Penapisan Bakteri Probiotik asal Terumbu Karang untuk Pengendalian Vibriosis pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon)

TERUMBU KARANG UNTUK PENGENDALIAN

VIBRIOSIS PADA LARVA UDANG WINDU

(Penaeus monodon)

ADE DWI SASANTI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

i

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Penapisan Bakteri Probiotik Asal Terumbu Karang Untuk Pengendalian Vibriosis Pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon) adalah benar hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada Perguruan Tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2008

Ade Dwi Sasanti C151050041

ii

Pengendalian Vibriosis pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon). Dibimbing oleh WIDANARNI dan SUKENDA.

Vibrio patogen, khususnya Vibrio harveyi berpendar, dapat menyebabkan kematian massal pada budidaya udang windu. Salah satu alternatif untuk menghambat Vibrio harveyi berpendar adalah dengan menggunakan bakteri probiotik yang dapat menekan pertumbuhan Vibrio tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri dari terumbu karang yang potensial menghambat pertumbuhan V. harveyi. Total 110 isolat diisolasi dari Acropora sp, Merulina sp., Hystrix sp., Poecillophora sp., Porites sp. dan Haliophora sp., dan dilakukan penapisan untuk melihat aktivitas kemampuannya melawan V. harveyi MR 5339 RfR dalam uji in vitro dan uji in vivo. Dua isolat (13G1, 13B) diisolasi dari Poecillophora sp. dan dua isolat lainnya (8A, 1C) diisolasi dari Acropora sp., memiliki aktivitas probiotik melawan V. harveyi MR 5339 RfR pada uji in vitro dan in vivo. Isolat 13G1 merupakan isolat yang paling efektif menghambat pertumbuhan V. harveyi MR 5339 RfR dan secara signifikan mengurangi kematian larva pada uji in vivo. Sekuensing sebagian gen 16S-rRNA isolat 13G1 menunjukkan bahwa 13G1 memiliki kemiripan dengan V. alginolyticus.

iii ABSTRACT

ADE DWI SASANTI. Screening of Probiotic Bacteria from Coral Reef for Controlling Vibriosis in Tiger Shrimp Penaeus monodon. Under the direction of WIDANARNI and SUKENDA.

Pathogenic species of Vibrio genus, especially luminous Vibrio harveyi, could cause mass mortality in tiger shrimp culture. One of the technique to work against luminous Vibrioharveyi is, using probiotic bacteria to inhibit the luminous Vibrio growth. This study was carried out to obtain bacteria isolates from coral reef which potentially inhibit V. harveyi MR 5339 RfR growth. A total of 110 isolates were isolated from Acropora sp., Merulina sp., Hystrix sp., Poecillophora sp., Porites sp. and Haliophora sp., and were screened for their antagonistic activity against V. harveyi MR 5339 RfRin in vitro and in vivo test. Two isolates (13G1, 13B) isolated from Poecillophora sp. and two other isolates (8A, 1C) isolated from Acropora sp., have probiotic activity against V. harveyi MR 5339 RfR in in vitro and in vivo test. 13G1 isolate was the most effective isolate in inhibiting growth of V. harveyi MR 5339 RfR and significantly reduced larval mortality in in vivo test. Partial sequencing of 16S-rRNA gen of 13G1 isolate showed that 13G1 similarity to V. alginolyticus.

iv

VIBRIOSIS PADA LARVA UDANG WINDU

(

Penaeus monodon

)

ADE DWI SASANTI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Perairan

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

v

Judul Tesis : Penapisan Bakteri Probiotik asal Terumbu Karang untuk Pengendalian Vibriosis pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon)

Nama : Ade Dwi Sasanti NIM : C151050041

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Widanarni Dr. Sukenda Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Perairan

Prof. Dr. Enang Harris,M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

vi

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Alloh SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Agustus 2006 ini adalah probiotik dengan judul Penapisan Bakteri Probiotik asal Terumbu Karang untuk Pengendalian Vibriosis pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon).

Sebagian dari penelitian ini didanai melalui Proyek Hibah Bersaing Tahun 2007 atas nama Dr. Widanarni dengan judul Bakteri Probiotik dalam Budidaya Udang : Seleksi, Mekanisme Aksi, Karakterisasi dan Aplikasinya sebagai Agen Biokontrol.

Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Widanarni dan Bapak Dr. Sukenda selaku pembimbing, Bapak Dr. Chairul Muluk dan Bapak Dr. Murjani yang telah banyak memberikan masukan dan referensi, Staff di Laboratorium Kesehatan Ikan, Laboratorium Genetika dan Pengembangbiakan Ikan serta Laboratorium Lingkungan yang telah membantu selama proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, ananda Adzkia, ayah, ibu dan seluruh keluarga atas doa, dukungan dan kasih sayangnya serta rekan-rekan mahasiswa AIR 2005 dan adik-adik mahasiswa BDP 39, 40 atas kerja samanya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2008 Ade Dwi Sasanti

vii

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 30 Desember 1976, merupakan anak ke dua dari ayah H. Abu Sairi, dan ibu Enung Hayati. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara.

Tahun 1995 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Serang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Tahun 2000 penulis berhasil menyelesaikan studi S-1 dan mendapatlan gelar Sarjana Perikanan (S.Pi). Mulai tahun 2001 hingga kini penulis bekerja sebagai staf dosen di Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya. Kesempatan untuk melanjutkan studi ke Program Magister diperoleh pada tahun 2005 dengan beasiswa dari Dirjen Dikti (BPPS).

viii

Daftar Gambar ... x

Daftar Lampiran ... xii

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 2

Manfaat Penelitian ... 2

TINJAUAN PUSTAKA ... 3

Vibrio harveyi dan Vibriosis pada Udang ... 3

Udang Windu Penaeus monodon ... 4

Probiotik Akuakultur ... 5

Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik ... 5

Resistensi Antibiotik ... 9

Identifikasi Bakteri dengan Teknik Molekuler ... 9

Terumbu Karang ... 10

BAHAN DAN METODE ... 12

Waktu dan Tempat ... 12

Media, Antibiotik dan Bahan Kimia ... 12

Isolasi Bakteri Probiotik dari Terumbu Karang ... 12

Uji in vitro Bakteri Kandidat Probiotik ... 13

Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik ... 13

Pembuatan Mutan Bakteri Kandidat Probiotik ... 14

Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik ... 14

Identifikasi Bakteri Probiotik Terpilih ... 15

Rancangan Penelitian dan Teknik Analisa ... 17

Parameter yang Diamati ... 17

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 19

Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik ... 19

Uji in vitro Bakteri Kandidat Probiotik ... 20

Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik ... 26

Ciri Fisik Isolat Terpilih ... 27

Mutan Resisten Rifampisin ... 28

Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik ... 29

Identifikasi Bakteri Terpilih ... 46

KESIMPULAN DAN SARAN ... 47

Kesimpulan ... 47

Saran ... 47

DAFTAR PUSTAKA ... 48

ix

DAFTAR TABEL

No. Teks Halaman

x

1. Diagram seleksi bakteri probiotik untuk pemeliharaan larva hewan akuatik (Gomez-Gill dan Roque, 1998) ... 8 2. Terumbu karang yang diisolasi bakterinya ... 19 3. Penampilan V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar (A) dan

SWC-agar (B) ……… 20 4. Penampilan V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar yang

diamati pada kondisi terang (A) dan gelap (B) ... 20 5. Zona hambat yang dihasilkan bakteri kandidat probiotik terhadap V.

harveyi MR5339 RfR ... 21 6. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri kandidat

probiotik pada media SWC-agar + rifampisin 50 µg/ml ... 24 7. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri kandidat

probiotik pada uji in vitro metode kultur bersama ... 25 8. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas ... 26 9. Penampilan isolat 13G1 pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar

(B) ... 27 10. Penampilan isolat 13B pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar

(B)... 27 11. Penampilan isolat 8A pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).. 28 12. Penampilan isolat 1C pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).. 28 13. Perbandingan pertumbuhan bakteri kandidat probiotik resisten

rifampisin dengan tipe liarnya ... 29 14. Kelangsungan hidup larva udang windu yang diberi bakteri kandidat

probiotik tipe liar pada uji in vivo ... 31 15. Kelangsungan hidup larva udang windu yang diberi bakteri kandidat

probiotik tipe mutan pada uji in vivo ... 31 16. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339

RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar... 32

xi

17. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan ... 34 18. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339

RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar...

36

19. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan ...

38

20. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva mati yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar...

40

21. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva mati yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan ...

41

22. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar ... 44 23. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat

probiotik tipe mutan ... 44 24. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat

probiotik tipe liar ... 45 25. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat

probiotik tipe mutan... 45 26. DNA hasil PCR yang akan dipotong (A) dan (B) agarose gel yang

sudah dipotong ... 55 27. DNA hasil gene clean (tanda panah) ... 55

xii

(Thiosulphate Citrate Bile sucrose)-agar ... 54

2. Proses gene clean ... 55

3. Asal dan kode isolat bakteri kandidat probiotik yang digunakan dalam penelitian ini ... 56

4. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas... 57

5. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri kandidat probiotik tipe liar ... 58

6. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri kandidat probiotik tipe mutan ... 59

7. Populasi V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik pada air media pemeliharaan ... 60

8. Populasi V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik pada larva hidup ... 61

9. Populasi V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik pada larva mati ... 62

10. Populasi total bakteri pada air media pemeliharaan ... 63

11. Populasi total bakteri pada larva hidup ... 64

12. Populasi total bakteri pada larva mati ... 65

13. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar ... 66 14. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan ... 67 15. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar ... 68 16. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan ... 69 17. Hasil elektropherogram 63f dari gen 16S-rRNA isolat 13G1 ... 70

Latar Belakang

Vibriosis merupakan salah satu penyakit pada udang yang dapat menyebabkan kematian massal (Karunasagar et al. 1994; Lightner 1996). Vibriosis dapat menyerang udang pada berbagai stadia mulai dari nauplius, zoea, mysis dan post larva di hatchery hingga udang dewasa di tambak pembesaran (Goarant et al. 1998; Saulnier et al. 2000). Penyakit ini disebabkan oleh infeksi bakteri Vibrio berpendar (luminescent Vibrio), yang diidentifikasi sebagai Vibrio harveyi patogen (Abraham & Palaniappan, 2004).

