Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur
IDENTIFIKASI KARAKTER UNGGULAN DAN INTROGRESI
DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Ihsan Mentaya Putra
NIM G840080064
ABSTRAK
IHSAN MENTAYA PUTRA. Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi
DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO
HAMI SENO dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Pertumbuhan jumlah penduduk yang terus berkembang membuat lahan
pertanian mulai berkurang sehingga diperlukan varietas padi yang mampu
meningkatkan hasil produksi padi. Salah satu alternatif dengan pemuliaan
tanaman padi dengan bantuan teknologi marka molekuler. Penelitian ini bertujuan
untuk mempelajari korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk
strategi pengembangan varietas unggul baru. Padi Bio-148 yang digunakan
merupakan padi hasil persilangan IR64-Gajah Mungkur. Karakterisasi Padi Bio148 yang diamati dan diukur ialah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai
per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan sekunder, bobot
1000 butir dibandingkan dengan kedua tetuanya. Marka molekuler yang
digunakan adalah marka SSR (mikrosatelit) dengan 57 primer yang terletak pada
kromosom 1 sampai 12. Hasil penelitian jumlah cabang primer, sekunder, jumlah
gabah isi, dan hampa padi Bio-148 lebih unggul dari IR64 dan Gajah Mungkur.
Hasil survei molekuler menggunakan gel akrilamid menghasilkan fragmen
berukuran 100-200 pb. Hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa terdapat
introgresi beberapa segmen kromosom Gajah Mungkur yang bertanggung jawab
terhadap karakter unggul padi Bio-148 seperti, jumlah gabah, bobot gabah, gabah
isi, dan jumlah malai terletak pada kromosom 5,7, dan 10 padi Bio-148.
Kata kunci: karakter unggul, padi, pemuliaan tanaman, SSR.
ABSTRACT
IHSAN MENTAYA PUTRA. Superior Character Identification and DNA
Introgressed Derivatives IR64-Gajah Mungkur. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
The growth of a population that is constantly evolving to make farmland
diminished so needed rice varieties which are able to increase the yield of rice.
One alternative to breeding rice plants with the help of molecular markers
technology. The objective of this study was find correlation between introgressed
and character, then strategy of new superior varieties development. Bio-148 rice
that used as result of cross IR64 rice-Gajah Mungkur. Characterization of Rice
Bio- 148 was observed and measured plant height, days to flowering, number of
panicles per plant, number of grains per panicle, number of primary and
secondary branches, 1000 grain weight compared with both parent. Molecular
markers used were SSR markers (microsatellites) with 57 primer located on
chromosome 1 to 12. Results showed number of primary and secondary branches
and number of grains. Molecular survey results using acrylamide gel fragment
size of 100-200 bp. Molecular analysis of the results showed that there were
introgressed chromosome segments Gajah Mungkur responsible for the superior
character of Bio-148 i.e. grain number, grain weight, filled grains, and the number
of panicles located on chromosome 5,7, and 10 Bio-148 rice.
Keywords : Plant breeding, rice, SSR, superior character.
IDENTIFIKASI KARAKTER UNGGULAN DAN INTROGRESI
DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ii
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan
IR64-Gajah Mungkur
Nama
: Ihsan Mentaya Putra
NIM
: G84080064
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSc
Pembimbing I
Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MSc App
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Untaian rasa syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas segala
nikmat dan karunia-Nya penulisan penelitian yang berjudul “Identifikasi Karakter
Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR 64-Gajah Mungkur” dapat
diselesaikan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Agustus 2012
bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen),
Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu, Bogor.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan usulan penelitian ini antara lain Dr Djarot Sasongko Hami
Seno, MSc dan Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko selaku pembimbing skripsi.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan penelitian ini. Penulis menyadari tentang kekurangan
dalam penulisan penelitian ini, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan
kritik yang dapat membuat penulisan berikutnya lebih baik. Akhir kata, penulis
berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak demi
kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Mei 2013
Ihsan Mentaya Putra
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Percobaan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakter Unggulan
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA Padi
Analisis Introgresi
Pembahasan
Karakter Unggulan
Isolasi DNA Padi
Amplifikasi DNA Padi
Analisis Introgresi
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
vi
vi
vi
1
2
2
2
2
3
4
4
4
6
6
7
8
8
10
10
11
12
12
14
DAFTAR TABEL
1 Karakter unggul padi
2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi
3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil
4 Konsentrasi dan kemurnian DNA
5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148
5
5
6
6
8
DAFTAR GAMBAR
1 Malai tanaman padi
2 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 1-9
3 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 10-22
4 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 23-43
5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148
5
6
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alur penelitian
2 Primer SSR
3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA)
4 Analisis statistik dengan uji Duncan
5 Reagen
14
15
17
19
20
PENDAHULUAN
Pesatnya peningkatan populasi penduduk dan semakin berkurangnya lahan
pertanian dapat menimbulkan kesulitan pangan di masa mendatang. Indonesia
dengan jumlah penduduk 237.641.326 jiwa pada tahun 2010 dengan rata-rata
pertumbuhan penduduk 1,49% per tahun dan luas areal panen 11,8 juta hektar dengan
konsumsi per kapita rata-rata 113,48 kg per tahun dihadapkan ancaman bagi
ketahanan pangan (BPS 2012). Konstribusi padi yang telah ada terhadap produksi
padi nasional masih relatif rendah, sehingga pengembangannya masih terus
diupayakan. Rendahnya produktivitas padi gogo disebabkan oleh kondisi iklim dan
tanah yang bervariasi, penerapan teknologi budidaya yang belum optimal terutama
dalam penggunaan varietas unggul.
Target program ketahanan pangan adalah meningkatkan produksi padi
sehingga dicapai swadaya nasional, diantaranya melalui pengembangan tanaman
padi produktif. Intensifikasi kegiatan pemuliaan tanaman dapat dilakukan melalui
perakitan varietas unggul baru yang berdaya hasil tinggi, berkualitas, serta resisten
terhadap kendala biotik dan abiotik. Varietas unggul memberikan manfaat teknis
dan ekonomis yang banyak bagi perkembangan pertanian, diantaranya pertumbuhan
tanaman menjadi seragam sehingga panen serempak, rendemen lebih tinggi, mutu
hasil lebih tinggi dan sesuai dengan selera konsumen, dan tanaman akan mempunyai
ketahanan yang tinggi terhadap hama dan penyakit, serta adaptasi yang tinggi
terhadap lingkungan sehingga dapat memperkecil penggunaan pupuk dan pestisida.
(Shivanna & Sawhney 1997).
Penelitian dan perakitan padi tipe baru di Indonesia telah dimulai sejak
tahun 1995. Pada tahun 2001 program penelitian padi tipe baru menjadi program
baru Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. Pada tahun 2005 telah dihasilkan lebih
dari 4000 kombinasi persilangan padi tipe baru, empat varietas unggul yaitu
Cimelati, Ciapus, Gilirang, dan Fatmawati. Tiga varietas pertama adalah varietas
unggul semi tipe baru (VUSTB), sedangkan Fatmawati adalah varietas unggul
tipe baru (VUTB) perdana (Abdullah et al. 2005).
Perakitan padi tipe baru dengan bantuan teknologi molekular terbukti dapat
membantu introgresi gen ke dalam tanaman budidaya. Persilangan silang balik (
backcross ) dipandang sebagai teknik persilangan yang dapat diterapkan untuk
mentransfer satu atau beberapa gen yang diinginkan dari tanaman donor ke
tanaman penerima. Namun demikian diperlukan persilangan silang balik beberapa
kali agar diperoleh introgresi yang diinginkan dan seminimal mungkin membawa
introgresi negatif ( linkage drag ) fragmen liar yang tidak diinginkan (ReyesValdes 2000). Hasil penelitian Utami (2004) mengenai seleksi introgresi genotip
tahan pathogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR64 menyatakan Analisis
introgresi pada galur populasi BC2F3 dari persilangan IR 64 dengan O. rufipogon
menunjukkan adanya introgresi fragmen dari tanaman donor O. rufipogon yang
bervariasi dari 9%–40% dari total kromosom yang terpetakan.
