Kajian Molekular Mutant Del-SEA Thalassemia-α pada Populasi Medan
Kajian Molekular Mutant Del-SEA Thalassemia-α pada Populasi Medan
Ratna Akbari Ganie
Departemen Patologi Klini, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara, Medan
Abstrak: Jumlah total dari 1.521 merupakan individu dewasa sehat dari tujuh kelompok etnik
berbeda yang hidup di kota Medan yang tersaring pembawa α thalessemia dengan hemoglobin
electrophoresis. Diantara semua sampel, 51 orang dicurigai terdapat ciri thalassemia, mutasi DNA
dideteksi dengan metode PCR. Mutasi 21 del-SEA ditemukan pada suku Aceh sebanyak 3.5%,
2.97% di suku Melayu, 2,69% Cina, 1,71% suku Jawa, 1.19% suku Batak dan tidak ditemukan
pada suku Minangkabau dan Nias. Mutasi 21 del-SEA biasanya juga ditemukan pada populasi di
Asia Tenggara dan Pasifik atau gen Mongoloid dan Malenesian sepanjang 17.5 kb pada gen globin
α1 maupun α1. Penggolongan subjek homozigot dengan cara menurunkan atau menghilangkan gen
globin pada hipokromik, anemia hemolitik, dan ketergantungan pada tranfusi darah untuk
memperpanjang hidup orang yang terjangkit thalassemia-α. Berdasarkan pada pembiayaan ini,
dapat dipahami bahwa semua kelompok etnik yang ada di Medan secara genetik termasuk ke
dalam bagian gen Mongolia dan Malanesia.
Kata kunci: α-thalassemia, mutan del-SEA, kelompok etnik di Medan
Abstract: A total number of 1.521 apparently healthy adult individuals from seven mayor
different ethnic groups who habited Medan were screened for α-thalassemia carrier by
hemoglobin electrophoresis. Among these, 51 subjects were suspected as α-thalassemia trait; the
DNA mutation were determined using PCR method to detect the del-SEA mutation performance.
During this study, 21 del-SEA mutations have been identified by specific olygonucleotides primers
in descending frequencies, 3.5% in Aceh; 2.97% in Malay; 2,69% in Chinese; 1.71% in Javanese;
1,19% in Batak and absent in Minang and Nias. The del-SEA mutant was commonly found in
Southeast Asian and Pacific populations or Mongoloid and Melanesian gene pools result in about
17.5 Kb deletion along the α1 and α2 globin genes. The homozygote subject characterized by
reduced or absent of α-globin gene expression leading to hypochromic, hemolytic anemia and
dependence on blood transfusions to sustain life which was known as thalassemia-α. Based on this
funding, understandable that these Medan’s ethnic groups genetically share the Mongoloid and
Melanesian gene pools.
Keywords: α-thalassemia, del-SEA mutant, Medan’s ethnic group
PENDAHULUAN
Seperti daerah endemik malaria lainnya,
keberadaan
penyakit
thalassemia
dan
hemoglobinopatia pada penduduk Indonesia
cukup tinggi, sebagai seleksi positif terhadap invasi
1
plasmodium (Flint et al., 1993). Dari beberapa
penelitian terdahulu telah dilaporkan bahwa
keberadaan thalassemia-β dan Hemoglobin-E
cukup tinggi baik dalam skala sporadis maupun
nasional, bahkan pada beberapa populasi
frekuensinya mencapai >15%. Sementara itu,
penelitian tentang keberadaan thalassemia-α
masih sangat terbatas, walaupun telah dilaporkan
oleh Hill et al., (1989) bahwa prevalensi mutasi
93
yang menyebabkan gangguan sintesis globin-α
ini cukup tinggi pada populasi Asia Daratan
2
dan Pasifik. WHO (1994) memperkirakan
terdapat
kira-kira
13.000–16.000
bayi
thalassemia-α baru, lahir setiap tahunnya di
seluruh dunia dan jika mereka dapat mencapai
usia dewasa maka diperkirakan ada 680.000
penderita thalassemia-α di Asia Tenggara
3,4
Prevalensi thalasemia-α
(Higgs, 1983).
sangat tinggi pada ras Mongoloid terutama di
China daratan yang pada beberapa populasi
terdahulu dapat mencapai 42% ((Lie et al.,
5,6
1982; Yang et al, 1985).
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
Sementara itu, angka yang banyak dirujuk
para ahli epidemiologi genetic Indonesia
adalah
estimasi
Wong
(1983)
yang
memperkirakan terdapat kira-kira 0,5% carrier
thalassemia-α di Indonesia secara nasional,
jauh di bawah angka pembawa sifat
thalassemia-β yang diperkirakan mencapai
7
3,5% dan Hb-E yang mencapai 5%. Nanum
demikian banyak peneliti percaya bahwa
angka thalassemia-α jauh di atas angka
tersebut, bahkan pada beberapa populasi
Indonesia di Jawa, Kalimantan, dan Sulawesi
yang telah diteliti mencapai 2,5- 3-2%
8
Dugaan tersebut
(Setianingsih, 2003).
diperkuat dengan keberadaan kasus bayi
Hydrop Fetalis dan Hb-H yang dijumpai di
rumah sakit-rumah sakit rujukan cukup tinggi.
Walaupun keberadaan thalassemia-α di
Medan telah pernah dilaporkan sebelumnya
oleh Hariman et al.(1984) yaitu masingo
masing sebesar 2,5% untuk thalassemia-α dan
+
thalassemia-α , tetapi masih terbatas pada aras
9
Biokimiawi melalui skrining hematologis.
Penelitian
tingkat
molekular
untuk
mengetahui dasar molekular penyakit tersebut
pada populasi Medan sampai saat ini belum
pernah
dilakukan.
Sebelumnya
telah
dilaporkan terdapat setidaknya 37 jenis mutan
pada gen globin-α1 dan globin-α2 sebagai
o
+
penyebab thalassemia-α dan thalassemia-α di
10
seluruh dunia (Huisman et al., 1997). Mutasi
paling umum pada populasi Asia–Pasifik
adalah delesi 4,2 Kb dan 3,7 Kb yang
+
menyebabkan thalassemia-α (Hill et al.,
1989). Mutasi paling sering di Populasi Asia
Tenggara yang mendapat pengaruh kuat
SEA
unggun gen Mongoloid adalah mutasi –
sepanjang 17,5 Kb pada gen globin-α1
maupun globin-α2 (Bowden et al., 1992).