V. harveyi dapat diisolasi dari udang sakit maupun sehat (Lavilla-Pitogo et al. 1990; Vandenberghe et al. 2003), air laut sekitar lokasi budidaya udang (Abraham & Palaniappan, 2004) dan sedimen (Vandenberghe et al. 2003). Berdasarkan hal tersebut V. harveyi merupakan bakteri yang dapat hidup bebas atau berasosiasi dengan organisme laut seperti ikan dan udang. Namun dalam kondisi tertentu yaitu bila populasinya > 104 CFU/ml dapat bersifat patogen bagi udang (Saulnier et al. 2000) sehingga menyebabkan vibriosis.

Salah satu alternatif pencegahan vibriosis adalah dengan menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen di tubuh udang. Gullian et al. (2004) menyatakan bahwa populasi V. harveyi di udang dapat ditekan dengan cara mengintroduksikan bakteri tertentu yang diisolasi dari hepatopankreas udang sehat. Populasi V. harveyi patogen digantikan oleh populasi bakteri lain yang menguntungkan bagi udang (Moriarty 1999). Dalam hal ini bakteri probiotik dapat mensubstitusi keberadaan bakteri patogen melalui competitive exclusion (Fuller 1992; Verschuere et al. 2000) atau dengan memproduksi senyawa antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain (Vijayan et al. 2006; Lategan et al. 2006).

Bakteri yang digunakan sebagai probiotik dapat diisolasi dari air laut (Chytanya et al. 2002), sedimen laut (Muliani 2002) atau invertebrata laut seperti sponge (Suryati et al. 2004). Sumberdaya laut lainnya yang diduga menyimpan potensi sebagai sumber bakteri probiotik adalah terumbu karang. Terumbu karang merupakan suatu ekosistem yang memiliki keragaman mikroorganisme lebih

2

tinggi dibandingkan air laut maupun sedimen laut (Rheinheimer 1991). Terumbu karang juga merupakan habitat asli bagi beberapa jenis udang (Dahuri, 2003). Dengan mengisolasi bakteri asal terumbu karang diharapkan dapat ditemukan bakteri yang mampu menghambat kolonisasi dan pertumbuhan V. harveyi patogen pada larva udang windu.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mendapatkan bakteri asal terumbu karang yang potensial menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen.

2. Mempelajari efektifitas isolat potensial asal terumbu karang dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen pada larva udang windu. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai potensi isolat asal terumbu karang dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen untuk penanggulangan penyakit vibriosis pada larva udang windu.

Vibrio harveyi dan Vibriosis pada Udang

V. harveyi adalah bakteri gram negatif, berluminesen, dapat hidup bebas atau berasosiasi dengan organisme laut seperti ikan dan udang (Aguirre-Guzman et al. 2001). V. harveyi pada umumnya bersifat patogen oportunistik pada infeksi sekunder atau dapat juga bersifat patogen sejati penyebab penyakit (Goarant et al. 1998; Saulnier et al. 2000). Pada sistem budidaya udang, V. harveyi sering ditemukan di hatchery (Sung et al. 1999) dan dapat diisolasi dari air laut yang masuk (Vandenberghe et al. 2003), induk, larva dan air tanki pembesaran larva (Sung et al. 2001). V. harveyi juga dapat diisolasi dari tambak pembesaran udang (Karunasagar et al. 1994; Alapide-Tendencia & Dureza, 1997). Karunasagar et al. (1996) menyatakan bahwa, V. harveyi dapat bertahan di lingkungan hatchery dengan membentuk semacam lapisan biofilm pada berbagai permukaan.

Larva udang yang terserang V. harveyi pada kondisi gelap tampak berpendar, sedangkan udang yang dipelihara di tambak seperti ada cahaya jika tambak ditiup angin. Udang yang terserang V. harveyi sering ditemukan berenang di tepi pematang, dengan tanda-tanda kulit badan rusak dan berwarna gelap atau merah, bagian ekor dan kaki renangnya berwarna merah, insang berwarna coklat, otot atau dagingnya berwarna suram dan ususnya kosong, gerakannya lemah dan menyentak-nyentak (Rukyani 1993; Jiravanichpaisal et al. 1994).

V. harveyi dapat menyebabkan vibriosis dikarenakan sifat patogenisitasnya. Sifat patogenisitas ini berkaitan erat dengan fenomena kemampuan berluminesensi yang dikontrol oleh suatu sistem quorum sensing. Apabila quorum tercapai, maka V. harveyi dapat mengeluarkan faktor-faktor virulensinya (Karunasagar et al. 1994). V. harveyi mengeluarkan suatu senyawa ke dalam medium selama masa pertumbuhan, senyawa ini berfungsi sebagai autoinduser yang akan menginduksi terjadinya luminescens (Manefield et al. 2000).

Berdasarkan Pizutto & Hirst (1995), beberapa strain V. harveyi mampu menghasilkan protein ekstraseluler yang dikenal sebagai toksin T1 dengan berat molekul sekitar 100 kDa. Hal ini diperkuat oleh Harris & Owen (1999) yang

4

menyatakan bahwa beberapa strain V. harveyi menghasilkan semacam protein yang bersifat toksin yang dapat menyebabkan kematian pada tikus dan P. monodon pada dosis 3.1 dan 2.2 µg/g bobot tubuh.

Ciri-ciri morfologi dan fisiologi V. harveyi pada medium Nutrien Agar dengan NaCl 1,5% dan Seawater complete-agar (SWC-agar) adalah : bentuk koloni bulat dengan elevasi cembung, berwarna krem, berdiameter 2-3 mm setelah inkubasi 24 jam pada suhu 280C. Pada medium selektif untuk genus Vibrio, yaitu TCBS-agar (Tiosulfate Citrate Bile Sucrose), koloni V. harveyi berwarna hijau dan berpendar bila diamati di ruang gelap. Demikian pula halnya koloni V. harveyi yang ditumbuhkan di medium Nutrien Agar dengan NaCl 1,5% dan SWC-agar akan berpendar jika diamati di ruang gelap (Lavilla-Pitogo et al. 1990). V. harveyi berupa sel tunggal berbentuk batang pendek, motil, oksidase positif, tidak membentuk gas dari fermentasi terhadap D-glukosa, tidak memproduksi H2S dan memiliki flagela pada salah satu kutub selnya (Baumann et al. 1994).

Udang Windu Penaeus monodon

Morfologi udang windu dicirikan oleh warna karapas dan bagian tubuh bergaris-garis tebal melintang berwarna coklat keabuan, kaki jalan (periopod) dan kaki renang (pleiopod) berwarna coklat dan setae berwarna merah di bagian pinggirnya. Tubuh udang terdiri dari cephalothorax (bagian kepala dan dada) dan bagian abdomen (perut). Bagian cephalothorax diselaputi oleh kulit kitin yang tebal atau karapas. Cephalothorax dan abdomen terdiri dari segmen-segmen atau ruas-ruas yang umumnya berjumlah 20 buah (Martosoedarmo dan Ranoemihardjo 1980).

Selama masa stadia larva, udang windu mengalami beberapa kali perubahan bentuk atau pergantian stadia. Dimulai dengan menetasnya telur menjadi larva dan melalui stadia nauplius yang mempunyai 6 substadia, zoea dan mysis masing-masing 3 substadia. Telur menetas setelah 10-12 jam, nauplius (2 hari), zoea (3-5 hari). Stadia mysis akan berkembang menjadi postlarva dan seterusnya menjadi juvenil dan akhirnya tumbuh menjadi dewasa (Martosoedarmo dan Ranoemihardjo 1980).

Probiotik Akuakultur

Berdasarkan Fuller (1992) probiotik adalah mikrob hidup yang ditambahkan ke dalam pakan yang dapat memberikan pengaruh menguntungkan bagi hewan inang dengan memperbaiki keseimbangan mikrob ususnya. Tetapi bagi hewan-hewan akuatik selain saluran pencernaan, air di sekelilingnya juga memegang peranan penting. Dengan demikian probiotik untuk hewan akuatik adalah agen mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nutrisinya, memperbaiki respon inang terhadap penyakit atau memperbaiki kualitas lingkungannya (Verschuere et al. 2000).

Penggunaan bakteri probiotik sebagai biokontrol terhadap V. harveyi telah banyak dilakukan (Chythanya et al. 2002; Gullian et al. 2004; Vijayan et al. 2006). Bakteri yang digunakan sebagai biokontrol dapat diisolasi dari perairan laut di sekitar tambak atau pembenihan udang (Haryanti et al. 2000; Chytanya et al. 2002), lumpur dan air tambak (Rengpipat et al. 1998), air pemeliharaan larva (Rosa et al. 1997; Li et al. 2006) dan dari larva udang sehat (Rengpipat et al. 2000; Widanarni et al. 2003). Menurut Verschuere et al. (2000) probiotik dapat diaplikasikan di lapangan dengan cara : (1) ditambahkan pada pakan buatan; (2) ditambahkan pada media kultur; (3) perendaman; (4) diberikan melalui pakan hidup.

Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik

Berdasarkan Verschuere et al. (2000) mekanisme kerja probiotik dapat dibagi menjadi beberapa cara yaitu : (1) produksi senyawa inhibitor seperti siderophores, lysozymes, protease, antibiotik; (2) kompetisi terhadap senyawa kimia atau sumber energi seperti besi atau nutrien yang diambil dari inang; (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan; (4) peningkatan respon imun (kekebalan); (5) perbaikan kualitas air dan (6) interaksi dengan fitoplankton.