Persilangan konvensional yang dipandu dengan analisis molekuler. Analisis
digunakan untuk mempermudah pekerjaan sampai pada tahap molekuler serta
menganalisis genom tanaman padi. Padi IR64 dipilih karena digunakan oleh
banyak petani dan memiliki karakter unggul seperti anakan yang banyak, tahan
wereng serta mempunyai daya adaptasi. Padi Gajah Mungkur memiliki karakter
unggul bobot gabah yang besar dan toleran terhadap kekeringan (summited
2
Trijatmiko et al.). Hasil persilangan kedua tetua tersebut yang teramati pada
penelitian sebelumnya, mengindikasikan adanya turunan (Bio-148) dengan
karakter unggulan dari kedua tetua.
Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi karakter galur Bio-148
dibandingkan tetua IR64 dan Gajah Mungkur, serta mendeteksi introgresi
kromosom dari donor Gajah Mungkur ke IR64. Hipotesis adalah introgresi
beberapa segmen kromosom dari Gajah Mungkur pada galur Bio-148 yang diduga
mempengaruhi karakter unggul padi. Potensi hasil galur Bio-148 yang lebih tinggi
dari IR64 seperti jumlah gabah isi per malai, berat 1000 gabah isi, dan jumlah
malai per tanaman. Informasi tersebut akan bermanfaat untuk mempelajari
korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk srategi pengembangan
varietas unggul baru.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus-Desember 2012. Tempat
penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen),
Penelitian Pertanian Cimanggu, Jl. Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA meliputi daun padi (IR64,
Gajah Mungkur, Bio-148), natrium bisulfit, bufer ekstraksi (10 mL Tris-HCl pH 8
M, 10 mL EDTA 0.5 M, 12.5 mL NaCl 4 M, 67.5 mL akuades), nitrogen cair,
20% SDS, natrium asetat, kalium asetat, isopropanol dingin, etanol 70%, bufer TE
(Tris-EDTA), RNAse, 0.5 M NaOH. Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
adalah bufer PCR, MgCl 25 mM, dNTP set 1 mM, primer SSR Padi 10 mM, Taq
polymerase (5 U/µL), DNA (IR64, Gajah Mungkur, Bio-148) hasil isolasi 25
ng/µL, dan akuades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu
loading dye, bufer TBE (Tris Boric EDTA) 1x, akrilamid 8%, APS (ammonium
persulfat), TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil etilenediamin), DNA marker, DNA
hasil isolasi atau hasil PCR, etidium bromida, dan akuades.
Alat
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik,
shaker, tissue lyser, cawan Petri, stirrer, gelas ukur 500 mL, labu Erlenmeyer 250
mL, oven, vortex, gelas piala, tabung Eppendorf (0.2 mL, 1.5 mL, dan 2 mL),
grinding balls, pipet mikro, dan mesin sentrifus. Selain itu, digunakan pula
elektroforesis,
UV
illuminator
Chemidoc
EQ
Biorad,
nanodrop
(spektrofotometer), gel doc, dan mesin PCR Thermal Cycle.
3
Prosedur Percobaan
Karakterisasi Komponen Unggulan
Penumbuhan padi dilakukan secara bertahap. Padi disemai dalam cawan
Petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap hari untuk
menghindari kekeringan. Penyemaian dalam cawan Petri dilakukan selama 10
hari. Padi yang sudah cukup tinggi dipindahkan ke dalam ember dan disimpan di
rumah kaca. Padi yang ditanam adalah padi IR 64, Gajah Mungkur, dan Bio-148
dengan masing-masing tiga ulangan (Trijatmiko 2011).
Parameter yang diamati dan diukur adalah tinggi tanaman, umur berbunga,
jumlah malai per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan
sekunder, bobot 1000 butir. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah sampai
ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan
software statistik SAS 7.
Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA padi menggunakan modifikasi Dellaporta et al. (1983)
Sebanyak 0.1 gram daun padi potongan kecil (IR64, Gajah Mungkur, dan Bio148) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang berisi satu grinding
ball, kemudian penggerusan menggunakan alat tissue lyser hingga menjadi serbuk
dan disiram dengan nitrogen cair. Sebanyak 1000 µL bufer ekstraksi dan 68 µL
SDS 20%, dipipet kedalam tabung yang berisi sampel, diinkubasi selama 15 menit
pada suhu 65oC di dalam penangas air dan setiap 2 menit tabung dibolak-balikan
agar tercampur dengan rata. Ditambahkan kalium asetat 5 M dipipet sebanyak 334
µL, dibolak-balik kembali hingga tercampur dengan rata, kemudian diinkubasi
selama 1 jam di dalam es.
Tabung-tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm, sebanyak 800 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL baru.
Ditambahkan 600 µL isopropanol tabung dibolak-balik hingga tercampur rata
kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam freezer (-20oC). Selanjutnya
disentrifugasi selama 10 menit pada 12000 rpm. Supernatan dibuang,
disentrifugasi kembali 30 detik, 12000 rpm. Sisa supernatan dipipet menggunakan
pipet mikro.
Tabung yang berisi pelet di oven 10 menit, 65oC. Ditambahkan 200 µL
ddH2O dan 2 µL RNAse, diinkubasi dalam penangas air 65oC, 30 menit sambil
tabung dibolak-balik setiap 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi 10 menit, 12000
rpm. Supernatan dipindahkan kedalam tabung baru dengan ukuran 1.5 mL.
Ditambahkan 25 µL natrium asetat 3 M dan 150 µL isopropanol dingin, dikocok
dan diinkubasi -20oC, 30 menit. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm, 5 menit dan supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran
disentrifugasi kembali 10 menit, 12000 rpm. Kemudian disentrifugasi kembali
pada 12000 rpm, 30 detik. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam oven 65oC, 10
menit. Pelet yang telah kering dilarutkan kembali dengan buffer pada saat akan
dianalisi lebih lanjut.
4
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Nanodrop
Alat diatur untuk pengukuran konsentrasi DNA (Thermo Fisher Scientific
2009). Larutan bufer TE digunakan sebagai blanko. Sebanyak 2 µL larutan TE
dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, nanodrop ditutup kemudian
tombol read blank pada komputer ditekan. Setelah sisa buffer TE dibersihkan
dengan tissue, 2 µL dimasukkan ke dalam lubang ukur, kemudian dipilih menu
read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian sampel akan muncul
dalam satuan konsentrasi ng/µL.
Amplifikasi DNA dengan PCR mikrosatelit (SSR)
Amplifikasi DNA menggunakan metode Praetiyono (2010). Sebanyak 20
µL yang terdiri atas 15 µL larutan cocktail (1.8 µL buffer, 0.2 µL MgCl2 25 mM,
2 µL dNTP mix 1 mM, 2 µL enzim DNA taq polimerase 5 U/µL, dan 9 µL
akuabides); 3 µL primer forward dan reverse, dan 2 µL DNA (25 ng/µL)
diamplifikasi PCR dengan marka SSR_PD dengan kondisi amplifikasi: pra
denaturasi (94oC, 5 menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing (55oC, 30
detik), elongasi (72oC, 45 detik); siklus 35x dan pasca amplifikasi (72oC, 7 menit).