Mutan ini menyebabkan sintesis protein
globin-α gagal karena tidak terbentuknya
mRNA, sehingga bentuk homozigotnya
menyebabkan bayi Hydrop Fetalis yang
bersifat lethal (Pressley et al., 1980; Wasi,
12,13
Distribusi mutan tersebar pada
1983).
populasi Thailand, Malaysia dan Philipina
dengan frekuensi polymorfik mencapai 5%
14
(Wasi, 1981).
Pengetahuan tentang dasar molekular
thalassemia-α
sangat
penting
untuk
mempersiapkan prenatal diagnosis pada awal
kehamilan, yang merupakan salah satu strategi
untuk
mengurangi
insidensi
penderita
thalassemia-α yang baru. Sampai saat ini
belum ada terapi kuratif yang memadai untuk
penderita, walaupun cangkok sumsum tulang
telah berhasil dilakukan, tetapi dibutuhkan
Kajian Molukuler Mutant…
biaya yang sangat besar dan survival ratenya
maksimal 15 tahun (Kanokpongsakdi et al.,
15,16
Terapi gen sendiri
1990; Cao et al., 1999).
untuk penderita thalassemia-α memang telah
dilakukan di Amerika tetapi masih terbatas
pada skala penelitian belum untuk pelayanan
17
Dengan
(Weatherall and Clegg, 2001).
demikian dapat disimpulkan bahwa tindakan
preventif merupakan strategi yang paling tepat
dalam managemen penyakit thalassemia.
Berdasarkan latar belakang di atas maka
dilakukan penelitian tentang kajian molekular
thalassemia-α pada penduduk kota Medan
untuk mengetahui keberadaan mutasi paling
SEA
umum del – pada berbagai kelompok suku
di Medan. Data yang diperoleh diharapkan
dapat
menjadi
acuan
dasar
dalam
pengembangan prenatal diagnosis dalam
managemen penyakit thalassemia di Medan
dan sekitarnya sehingga munculnya bayi
hidrop fetalis dan Hb H dapat dihindari.
BAHAN DAN CARA PENELITIAN
Populasi dan Sampel
Sampel DNA dikoleksi dari darah vena
1.521 individu dewasa sehat, pendonor darah
dengan kisaran umur 18–59 tahun, terdiri dari
1.306 laki-laki dan 215 perempuan. Sampel
darah dikoleksi dari 7 kelompok etnik
penduduk kota Medan yang mewakili
populasi penduduk yang dominan. Komposisi
jumlah sampel wakil tiap suku diambil
sedemikian rupa sehingga mendekati keadaan
sebenarnya yang merupakan representasi
komposisi penduduk kota Medan berdasarkan
data Sensus Penduduk tahun 2000 (Katalog
18
BPS; 2110.12.).
Cara Penelitian
Terhadap
51
sampel
darah
dari
keseluruhan 1.521 sampel yang diperiksa,
yang terdeteksi sebagai carrier thalasemia-α,
secara hematologis atau biokimiawi berdasarkan
serangkaian hasil pemeriksaan indeks hematologis,
serum feritin dan tranferin, kuantifikasi HbA2 dan
keberadaan badan inklusi, selanjutnya dilakukan
pemeriksaan DNA.
Isolasi DNA dari buffycoat dilakukan dengan
metode modifikasi Lysis buffer Sucrose–Tris HClSDS (Gibco-BRL) dilanjutkan dengan purifikasi
DNA menggunakan Proteinase-K (Merck) dan
SEA
Proteinase-E (Merck). Deteksi mutan –
dilakukan dengan teknik Polymerase Chaín
Reaction (PCR) menggunakan 3 primer Southeast
Asian Type (Nicholl et al., 1987; Chang et al.,
11,19,20
1991; Bowden et al, 1992) dari Sigma:
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
94
Karangan Asli
Tabel 1. Distribusi jumlah sampel penelitian tiap suku terhadap komposisi penduduk Kota Medan pada Sensus
Penduduk 2000 dan jumlah carrier Thalassemia-α.
Jumlah Sampel
Penelitian
n
%
Suku
1. Batak
503
2. Jawa
466
3. Cina
223
4. Melayu
136
5. Minangkabau
128
6. Aceh
57
7. Nias
8
0
8. Lain-lain suku
Jumlah
1.521
* SP = Sensus Penduduk
Jumlah Penduduk
Medan SP 2000*
%
33,07
641.782
33,70
30,64
628.898
33,03
14,66
202.839
10,65
8,94
125.557
6,59
8,42
163.774
8,60
3,75
53.011
2,78
0,53
13,159
0,69
0,00
75.253
3,95
100
1.904.273
100
A4 Forward = 5’-GGG-GCG- CCT-TGGGGA-GGT-TC-3’
A1B Reverse = 5’-GTT-CCC-TGA-GCCCCG-ACA-CG-3’
A9 Reverse = 5’-ATA-TAT-GGG-TCTGGA-AGT-GTA-TC-3’
Reaksi dilakukan dengan komposisi 10x
buffer PCR (Roche) 2 mM dNTPs (PerkinElmer), 25 mM MgCl2, 10 pmole masingmasing primer
dan 0,2 IU enzim Tag
Polymerase
(Perkin
Elmer)
dengan
Termocycler Gene Amp® PCR System 2400
Perkin Elmer. Siklus PCR diawali dengan hot
start pada 95oC selama 1 menit, annealing
∑ Carrier Thal-α
Ratio ∑ : SP
n
%
Relatif sama
9
1,78
Relatif sama
17
3,64
Relatif sama
15
6,72
Relatif sama
6
4,41
Relatif sama
2
1,56
Relatif sama
2
3,07
Relatif sama
0
0
Berbeda
0
51
0
3,35
dalam buffer TBE 1x (Gibco-BRL) dengan
pengecatan ethidium bromida. Sebagai
standard digunakan DNA marker DNA 100bp
ladder (Amersham Pharmacia Biotech).