Vine et al. (2004) menyatakan bahwa probiotik yang bekerja di dalam mukosa usus inang harus mampu bertahan hidup dan berkembangbiak dengan cepat. Dengan demikian probiotik tersebut tidak terbawa keluar bersama sisa metabolisme inang. Meskipun secara in vitro terbukti mampu menekan atau

6

menghambat pertumbuhan bakteri patogen, tetapi bila tidak dapat bertahan hidup dalam mukosa usus kemungkinan besar probiotik yang menghambat pertumbuhan patogen tidak ditemukan pada uji in vivo.

Chytanya et al. (2002) menunjukkan, Pseudomonas I-2 menghasilkan senyawa penghambat berberat molekul rendah, stabil terhadap panas, terlarut dalam klorofom dan resisten enzim proteolitik. Senyawa ini berhasil menghambat pertumbuhan Vibrio patogen. Vine et al. (2004) melaporkan lima kandidat probiotik (AP1 – AP5) yang diisolasi dari ikan badut Amphiprion percula (Lacepede) berhasil melekat dan berkolonisasi pada mukus ikan. Sehingga dapat mengurangi populasi bakteri patogen Aeromonas hydrophila dan Vibrio alginolyticus. Gullian et al. (2004) berhasil mengisolasi tiga isolat potensial probiotik (Vibrio P62, Vibrio P63 dan Bacillus P64) asal udang sehat yang mampu berkolonisasi hingga 83% pada hepatopankreas udang uji.

Gullian et al. (2004), juga menyatakan bahwa bakteri probiotik yang diisolasi dari hepatopankreas udang sehat mampu meningkatkan respon immunitas udang. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Rengpipat et al. (1998) mengenai penggunaan Bacillus S11 pada udang windu (Penaeus monodon). Udang yang mendapat perlakuan Bacilus S11 tingkat kelangsungan hidupnya mencapai 100% saat diinfeksi denganVibrio harveyi sedangkan kontrol hanya 26 %. Hasil serupa juga ditunjukkan oleh Vaseeharan & Ramasamy (2003) yang menyatakan bahwa larva udang windu yang diberi Bacilus subtilis BT23 tingkat kelangsungan hidupnya mencapai 100% saat diinfeksi dengan V. harveyi dibandingkan dengan kontrol positif yang hanya 50% tingkat kelangsungan hidupnya. Bakteri probiotik juga dapat memperbaiki kualitas air. Berdasarkan Li et al. (2006), bakteri Arthrobacter XE-7 memiliki efek antagonis terhadap V. parahaemolyticus, V. anguillarum dan V. nereis. Arthrobacter XE-7 juga mampu mengoksidasi ammonia menjadi nitrit.

Tahapan seleksi bakteri probiotik untuk kegiatan pemeliharaan larva hewan akuatik mencakup beberapa tahap berikut : (1) pengumpulan informasi dasar yang didapat dari studi pustaka maupun di lapangan; (2) pengumpulan probiotik potensial meliputi kelangsungan hidup bakteri probiotik dan kemampuan bersaing dengan galur patogen; (3) evaluasi kemampuan probiotik

potensial berkompetisi dengan galur patogen meliputi kemampuan hidup probiotik pada inang atau lingkungannya, kemampuan melekat pada permukaan tubuh inang, kemampuan membentuk koloni dan mencegah perkembangan bakteri patogen baik dengan memproduksi senyawa inhibitor maupun berkompetisi tempat perlekatan dan nutrien; (4) pendugaan patogenisitas probiotik potensial yang meliputi probiotik tidak boleh patogen pada inang; (5) evaluasi pengaruh probiotik potensial pada larva dengan hasil terbaik yang dilihat dari nilai kelangsungan hidup tertinggi, penambahan bobot terbesar, peningkatan daya tahan tubuh inang terhadap stress dan serangan patogen terendah; dan (6) analisis ekonomi biaya laba (Gomez-Gill dan Roque, 1998). Diagram seleksi bakteri probiotik disajikan pada Gambar 1.

Evaluasi kemampuan probiotik potensial berkompetisi dengan galur patogen dapat dilakukan melalui tes antagonis secara in vitro. Uji in vitro dapat berupa uji tantang antara bakteri kandidat probiotik dengan bakteri patogen dalam media cair maupun padat. Pada media padat dapat berupa disk difussion method untuk melihat kemampuan kandidat probiotik dalam menghasilkan senyawa antibakterial. Zona bening yang dihasilkan menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu mensekresikan suatu senyawa antimikrob (Chytanya et al. 2002). Menurut Verschuere et al. (2000), uji in vitro pada media cair dapat dilakukan dengan metode kultur bersama. Melalui metode ini dapat diuji kemampuan kandidat probiotik bersaing dengan bakteri patogen dalam memanfaatkan nutrien yang sama. Kompetisi terhadap bahan kimia atau sumber energi yang sama dapat menunjukkan bagaimana populasi mikrob yang berbeda dapat hidup dalam relung yang sama.

8

Gambar 1. Diagram seleksi bakteri probiotik untuk pemeliharaan larva hewan akuatik (Gomez-Gill dan Roque, 1998)

Praktek di hatchery

Literatur Seleksi awal Penelaahan

literatur

Probiont potensial

Penapisan dari strain yang sama

Uji kemampuan menghambat patogen pada media padat/cair

Uji patogenisitas

Efek di laboratorium

Pertumbuhan dalam media cair

Analisa ekonomi

Karakterisasi dan identifikasi Probiont bernilai

ekonomis Bakteri probiotik yang

telah teruji

Kesimpulan pengaruh yang ada

Efek di hatchery

Tolak

Hasil positif Hasil negatif Tidak ada pengaruh

Resistensi Antibiotik

Menurut Chytanya et al. (1999) beberapa organisme secara alami resisten terhadap beberapa antibiotik. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain karena (1) organisme tersebut tidak memiliki dinding sel sehingga menjadi resisten terhadap antibiotik yang bekerja dengan cara merusak dinding sel, (2) organisme mungkin tidak permeabel terhadap beberapa jenis antibiotik, (3) mikroorganisme mempunyai kemampuan untuk menginaktifkan komponen-komponen dalam antibiotik, (4) mikroorganisme memiliki sistem metabolisme yang dapat memblokir antibiotik tertentu sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut, (5) mikroorganisme memiliki kemampuan untuk memompa antibiotik tertentu keluar dari dinding sel sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut.

Penanda resisten terhadap antibiotik digunakan untuk membedakan antara bakteri kandidat probiotik dengan bakteri alami yang telah ada pada tubuh udang. Pada umumnya kelompok Vibrio bersifat sensitif terhadap antibiotik rifampisin (Tendencia & de la Pena 2001). Dengan penanda molekuler tersebut, bakteri kandidat probiotik dapat dibedakan dengan bakteri alami yang sebelumnya telah ada pada tubuh udang, sehingga penghambatan V. harveyi dapat diamati.

Identifikasi Bakteri dengan Teknik Molekuler

Identifikasi bakteri dapat dilakukan menggunakan analisis fenotipik dengan mempelajari sifat fisiologis atau biokimianya (Hadioetomo 1993) maupun analisis genotipik secara molekuler. Seringkali hasil uji biokimia atau fisiologi tersebut berbeda karena perbedaan ekspresi gen. Untuk karakterisasi galur-galur dalam satu spesies perlu dilihat sifat yang paling mendasar dan relatif stabil yaitu dengan analisis genotipik (Singleton, 1995).

Sudeesh et al. (2002) menggunakan 16S-rRNA sebagai gen target untuk menganalisa keragaman genom di antara V. parahaemolyticus dan V. alginolyticus yang diisolasi dari tambak udang, sedangkan Schulze et al. (2006) menggunakan 16S-rRNA untuk identifikasi keragaman bakteri di lingkungan hatchery. Digunakannya 16S-rRNA sebagai gen target karena (1) bersifat universal : protein synthesis machinery; (2) sekuen basa-basanya bersifat konservatif; (3) jumlahnya melimpah dalam sel; (4) memenuhi ukuran untuk perhitungan secara statistika (tidak terlalu panjang dan terlalu pendek); (5) ketersediaan informasi (data

10

bank/database di GenBank) (Madigan et al. 1997). Proses amplifikasi 16S-rRNA dapat dilakukan melalui teknik PCR.

Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik biologi molekuler untuk memperbanyak sekuen DNA tertentu (lebih dari 100 juta kopian) dalam waktu hanya beberapa jam, oleh karena itu teknik ini disebut pula amplifikasi DNA. Dengan PCR, molekul DNA dapat diperbanyak sampai jutaan kopi dalam tabung reaksi. Teknik ini terdiri dari beberapa siklus yang setiap siklusnya terdiri atas 3 tahap yaitu tahap denaturasi, pelekatan primer (primer anealling) dan pemanjangan (elongasi) (Griffin and Griffin, 1993).

Berdasarkan Marchesi et al. (1998) tersedia beberapa primer yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S-rRNA. Diantaranya adalah 27f dan 149r. Namun kedua primer tersebut belum dapat mengamplifikasi sampel bakteri yang berasal dari beragam sumber seperti sedimen laut dalam, bakteri rongga mulut, dan bakteri yang diisolasi deri epilithon (bakteri yang berasosiasi dengan batu pada habitat air mengalir). Selain itu ada pula primer 63f dan 1387r yang telah diuji coba berhasil mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari berbagai sumber diantaranya sedimen laut dalam.

Terumbu Karang

Ekosistem terumbu karang atau coral reefs adalah suatu sistem habitat kehidupan biota laut yang hangat, jernih, tidak dalam dan kaya dengan keanekaragaman hayati. Daerah habitat karang memiliki produktivitas dan keanekaragaman jenis fauna yang tinggi. Ekosistem terumbu karang juga merupakan tempat hidup, mencari makan (feeding ground), daerah asuhan (nursery ground), pelindung (shelter) dan tempat memijah (spawning ground) untuk berbagai organisme laut (Murdiyanto, 2003). Terumbu karang juga merupakan habitat asli bagi beberapa jenis udang dan ikan (Dahuri, 2003).