Elektroforesis Hasil PCR
Pembuatan gel akrilamid dilakukan dengan cara mencampurkan 60 mL
larutan akrilamid 8%, 600 µL APS, dan 60 µL TEMED. Campuran larutan
tersebut dituangkan ke dalam cetakan kaca yang telah dirangkai menggunakan
klip. Sebanyak 3 µL loading dye ditambahkan pada hasil amplifikasi DNA, lalu
dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan daya 85 watt
selama 100 menit. Gel akrilamid diwarnai dengan larutan etidium bromida (20
mg/L) selama 8 menit, kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan air selama 16
menit. Pita-pita DNA divisualisasikan dengan chemidoc gel system (BIORAD)
(Sambrook 2001).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakter Unggulan
Hasil karakter unggul yang teramati pada Bio-148, IR64 dan Gajah
Mungkur adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman,
jumlah biji per malai, bobot 1000 butir disajikan pada Tabel 1. Padi Bio-148
memiliki tinggi tanaman diantara kedua tetuanya, yaitu IR64 dan Gajah Mungkur.
Hal serupa teramati pada bobot 1000 butir dan jumlah malai per tanaman. Umur
berbunga, bobot gabah isi dan jumlah gabah per malai Bio-148 lebih besar
dibandingkan kedua tetuanya.
5
Tabel 1 Karakter unggul padi
Varietas
Bobot (g)
1000 Gabah
butir
isi
Jumlah
Malai per
Gabah
tanaman
per malai
Ulangan
Tinggi
tanaman
(cm)
Umur
berbunga
(hari)
1
122
56
35.5
56.9
14
143.2
2
130
56
35.9
41.4
10
135.5
3
117
57
34.7
36.7
10
151.4
1
107.5
60
19.4
108
54
178.6
2
101
62
20.8
78.3
47
137.6
3
103
63
19.1
100.6
50
166.8
1
117.5
64
21.7
103.2
36
225
2
105.5
65
23.9
99.4
43
171.5
3
107.5
67
23.3
85.8
30
258.9
GM
IR64
Bio-148
Hasil pengamatan komponen hasil pada Bio-148, IR64 dan Gajah Mungkur
yang ditunjukkan pada Tabel 2. Panjang malai dan bobot 1000 butir Bio-148
diantara Gajah Mungkur dan IR64, sedangkan jumlah cabang primer, sekunder,
jumlah gabah isi, dan hampa Bio 148 lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur
dan IR64.
Tabel 2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi
Varietas Panjang malai (cm)
GM
IR64
Bio-148
Bobot 1000
butir (g)
Jumlah Cabang
primer Sekunder
Jumlah Gabah
Isi
Hampa
25.76a
35.37c
9.50b
25.47a
111.94a
26.23a
24.70b
19.75a
8.69a
23.07a
95.75b
23.96a
b
22.98
25.60a
10.68c
36.49b
117.42a
66.20b
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama, menunjukkan tidak berbeda
nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan
a
IR64
Bio-148
Gajah
Mungkur
Gambar 1 Malai tanaman padi
Hasil analisis koefisien korelasi Pearson pada komponen hasil disajikan
pada Tabel 3. Panjang malai berkolerasi positif terhadap jumlah cabang primer,
jumlah cabang sekunder, gabah isi, dan gabah hampa.
6
Tabel 3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil
Komponen
Hasil
P. Malai
J. C. Primer
J. C. Sekunder
J. G. Isi
J. G. Hampa
Jumlah
Cabang
Primer
Panjang
Malai
Jumlah
Cabang
Sekunder
Jumlah
Gabah
Hampa
Jumlah
Gabah Isi
1
0.622**
1
0.688**
0.895**
1
0.743**
0.714**
0.818**
1
0.18**
0.636**
0.62**
*berbeda nyata pada taraf 5%, **berbeda nyata pada taraf 1%
0.123*
1
Isolasi DNA
Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada Bio-148, IR64 dan
Gajah Mungkur ditunjukkan pad Tabel 4. Konsentrasi hasil isolasi Bio-148
memiliki nilai yang terendah dibandingkan varietas lainnya, akan tetapi memiliki
kemurnian yang sama dengan IR64 dan lebih tinggi dibanding Gajah Mungkur.
Hal ini cukup baik bagi ketiga sampel karena berada pada kisaran 1.8 sampai 2
yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA.
Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA
Varietas
Konsentrasi (ng/µL)
GM
IR64
Bio-148
A260/280
1.8
1.9
1.9
261.3
385.6
95.3
Amplifikasi DNA Padi
Hasil elektroforesis amplikon 16 primer kromosom 1-3 (Gambar 2)
menunjukkan 9 primer (RM 5, 104, 233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) yang
memberikan pola yang sama dengan Bio-148 maupun IR64.
5
3
6
4
8
9
1
7
2
M
Gambar 2 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 1-9 menunjukkan amplikon dengan marka RM 5, 104,
233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186. Masing-masing no. terdiri atas 3
sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur.
7
Sedangkan penggunaan 16 primer kromosom 4-7 (Gambar 3) menunjukkan
13 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
13
17
18
15
10
19
11 12
21
20
22
16
14
M
Gambar 3 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 10-22 menunjukkan amplikon dengan marka RM 255, 13,
31, 153, 159, 161, 178, 188, 162, 118, 125, 172, 214. Masing-masing
no. terdiri atas 3 sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah
Mungkur.
Hasil elektroforesis amplikon 21 primer kromosom 8-12 (Gambar 4)
menunjukan 12 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
40
29
23
24
25
26
28
30
35 36
34
31
27
37
38
42
39
43
41
33
32
Gambar 4 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 23-43 menunjukkan amplikon dengan marka RM 72, 152,
210, 230, 264, 105, 201, 215, 242, 147, 171, 222, 244, 21R, 167, 209,
254, 4A, 20A, 179, 247. Masing-masing no. terdiri atas 3 sampel
dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur.
Analisis Introgresi
Hasil pengamatan jumlah introgresi kromosom DNA Gajah Mungkur
terhadap galur Bio-148 disajikan pada Tabel 5. Gambar 5 menunjukkam hasil
analisis SSR introgresi segmen kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 (100-
8
200 pb) pada kelompok no. 11 (RM 13), no. 13 (RM 153) kromosom 5; no. 21
(RM 172) pada kromosom 7, dan no. 34 (RM 222) pada kromosom 10.
Gambar 5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148
Tabel 5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148
Kromosom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Total
Jumlah marka SSR
2
5
8
2
8
2
6
7
5
4
4
4
57
Jumlah marka mengkuti
GM
0
0
0
0
2
0
1
0
0
1
0
0
4
Persentase (%)
0
0
0
0
25
0
16.67
0
0
25
0
0
7.02
Pembahasan
Karakter Unggulan
Tinggi tanaman merupakan faktor penting yang mempengaruhi tingkat
kepadatan daun dan kemampuan untuk fotosintesis untuk menghasilkan asimilat.
Karakter tinggi tanaman untuk menjadi tanaman ideal dengan potensi hasil tinggi
adalah sekitar 100 cm (Peng et al. 2008). Pengamatan tinggi tanaman pada
penelitian ini dilakukan 12 minggu setelah masa tanam. Tinggi tanaman diukur
dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan Bio-148
9
memiliki tinggi rata-rata (110.2 cm) diantara IR64 (103.8 cm) dan Gajah Mungkur
(123 cm). Hasil pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya
membandingkan tinggi tetua dengan turunan. Berdasarkan tinggi tanaman, Bio148 potensial sebagai padi unggul. Hasil penelitian ini menunjukkan tinggi
tanaman yang didapatkan lebih tinggi dibandingkan galur Fatmawati/Way Rarem
(106.3 cm) (Herawati 2009).