HASIL PENELITIAN
Pola elektroforesis hasil PCR DNA mutan
–SEA
17 Kb Southeast Asia type dan pola
del
-SEA
DNA normal atau non-del
pada 1,55%
agarosa dapat dilihat pada gambar berikut:
1
2
3
o
pada suhu 63 C selama 1 menit dikuti dengan
o
fase ekstensi selama 30 detik pada suhu 72 C.
Inkubasi utama dilakukan pada siklus
o
denaturasi pada suhu 95 C selama 1 menit;
o
annealing pada suhu 63 C selama 1 menit dan
o
ekstensi pada suhu 72 C selama 1 menit
sebanyak 30 siklus. Diakhiri dengan fase
o
terminasi dengan suhu denaturasi 95 C selama
o
30 detik; annealing pada 63 C selama 1 menit
o
dan ekstensi pada suhu 72 C selama 10 menit.
Pasangan primer A4 dan A1B akan
menghasilkan fragmen DNA sepanjang 194
bp pada sampel DNA normal maupun
SEA
mutan– , sedangkan pasangan primer A4
dengan A9 akan menghasilkan fragment DNA
sepanjang 570 bp pada sampel DNA mutan–
SEA
dan tidak dijumpai pada DNA normal.
Visualisasi fragment DNA hasil PCR
dilakukan dengan elektroforesis1,55% agarosa
95
570 bp
194 bp
Gambar 1. Pola Elektroforesis 1,55% agarosa hasil
PCR sampel DNA del --SEA . 1= Marker
DNA 100 bp Ladder, 2 = DNA non-del-SEA,
3 = DNA del-SEA
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
Kajian Molukuler Mutant…
Tabel 2. Distribusi Carrier Thalassemia-α0
penduduk Kota Medan
Suku
1. Batak
∑ Sampel
Penelitian
n
%
503
2. Jawa
466
3. Cina
223
4. Melayu
136
5. Minangkabau
6. Aceh
128
57
7. Nias
8
1.521
Jumlah
del –SEA 17,5 Kb dan non- del--SEA 17,5 Kb pada berbagai suku
∑carrier
thal-α
33,07
30,64
14,66
8,94
8,42
3,75
0,53
100
∑carrier
Del-SEA 17,5 kb
∑carrier
Non Del-SEA 17,5 Kb
n
%
n
%
n
%
9
1,78
6
1,19
3
0,59
17
3,64
8
1,71
9
1,93
15
6,72
6
2,69
9
4,03
6
4,41
4
2,94
2
1,47
2
1,56
0
0,00
2
1,56
2
3,07
2
3,50
0
0,00
0
0
0
0,00
0
0,00
51
3,35
26
1,70
25
1,64
Tabel 3. Persentase carrier thal-α del-SEA terhadap seluruh carrier thal-α pada bebagai suku di Medan
∑carrier
thal-α
∑carrier
Del-SEA 17,5 kb
∑carrier
Non Del-SEA 17,5 Kb
Suku
n
%
n
%
n
%
1. Batak
9
100
6
66,7
3
33,3
2. Jawa
17
100
8
47,0
9
53,0
3. Cina
15
100
6
40,0
9
60,0
4. Melayu
6
100
4
66,7
2
33,3
5. Minangkabau
2
100
0
0,0
2
100,0
6. Aceh
2
100
2
100,0
0
0,0
7. Nias
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Jumlah
51
26
50,98
25
49,02
SEA
Deteksi mutasi gen delesi –
17,5 Kb
terhadap 51 sampel DNA carrier thalassemiaα pada penduduk kota Medan menunjukkan
hasil seperti yang diperlihatkan pada Tabel 2.
PEMBAHASAN
Analisis molekular terhadap 51 sampel
DNA yang dicurigai sebagai pembawa sifat
(carrier) thalassemia-α, 26 sampel (51%) di
antaranya ternyata positif mengalami mutasi
-SEA
delesi del
sepanjang 17,5 Kb pada
kromosom 11. Hasil penelitian ini tidak
mengejutkan karena sebelumnya telah
-SEA
dilaporkan bahwa mutasi del
merupakan
mutasi utama pada populasi Asia Tenggara
dan Pasifik di samping mutasi delesi utama
4,2
3,7
lainnya seperti del (α) dan del (α) dan
Fil
Thai
HW
mutasi minor delesi – , -dan – yang
sering dijumpai pada populasi Filipina,
13
Thailand dan Hawai (Wasi, 1983).
SEA
diakibatkan delesi sepanjang
Mutasi –
kira-kira 17,5 Kb yang mengakibatkan
sebagian fragmen kedua gen globin-α, baik α1
maupun α2 ikut hilang, sehingga sintesis
globin-α tidak terjadi atau thalassemia-α0
21
(Liebhaber et al., 1985). Mutan ini banyak
dijumpai pada populasi yang mendapat kuat
unggun gen Mongoloid misalnya Asia Timur
maupun Asia Tenggara. Keberadaan gen ini
dalam suatu populasi perlu diwaspadai karena
bentuk homozigotnya menghasilkan bayi
hydrop fetalis yang bersifat lethal. Jika gen
tersebut berkombinasi dengan alel lainnya
yang juga sering dijumpai pada populasi Asia
4,2
3,7
Tenggara seperti del (α) , del (α) dan
Constant spring (CS)
maka akan
menghasilkan bayi Hb-H yang secara klinik
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
96
Karangan Asli
sama dengan thalassemia Intermedia atau
Mayor yang membutuhkan transfusi darah
rutin seumur hidupnya (Bowden et al.,
11
1997).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
SEA
mutan del–
dominan (>50%) ditemukan
pada total carrier thalassemia-α dibanding
dengan mutan lainnya pada populasi Batak
dan Melayu (66,7%), dan Aceh (100%).