Organisme yang hidup di terumbu karang tidak hanya makroorganisme, tetapi juga mikroorganisme. Terumbu karang merupakan suatu ekosistem yang memiliki keragaman mikroorganisme lebih tinggi dibandingkan air laut maupun sedimen laut. Hal ini disebabkan permukaan karang dilapisi oleh semacam mukosa yang mengandung polisakarida. Mukosa ini merupakan media yang ideal

bagi pertumbuhan bakteri sehingga tercipta lapisan komunitas bakteri pada permukaan karang (Rheinheimer, 1991).

Individu karang pada dasarnya adalah hewan yang hidup di laut. Hewan-hewan ini dapat berasosiasi dengan tanaman maupun Hewan-hewan laut lainnya. Termasuk dalam kelompok hewan karang adalah hewan dari filum Porifera dan filum Coelenterata (Sugiri, 2000). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa hewan karang juga memiliki bahan aktif anti bakteri. Proksch (2000) menyatakan sponge dari jenis Oceanapia sp. dan Aplysina aerophoba mampu menghasilkan senyawa antimikrob. Sutedja et al. (2000) melaporkan bahwa sponge jenis Petrosia contignata mampu menghasilkan senyawa antimikroba yang mampu menghambat Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Escherichia coli. Radjasa et al. (2004) berhasil mengisolasi senyawa antimikrob dari Acropora sp. yang dapat menghambat V. harveyi. Suryati et al. (2004) menyatakan ada tiga spesies sponge yang aktif menghambat pertumbuhan bakteri yaitu Halichondria sp., Auletta sp., dan Callyspongia pseudoreticulata yang mengandung bahan aktif sterol, steroid dan asam fenolat.

Mikroorganisme yang hidup berasosiasi dengan hewan karang, juga dapat menghasilkan bahan aktif anti bakteri. Berdasarkan Webster et al. (2001) diketahui bahwa bakteri yang berasosiasi dengan sponge menghasilkan komponen bahan aktif anti bakteri. Lee et al. (2001) menyatakan bahwa Micrococcus sp. yang hidup pada sponge jenis Tedania ignis menghasilkan komponen diketopiperazin, sedangkan Vibrio sp. pada hewan karang jenis Dysidea memproduksi bifenil eter bromina dan Vibrio sp. yang berasosiasi dengan Hyatella sp. menghasilkan komponen bioaktif berupa peptida anti Bacillus.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian berlangsung dari bulan Agustus 2006 sampai dengan Juli 2007. Sampel terumbu karang berasal dari perairan di sekitar Pulau Jukung, Kepulauan Seribu. Isolasi bakteri, uji in vitro dan uji in vivo dilaksanakan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Tahap sekuensing untuk identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Bioteknologi PUSPIPTEK Serpong.

Media, Antibiotik dan Bahan Kimia

Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri adalah SWC-agar (Sea Water Complete agar) (Lampiran 1). Selain itu digunakan juga media selektif TCBS-agar (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar) untuk menumbuhkan Vibrio sp. (Lampiran 1).

Antibiotik yang digunakan adalah Rifampisin. Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi DNA terdiri dari : 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0 dan 1 mM EDTA pH 8.0), lysozyme 50 mg/ml (50 mg lysozyme, 30 µl NaCl 5M, 200 µl EDTA 0.5 M, 770 µl ddH2O), 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 10 mg/ml Proteinase-K, 5 M NaCl, 10% CTAB/NaCl, phenol:chloroform: isoamylalcohol (25:24:1,v/v), chloroform:isoamylalcohol (24:1, v/v), isopropanol absolute, 70% ethanol dan aquabidest steril. Proses elektroforesis menggunakan bahan kimia sebagai berikut : 1% agarose, 1X TBE buffer dan loading dye (0.25% Bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol, 50% glycerol, 6 mM EDTA pH 8).

Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan bahan-bahan sebagai berikut : aquabidest steril 15.1 µl, primer 63f 1 µl, primer 1387r µl, dNTP 2.5 µl, Taq DNA polymerase 0.4 µl, polymerase buffer 2.5 µl, MgCl2 2.0 µl dan template DNA 0.5 µl. Untuk gene clean digunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit Geneaid.

Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik dari Terumbu Karang

Sampel terumbu karang dikemas dalam kantong plastik steril yang telah diberi air laut dan oksigen. Kantong plastik disusun di dalam wadah stereofoam dan diberi potongan es disekitarnya. Sebelum diisolasi bakterinya, sampel

ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dibilas dengan air laut steril sebanyak 1-2 kali untuk mencegah kontaminan. Sampel selanjutnya dihaluskan dan disebar sebanyak 100 µl pada media Sea Water Complete agar (SWC-agar) lalu diinkubasi pada suhu ruang (28-310C) selama 24 jam. Koloni yang tumbuh kemudian digunakan dalam uji in vitro.

Uji in vitroBakteri Kandidat Probiotik a. Metode Zona Hambat

Isolat V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki tingkat kekeruhan yang sama dengan konsentrasi biakan dalam suspensi sekitar 109 sel/ml. Selanjutnya V. harveyi MR5339 RfR disebar pada media SWC-agar sebanyak 50µl. Kertas cakram (Whatman antibiotic assay paper) berdiameter 6 mm ditetesi suspensi bakteri kandidat probiotik sebanyak 10 µl, kemudian ditaruh di atas media SWC-agar yang telah diberi V. harveyi MR5339 RfR. Sebagai kontrol digunakan larutan garam fisiologis. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang, diameter zona bening yang dihasilkan diukur menggunakan penggaris pada 3 posisi dari setiap kertas cakram, kemudian dirata-ratakan.

b. Metode Kultur Bersama

Isolat-isolat yang tidak menghasilkan zona hambat diuji kemampuannya melawan V. harveyi MR5339 RfR dengan metode kultur bersama. Isolat–isolat tersebut ditumbuhkan pada media SWC-cair dengan kepadatan 102 CFU/ml. Pada tabung yang sama ditambahkan 102 CFU/ml V. harveyi MR5339 RfR kemudian diinkubasi semalam pada inkubator bergoyang dengan suhu 280C. Kultur selanjutnya disebar pada media SWC+Rf sehingga hanya V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh. Apabila V. harveyi MR5339 RfR pada tabung kontrol (tanpa isolat bakteri kandidat probiotik) tumbuh jauh lebih banyak dibandingkan dengan kultur campuran (V. harveyi MR5339 RfR dicampur dengan isolat bakteri kandidat probiotik), berarti bakteri kandidat probiotik mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR.

Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik

Sebelum dilakukan uji in vivo pada udang, sepuluh isolat masing-masing lima isolat dari metode zona hambat dan lima isolat dari metode kultur bersama

14

diuji patogenisitasnya pada udang. Satu lup dari masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media SWC-cair secara terpisah. Kultur ditempatkan pada inkubator bergoyang selama 10 jam pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu ruang. Pellet sel yang terbentuk kemudian diresuspensikan dalam larutan fisiologis dan ditambahkan pada media pemeliharaan larva udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml. Larva udang dipelihara dalam toples yang diisi air laut steril 2 liter dengan kepadatan 10 ekor/l dan diberi pakan Artemia 3-5 individu/ml. Patogenisitas bakteri kandidat probiotik diamati melalui kematian larva selama 5 hari pemeliharaan. Pada akhir percobaan dihitung kelangsungan hidup (SR) larva udang dan dibandingkan dengan kontrol, yakni perlakuan tanpa penambahan bakteri kandidat probiotik. Pembuatan Mutan Bakteri Kandidat Probiotik

Isolat-isolat yang menghasilkan kelangsungan hidup terbaik pada uji patogenisitas, sebelum uji in vivo pada larva udang diberi penanda resisten rifampisin (RfR) terlebih dahulu. Pemberian penanda RfR pada bakteri kandidat probiotik dilakukan melalui mutasi spontan dengan menumbuhkan bakteri tersebut pada media SWC-agar yang telah mengandung rifampisin 50 µg/ml (SWC+Rf). Pemberian penanda RfR pada bakteri probiotik dimaksudkan agar keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dan lingkungan pemeliharaannya dapat dimonitor.

Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik

Isolat-isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial dan tidak bersifat patogen diuji efektifitasnya dalam menghambat serangan V. harveyi MR5339 RfR pada larva udang. Isolat bakteri kandidat probiotik diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml sehari setelah larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi dengan larva udang selama 6 jam, V. harveyi MR5339 RfR diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml. Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol (kontrol positif : hanya diinokulasi V. harveyi MR5339 RfR, kontrol negatif : tanpa penambahan V. harveyi MR5339 RfR maupun bakteri kandidat probiotik). Pengamatan dilakukan selama 12 hari dan pada akhir percobaan dihitung SR larva udang, populasi

bakteri baik dari larva udang maupun dari media airnya setiap tiga hari. Selama percobaan larva udang diberi pakan Artemia sebanyak 3-5 individu/ml.

Identifikasi Bakteri Probiotik Terpilih

Identifikasi isolat terpilih dilakukan berdasarkan hasil sekuensing gen 16S r RNA (Marchesi et al., 1998). Sekuensing gen 16S-rRNA terdiri dari tahapan ekstraksi DNA, amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR (Suwanto, 2002), gene clean menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction KIT Geneaid dan sekuensing dengan mesin Sequenser.

a. Ekstraksi DNA

Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan dalam media SWC-cair. Kultur diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 28-290C, 130 rpm selama 24 jam. Sel bakteri dipanen dengan mengambil 1.5 ml suspensi biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 2 menit. Selanjutnya supernatan dibuang. Tahap ini diulang sebanyak tiga kali. Pellet bakteri yang terbentuk diresuspensi dengan 1 ml buffer TE 1X dan disentrifugasi 6000 rpm 2 menit. Setelah disentrifugasi, supernatan yang ada dibuang.

