIMAKASIH
. DAFTAR LAMPIRAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
v
vi
I.
PENDAHULUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
I1 .
TINJAUAN PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A . Gen Protease dari B . stearothermophilus,
B . subtilis dan E. coli . . . . . . . . . . . . . . .
3
B . Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
C . Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa
Inang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
12
E . Hibridisasi Southern . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
...................
14
2 . Hibridisasi Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
.............................
18
...............
21
A . Bahan dan Alat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
B . Metode Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1 . Teori Hibridisasi
3 . Deteksi
111 .
10
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
1. Isolasi DNA Plasmid
2
.
.....
Isolasi DNA Kromosom .
iii
23
24
3 . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi
4. Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . .
5 . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 . Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan
Pelacak
.............................
7 . Pelabelan DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . .
8 . Pemurnian DNA Pelacak
...............
9 . Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :
10 . Deteksi Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV .
HASIL DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA . . . .
B . Isolasi DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
D . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E . Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian
DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F.
Hibridisasi dan Deteksi . . . . . . . . . . . . . . . .
G . Analisis Hasil Pengklonan Gen B . stearo-
thermophilus DSM297 ke dalam E . coli
DH5a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V.
KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Kesimpulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B . Saran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LAMPIRAN
T[T?4
1Y'jy
*
s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh
M A R D I
F 27. 0387
1 9 9 4
FAKULTAS
INSTITUT
TEKNOLOGI
PERTANIAN
B O G O R
PERTANIAN
BOGOR
Mardi .
Protease
Di bawah
Antonius
F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi
pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern.
bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir.
Suwanto .
RINGKASAN
Fragmen-f ragmen
DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escherichia coli DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya
1993) .
(Candra,
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan
dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni.
Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrnophilus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2
%
menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
terklonkan dalam pMTS1.
Potongan DNA tersebut berukuran
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder).
Konsentrasi agarosa yang tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency.
Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS).
Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~
(percobaan I) dan 30°c
(percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS).
Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin.
Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
pelacaknya.
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh
:
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi
pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen
Pembimbing I
i'
Dosen Pembimbing I1
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan
bagian dari
rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk
Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan
untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam
produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari
isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk
memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media
fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut
dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang
dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan
gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli . Kedua penelitian ini dimaksudkan
sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa
genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal
Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian,
kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan
teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitankesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan
informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang
membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk
menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam
rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Penulis
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat
dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan
skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis
sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T. Suhartono, atas
bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi
ini .
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan
kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan,
pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang
telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler
kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir . Budiatman Satiawihardja, yang
telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan
untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs.
Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti,
MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi
serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan
masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung
dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta
teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
Keluarga Eks Kolese Loyola, pihak keluarga serta semua
pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i
..............................
DAFTAR IS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR GAMBAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
UCAPAN TERIMAKASIH
. DAFTAR LAMPIRAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
v
vi
I.
PENDAHULUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
I1 .
TINJAUAN PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A . Gen Protease dari B . stearothermophilus,
B . subtilis dan E. coli . . . . . . . . . . . . . . .
3
B . Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
C . Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa
Inang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
12
E . Hibridisasi Southern . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
...................
14
2 . Hibridisasi Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
.............................
18
...............
21
A . Bahan dan Alat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
B . Metode Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1 . Teori Hibridisasi
3 . Deteksi
111 .
10
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
1. Isolasi DNA Plasmid
2
.
.....
Isolasi DNA Kromosom .
iii
23
24
3 . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi
4. Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . .
5 . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 . Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan
Pelacak
.............................
7 . Pelabelan DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . .
8 . Pemurnian DNA Pelacak
...............
9 . Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :
10 . Deteksi Hibridisasi . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV .
HASIL DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA . . . .
B . Isolasi DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . Elektroforesis Gel Agarosa Mini . . . . . . . .
D . Southern Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E . Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian
DNA Pelacak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F.
Hibridisasi dan Deteksi . . . . . . . . . . . . . . . .
G . Analisis Hasil Pengklonan Gen B . stearo-
thermophilus DSM297 ke dalam E . coli
DH5a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V.
KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A . Kesimpulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B . Saran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
LAMPIRAN