Peralihan antara fase vegetatif menuju fase generatif ditunjukan dengan
mulai berbunganya tanaman padi. Apabila 50% dari tanaman dalam satu
hamparan bunganya telah keluar, maka pertanaman tersebut dianggap sudah
memasuki fase pembungaan (Manurung dan Ismunadji 1988). Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa umur berbunga padi Bio-148 (65 hari) diantara varietas
Gajah Mungkur (56 hari) dengan IR64 (62 hari) (Tabel 1). Secara statistik Hasil
pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya membandingkan umur
berbunga tetua dengan turunan. Perbedaan pembungaan merupakan sifat
agronomi yang dipengaruhi oleh faktor genetik dan fisiologi. Oleh sebab itu
diduga terjadi akumulasi alel-alel dari kedua tetua pada individu (Trijatmiko
2001). Hasil penelitian ini menunjukkan umur berbunga padi yang digunakan
lebih kecil dibandingkan galur Way Rarem (90 hari) dan Fatmawati (104 hari)
(Herawati 2009).
Untuk tipe tanaman ideal, bobot 1000 butir berkisar antara 28-30 g (Ma et
al. 2006). Hasil penelitian ini (Tabel 1) menunjukkan, walaupun bobot Bio-148
(23 g) sudah lebih besar dari tetua IR64 (19.8 g) tetapi masih lebih kecil dari tetua
Gajah Mungkur (35.4 g). Selain itu masih lebih kecil dari bobot ideal. Namun
demikian, hasil ini relatif lebih baik dibandingkan hasil persilangan
Fatmawati/SGJT-28 (17 g) (Herawati 2009). Analisis statistik (Tabel 2)
menunjukkan bobot ke 3 sampel pada penelitian ini berbeda nyata.
Jumlah malai per tanaman merupakan salah satu karakter yang terkait
dengan hasil gabah (Rahmawati 2006). Varietas unggul baru (VUB) umumnya
memiliki jumlah malai >20 per rumpun (LITBANG 2006). Jumlah malai per
tanaman padi Bio-148 (36) didapatkan diantara IR64 (50) Gajah Mungkur (11)
(Lampiran 2). Analisis statistik jumlah malai per tanaman tidak dilakukan karena
hanya membandingkan jumlah malai tetua dengan turunan. Jumlah malai Bio-148
yang diperoleh ini masih lebih kecil dibandingkan hasil persilangan
Fatmawati/Way Rarem (8) (Herawati 2009), namun sudah lebih besar umumnya
VUB (LITBANG 2006) sehingga cukup potensial sebagai VUB.
Tanaman ideal, jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan gabah isi
lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil jumlah gabah per malai padi Bio-148
(218.5) lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur (143.4) IR64 (161) (Tabel 1).
Analisis statistik (Tabel 2) menunjukkan jumlah gabah isi per malai Bio-148
berbeda nyata dengan IR64 sedangkan jumlah gabah hampa per malai Bio-148
berbeda nyata dengan kedua tetua. Hasil penelitian ini menunjukkan gabah per
malai Bio-148 lebih baik dari hasil persilangan Fatmawati/Way Rarem (164.7)
(Herawati 2009). Oleh karena itu Bio-148 potensial sebagai VUB.
Hasil pengamatan gabah (Tabel 2) menunjukkan panjang malai Bio-148
lebih besar dari IR64 dan lebih kecil dari Gajah Mungkur. Hasil serupa teramati
pada bobot 1000 butir. Sementara untuk jumlah cabang primer dan sekunder Bio148 lebih besar dari IR64 dan Gajah Mungkur. Hal serupa teramati pada jumlah
gabah isi dan hampa. Hasil penelitian Peng et al. (2008) menunujukkan bahwa
10
untuk meningkatkan hasil padi tipe baru dibutuhkan tetua dengan karakter jumlah
gabah per malai dan ukuran malai yang besar. Fenomena segregasi transgresif dua
arah ini kemungkinan menunjukkan tidak satupun tetua membawa semua alel
positif atau alel negatif. Transgresi terjadi karena akumulasi alel-alel
komplementer yang diwariskan oleh kedua tetua pada individu tertentu
(Trijatmiko 2001).
Berdasarkan korelasi Pearson (Tabel 2), diperoleh informasi bahwa rata-rata
jumlah cabang primer, sekunder, jumlah gabah isi, dan hampa berkorelasi nyata
terhadap panjang malai pada taraf kepercayaan 5% sedangkan rata-rata jumlah
gabah hampa sangat berkorelasi nyata terhadap rata-rata jumlah gabah isi
berdasarkan taraf 1%. Karakter unggul akan lebih efektif meningkatkan hasil
apabila karakter unggul berkorelasi positif. Berdasarkan data pada Tabel 3
diketahui bahwa semua karakter unggul berupa panjang malai, jumlah cabang
primer, cabang sekunder, gabah isi dan gabah hampa berkolerasi positif.
Isolasi DNA Padi
Daun tanaman padi Bio-148 yang merupakan hasil persilangan digunakan
untuk isolasi DNA. Hasil isolasi DNA perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas
atau kemurnian DNA dan konsentrasi yang dibutuhkan untuk analisis PCR. Uji
kuantitatif menggunakan spektrofotometer melalui pengukuran konsentrasi
sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian sampel pada
perbandingan panjang gelombang 260/280 nm. Hasil isolasi ketiga varietas padi
memiliki kemurnian 1.8-1.9. Nilai kemurnian sampel yang baik menurut
Sambrook et al. (2001) adalah 1.8-2.0. Adanya kontaminasi protein terlihat dari
nilai kemurnian yang kurang dari 1.8, sedangkan nilai kemurnian sampel yang
lebih dari 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA. Uji kualitatif DNA dapat
dilakukan melalui elektroforesis gel akrilamid. Uji kualitatif ini berupa gambaran
untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA.
DNA padi diisolasi untuk melihat komponen padi unggulan dari segi
genotipe, diantaranya mendeteksi introgresi kromosom dari donor Gajah
Mungkur. Isolasi DNA padi dilakukan menggunakan metode modifikasi
Dellaporta et al. (1983). Konsentrasi DNA beragam (Tabel 4), secara umum
konsentrasi DNA hasil isolasi memiliki konsentrasi yang relatif baik dan sudah
cukup digunakan pada proses amplifikasi dengan mesin PCR. Hal ini juga sejalan
dengan hasil pengukuran konsentrasi DNA padi menggunakan metode Dellaporta,
sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Noferta (2011) yang memperlihatan
konsentrasi DNA hasil isolasi sebesar 75 ng/µL.
Amplifikasi DNA Padi
Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR TETRAD. DNA sampel
digunakan sebagai cetakannya untuk diperbanyak dengan 57 primer yang
ditargetkan pada kromosom 1-12. Tujuannya untuk mendapatkan primer-primer
yang memberikan pola amplikon yang sama terhadap Bio-148, IR64, dan Gajah
Mungkur. Hal ini akan menunjukkan sumber asal DNA pada Bio-148. Seleksi
(Gambar 2) dilakukan melihat kesamaan pola amplikon sampel Bio-148 dari tetua
(IR64 dan Gajah Mungkur). Hasil pengamatan kelompok primer kromosom 1-3
(Gambar 2) mendapatkan dari 16 primer, yang terlihat 9 primer (RM 5, 104,
233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) pola amplikon sampel Bio-148 sama dengan
11
IR64. Hal ini menunjukkan kromosom 1-3 Bio-148 tidak ada introgresi DNA dari
Gajah Mungkur.