Mutan ini ditemukan dengan frekuensi lebih
rendah pada populasi Medan non-Melayu
yaitu 47% dan 40% pada populasi Jawa dan
China. Angka tersebut relevan dengan hasil
penelitian sebelumnya. George (1994)
SEA
melaporkan bahwa frekuensi gen del– pada
populasi Melayu di Semenanjung Malaya
mencapai 4,5% atau 61,3% dari keseluruhan
22
kasus thalassemia-α. Laporan lainnya juga
menyebutkan bahwa mutasi yang sering
dijumpai pada populasi China adalah del
5,6
(α)((Lie et al., 1982; Yang et al, 1985). Dan
4,2
3,7
pada populasi Jawa del (α) , del (α)
8
(Setianingsih et al., 2003). Jika dilihat dari
frekuensi gen dalam populasi secara
keseluruhan maka mutant ini paling banyak
dijumpai berturut-turut pada populasi Aceh
(3.5%); Melayu (2.97%); China (2,69%); Jawa
(1.71%) dan Batak (1,19%) dan tidak
dijumpai pada populasi Minangkabau and
Nias.
Hasil penelitian ini sangat berguna dalam
pengembangan prenatal diagnosis untuk
populasi Medan, dengan menetapkan mutasi
SEA
del– menjadi prioritas utama dalam skrining
prenatal diagnosis pada pasangan pembawa
sifat thalassemia-α, terutama jika mereka
berasal dari etnik Batak, Melayu, Aceh, Jawa,
dan China.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
bahwa:
- Mutant thalassemia-α paling sering
dijumpai pada populasi Medan adalah del
SEA
-
97
-SEA
Mutan del dijumpai terutama pada suku
Aceh, Batak dan Jawa melebihi 50% dari
total kasus thalassemia-αyang ada.
Hasil penelitian dapat dilakukan sebagai
acuan untuk pengembangan Prenatal
Diagnosis thalassemia-α untuk populasi
-SEA
Medan dengan menetapkan mutan del
sebagai prioritas utama deteksi.
DAFTAR PUSTAKA
1. Flint J, Harding R, Clegg JB and Boyce A
(1993). Why are some genetic diseases so
common? Distinguishing selection from
other process by molecular analysis of
globin gene variants. Hum Genet. 91:91117.
2. Hill, A.V.S., O’Shaughnessy, D.F. and
Clegg, J.B. 1989. Haemoglobin and globin
gene variants in the Pacific. In: Hill
A.V.S. and Serjeantson S.W. (eds); The
Colonization of the Pacific; a genetic trial.
Clarendon Press. Oxford. UK.
3. WHO (1994) Guidelines for the control
of haemoglobin disorders. Report of the
VIth annual Meeting of the WHO
Working Group on Haemoglobinopathies.
Cagliari. Sardinia, 8-9 April 1989. Word
Health Organization, Geneva.
4. Higgs D.R, Wood WG., Jarman A.P.,
Vickers M.A., Wilkie A.O., Lamb J., Vyas
P and Bannett J.P. (1990) The alpha
thalassenias. Ann.N.Y. Acad.Sci. 612:15-
22.
5. Li, AMC, Lee, FT and Tood D (1982)
The screening of Chinese blood cord
blood for hemoglobinopathies. Hum
Hered 32 : 62-65
6. Yang TY, Yang XY and Chen WC (1985)
Thalassemia in China. Ann N.Y. Acad.
Sci 445: 92-97.
7. Wong H.B (1983) Thalassemia as
community health in Southeast Asia.
Naskah Lengkap Kongres National
PHDTI. Yogyakarta 24-26 September
1983.
8. Setianingsih,
Nainggolan,
I., Harahap, A. and
I.M.
2003.
Alpha
thalassaemia in Indonesia: phenotypes and
molecular defects. Tropical Diseases,
Edited by Marzuki, Verhoef, and Snippe.
Kluwer Academic/Plenum Publishers,
New York. 47-56.
9. Hariman, H., Abdullah, I., Nasution, B.
1984. Some aspects of alpha-thalassamias
in the region. Medika X(1). 54: 24-28.
10. Huisman, T.H.J., Carver, M.F.H. and
Baysal, E. 1997. A Syllabus of
Thalassemia Mutations. The Sickle Cell
Anemia Foundation, Augusta. GA. P 235.
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
11. Bowden, D.K., Vickers, M.A. and Higgs,
D.R. 1992. A PCR-based strategy to
detect the common severe determinants
of α-thalassemia. Br. J. Haematol. 81:
104-108.
12. Pressley, L., Higgs, D.R., Clegg, J.B. and
Weatherall, D.J. 1980. Gene deletions in
an α thalassemia prove that the 5’ξ locus
is functional. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
77: 3586-3589.
13. Wasi, P. 1983. Population Screening. In:
Weatherall, D.J. (ed). Method in
Hematology. The Thalassemias. London.
Churchill Livingstone. 134-144.
14. Wasi, P. 1981. Haemoglobinopathies
including thalassemia. Clin. Haematol.
10: 707-729.
15. Kanokpongsakdi, S., Winichagoon, P. and
Fucharoen,
S.
1990.
Control
of
thalassaemia in Southeast Asia. Journal of
Paediatrics, Obstetrics and Gynaecology.
Thailand. 9-14.
16. Cao, A., Galanello, R. and Rosatelli, M.C.
1999. Prenatal diagnosis and screening of
the haemaglobinopathies. The Electronic
Journal Of the International Federation
Of Clinical Chemistry And Laboratory
Medicine. Italy. 3: 1-11.
Kajian Molukuler Mutant…
17. Weatherall DJ and Clegg JB (2001) The
Thalassemia Syndromes, 4th eds. Blackwell
Scientific Publ. Oxford. P 31-32
18. Badan Pusat Statistik Propinsi Sumatera
Utara. 2001. Angka Sementara Penduduk
Sumatera Utara : Hasil Sensus Penduduk
2000. Katalog BPS: 2110.12.
19. Nicholls, R.D., Fischel-Ghodsian, N.,
Higgs, D.R. 1987. Recombination at the
human α-globin gene cluster: sequence
features and topological constraints. Cell.
49: 369-374.
20. Liebhaber S.A, Goorsens M and Kan Y.W
(1981) Cloning ang complete nucleotide
sequence of the human 5’α-globin gene.
Proc. Natl.Acad.Scid USA 77:7054-7063.
21. Chang, J.G., L.S., Lin, C.P and Chen C.P.
1991. Rapid diagnosis of -thalassaemia-1
of Southeast Asia type and hydrops fetalis
by polymerase chain reaction. Blood. 78:
853-854
22. George, E., 1994. Diagnosis Pranatal
Talasemia
di
Malaysia.
Universiti
Kebangsaan Malaysia. 10-26.