Pellet yang tertinggal diresuspensi dengan 500 µl buffer TE 1X, selanjutnya ditambahkan 100 µl lysozyme 50 mg/ml lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0C. Setelah diinkubasi ditambahkan 100 µl SDS 10% dan 10 µl proteinase-K lalu dibolak-balik perlahan-lahan hingga tercampur. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37 0C selama 1 jam. Selanjutnya ditambahkan 100 µl 5 M NaCl dan 100 µl 10% CTAB/NaCl yang telah dihangatkan terlebih dahulu (65 0C) selanjutnya diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65 0C. Kemudian ditambahkan 500 µl campuran phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) lalu divortex hingga tercampur. Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.

Cairan yang terbentuk yang berada pada lapisan teratas dipindahkan ke dalam eppendroff baru lalu ditambahkan 0.6 volum isopropanol dingin. Tabung eppendorf dibolak-balik secara perlahan supaya tercampur selanjutnya selama 20 menit disimpan di suhu -20 0C. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan maksimal selama 5 menit pada suhu -4 0C. Supernatan yang ada dibuang.

16

Selanjutnya ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin lalu disentrifugasi lagi pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Supernatan dibuang kembali, lalu disimpan di suhu ruang hingga etanol menguap habis. Sebelum disimpan DNA ditambah dengan elution buffer atau aquabidest steril serta dilakukan pengecekan dengan elektroforesis.

b. Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR

Primer yang digunakan adalah primer universal untuk domain bakteri berupa forward primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan reverse primer 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al., 1998). Semua komponen reaksi dicampur dalam microtube dan dimasukkan dalam mesin PCR. Tahapan PCR terdiri dari pre start 94 0C, 2 menit; tahap denaturasi 92 0C, 30 detik; tahap annealing 55 0C, 30 detik, tahap elongasi 72 0C selama 1 menit. Proses PCR terdiri dari 30 siklus. Selanjutnya post PCR pada suhu 75 0C 20 menit dan tahap stop PCR pada suhu 4 0C. Kemudian hasil PCR disimpan pada suhu -20 0C.

c. Gene clean

DNA produk PCR dimurnikan menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, Geneaid. Sebanyak 300 mg agarose (hasil pemotongan pada elektroforesis) dimasukkan dalam eppendorf. Kemudian ditambahkan 500 µl DF buffer dan divortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60 0C selama 15 menit hingga agarose terlarut sempurna. Kemudian 800 µl sampel dimasukkan ke dalam DFcolumn dan disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik dan supernatan dibuang. Selanjutnya ditambahkan 600 µl wash buffer yang telah ditambahkan etanol ke dalamnya, lalu disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik. Supernatan yang ada dibuang lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit pada kecepatan penuh. DF column dipindahkan pada eppendorf baru dan ditambahkan 15-50 µl aquabidest steril pada bagian tengahnya. Selanjutnya didiamkan selama 2 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan penuh selama 2 menit. Kemudian DNA yang terbentuk disimpan pada suhu -20 0C. Untuk pengecekan dapat dilakukan running elektroforesis DNA hasil gene clean (Lampiran 2).

Rancangan Penelitian dan Teknik Analisa

Penelitian dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), sebelas perlakuan dengan tiga ulangan pada saat uji patogenisitas dan dua belas perlakuan dengan tiga ulangan pada uji in vivo. Parameter yang diamati dianalisa keragamannya dengan ANOVA dan untuk mengetahui pengaruh perlakuan dilakukan uji lanjut. Variabel yang dianalisa secara statistik meliputi kelangsungan hidup larva udang baik pada uji patogenisitas maupun uji in vivo serta laju pertumbuhannya. Sedangkan nilai zona hambat dan populasi bakteri dianalisa secara deskriptif.

Parameter yang diamati

a. Tingkat Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu

Tingkat kelangsungan hidup larva udang windu dihitung menggunakan rumus :

SR=Nt x 100% (Effendie, 1997) No

Keterangan :

SR : tingkat kelangsungan hidup (%)

Nt : jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No : jumlah udang pada awal pengamatan

b. Laju Pertumbuhan Panjang dan Bobot Harian Larva Udang Windu Pertumbuhan panjang dan bobot total diamati pada awal dan akhir penelitian. Pertumbuhan larva udang windu dihitung berdasarkan pertambahan bobot dan panjang berdasarkan rumus berikut :

⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ ⎪⎩ ⎪ ⎨ ⎧ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ −

= 1 x100% Lo Lt t α dan ⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ ⎪⎩ ⎪ ⎨ ⎧ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ −

= 1 x100% Wo

Wt t

α (Effendie, 1997)

Keterangan :

α : Laju pertumbuhan harian udang (%) t : Lama waktu pemeliharaan udang (hari) Wt : Bobot rata-rata akhir udang (mg) Wo : Bobot rata-rata awal udang (mg) Lt : Panjang rata-rata akhir udang (mm) Lo : Panjang rata-rata awal udang (mm)

18

c. Populasi Bakteri

Populasi bakteri yang dihitung pada uji in vitro metode kultur bersama adalah jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada tabung kontrol dan kultur campuran probiotik. Pada uji in vivo populasi bakteri yang dihitung meliputi total bakteri, jumlah bakteri probiotik, jumlah V. harveyi MR5339 RFR, baik pada media pemeliharaan, larva udang mati dan udang hidup. Jumlah bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dan dikalikan dengan faktor pengenceran.

Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik

Terumbu karang yang diisolasi bakterinya terdiri dari 6 jenis yaitu Acropora sp., Merulina sp., Hystrix sp., Poecillophora sp., Porites sp. dan Haliophora sp. (Gambar 2). Identifikasi terumbu berdasarkan Veron (1986). Bakteri kandidat probiotik yang berhasil diisolasi dari terumbu karang ada 110 isolat (Lampiran 3). Dari jumlah tersebut 43 isolat berasal dari Acropora sp., 9 isolat dari Merulina sp., 12 isolat dari Hystrix sp., 14 isolat dari Poecillophora sp., 22 isolat dari Porites sp. dan 10 isolat dari Haliophora sp.. Dari total 110 isolat, 82 isolat termasuk golongan Vibrio sp dan 28 isolat dari golongan non Vibrio. Koloni 82 isolat Vibrio berwarna kuning pada media TCBS-agar, tidak berpendar dan bersifat menyebar pada media SWC-agar. Sedangkan 17 isolat non Vibrio menghasilkan koloni berwarna krem dan 11 isolat menghasilkan koloni berwarna putih pada media SWC-agar.

V. harveyi yang digunakan dalam penelitian ini adalah V. harveyi MR5339 RfR, merupakan koleksi Balai Penelitian Perikanan Pantai (Balitkanta) Maros, Sulawesi Selatan. Bakteri tersebut telah diuji bersifat patogen pada larva udang windu. Koloni V. harveyi MR5339 RfR berwarna hijau pada media TCBS-agar dan putih kekuningan pada media SWC-agar (Gambar 3) serta berpendar bila diamati pada ruang gelap (Gambar 4).

Acropora sp. Merulina sp. Hystrix sp.

Poecillophora sp. Porites sp. Haliophora sp. Gambar 2. Terumbu karang yang diisolasi bakterinya

20

A B

Gambar 3. Penampilan V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar (A) dan SWC-agar (B)

A B

Gambar 4. Penampilan bakteri V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar yang diamati pada kondisi terang (A) dan gelap (B)

Uji In Vitro Bakteri Kandidat Probiotik a. Metode Zona hambat

Bakteri yang memiliki kemampuan menghambat V. harveyi MR5339 RfR menghasilkan zona bening disekitar kertas cakram (Gambar 5). Bakteri yang tidak menghasilkan zona bening diuji kemampuannya menghambat V. harveyi MR5339 RfR dengan metode kultur bersama.

Dari 110 isolat hanya 54 isolat yang mampu menghasilkan zona hambat. Zona hambat yang dihasilkan berkisar antara 8 – 15 mm (Tabel 1). Ada lima isolat yang menghasilkan zona hambat terbesar, yaitu yang diisolasi dari Acropora sp. (isolat 1C dan 8A), Hystrix sp. (isolat 11D dan 11K)dan Poecillophora sp. (isolat 13I). Radjasa et al. (2004) berhasil mengisolasi TAB4.2 dari Acropora sp yang menghasilkan zona bening 11,75 mm saat uji in vitro dengan V. harveyi. TAB4.2 diidentifikasi sebagai Pseudoalteromonas dan menghasilkan metabolit sekunder berupa polipeptida (Radjasa et al. 2004).

Kontrol

A1

A2

A3

Kontrol

Kontrol

B3

C3

B2

B1

C2

22

Keterangan :

A : isolat 1C C : isolat 13I E : isolat 11K B : isolat 8A D : isolat 11D

Gambar 5. Zona hambat yang dihasilkan bakteri kandidat probiotik terhadap V. harveyi MR5339 RfR

Kontrol Kontrol

D3

E2

D2

D1

E3

Tabel 1. Zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri kandidat probiotik No Kode isolat Zona hambat (mm) No Kode isolat Zona hambat (mm)

1 Acp 1C 13.8 28 Lam 4I 9

2 Acp 1D 10 29 Lam 4J 8

3 Acp 1F 8 30 Acp 6D 8

4 Acp 1G 8 31 Acp 6E 8

5 Acp 1H 8 32 Acp 6F 8

6 Acp 3A 9 33 Acp 6G 11

7 Acp 3B 8 34 Fol 7H 9.2

8 Acp 3E 8 35 Fol 7I 8

9 Acp 2B 8 36 Fol 7A1 8

10 Acp 2C 10 37 Fol 7A2 11

11 Acp 2D 9 38 Hal 9B 11

12 Acp 2E 9 39 Hal 9C 10

13 Acp 2F 8 40 Hal 9E 8

14 Acp 2G 8 41 Hal 9G 8

15 Acp 2H 11 42 Hal 9I 8

16 Acp 8A 12.4 43 Acp 13A 10

17 Acp 8E 8 44 Acp 13C 8.3

18 Acp 5C 8 45 Acp 13I 15

19 Acp 5D 8 46 Acp 11D 12.5

20 Acp 5E 10 47 Acp 11H1 9

21 Acp 5F 10 48 Acp 11K 12.5

22 Lam 4B 10 49 Hal 12A 8

23 Lam 4C 9 50 Hal 12B 9.1

24 Lam 4D 9 51 Hal 12C 10

25 Lam 4E 9 52 Hal 12A2 10

26 Lam 4G 9 53 Hal 12A3 11

27 Lam 4H 9 54 Hal 12C2 8

Zona bening yang timbul di sekitar kertas cakram menunjukkan adanya kemampun bakteri kandidat probiotik dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR. Berdasarkan Verschuere et al. (2000) populasi mikroba dapat melepaskan substansi kimia yang memiliki kemampuan bakterisidal atau bakteriostasis yang dapat mempengaruhi populasi mikroba lain. Secara umum kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri lain dikarenakan satu atau kombinasi dari beberapa faktor seperti: produksi antibiotik, bakteriosin, siderophores, lysozymes, protease dan atau hidrogen peroksida atau mempengaruhi pH media dengan menghasilkan asam organik tertentu.