Hasil pengamatan 16 kelompok primer pada kromosom 4-7 (Gambar 3)
terdapat 13 pola amplikon DNA. Pola amplikon DNA Bio-148 yang didapatkan, 3
kelompok primer yang mirip tetua Gajah Mungkur pada no. 11 (RM 13), no. 13
(RM 153) yang terletak pada kromosom 5, dan 21 (RM 172) yang terletak pada
kromosom 7 dengan ukuran berkisar antara 100-200 pb. Sedangkan, 11 primer
lainnya mirip tetua IR64. Kelompok primer no. 18 didapatkan pola polimorfik
pada Bio-148. Pita yang dihasilkan mengindikasikan bahwa penanda mikrosatelit
bersifat kodominan bagi organisme diploid yang dapat membedakan genotip
homozigot dan heterozigot (Pandin et al. 2008). Kromosom 5 dan 7 pada Bio-148
mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur sedangkan kromosom 4 dan 6 boleh
dikatakan masih asli tetua IR64.
Hasil pengamatan (Gambar 4) 21 kelompok primer pada kromosom 8-12,
primer no. 34 (RM 222) pada kromosom 10 menunjukkan DNA Bio-148 mirip
tetua Gajah Mungkur dengan ukuran 100-200 pb. Perbedaan ukuran pita yang
terjadi pada masing-masing primer menunjukkan adanya perubahan genomik.
Perubahan tersebut dapat terjadi dari alel yang bersifat homozigot (satu pita)
menjadi heterozigot (dua pita) atau sebaliknya (Megia dan Djuita 2010).
Kelompok 20 primer lainnya pola amplikon yang mirip dengan tetua IR64. Hal ini
menunjukkan kromosom 10 Bio-148 mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur
sedangkan kromosom 8, 9, 11, dan 12 masih asli tetua IR64.
Banyak faktor yang menyebabkan perbedaan jumlah dan intensitas pita
DNA yang terbentuk pada setiap primer dan pada masing-masing lokus. Tingey et
al. (1994) menyatakan bahwa variasi yang terjadi pada jumlah dan intensitas pita
DNA yang terbentuk setelah proses amplifikasi sangat tergantung pada cara
primer mengenal urutan DNA komplementernya pada cetakan DNA (DNA
template) yang digunakan. Kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan juga
berpengaruh. DNA cetakan yang mengandung kontaminan seperti polisakarida
dan senyawa fenolik, serta konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering
menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas (Weeden et al.
1992). Selain itu sebaran situs penempelan primer pada DNA cetakan dan adanya
kompetisi tempat penempelan primer pada DNA cetakan menyebabkan satu
fragmen diamplifikasi dalam jumlah banyak sementara fragmen lainnya hanya
sedikit. Weeden et al. (1992) juga menyatakan bahwa amplifikasi mungkin
diinisiasi pada beberapa tempat, tetapi hanya beberapa set yang dapat dideteksi
sebagai pita sesudah amplifikasi.
Analisis Introgresi
Total marka yang digunakan terdapat 4 marka yang mengikuti pola
amplikon tetua Gajah Mungkur. Kromosom 5 (Tabel 5) dari 8 marka, 2 marka
dapat mendeteksi kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI
2/8x100%=25%), sedangkan untuk primer kromosom 7 dari 6 marka, hanya 1
marka menunjukkan kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI
1/6x100%=16.67%). Sementara kromosom 10 dari 4 marka yang digunakan,
hanya 1 marka mirip tetua Gajah Mungkur (persentase introgresi / PI
1/4x100%=25%). Introgresi kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 dengan
cara silang baik (back cross) beberapa kali agar diperoleh introgresi
12
yangdiinginkan dan seminimal mungkin membawa introgresi negatif (linkage
drag) fragmen liar yang tidak diinginkan (Reyes-Valdes 2000). Hasil penelitian
Mulsanti (2011) diperoleh enam marka SSR yang polimorfis, yaitu RM 206, 263,
276, 346, 335, dan 570 yang dapat membedakan antara masing-masing tetua padi
hibrida yang diuji.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Introgresi segmen kromosom padi Gajah Mungkur meningkatkan karakter
(umur berbunga, panjang malai, bobot 1000 butir, jumlah cabang primer
dansekunder, jumlah gabah per malai, jumlah gabah isi dan hampa) padi Bio-148.
Introgresi kromosom padi Gajah Mungkur pada padi Bio-148 terjadi pada
kromosom 5,7, dan 10 yang terkait pada produktivitas.
Saran
Dilakukan penelitian lebih lanjut dalam menentukan gen pembawa sifat
unggul. Selain itu perlu dilakukan penelitian terkait karakter selain komponen
hasil.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan
padi varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS.
Chawla HS. 2004. Introduction to Plant Biotechnology second edition. India: Science
Pb.
Dellaporta SL, J Wood, and JB Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation:
Version II. Plant Mol. Biol. Reptr. 1:19-21.
Herawati R, Purwoko BS, Dewi IS. 2009. Keragaman genetik dan karakter
agronomi galur haploid padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru hasi kultur
antera. J Agron Indonesia 37(2):87-94.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with
heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105.
Manurung SO dan M Ismunadji. 1988. Morfologi dan Fisiologi Padi. dalam Padi.
PPPTP. Bogor: 55-98.
Megia R dan Djuita Nina R. 2010. Deteksi integritas genomic pisang hasil iradiasi
in vitro berdasarkan penanda mikrosatelit. MAKARA SAINS. 14 :151-157.
Mulsanti IW. 2011. Identifikasi dan evaluasi kemurnian genetik benih padihibrida
menggunakan marka mikrosatelit [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
13
Noferta A. 2011. Analisis genom geminivirus isolate agresif PSS 1-4 dari pesisir
selatan Sumatera Barat [tesis]. Padang: Universitas Andalas.
Pandin DS. 2010. Penanda DNA untuk pemuliaan tanaman kelapa (Cocos
nucifera L.). Perspektif. 9: 21-35.
Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype
breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38.
Prasetiyono J. 2010. Studi Efek Introgresi Pup (p Uptake 1) untuk Meningkatkan
Toleransi Padi Terhadap Defisiensi Fosfor [Disertasi]. Bogor: Program Studi
Agronomi, Institut Pertanian Bogor.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi
menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375.
Reyes-valdes MH. 2000. A model for Marker-Based Selection in Gene
Introgression Breeding Program. Crop Sci. 40:91–98.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Shivanna KR, Sawhney. 1997. Pollen Biotechnology for Crop Production and
Improvement. UK: Cambridge University Pr.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific Inc.
Tingey SV, Rafalski JA, Hanafey MK. 1994. Genetic analysis with RAPD
markers. In: Coruzzi C and Puidormenech (eds). Plant Molecular Biology.
Berlin: Springer-Verlag.
Trijatmiko KR, Aswidinnoor H, Moeljopawiro S, dan Sopandie D. 2001.
Keterpautan marka RAPD dengan sifat daya tembus akar tanaman padi
IRAT112. Jurnal Bioteknologi Pertanian 6:29-35.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analyses
of Transgenic Plants. NewYork: Springer Inc.
Utami DW, Hajrial A, Asep S, Sugiono M, dan Edi G. 2004. Aplikasi teknik
Marker Assisted Selection (MAS) dalam seleksi introgresi genotip tahan
patogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR 64. Zuriat 2:15.
Weeden NF, Timmerman GM, Hemmat M, Kneen BE & Lodhi MA. 1992.
Inheritance and Reliability of RAPD Markers. Application of RAPD
Technology to Plant Breeding. Joint Plant Breeding Symposia Series
CSSA/ASHS/AGA. Minneapolis, 1 November 1992.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram alur penelitian
Tanam benih (IR64, Bio-148, da Gajah Mungkur)
Identifikasi karakter unggul
Isolasi DNA
Analisis kuantitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforsesis
Analisis data
15
Lampiran 2 Primer SSR
No.