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
98
Ratna Akbari Ganie
Departemen Patologi Klini, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara, Medan
Abstrak: Jumlah total dari 1.521 merupakan individu dewasa sehat dari tujuh kelompok etnik
berbeda yang hidup di kota Medan yang tersaring pembawa α thalessemia dengan hemoglobin
electrophoresis. Diantara semua sampel, 51 orang dicurigai terdapat ciri thalassemia, mutasi DNA
dideteksi dengan metode PCR. Mutasi 21 del-SEA ditemukan pada suku Aceh sebanyak 3.5%,
2.97% di suku Melayu, 2,69% Cina, 1,71% suku Jawa, 1.19% suku Batak dan tidak ditemukan
pada suku Minangkabau dan Nias. Mutasi 21 del-SEA biasanya juga ditemukan pada populasi di
Asia Tenggara dan Pasifik atau gen Mongoloid dan Malenesian sepanjang 17.5 kb pada gen globin
α1 maupun α1. Penggolongan subjek homozigot dengan cara menurunkan atau menghilangkan gen
globin pada hipokromik, anemia hemolitik, dan ketergantungan pada tranfusi darah untuk
memperpanjang hidup orang yang terjangkit thalassemia-α. Berdasarkan pada pembiayaan ini,
dapat dipahami bahwa semua kelompok etnik yang ada di Medan secara genetik termasuk ke
dalam bagian gen Mongolia dan Malanesia.
Kata kunci: α-thalassemia, mutan del-SEA, kelompok etnik di Medan
Abstract: A total number of 1.521 apparently healthy adult individuals from seven mayor
different ethnic groups who habited Medan were screened for α-thalassemia carrier by
hemoglobin electrophoresis. Among these, 51 subjects were suspected as α-thalassemia trait; the
DNA mutation were determined using PCR method to detect the del-SEA mutation performance.
During this study, 21 del-SEA mutations have been identified by specific olygonucleotides primers
in descending frequencies, 3.5% in Aceh; 2.97% in Malay; 2,69% in Chinese; 1.71% in Javanese;
1,19% in Batak and absent in Minang and Nias. The del-SEA mutant was commonly found in
Southeast Asian and Pacific populations or Mongoloid and Melanesian gene pools result in about
17.5 Kb deletion along the α1 and α2 globin genes. The homozygote subject characterized by
reduced or absent of α-globin gene expression leading to hypochromic, hemolytic anemia and
dependence on blood transfusions to sustain life which was known as thalassemia-α. Based on this
funding, understandable that these Medan’s ethnic groups genetically share the Mongoloid and
Melanesian gene pools.
Keywords: α-thalassemia, del-SEA mutant, Medan’s ethnic group
PENDAHULUAN
Seperti daerah endemik malaria lainnya,
keberadaan
penyakit
thalassemia
dan
hemoglobinopatia pada penduduk Indonesia
cukup tinggi, sebagai seleksi positif terhadap invasi
1
plasmodium (Flint et al., 1993). Dari beberapa
penelitian terdahulu telah dilaporkan bahwa
keberadaan thalassemia-β dan Hemoglobin-E
cukup tinggi baik dalam skala sporadis maupun
nasional, bahkan pada beberapa populasi
frekuensinya mencapai >15%. Sementara itu,
penelitian tentang keberadaan thalassemia-α
masih sangat terbatas, walaupun telah dilaporkan
oleh Hill et al., (1989) bahwa prevalensi mutasi
93
yang menyebabkan gangguan sintesis globin-α
ini cukup tinggi pada populasi Asia Daratan
2
dan Pasifik. WHO (1994) memperkirakan
terdapat
kira-kira
13.000–16.000
bayi
thalassemia-α baru, lahir setiap tahunnya di
seluruh dunia dan jika mereka dapat mencapai
usia dewasa maka diperkirakan ada 680.000
penderita thalassemia-α di Asia Tenggara
3,4
Prevalensi thalasemia-α
(Higgs, 1983).
sangat tinggi pada ras Mongoloid terutama di
China daratan yang pada beberapa populasi
terdahulu dapat mencapai 42% ((Lie et al.,
5,6
1982; Yang et al, 1985).
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
Sementara itu, angka yang banyak dirujuk
para ahli epidemiologi genetic Indonesia
adalah
estimasi
Wong
(1983)
yang
memperkirakan terdapat kira-kira 0,5% carrier
thalassemia-α di Indonesia secara nasional,
jauh di bawah angka pembawa sifat
thalassemia-β yang diperkirakan mencapai
7
3,5% dan Hb-E yang mencapai 5%. Nanum
demikian banyak peneliti percaya bahwa
angka thalassemia-α jauh di atas angka
tersebut, bahkan pada beberapa populasi
Indonesia di Jawa, Kalimantan, dan Sulawesi
yang telah diteliti mencapai 2,5- 3-2%
8
Dugaan tersebut
(Setianingsih, 2003).
diperkuat dengan keberadaan kasus bayi
Hydrop Fetalis dan Hb-H yang dijumpai di
rumah sakit-rumah sakit rujukan cukup tinggi.
Walaupun keberadaan thalassemia-α di
Medan telah pernah dilaporkan sebelumnya
oleh Hariman et al.(1984) yaitu masingo
masing sebesar 2,5% untuk thalassemia-α dan
+
thalassemia-α , tetapi masih terbatas pada aras
9
Biokimiawi melalui skrining hematologis.
Penelitian
tingkat
molekular
untuk
mengetahui dasar molekular penyakit tersebut
pada populasi Medan sampai saat ini belum
pernah
dilakukan.
Sebelumnya
telah
dilaporkan terdapat setidaknya 37 jenis mutan
pada gen globin-α1 dan globin-α2 sebagai
o
+
penyebab thalassemia-α dan thalassemia-α di
10
seluruh dunia (Huisman et al., 1997). Mutasi
paling umum pada populasi Asia–Pasifik
adalah delesi 4,2 Kb dan 3,7 Kb yang
+
menyebabkan thalassemia-α (Hill et al.,
1989). Mutasi paling sering di Populasi Asia
Tenggara yang mendapat pengaruh kuat
SEA
unggun gen Mongoloid adalah mutasi –
sepanjang 17,5 Kb pada gen globin-α1
maupun globin-α2 (Bowden et al., 1992).