24

Hasil uji penghambatan in vitro dari 56 isolat bakteri kandidat probiotik terhadap V. harveyi MR5339 RfR disajikan pada Gambar 6 dan 7. Uji in vitro bakteri kandidat probiotik dengan metode kultur bersama dilakukan dengan membandingkan jumlah koloni V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh di tabung kontrol dengan kultur campurannya (Gambar 6). Lima isolat kandidat probiotik yaitu isolat 5H1 diisolasi dari Acropora sp., isolat 11I dan 11G diisolasi dari Hystrix sp. serta isolat 13B dan 13G1 yang diisolasi dari Poecillophora sp., mampu menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR hingga 101 – 102 CFU/ml sedangkan pada tabung kontrol populasi V. harveyi mencapai 7 x 108 CFU/ml. Isolat-isolat yang lain juga mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR meskipun dengan daya hambat yang berbeda-beda (Gambar 7). Hal ini terlihat dari jumlah koloni V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh pada biakan yang dicampur dengan bakteri kandidat probiotik lebih rendah dibanding kontrol. Hal tersebut menunjukkan bahwa ke-56 isolat yang ada, sebenarnya potensial menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR.

Penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Komposisi media yang digunakan mungkin mempengaruhi jumlah senyawa antimikrob yang dihasilkan atau dilepaskan ke media. Selain itu, penghambatan pertumbuhan tidak selalu berkaitan dengan produksi senyawa antimikrob tetapi dapat juga karena adanya kompetisi terhadap bahan kimia atau energi yang tersedia. Hal ini menggambarkan bagaimana populasi bakteri yang berbeda menempati ekosistem yang sama (Verschuere et al. 2000).

Hasil penelitian Riquelme et al. (1997) menunjukkan bahwa dari 57 isolat bakteri yang diisolasi dari air laut, 3 diantaranya (5%) potensial menghambat pertumbuhan V. anguillarum. Isolat SV1 yang tidak memperlihatkan adanya zona penghambatan pada uji in vitro ternyata juga dapat meningkatkan kelangsungan hidup kerang-kerangan pada uji in vivo (Riquelme et al. 1997).

Gambar 6. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri kandidat probiotik pada media SWC-agar + rifampisin 50 µg/ml

Kontrol (V. harveyi)

Kultur campuran (V. harveyi + isolat 11I)

Kontrol

(V. harveyi) _{(V. harveyi)}Kontrol

Kontrol

(V. harveyi) _{(V. harveyi)}Kontrol

Kultur campuran

(V. harveyi + isolat 5H1) Kultur campuran

(V. harveyi + isolat 13B)

Kultur campuran (V. harveyi + isolat 11G)

Kultur campuran (V. harveyi + isolat 13G1)

25

Gambar 7. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh isolat bakteri kandidat probiotik pada uji in vitro metode kultur bersama

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Isolat kandidat probiotik

Lo

g C

F

U

/m

l s

el V.

harv

ey

Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik

Sebelum dilakukan uji in vivo pada larva udang, sepuluh isolat yang potensial sebagai kandidat probiotik, masing-masing lima isolat dari metode zona hambat dan lima isolat dari metode kultur bersama, diuji patogenisitasnya terhadap larva udang windu. Isolat-isolat terpilih merupakan isolat yang memberikan hasil terbaik pada uji in vitro metode zona hambat dan kultur bersama. Hasil uji patogenisitas isolat-isolat kandidat probiotik disajikan pada Gambar 8 dan Lampiran 4. Hasil yang ada memperlihatkan semua bakteri kandidat probiotik yang diuji tergolong tidak patogen. Hal ini dapat diketahui dengan melihat nilai kelangsungan hidup pada semua perlakuan tidak berbeda nyata dengan kontrol setelah dianalisa secara statistik. Isolat 13G1 yang mampu menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR paling baik pada uji in vitro metode kultur bersama menghasilkan kelangsungan hidup paling tinggi (88,33%). Hal ini menunjukkan isolat tersebut, diduga selain memiliki kemampuan menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR juga dapat meningkatkan kebugaran udang.

Gambar 8. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas

a a a a a a a a a a

86,67 86,67

83,33 85,00

88,33 86,67

83,33 83,33

81,67 83,33

80,00 a 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0

1C 5H1 11 G 13 I 13 G 1 13 B 8 A 11 I 11 D 11 K Ko nt r o l Isolat kandidat probiotik

K e la ngs unga n hi d up l a rv a u da ng (% )

27

Ciri Fisik Isolat Terpilih

Dari hasil seleksi pada uji in vitro dihasilkan empat isolat potensial yang mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi, tidak bersifat patogen pada larva udang serta menghasilkan kelangsungan hidup yang lebih baik dibanding kontrol pada uji patogenisitas. Keempat isolat tersebut adalah 13G1, 13B, 1C dan 8A. Isolat pertama, 13G1 diisolasi dari Poecillopohora sp., berwarna krem keputihan dan menyebar pada media SWC (Gambar 9A), bentuk koloni bulat cembung. Pada media selektif TCBS isolat 13G1 dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 9B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.

A B

Gambar 9. Penampilan isolat 13G1 pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).

Isolat kedua, 13B juga diisolasi dari Poecillopohora sp., berwarna putih kekuningan dan menyebar pada media SWC (Gambar 10A), bentuk koloni bulat datar. Pada media selektif TCBS isolat 13B dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 10B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.

A B

Gambar 10. Penampilan isolat 13B pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).

Isolat ketiga, 8A diisolasi dari Acropora sp., berwarna putih kekuningan dan menyebar pada media SWC (Gambar 11A), koloni berbentuk bulat kecil-kecil Gambar 8. Pada media selektif TCBS isolat 8A dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 11B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.

A B

Gambar 11. Penampilan isolat 8A pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B). Isolat keempat, 1C juga diisolasi dari Acropora sp., berwarna putih kekuningan pada media SWC (Gambar 12A), bentuk koloni bulat cembung. Pada media selektif TCBS isolat 1C dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 12B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.

29 0 0.5 1 1.5 2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Nilai O D (6 00 nm ) Jam ke 0 0.5 1 1.5 2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Nilai O D (6 00 nm ) Jam ke 0 0.5 1 1.5 2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

N ilai O D (600 n m ) Jam ke 13B 13BRf

A B

Gambar 12. Penampilan isolat 1C pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).

Mutan Resisten Rifampisin

Empat isolat terbaik hasil uji patogenisitas yaitu 13G1, 13B, 1C dan 8A dibuat mutan resisten rifampisin dengan cara menumbuhkan isolat-isolat tersebut pada media SWC-agar yang mengandung rifampisin 50 µg/ml. Morfologi koloni mutan maupun pola pertumbuhannya sama dengan tipe liarnya (Gambar 13), sehingga mutan tersebut dapat digunakan untuk mengamati penghambatan pertumbuhan V. harveyi oleh bakteri kandidat probiotik. Pemberian penanda RfR pada bakteri probiotik bertujuan untuk membedakan antara bakteri probiotik dengan bakteri alami yang telah ada pada tubuh udang, sehingga dapat dimonitor keberadaannya. 0 0.5 1 1.5 2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

N ilai O D (600 n m ) Jam ke

Gambar 13. Perbandingan pertumbuhan bakteri kandidat probiotik resisten rifampisin dengan tipe liarnya.

Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik

Empat isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial berdasarkan uji in vitro metode zona hambat dan kultur bersama serta tidak bersifat patogen terhadap larva udang diuji efektivitasnya dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR pada larva udang windu. Pengamatan dilakukan terhadap kelangsungan hidup larva, total bakteri, populasi V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik baik pada air media pemeliharaan, larva hidup maupun larva mati. Penanda RfR pada V. harveyi dan probiotik yang digunakan bertujuan untuk mengamati perbandingan populasi keduanya

Hasil pengujian menunjukkan keempat isolat tersebut, baik tipe liar (Gambar 14, Lampiran 5) maupun tipe mutannya (Gambar 15, Lampiran 6), secara signifikan (p<0.05) dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang. Isolat-isolat tersebut diduga dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR. Hal ini terlihat dari nilai kelangsungan hidup larva pada kontrol positif (hanya diinokulasi V. harveyi MR5339 RfR) lebih rendah (61,67% dan 68,33%) dibanding perlakuan dengan penambahan isolat probiotik (83,33% - 88,33%). Selain itu isolat-isolat tersebut juga diduga dapat meningkatkan kebugaran larva udang.

Berdasarkan Verschuere et al. 2000, bakteri probiotik dapat menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nutrisinya juga memperbaiki respon inang terhadap penyakit. Kedua hal tersebut diduga menjadi penyebab meningkatnya kebugaran larva udang. Hal ini terlihat dari nilai kelangsungan hidup larva pada kontrol negatif (tanpa inokulasi bakteri probiotik maupun V. harveyi) lebih rendah (80,00%) dibanding perlakuan dengan penambahan isolat probiotik (83,33% - 88,33%).