1
Primer
RM5
Forward
TGCAACTTCTAGCTGCTCGA
GGAAGAGGAGAGAAAGATGTGTGC
G
GTCCCCTCCACCCAATTC
CCAAATGAACCTACATGTTG
CCTTAATGGGTAGTGTGCAC
CATTCCGTCTCGGCTCAACT
CCCAGGCTAGCTCATGAACC
TTCGCCATGAAGTCTCTCG
GGTTTGGGAGCCCATAATCT
CCGTCGCCGTAGTAGAGAAG
CCAAAGATGAAACCTGGATTG
ATCTTGTTGTTTCGGCGGCGGC
GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC
TGCTGCTTGCCTGCTTCCTTT
TCCTCCATCTCCTCCGCTCCCG
TCCTCCCTCCCTTCGCCCACTG
TGTTGCGTGTGGAGATGTG
TCCAACATGGCAAGAGAGAG
GATCACGATCCACTGGAGCT
GCCTCTCTCGTCTCCTTCCT
GCCTCGAGCATCATCATCAG
2
RM104
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
RM6
RM233A
RM240
RM262
RM263
RM7
RM22
RM55
RM85
RM132
RM156
RM168
RM186
RM131
RM255
RM13
RM31
RM39
RM153
22
RM159
GGGGCACTGGCAAGGGTGAAGG
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
RM161
RM178
RM188
RM50
RM162
RM118
RM125
RM134
RM172
RM214
RM248
RM25
RM38
RM72
RM152
RM210
RM230
RM264
RM105
RM201
RM215
RM242
RM245
RM147
RM171
RM222
RM244
RM21R
TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC
TCGCGTGAAAGATAAGCGGCGC
TCCGCCTCTCCTCTCGCTTCCC
ACTGTACCGGTCGAAGACG
GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG
CCAATCGGAGCCACCGGAGAGC
ATCAGCAGCCATGGCAGCGACC
ACAAGGCCGCGAGAGGATTCCG
TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG
CTGATGATAGAAACCTCTTCTC
TCCTTGTGAAATCTGGTCCC
GGAAAGAATGATCTTTTCATGG
ACGAGCTCTCGATCAGCCTA
CCGGCGATAAAACAATGAG
GAAACCACCACACCTCACCG
TCACATTCGGTGGCATTG
GCCAGACCGTGGATGTTC
GTTGCGTCCTACTGCTACTTC
GTCGTCGACCCATCGGAGCCAC
CTCGTTTATTACCTACAGTACC
CAAAATGGAGCAGCAAGAGC
GGCCAACGTGTGTATGTCTC
ATGCCGCCAGTGAATAGC
TACGGCTTCGGCGGCTGATTCC
AACGCGAGGACACGTACTTAC
CTTAAATGGGCCACATGCG
CCGACTGTTCGTCCTTATCA
ACAGTATTCCGTAGGCACGG
51
RM167
GATCCAGCGTGAGGAACACGT
Reverse
GCATCCGATCTTGATGGG
K
1
TCAACAGACACACCGCCACCGC
1
TCGTCTACTGTTGGCTGCAC
GCATTGCAGACAGCTATTGA
TGTAACCATTCCTTCCATCC
CAGAGCAAGGTGGCTTGC
GCTACGTTTGAGCTACCACG
CCTCCCATCATTTCGTTGTT
CTGGGCTTCTTTCACTCGTC
TCCCGGTTATTTTAAGGCG
GCACAAGGTGAGCAGTCC
CATGGCGAGAATGCCCACGTCC
TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG
GAAACGAATCAATCCACGGC
GGGCGTGGTGGCCTTCTTCGTC
CGATGTTCGCCATGGCTGCTCC
CGAAACCGCTCAGTTCAAC
GGTGGCATTCGATTCCAG
AAGTCCATTACTCTCCTCCC
AATTCAAACTGCGGTGGC
ATCAACCTGCACTTGCCTGG
GCTTGTGCTTCTCTCTCTCTCTCT
CTCTC
TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG
GATCACCGTTCCCTCCGCCTGC
GCAACGCACAACCGAACCGAGC
AAATTCCACGTCAGCCTCC
CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG
CACATCCTCCAGCGACGCCGAG
AGGGGATCATGTGCCGAAGGCC
GCTCTCCGGTGGCTCCGATTGG
CAACCACGACACCGCCGTGTTG
AAGAACAGCTGACTTCACAA
GTAGCCTAGCATGGTGCATG
CTACCATCAAAACCAATGTTC
TCGGTCTCCATGTCCCAC
GCATCGGTCCTAACTAAGGG
CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG
CGAGGATGGTTGTTCACTTG
CACCGCAGTCACTTTTCAAG
GATCCGTGTCGATGATTAGC
TGGTCGAGGTGGGGATCGGGTC
CTACCTCCTTTCTAGACCGATA
TGAGCACCTCCTTCTCTGTAG
TATATGCCAAGACGGATGGG
CTGAGAATCCAATTATCTGGGG
CCCCCGAATCCCATCGAAACCC
ACGAGATACGTACGCCTTTG
CAAAGCTTCCGGCCAAAAG
CTGCTCTCGGGTGAACGT
GCTCCATGAGGGTGGTAGAG
AGTCCGACCACAAGGTGCGTTG
TC
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
10
10
10
10
11
11
16
No.
Primer
52
RM209
53
RM254
54
RM4A
55
RM20A
56
RM179
57
RM247
K= Kromosom
Forward
ATATGAGTTGCTGTCGTGCG
AGCCCCGAATAAATCCACCT
TTGACGAGGTCAGCACTGAC
ATCTTGTCCCTGCAGGTCAT
CCCCATTAGTCCACTCCACCACC
TAGTGCCGATCGATGTAACG
Reverse
CAACTTGCATCCTCCCCTCC
CTGGAGGAGCATTTGGTAGC
AGGGTGTATCCGACTCATCG
GAAACAGAGGCACATTTCATTG
CCAATCAGCCTCATGCCTCCCC
CATATGGTTTTGACAAAGCG
K
11
11
12
12
12
12
17
Lampiran 3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA)
a) Panjang malai
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
76.545a
2
38.272
6.090
.003
127283.872
1
127283.872
20252.706
.000
6.090
.003
Perlakuan
76.545
2
38.272
Error
1828.872
291
6.285
Total
Corrected
Total
186631.710
294
1905.417
293
b) Jumlah cabang primer
Source
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
Corrected
Model
Intercept
207.136a
2
103.568
47.155
.000
18151.190
1
18151.190
8264.271
.000
Perlakuan
207.136
2
103.568
47.155
.000
Error
639.136
291
2.196
Total
Corrected
Total
27020.000
294
846.272
293
c) Jumlah cabang sekunder
Source
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
Corrected
Model
Intercept
9784.373a
2
4892.187
43.372
.000
154218.328
1
154218.328
1367.238
.000
Perlakuan
9784.373
2
4892.187
43.372
.000
Error
32823.494
291
112.796
Total
Corrected
Total
268923.000
294
42607.867
293
d) Jumlah gabah isi
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
29562.758a
2
14781.379
7.591
.001
2314326.513
1
2314326.513
1188.481
.000
7.591
.001
Perlakuan
29562.758
2
14781.379
Error
566663.667
291
1947.298
18
Total
Corrected
Total
3819751.000
294
596226.425
293
e) Jumlah gabah hampa
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
Df
Mean
Square
F
Sig.
93171.371a
2
46585.686
77.452
.000
277573.188
1
277573.188
461.486
.000
77.452
.000
Perlakuan
93171.371
2
46585.686
Error
175029.829
291
601.477
Total
Corrected
Total
701983.000
294
268201.201
293
19
Lampiran 4 Analisis statistik dengan uji Duncan
a) Panjang malai
Duncana,,b,,c
Subset
1
2
24.5735
Varietas
N
IR64
151
Bio-148
109
25.5367
GM
34
25.7471
Sig.