Mutan ini menyebabkan sintesis protein
globin-α gagal karena tidak terbentuknya
mRNA, sehingga bentuk homozigotnya
menyebabkan bayi Hydrop Fetalis yang
bersifat lethal (Pressley et al., 1980; Wasi,
12,13
Distribusi mutan tersebar pada
1983).
populasi Thailand, Malaysia dan Philipina
dengan frekuensi polymorfik mencapai 5%
14
(Wasi, 1981).
Pengetahuan tentang dasar molekular
thalassemia-α
sangat
penting
untuk
mempersiapkan prenatal diagnosis pada awal
kehamilan, yang merupakan salah satu strategi
untuk
mengurangi
insidensi
penderita
thalassemia-α yang baru. Sampai saat ini
belum ada terapi kuratif yang memadai untuk
penderita, walaupun cangkok sumsum tulang
telah berhasil dilakukan, tetapi dibutuhkan
Kajian Molukuler Mutant…
biaya yang sangat besar dan survival ratenya
maksimal 15 tahun (Kanokpongsakdi et al.,
15,16
Terapi gen sendiri
1990; Cao et al., 1999).
untuk penderita thalassemia-α memang telah
dilakukan di Amerika tetapi masih terbatas
pada skala penelitian belum untuk pelayanan
17
Dengan
(Weatherall and Clegg, 2001).
demikian dapat disimpulkan bahwa tindakan
preventif merupakan strategi yang paling tepat
dalam managemen penyakit thalassemia.
Berdasarkan latar belakang di atas maka
dilakukan penelitian tentang kajian molekular
thalassemia-α pada penduduk kota Medan
untuk mengetahui keberadaan mutasi paling
SEA
umum del – pada berbagai kelompok suku
di Medan. Data yang diperoleh diharapkan
dapat
menjadi
acuan
dasar
dalam
pengembangan prenatal diagnosis dalam
managemen penyakit thalassemia di Medan
dan sekitarnya sehingga munculnya bayi
hidrop fetalis dan Hb H dapat dihindari.
BAHAN DAN CARA PENELITIAN
Populasi dan Sampel
Sampel DNA dikoleksi dari darah vena
1.521 individu dewasa sehat, pendonor darah
dengan kisaran umur 18–59 tahun, terdiri dari
1.306 laki-laki dan 215 perempuan. Sampel
darah dikoleksi dari 7 kelompok etnik
penduduk kota Medan yang mewakili
populasi penduduk yang dominan. Komposisi
jumlah sampel wakil tiap suku diambil
sedemikian rupa sehingga mendekati keadaan
sebenarnya yang merupakan representasi
komposisi penduduk kota Medan berdasarkan
data Sensus Penduduk tahun 2000 (Katalog
18
BPS; 2110.12.).
Cara Penelitian
Terhadap
51
sampel
darah
dari
keseluruhan 1.521 sampel yang diperiksa,
yang terdeteksi sebagai carrier thalasemia-α,
secara hematologis atau biokimiawi berdasarkan
serangkaian hasil pemeriksaan indeks hematologis,
serum feritin dan tranferin, kuantifikasi HbA2 dan
keberadaan badan inklusi, selanjutnya dilakukan
pemeriksaan DNA.
Isolasi DNA dari buffycoat dilakukan dengan
metode modifikasi Lysis buffer Sucrose–Tris HClSDS (Gibco-BRL) dilanjutkan dengan purifikasi
DNA menggunakan Proteinase-K (Merck) dan
SEA
Proteinase-E (Merck). Deteksi mutan –
dilakukan dengan teknik Polymerase Chaín
Reaction (PCR) menggunakan 3 primer Southeast
Asian Type (Nicholl et al., 1987; Chang et al.,
11,19,20
1991; Bowden et al, 1992) dari Sigma:
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
94
Karangan Asli
Tabel 1. Distribusi jumlah sampel penelitian tiap suku terhadap komposisi penduduk Kota Medan pada Sensus
Penduduk 2000 dan jumlah carrier Thalassemia-α.
Jumlah Sampel
Penelitian
n
%
Suku
1. Batak
503
2. Jawa
466
3. Cina
223
4. Melayu
136
5. Minangkabau
128
6. Aceh
57
7. Nias
8
0
8. Lain-lain suku
Jumlah
1.521
* SP = Sensus Penduduk
Jumlah Penduduk
Medan SP 2000*
%
33,07
641.782
33,70
30,64
628.898
33,03
14,66
202.839
10,65
8,94
125.557
6,59
8,42
163.774
8,60
3,75
53.011
2,78
0,53
13,159
0,69
0,00
75.253
3,95
100
1.904.273
100
A4 Forward = 5’-GGG-GCG- CCT-TGGGGA-GGT-TC-3’
A1B Reverse = 5’-GTT-CCC-TGA-GCCCCG-ACA-CG-3’
A9 Reverse = 5’-ATA-TAT-GGG-TCTGGA-AGT-GTA-TC-3’
Reaksi dilakukan dengan komposisi 10x
buffer PCR (Roche) 2 mM dNTPs (PerkinElmer), 25 mM MgCl2, 10 pmole masingmasing primer
dan 0,2 IU enzim Tag
Polymerase
(Perkin
Elmer)
dengan
Termocycler Gene Amp® PCR System 2400
Perkin Elmer. Siklus PCR diawali dengan hot
start pada 95oC selama 1 menit, annealing
∑ Carrier Thal-α
Ratio ∑ : SP
n
%
Relatif sama
9
1,78
Relatif sama
17
3,64
Relatif sama
15
6,72
Relatif sama
6
4,41
Relatif sama
2
1,56
Relatif sama
2
3,07
Relatif sama
0
0
Berbeda
0
51
0
3,35
dalam buffer TBE 1x (Gibco-BRL) dengan
pengecatan ethidium bromida. Sebagai
standard digunakan DNA marker DNA 100bp
ladder (Amersham Pharmacia Biotech).
HASIL PENELITIAN
Pola elektroforesis hasil PCR DNA mutan
–SEA
17 Kb Southeast Asia type dan pola
del
-SEA
DNA normal atau non-del
pada 1,55%
agarosa dapat dilihat pada gambar berikut:
1
2
3
o
pada suhu 63 C selama 1 menit dikuti dengan
o
fase ekstensi selama 30 detik pada suhu 72 C.