31

Hasil penelitian Gullian et al. (2004), menunjukkan bahwa bakteri probiotik yang diisolasi dari hepatopankreas udang sehat mampu meningkatkan respon immunitas udang. Hasil serupa juga ditunjukkan oleh Vaseeharan & Ramasamy (2003) yang menyatakan bahwa larva udang windu yang diberi Bacilus subtilis BT23 tingkat kelangsungan hidupnya mencapai 100% saat diinfeksi dengan V. harveyi dibandingkan dengan kontrol positif yang hanya 50% tingkat kelangsungan hidupnya.

Keterangan :

A : 13B + MR5339 RfR C : 8A + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 + MR5339 RfR D : 1C + MR5339 RfR F : Kontrol

Gambar 14. Kelangsungan hidup larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar pada uji in vivo

Keterangan :

A : 13B RfR + MR5339 RfR C : 8A RfR + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 RfR + MR5339 RfR D : 1C RfR + MR5339 RfR F : Kontrol

85,00 88,33

83,33 85,00

61,67

80,00

86,67 88,33

83,33 83,33

61,67

80,00

a b

b b b b

b

c c bc bc a

50 60 70 80 90 100

A B C D E F

Perlakuan K el angs u ngan hi dup ( % ) 50 60 70 80 90 100

A B C D E F

Perlakuan K el angs u ngan hi dup ( % )

Gambar 15. Kelangsungan hidup larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan pada uji in vivo

Peningkatan nilai kelangsungan hidup larva karena adanya penghambatan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri probiotik ditunjukkan dengan menurunnya jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR baik pada air pemeliharaan maupun pada larva hidup bila dibandingkan dengan perlakuan kontrol positif. Gambar 16 menunjukkan populasi total bakteri, jumlah total Vibrio sp. dan jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar.

13B + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

l

13G1 + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

l

8A + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

l

1C + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

33

V. harveyi Total Vibrio sp Total bakteri

Gambar 16. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339 RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar

MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Lo

g CF

U/

m

l

Kontrol

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

L

og CF

U/

m

Pada perlakuan pemberian bakteri kandidat probiotik tipe liar, tidak dapat dibedakan antara Vibrio kandidat probiotik dengan Vibrio yang telah ada sebelumnya pada tubuh udang, sehingga pada perlakuan ini yang dihitung adalah total Vibrio sp.. Keempat isolat kandidat probiotik (13B, 13G1, 8A dan 1C) menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata. Keempatnya dapat menekan jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR pada air pemeliharaan hingga 103 CFU/ml pada hari kedua. Sedangkan total Vibrio sp pada masing-masing perlakuan nilainya masih lebih tinggi (105 – 106 CFU/ml) dibandingkan kontrol positif (populasi total Vibrio sp hanya 105 CFU/ml). Hal ini menunjukkan media pemeliharaan larva udang didominasi oleh Vibrio yang bersifat menguntungkan bagi inang yang dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR.

Gambar 17 menunjukkan populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan. Bakteri kandidat probiotik pada perlakuan ini telah dimutasi menjadi resisten rifampisin sehingga keberadaannya di media pemeliharaan dapat dimonitor. Dari Gambar 17 terlihat penurunan jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR pada air pemeliharaan hingga 103 CFU/ml pada hari kedua dan sudah tidak terdeteksi lagi keberadaannya pada hari keenam. Keempat isolat kandidat probiotik (13B RfR, 13G1 RfR, 8A RfR dan 1C RfR) memberikan pengaruh yang tidak berbeda nyata (Gambar 17, Lampiran 7). Jumlah sel bakteri kandidat probiotik rata-rata menurun pada hari kedua (104 CFU/ml) dan tidak terdeteksi lagi pada hari keenam. Adanya penurunan jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR dan lebih tingginya jumlah sel bakteri probiotik menunjukkan adanya penghambatan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri probiotik.

Sung et al. (1999) menyatakan apabila terjadi penurunan keragaman Vibrio sp. pada air media pemeliharaan udang dan didominasi oleh komunitas Vibrio patogen biasanya terjadi vibriosis yang diikuti oleh penurunan populasi udang di tambak. Pada penelitian ini, perlakuan kontrol positif didominasi oleh V. harveyi MR5339 RfR dengan jumlah larva mati lebih banyak dibanding perlakuan penambahan probiotik baik tipe liar maupun tipe mutan. Pada perlakuan dengan penambahan probiotik, V. harveyi MR5339 RfR bukan sebagai populasi dominan.

V. harveyi Probiotik Total bakteri

Gambar 17. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada air media pemeliharaan larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan

13B RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

l

13G1 RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) L o g CF U/ m l

8A RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

l

1C RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g CF U/ m l MR5339 RfR 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g CF U/ m l Kontrol 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari)

Log CF

U/

m

37

Gambar 18 memperlihatkan populasi total bakteri, jumlah total Vibrio sp. dan jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar. Pada Gambar 18 terlihat bahwa populasi V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup dengan perlakuan penambahan bakteri probiotik lebih rendah (102 CFU/larva) dibanding perlakuan tanpa probiotik (103 CFU/larva), bahkan pada hari ke-4, V. harveyi MR5339 RfR sudah tidak terdeteksi lagi. Tidak terdeteksinya V. harveyi MR5339 RfR pada hari keempat diduga karena telah terjadi penurunan populasi V. harveyi MR5339 RfR di media pemeliharaan (akibat dihambat pertumbuhannya oleh bakteri probiotik) sehingga peluang untuk berkolonisasi di tubuh udang semakin kecil bila dibandingkan bakteri kandidat probiotik. Pada perlakuan kontrol positif, V. harveyi MR5339 RfR masih terdeteksi hingga hari keempat. Hal ini dimungkinkan karena tidak adanya persaingan antara V. harveyi MR5339 RfR dengan bakteri kandidat probiotik pada media pemeliharaan sehingga peluang untuk menempel di tubuh udang lebih besar.

Pada Gambar 18 dapat diketahui bahwa jumlah sel Vibrio sp. yang ditemukan pada larva hidup lebih banyak dibandingkan jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR. Hal ini menunjukkan larva udang didominasi oleh Vibrio sp.. Hasil penelitian Gullian et al. (2004) menyatakan isolat Vibrio potensial probiotik asal udang sehat mampu berkolonisasi hingga 83% pada hepatopankreas udang uji.

Karunasagar et al. (1994) dan Manefield et al. (2000) menyatakan V. harveyi dapat menyebabkan vibriosis dikarenakan sifat patogenisitasnya. Sifat patogenisitas ini berkaitan erat dengan fenomena kemampuan berluminesensi yang dikontrol oleh suatu sistem quorum sensing. Apabila quorum tercapai, maka V. harveyi dapat mengeluarkan faktor-faktor virulensinya. Pada penelitian ini, tubuh udang didominasi oleh Vibrio sp. dan hanya sedikit V. harveyi MR5339 RfR yang berkoloni sehinggga V. harveyi MR5339 RfR tidak dapat mencapai quorum untuk mensekresikan faktor-faktor virulensinya. Dengan demikian V. harveyi MR5339 RfR tidak dapat mengakibatkan kematian pada larva udang sehingga tingkat kelangsungan hidup larva yang diberi probiotik lebih besar dibanding perlakuan tanpa probiotik.

39

Vibrio harveyi Total Vibrio sp Total bakteri

Gambar 18. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar. 13B + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Log CF U/ lar v a

13G1 + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a

8A + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a

1C + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a MR5339 RfR 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a Kontrol 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a

Gambar 19 memperlihatkan populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan. Pada Gambar 19 jumlah sel bakteri probiotik pada larva hidup, hingga hari kedua perlakuan, masih lebih tinggi (104 CFU/larva) bila dibandingkan jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR (101 CFU/larva). Hal ini menunjukkan adanya penghambatan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri probiotik. Pada hari keempat bakteri probiotik tidak dapat dideteksi lagi keberadaannya di tubuh udang. Diduga hal ini terjadi karena isolat-isolat yang digunakan berasal dari terumbu karang, dimana pada penelitian ini belum tercipta kondisi yang optimal yang mendukung kelangsungan hidup dan pertumbuhan bakteri tersebut. Dengan demikian terjadi penurunan jumlah bakteri probiotik di media pemeliharaan sehingga tidak tertutup kemungkinan terjadi pula penurunan jumlah sel bakteri probiotik di tubuh udang hingga tidak terdeteksi lagi pada hari keempat.

Penghambatan pertumbuhan V. harveyi oleh bakteri probiotik dapat berupa kompetisi pelekatan atau sumber nutrien atau produksi senyawa antimikrob (Verschuere et al., 2000). Selvin et al. (2004) menyatakan bahwa udang yang diberi ekstrak sponge Dendrilla nigra saat diuji tantang dengan V. harveyi tingkat kelulushidupannya 100%. Diduga sponge menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang bersifat antimikrob. Webster et al. (2001) menyatakan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan sponge juga menghasilkan komponen bioaktif. Sebagai contoh Micrococcus sp. pada sponge jenis Tedania ignis menghasilkan komponen diketopiperazin; Vibrio sp. pada Dysidea memproduksi bifenil eter bromina; Vibrio sp. pada Hyatella sp. menghasilkan komponen bioaktif berupa peptida anti Bacillus (Lee et al. 2001).

Keempat isolat yang digunakan (13B RfR, 13G1 RfR, 8A RfR dan 1C RfR) diisolasi dari terumbu karang, dimana hewan-hewan karang itu sendiri berdasarkan penelitian dapat menghasilkan bahan aktif anti bakteri atau hidup berasosiasi dengan mikrob yang menghasilkan bahan aktif anti bakteri (Proksch 2000; Webster et al. 2001; Lee et al. 2001). Dengan demikian penghambatan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR di tubuh udang pada penelitian ini diduga berasal dari bahan aktif tersebut.