1.000
.629
b) Jumlah cabang primer
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset
2
1
8.6689
3
9.5000
10.4771
1.000
1.000
1.000
c) Jumlah cabang sekunder
Duncana,,b,,c
Subset
Varietas
N
IR64
151
1
22.8940
GM
34
25.4118
Bio-148
109
Sig.
2
35.1927
.173
1.000
d) Jumlah gabah isi
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset
1
94.9868
2
112.8235
115.6514
1.000
.712
e) Jumlah gabah hampa
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
Subset
1
2
24.4834
GM
34
25.9412
Bio-148
109
Sig.
61.5963
.732
1.000
20
Lampiran 5 Reagen
Larutan / Bufer
TBE (TrisHCl-Boric Acid-EDTA) 10x
APS 10%
Akrilamid/bisakrilamid 40%
Akrilamid 8%
Marka 100 bp Ladder plus
Loading dye 6x
Gel akrilamid
Ekstraksi buffer 500 mL
20% SDS
5 M Kalium asetat
3 M Natrium asetat
TE 1 x
TE 0.1 x
Cara pembuatan
Sebanyak 108 g Tris HCL, EDTA 40 mL
pH 8, boric acid 55 g dilarutkan dengan
aquades hingga volume akhir 1 L
Amonium persulfat sebanyak 1 g
dlarutkan dengan akuades hingga 10 mL
Sebanyak 380 g akrilamid dan 20 g
bisakrilamid dilarutkan dengan akuades
hingga 1 L
Sebanyak
200
mL
akrilamid/
bisakrilamid 40% dan 50 mL TBE 10x
dilarutkan dengan akuades 750 mL
50 µL stock 100 bp Ladder plus ditambah
950 µL TrisEDTA untuk menjadikan
konsentrasi akhir 50 µg/ µL
Bromofenol biru 0.03%, 10 mM TrisHCL (pH 7.6), gliserol 60%, 60 mM
EDTA, dan xylenecyanol FF dilarutkan
dalam akuades.
Sebanyak 55 mL akrilamid 8%, 550 µL
APS 10%, dan 55 µL TEMED lalu
diaduk.
Sebanyak 50 mL Tris-HCl pH 8, 50 mL
0.5 M EDTA, 62.5 mL 4 M NaCl, dan
337.5 mL dH2O dicampur dan diaduk
hingga rata.
Sebanyak 200 gram SDS dilarutkan
dengan 800 mL akuades.
Sebanyak 49.07 gram kalium asetat
ditimbang dan ditambahkan dengan air
steril sebanyak 70 mL lalu di sterilisasi
kedalam autoklaf (121°C, 2atm, 20
menit).
Ditimbang sebanyak 204.15 g natrium
asetat kemudian dimasukkan 200 mL
air steril dan 90 mL asam asetat
20ncubat kemudian di sterilisasi ke
dalam autoklaf (121°C, 2atm, 20
menit).
Sebanyak 10 mL Tris HCl 1M (pH 8)
ditambah dengan 2 mL EDTA 0.5M
(pH 8) dan ditera hingga 1000 mL
menggunakan akuades.
Sebanyak 15 µL larutan TE 1 x
dilarutkan dengan akuades sebanyak
135 µL dengan volume akhir 150 µL
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banjarbaru, Kalimantan Selatan pada tanggal 14 Juli
1990 sebagai putra kedua dari ayah Bambang Tri Saputra dan ibu Noorhasanah.
Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 11 Bandung dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur
Undangan Saringan Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia
Dasar dan Biokimia Umum pada tahun ajaran 2010. Penulis pernah melakukan
Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Biak Sel dan Mikropropagasi Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor selama periode Juli –
Agustus 2011 dengan judul Pengaruh Asam Humat terhadap Pertumbuhan Planlet
Tebu (Saccharum officinarum L) Hasil Aklimatisasi.
Penulis juga aktif dalam organisasi kampus sebagai staf divisi
Biomolekuler dalam Research and Education Himpunan Profesi Mahasiswa
Biokimia (CREBs) 2010, ketua divisi Biomolekuler dalam Research and
Education Himpunan Profesi Mahasiswa Biokimia (CREBs) 2011.
DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter
Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Ihsan Mentaya Putra
NIM G840080064
ABSTRAK
IHSAN MENTAYA PUTRA. Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi
DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO
HAMI SENO dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Pertumbuhan jumlah penduduk yang terus berkembang membuat lahan
pertanian mulai berkurang sehingga diperlukan varietas padi yang mampu
meningkatkan hasil produksi padi. Salah satu alternatif dengan pemuliaan
tanaman padi dengan bantuan teknologi marka molekuler. Penelitian ini bertujuan
untuk mempelajari korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk
strategi pengembangan varietas unggul baru. Padi Bio-148 yang digunakan
merupakan padi hasil persilangan IR64-Gajah Mungkur. Karakterisasi Padi Bio148 yang diamati dan diukur ialah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai
per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan sekunder, bobot
1000 butir dibandingkan dengan kedua tetuanya. Marka molekuler yang
digunakan adalah marka SSR (mikrosatelit) dengan 57 primer yang terletak pada
kromosom 1 sampai 12. Hasil penelitian jumlah cabang primer, sekunder, jumlah
gabah isi, dan hampa padi Bio-148 lebih unggul dari IR64 dan Gajah Mungkur.
Hasil survei molekuler menggunakan gel akrilamid menghasilkan fragmen
berukuran 100-200 pb. Hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa terdapat
introgresi beberapa segmen kromosom Gajah Mungkur yang bertanggung jawab
terhadap karakter unggul padi Bio-148 seperti, jumlah gabah, bobot gabah, gabah
isi, dan jumlah malai terletak pada kromosom 5,7, dan 10 padi Bio-148.
Kata kunci: karakter unggul, padi, pemuliaan tanaman, SSR.
ABSTRACT
IHSAN MENTAYA PUTRA. Superior Character Identification and DNA
Introgressed Derivatives IR64-Gajah Mungkur. Supervised by DJAROT
SASONGKO HAMI SENO and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
The growth of a population that is constantly evolving to make farmland
diminished so needed rice varieties which are able to increase the yield of rice.
One alternative to breeding rice plants with the help of molecular markers
technology. The objective of this study was find correlation between introgressed
and character, then strategy of new superior varieties development. Bio-148 rice
that used as result of cross IR64 rice-Gajah Mungkur. Characterization of Rice
Bio- 148 was observed and measured plant height, days to flowering, number of
panicles per plant, number of grains per panicle, number of primary and
secondary branches, 1000 grain weight compared with both parent. Molecular
markers used were SSR markers (microsatellites) with 57 primer located on
chromosome 1 to 12. Results showed number of primary and secondary branches
and number of grains. Molecular survey results using acrylamide gel fragment
size of 100-200 bp. Molecular analysis of the results showed that there were
introgressed chromosome segments Gajah Mungkur responsible for the superior
character of Bio-148 i.e. grain number, grain weight, filled grains, and the number
of panicles located on chromosome 5,7, and 10 Bio-148 rice.
Keywords : Plant breeding, rice, SSR, superior character.