Inkubasi utama dilakukan pada siklus
o
denaturasi pada suhu 95 C selama 1 menit;
o
annealing pada suhu 63 C selama 1 menit dan
o
ekstensi pada suhu 72 C selama 1 menit
sebanyak 30 siklus. Diakhiri dengan fase
o
terminasi dengan suhu denaturasi 95 C selama
o
30 detik; annealing pada 63 C selama 1 menit
o
dan ekstensi pada suhu 72 C selama 10 menit.
Pasangan primer A4 dan A1B akan
menghasilkan fragmen DNA sepanjang 194
bp pada sampel DNA normal maupun
SEA
mutan– , sedangkan pasangan primer A4
dengan A9 akan menghasilkan fragment DNA
sepanjang 570 bp pada sampel DNA mutan–
SEA
dan tidak dijumpai pada DNA normal.
Visualisasi fragment DNA hasil PCR
dilakukan dengan elektroforesis1,55% agarosa
95
570 bp
194 bp
Gambar 1. Pola Elektroforesis 1,55% agarosa hasil
PCR sampel DNA del --SEA . 1= Marker
DNA 100 bp Ladder, 2 = DNA non-del-SEA,
3 = DNA del-SEA
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
Kajian Molukuler Mutant…
Tabel 2. Distribusi Carrier Thalassemia-α0
penduduk Kota Medan
Suku
1. Batak
∑ Sampel
Penelitian
n
%
503
2. Jawa
466
3. Cina
223
4. Melayu
136
5. Minangkabau
6. Aceh
128
57
7. Nias
8
1.521
Jumlah
del –SEA 17,5 Kb dan non- del--SEA 17,5 Kb pada berbagai suku
∑carrier
thal-α
33,07
30,64
14,66
8,94
8,42
3,75
0,53
100
∑carrier
Del-SEA 17,5 kb
∑carrier
Non Del-SEA 17,5 Kb
n
%
n
%
n
%
9
1,78
6
1,19
3
0,59
17
3,64
8
1,71
9
1,93
15
6,72
6
2,69
9
4,03
6
4,41
4
2,94
2
1,47
2
1,56
0
0,00
2
1,56
2
3,07
2
3,50
0
0,00
0
0
0
0,00
0
0,00
51
3,35
26
1,70
25
1,64
Tabel 3. Persentase carrier thal-α del-SEA terhadap seluruh carrier thal-α pada bebagai suku di Medan
∑carrier
thal-α
∑carrier
Del-SEA 17,5 kb
∑carrier
Non Del-SEA 17,5 Kb
Suku
n
%
n
%
n
%
1. Batak
9
100
6
66,7
3
33,3
2. Jawa
17
100
8
47,0
9
53,0
3. Cina
15
100
6
40,0
9
60,0
4. Melayu
6
100
4
66,7
2
33,3
5. Minangkabau
2
100
0
0,0
2
100,0
6. Aceh
2
100
2
100,0
0
0,0
7. Nias
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Jumlah
51
26
50,98
25
49,02
SEA
Deteksi mutasi gen delesi –
17,5 Kb
terhadap 51 sampel DNA carrier thalassemiaα pada penduduk kota Medan menunjukkan
hasil seperti yang diperlihatkan pada Tabel 2.
PEMBAHASAN
Analisis molekular terhadap 51 sampel
DNA yang dicurigai sebagai pembawa sifat
(carrier) thalassemia-α, 26 sampel (51%) di
antaranya ternyata positif mengalami mutasi
-SEA
delesi del
sepanjang 17,5 Kb pada
kromosom 11. Hasil penelitian ini tidak
mengejutkan karena sebelumnya telah
-SEA
dilaporkan bahwa mutasi del
merupakan
mutasi utama pada populasi Asia Tenggara
dan Pasifik di samping mutasi delesi utama
4,2
3,7
lainnya seperti del (α) dan del (α) dan
Fil
Thai
HW
mutasi minor delesi – , -dan – yang
sering dijumpai pada populasi Filipina,
13
Thailand dan Hawai (Wasi, 1983).
SEA
diakibatkan delesi sepanjang
Mutasi –
kira-kira 17,5 Kb yang mengakibatkan
sebagian fragmen kedua gen globin-α, baik α1
maupun α2 ikut hilang, sehingga sintesis
globin-α tidak terjadi atau thalassemia-α0
21
(Liebhaber et al., 1985). Mutan ini banyak
dijumpai pada populasi yang mendapat kuat
unggun gen Mongoloid misalnya Asia Timur
maupun Asia Tenggara. Keberadaan gen ini
dalam suatu populasi perlu diwaspadai karena
bentuk homozigotnya menghasilkan bayi
hydrop fetalis yang bersifat lethal. Jika gen
tersebut berkombinasi dengan alel lainnya
yang juga sering dijumpai pada populasi Asia
4,2
3,7
Tenggara seperti del (α) , del (α) dan
Constant spring (CS)
maka akan
menghasilkan bayi Hb-H yang secara klinik
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
96
Karangan Asli
sama dengan thalassemia Intermedia atau
Mayor yang membutuhkan transfusi darah
rutin seumur hidupnya (Bowden et al.,
11
1997).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
SEA
mutan del–
dominan (>50%) ditemukan
pada total carrier thalassemia-α dibanding
dengan mutan lainnya pada populasi Batak
dan Melayu (66,7%), dan Aceh (100%).
Mutan ini ditemukan dengan frekuensi lebih
rendah pada populasi Medan non-Melayu
yaitu 47% dan 40% pada populasi Jawa dan
China. Angka tersebut relevan dengan hasil
penelitian sebelumnya. George (1994)
SEA
melaporkan bahwa frekuensi gen del– pada
populasi Melayu di Semenanjung Malaya
mencapai 4,5% atau 61,3% dari keseluruhan
22
kasus thalassemia-α. Laporan lainnya juga
menyebutkan bahwa mutasi yang sering
dijumpai pada populasi China adalah del
5,6
(α)((Lie et al., 1982; Yang et al, 1985). Dan
4,2
3,7
pada populasi Jawa del (α) , del (α)
8
(Setianingsih et al., 2003). Jika dilihat dari
frekuensi gen dalam populasi secara
keseluruhan maka mutant ini paling banyak
dijumpai berturut-turut pada populasi Aceh
(3.5%); Melayu (2.97%); China (2,69%); Jawa
(1.71%) dan Batak (1,19%) dan tidak
dijumpai pada populasi Minangkabau and
Nias.