41

V. harveyi Probiotik Total bakteri

Gambar 19. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva hidup yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan

13B RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a

13G1 RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12 Waktu (hari) Log C F U /la rv a

8A RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a

1C RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /lar v a MR5339 RfR 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Lo g C F U /la rv a Kontrol 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6 8 10 12

Waktu (hari) Log C F U /lar v a

Pada Gambar 20 ditunjukkan populasi total bakteri, jumlah total Vibrio sp. dan jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada larva mati yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar. Gambar 21 memperlihatkan hasil perlakuan pemberian bakteri kandidat probiotik tipe mutan. Secara keseluruhan keempat isolat bakteri kandidat probiotik menghasilkan pengaruh yang tidak berbeda nyata. Terjadi kematian larva udang pada perlakuan pemberian bakteri kandidat probiotik tetapi jumlah larva yang mati lebih sedikit bila dibandingkan perlakuan kontrol positif. Jumlah V. harveyi MR5339 RfR yang mengkolonisasi larva mati berkisar antara 103 – 104 CFU/larva.

Jumlah V. harveyi MR5339 RfR yang mengkoloni larva mati dapat sama jumlahnya pada setiap perlakuan pemberian probiotik tetapi jumlah larva udang yang mati pada perlakuan kontrol positif lebih besar dibanding perlakuan pemberian probiotik. Diduga kisaran angka 103 – 104 CFU/larva menunjukkan jumlah V. harveyi MR5339 RfR yang dapat menyebabkan kematian pada larva udang. Pada penelitian Widanarni et al. (2003), Hala et al. (2002) dan Muliani (2002) jumlah V. harveyi yang ditemukan pada larva yang mati berkisar antara 102 – 104 CFU/larva.

Hasil penelitian Sung et al. (2001) menunjukkan pada kolam yang terdapat vibriosis, populasi Vibrio patogen pada hepatopankreas udang dapat mencapai 104 CFU/gram hepatopankreas, didominasi oleh V. harveyi (53,3%) dan V. parahaemolyticus (20%). Dari penelitian ini diperoleh, jumlah sel V. harveyi MR5339 RfR yang ditemukan pada larva mati (Lampiran 9) lebih banyak dibanding pada larva hidup.

43

V. harveyi Vibrio sp Total bakteri Larva mati

Gambar 20. Populasi total bakteri, jumlah sel Vibrio sp dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva mati yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar. 13B + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

13G1 + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

8A + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1C + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MR5339 RfR 0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kontrol 0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vibrio harveyi Probiotik Total bakteri Larva mati

Gambar 21. Populasi total bakteri, jumlah bakteri probiotik dan V. harveyi MR5339 RfR pada larva mati yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan.

13B RfR + MR5339 RFR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

13G1 RfR + MR5339 RfR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

8A RfR + MR5339 RFR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1C RfR + MR5339 RFR

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MR5339 RFR 0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kontrol 0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Waktu (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

45

Populasi total bakteri dari seluruh perlakuan tidak berbeda jauh dan memiliki pola yang sama. Lampiran 10 menyajikan total bakteri pada media pemeliharaan sedangkan Lampiran 11 menunjukkan total bakteri pada larva hidup dan Lampiran 12 memperlihatkan total bakteri pada larva mati. Pada media pemeliharaan larva udang baik perlakuan bakteri kandidat probiotik tipe liar maupun mutan terjadi penurunan total bakteri mendekati total bakteri pada perlakuan kontrol negatif. Demikian pula halnya total bakteri pada larva hidup. Adanya penurunan ini diduga bersamaan dengan berkurangnya populasi bakteri probiotik maupun V. harveyi MR5339 RfR yang diinokulasikan sehingga populasi bakteri kembali mendekati populasi bakteri alaminya. Sung et al. (1999) dan Sung et al. (2001) menyatakan bahwa ada hubungan antara kejadian penyakit dengan komposisi bakteri patogen di air. Pada penelitian ini populasi V. harveyi MR5339 RfR paling tinggi terdapat di air pemeliharaan pada perlakuan kontrol positif demikian pula populasi udang yang mati juga terbanyak pada perlakuan ini.

Moriarty (1998) melaporkan pada tambak yang mendapat perlakuan probiotik DMS (Detritus Management System) terjadi penurunan total Vibrio dan Vibrio berpendar hingga 102 bila dibandingkan kontrol (104) dan terjadi peningkatan keragaman total bakteri yang didominasi oleh Bacillus sp. Riquelme et al. (2001) menyatakan, wadah pemeliharaan larva Argopecten purpuratus yang mendapat perlakuan IPB (inhibitor-producing bacteria) memiliki keragaman total bakteri lebih tinggi dibandingkan wadah yang tidak diberi IPB. Demikian pula hasil penelitian Devaraja et al. (2002) yang menunjukkan adanya peningkatan keragaman bakteri pada tambak yang diberi probiotik komersial.

Pada ekosistem alami, komunitas mikrob berada dalam kondisi dinamis. Schulze et al. (2006) menyatakan pada dasarnya keragaman bakteri di lingkungan hatchery memiliki keseimbangan antara bakteri patogen dan strain bakteri potensial probiotik. Sehubungan dengan waktu regenerasi yang singkat mikroorganisme diketahui merespon dengan cepat perubahan lingkungan disekelilingnya. Vibrio sp. yang hidup di perairan asin menyukai habitat yang kaya nutrien bahan organik (Sung et al. 2001). Pada penelitian ini diupayakan setiap wadah mendapat kondisi yang sama. Dengan demikian komposisi total bakteri maupun total Vibrio sp. tidak mengalami perubahan yang drastis.

Pemberian bakteri probiotik selain dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen juga dapat meningkatkan laju pertumbuhan hewan akuatik. Peranan bakteri probiotik dalam meningkatkan laju pertumbuhan krustasea antara lain dilaporkan oleh Rengpipat et al. (1998) dan Planas et al. (2004), sedangkan pada organisme akuatik lainnya dilaporkan oleh Riquelme et al. (1997) serta Skjermo & Valdstein (1999). Pada penelitian ini larva udang yang diberi bakteri probiotik menghasilkan respon pertumbuhan lebih baik dibanding tanpa pemberian probiotik.

Hasil pengujian menunjukkan keempat isolat tersebut, baik tipe liar maupun tipe mutannya, secara signifikan (p<0.05) dapat meningkatkan pertumbuhan panjang (Gambar 22 dan 23, Lampiran 13 dan 14) dan bobot larva udang (Gambar 24 dan 25, Lampiran 14 dan 15). Penelitian ini menunjukkan larva udang yang diberi probiotik memiliki nilai pertumbuhan panjang lebih besar (5,06 – 6,14%) dibanding perlakuan tanpa probiotik (3,54 – 4,58%). Demikian pula untuk laju pertumbuhan bobot menunjukkan bahwa larva udang yang diberi probiotik menghasilkan laju pertumbuhan bobot lebih besar (17,51 – 19,09%) dibanding perlakuan tanpa pemberian porbiotik (14,69 – 15,27%). Diduga pada perlakuan tanpa penambahan probiotik, larva udang membutuhkan energi lebih besar untuk mengatasi V. harveyi MR5339 RfR. Pada perlakuan penambahan probiotik, bakteri probiotik menghambat pertumbuhan populasi V. harveyi MR5339 RfR. Dengan demikian pada perlakuan penambahan probiotik, larva udang dapat memanfaatkan energi untuk tumbuh lebih banyak dibanding pada perlakuan tanpa probiotik.

Berdasarkan Verschuere et al. 2000 bakteri probiotik dapat berasosiasi dengan inang atau memodifikasi komunitas mikrob inang dan menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nutrisinya. Diduga bakteri probiotik yang diberikan mengandung makro dan mikro nutrien yang dibutuhkan larva udang tetapi tidak dimiliki oleh pakan yang diberikan sehingga menghasilkan pertumbuhan lebih baik dibanding kontrol. Selain itu ada pula kemungkinan bakteri probiotik yang diberikan mampu menghasilkan enzim-enzim pencernaan sehingga larva udang dapat mencerna pakan yang diberikan lebih baik sehingga nutrisi yang diserap lebih banyak.

47

Keterangan :

A : 13B + MR5339 RfR C : 8A + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 + MR5339 RfR D : 1C + MR5339 RfR F : Kontrol

Gambar 22. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar

Keterangan :

A : 13B RfR + MR5339 RfR C : 8A RfR + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 RfR + MR5339 RfR D : 1C RfR + MR5339 RfR F : Kontrol

Gambar 23. Pertumbuhan panjang larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan

a

b ab b ab

ab 5,23

6,14

5,28 5,69

3,82

4,58

ab ab a b b b

5,28

5,93

5,25 _5,06

4,30 3,54 0 1 2 3 4 5 6 7

A B C D E F

Perlakuan P e rt um bu ha n p anj a ng ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 7

A B C D E F

Perlakuan P e rt umbu ha n pa nj a ng ( %)

Keterangan :

A : 13B + MR5339 RfR C : 8A + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 + MR5339 RfR D : 1C + MR5339 RfR F : Kontrol

Gambar 24. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe liar

Keterangan :

A : 13B RfR + MR5339 RfR C : 8A RfR + MR5339 RfR E : MR5339 RfR B : 13G1 RfR + MR5339 RfR D : 1C RfR + MR5339 RfR F : Kontrol

Gambar 25. Pertumbuhan bobot larva udang windu yang diberi bakteri kandidat probiotik tipe mutan

17,59 15,27 14,69 17,61 17,51 18,99

b b c a b a

b a 14,86

b b b a

15,57 17,56 17,52 19,09 17,77 10 12 14 16 18 20

A B C D E F

Perlakuan P e rt u m bu ha n bo bo t (% ) 10 12 14 16 18 20

A B C D E F

Perlakuan P e rt um buha n bob ot (%)