Hasil penelitian ini sangat berguna dalam
pengembangan prenatal diagnosis untuk
populasi Medan, dengan menetapkan mutasi
SEA
del– menjadi prioritas utama dalam skrining
prenatal diagnosis pada pasangan pembawa
sifat thalassemia-α, terutama jika mereka
berasal dari etnik Batak, Melayu, Aceh, Jawa,
dan China.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
bahwa:
- Mutant thalassemia-α paling sering
dijumpai pada populasi Medan adalah del
SEA
-
97
-SEA
Mutan del dijumpai terutama pada suku
Aceh, Batak dan Jawa melebihi 50% dari
total kasus thalassemia-αyang ada.
Hasil penelitian dapat dilakukan sebagai
acuan untuk pengembangan Prenatal
Diagnosis thalassemia-α untuk populasi
-SEA
Medan dengan menetapkan mutan del
sebagai prioritas utama deteksi.
DAFTAR PUSTAKA
1. Flint J, Harding R, Clegg JB and Boyce A
(1993). Why are some genetic diseases so
common? Distinguishing selection from
other process by molecular analysis of
globin gene variants. Hum Genet. 91:91117.
2. Hill, A.V.S., O’Shaughnessy, D.F. and
Clegg, J.B. 1989. Haemoglobin and globin
gene variants in the Pacific. In: Hill
A.V.S. and Serjeantson S.W. (eds); The
Colonization of the Pacific; a genetic trial.
Clarendon Press. Oxford. UK.
3. WHO (1994) Guidelines for the control
of haemoglobin disorders. Report of the
VIth annual Meeting of the WHO
Working Group on Haemoglobinopathies.
Cagliari. Sardinia, 8-9 April 1989. Word
Health Organization, Geneva.
4. Higgs D.R, Wood WG., Jarman A.P.,
Vickers M.A., Wilkie A.O., Lamb J., Vyas
P and Bannett J.P. (1990) The alpha
thalassenias. Ann.N.Y. Acad.Sci. 612:15-
22.
5. Li, AMC, Lee, FT and Tood D (1982)
The screening of Chinese blood cord
blood for hemoglobinopathies. Hum
Hered 32 : 62-65
6. Yang TY, Yang XY and Chen WC (1985)
Thalassemia in China. Ann N.Y. Acad.
Sci 445: 92-97.
7. Wong H.B (1983) Thalassemia as
community health in Southeast Asia.
Naskah Lengkap Kongres National
PHDTI. Yogyakarta 24-26 September
1983.
8. Setianingsih,
Nainggolan,
I., Harahap, A. and
I.M.
2003.
Alpha
thalassaemia in Indonesia: phenotypes and
molecular defects. Tropical Diseases,
Edited by Marzuki, Verhoef, and Snippe.
Kluwer Academic/Plenum Publishers,
New York. 47-56.
9. Hariman, H., Abdullah, I., Nasution, B.
1984. Some aspects of alpha-thalassamias
in the region. Medika X(1). 54: 24-28.
10. Huisman, T.H.J., Carver, M.F.H. and
Baysal, E. 1997. A Syllabus of
Thalassemia Mutations. The Sickle Cell
Anemia Foundation, Augusta. GA. P 235.
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
Ratna Akbari Ganie
11. Bowden, D.K., Vickers, M.A. and Higgs,
D.R. 1992. A PCR-based strategy to
detect the common severe determinants
of α-thalassemia. Br. J. Haematol. 81:
104-108.
12. Pressley, L., Higgs, D.R., Clegg, J.B. and
Weatherall, D.J. 1980. Gene deletions in
an α thalassemia prove that the 5’ξ locus
is functional. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
77: 3586-3589.
13. Wasi, P. 1983. Population Screening. In:
Weatherall, D.J. (ed). Method in
Hematology. The Thalassemias. London.
Churchill Livingstone. 134-144.
14. Wasi, P. 1981. Haemoglobinopathies
including thalassemia. Clin. Haematol.
10: 707-729.
15. Kanokpongsakdi, S., Winichagoon, P. and
Fucharoen,
S.
1990.
Control
of
thalassaemia in Southeast Asia. Journal of
Paediatrics, Obstetrics and Gynaecology.
Thailand. 9-14.
16. Cao, A., Galanello, R. and Rosatelli, M.C.
1999. Prenatal diagnosis and screening of
the haemaglobinopathies. The Electronic
Journal Of the International Federation
Of Clinical Chemistry And Laboratory
Medicine. Italy. 3: 1-11.
Kajian Molukuler Mutant…
17. Weatherall DJ and Clegg JB (2001) The
Thalassemia Syndromes, 4th eds. Blackwell
Scientific Publ. Oxford. P 31-32
18. Badan Pusat Statistik Propinsi Sumatera
Utara. 2001. Angka Sementara Penduduk
Sumatera Utara : Hasil Sensus Penduduk
2000. Katalog BPS: 2110.12.
19. Nicholls, R.D., Fischel-Ghodsian, N.,
Higgs, D.R. 1987. Recombination at the
human α-globin gene cluster: sequence
features and topological constraints. Cell.
49: 369-374.
20. Liebhaber S.A, Goorsens M and Kan Y.W
(1981) Cloning ang complete nucleotide
sequence of the human 5’α-globin gene.
Proc. Natl.Acad.Scid USA 77:7054-7063.
21. Chang, J.G., L.S., Lin, C.P and Chen C.P.
1991. Rapid diagnosis of -thalassaemia-1
of Southeast Asia type and hydrops fetalis
by polymerase chain reaction. Blood. 78:
853-854
22. George, E., 1994. Diagnosis Pranatal
Talasemia
di
Malaysia.
Universiti
Kebangsaan Malaysia. 10-26.
Majalah Kedokteran Nusantara Volume 41 y No. 2 y Juni 2008
98