IDENTIFIKASI KARAKTER UNGGULAN DAN INTROGRESI
DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ii
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan
IR64-Gajah Mungkur
Nama
: Ihsan Mentaya Putra
NIM
: G84080064
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSc
Pembimbing I
Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MSc App
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Untaian rasa syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas segala
nikmat dan karunia-Nya penulisan penelitian yang berjudul “Identifikasi Karakter
Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR 64-Gajah Mungkur” dapat
diselesaikan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Agustus 2012
bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen),
Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu, Bogor.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan usulan penelitian ini antara lain Dr Djarot Sasongko Hami
Seno, MSc dan Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko selaku pembimbing skripsi.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan penelitian ini. Penulis menyadari tentang kekurangan
dalam penulisan penelitian ini, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan
kritik yang dapat membuat penulisan berikutnya lebih baik. Akhir kata, penulis
berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak demi
kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Mei 2013
Ihsan Mentaya Putra
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Percobaan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakter Unggulan
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA Padi
Analisis Introgresi
Pembahasan
Karakter Unggulan
Isolasi DNA Padi
Amplifikasi DNA Padi
Analisis Introgresi
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
vi
vi
vi
1
2
2
2
2
3
4
4
4
6
6
7
8
8
10
10
11
12
12
14
DAFTAR TABEL
1 Karakter unggul padi
2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi
3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil
4 Konsentrasi dan kemurnian DNA
5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148
5
5
6
6
8
DAFTAR GAMBAR
1 Malai tanaman padi
2 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 1-9
3 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 10-22
4 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 23-43
5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148
5
6
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alur penelitian
2 Primer SSR
3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA)
4 Analisis statistik dengan uji Duncan
5 Reagen
14
15
17
19
20
PENDAHULUAN
Pesatnya peningkatan populasi penduduk dan semakin berkurangnya lahan
pertanian dapat menimbulkan kesulitan pangan di masa mendatang. Indonesia
dengan jumlah penduduk 237.641.326 jiwa pada tahun 2010 dengan rata-rata
pertumbuhan penduduk 1,49% per tahun dan luas areal panen 11,8 juta hektar dengan
konsumsi per kapita rata-rata 113,48 kg per tahun dihadapkan ancaman bagi
ketahanan pangan (BPS 2012). Konstribusi padi yang telah ada terhadap produksi
padi nasional masih relatif rendah, sehingga pengembangannya masih terus
diupayakan. Rendahnya produktivitas padi gogo disebabkan oleh kondisi iklim dan
tanah yang bervariasi, penerapan teknologi budidaya yang belum optimal terutama
dalam penggunaan varietas unggul.
Target program ketahanan pangan adalah meningkatkan produksi padi
sehingga dicapai swadaya nasional, diantaranya melalui pengembangan tanaman
padi produktif. Intensifikasi kegiatan pemuliaan tanaman dapat dilakukan melalui
perakitan varietas unggul baru yang berdaya hasil tinggi, berkualitas, serta resisten
terhadap kendala biotik dan abiotik. Varietas unggul memberikan manfaat teknis
dan ekonomis yang banyak bagi perkembangan pertanian, diantaranya pertumbuhan
tanaman menjadi seragam sehingga panen serempak, rendemen lebih tinggi, mutu
hasil lebih tinggi dan sesuai dengan selera konsumen, dan tanaman akan mempunyai
ketahanan yang tinggi terhadap hama dan penyakit, serta adaptasi yang tinggi
terhadap lingkungan sehingga dapat memperkecil penggunaan pupuk dan pestisida.
(Shivanna & Sawhney 1997).
Penelitian dan perakitan padi tipe baru di Indonesia telah dimulai sejak
tahun 1995. Pada tahun 2001 program penelitian padi tipe baru menjadi program
baru Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. Pada tahun 2005 telah dihasilkan lebih
dari 4000 kombinasi persilangan padi tipe baru, empat varietas unggul yaitu
Cimelati, Ciapus, Gilirang, dan Fatmawati. Tiga varietas pertama adalah varietas
unggul semi tipe baru (VUSTB), sedangkan Fatmawati adalah varietas unggul
tipe baru (VUTB) perdana (Abdullah et al. 2005).
Perakitan padi tipe baru dengan bantuan teknologi molekular terbukti dapat
membantu introgresi gen ke dalam tanaman budidaya. Persilangan silang balik (
backcross ) dipandang sebagai teknik persilangan yang dapat diterapkan untuk
mentransfer satu atau beberapa gen yang diinginkan dari tanaman donor ke
tanaman penerima. Namun demikian diperlukan persilangan silang balik beberapa
kali agar diperoleh introgresi yang diinginkan dan seminimal mungkin membawa
introgresi negatif ( linkage drag ) fragmen liar yang tidak diinginkan (ReyesValdes 2000). Hasil penelitian Utami (2004) mengenai seleksi introgresi genotip
tahan pathogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR64 menyatakan Analisis
introgresi pada galur populasi BC2F3 dari persilangan IR 64 dengan O. rufipogon
menunjukkan adanya introgresi fragmen dari tanaman donor O. rufipogon yang
bervariasi dari 9%–40% dari total kromosom yang terpetakan.
Persilangan konvensional yang dipandu dengan analisis molekuler. Analisis
digunakan untuk mempermudah pekerjaan sampai pada tahap molekuler serta
menganalisis genom tanaman padi. Padi IR64 dipilih karena digunakan oleh
banyak petani dan memiliki karakter unggul seperti anakan yang banyak, tahan
wereng serta mempunyai daya adaptasi. Padi Gajah Mungkur memiliki karakter
unggul bobot gabah yang besar dan toleran terhadap kekeringan (summited
2
Trijatmiko et al.). Hasil persilangan kedua tetua tersebut yang teramati pada
penelitian sebelumnya, mengindikasikan adanya turunan (Bio-148) dengan
karakter unggulan dari kedua tetua.
Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi karakter galur Bio-148
dibandingkan tetua IR64 dan Gajah Mungkur, serta mendeteksi introgresi
kromosom dari donor Gajah Mungkur ke IR64. Hipotesis adalah introgresi
beberapa segmen kromosom dari Gajah Mungkur pada galur Bio-148 yang diduga
mempengaruhi karakter unggul padi. Potensi hasil galur Bio-148 yang lebih tinggi
dari IR64 seperti jumlah gabah isi per malai, berat 1000 gabah isi, dan jumlah
malai per tanaman. Informasi tersebut akan bermanfaat untuk mempelajari
korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk srategi pengembangan
varietas unggul baru.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus-Desember 2012. Tempat
penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen),
Penelitian Pertanian Cimanggu, Jl. Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA meliputi daun padi (IR64,
Gajah Mungkur, Bio-148), natrium bisulfit, bufer ekstraksi (10 mL Tris-HCl pH 8
M, 10 mL EDTA 0.5 M, 12.5 mL NaCl 4 M, 67.5 mL akuades), nitrogen cair,
20% SDS, natrium asetat, kalium asetat, isopropanol dingin, etanol 70%, bufer TE
(Tris-EDTA), RNAse, 0.5 M NaOH. Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
adalah bufer PCR, MgCl 25 mM, dNTP set 1 mM, primer SSR Padi 10 mM, Taq
polymerase (5 U/µL), DNA (IR64, Gajah Mungkur, Bio-148) hasil isolasi 25
ng/µL, dan akuades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu
loading dye, bufer TBE (Tris Boric EDTA) 1x, akrilamid 8%, APS (ammonium
persulfat), TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil etilenediamin), DNA marker, DNA
hasil isolasi atau hasil PCR, etidium bromida, dan akuades.
Alat
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik,
shaker, tissue lyser, cawan Petri, stirrer, gelas ukur 500 mL, labu Erlenmeyer 250
mL, oven, vortex, gelas piala, tabung Eppendorf (0.2 mL, 1.5 mL, dan 2 mL),
grinding balls, pipet mikro, dan mesin sentrifus. Selain itu, digunakan pula
elektroforesis,
UV
illuminator
Chemidoc
EQ
Biorad,
nanodrop
(spektrofotometer), gel doc, dan mesin PCR Thermal Cycle.
3
Prosedur Percobaan
Karakterisasi Komponen Unggulan
Penumbuhan padi dilakukan secara bertahap. Padi disemai dalam cawan
Petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap hari untuk
menghindari kekeringan. Penyemaian dalam cawan Petri dilakukan selama 10
hari. Padi yang sudah cukup tinggi dipindahkan ke dalam ember dan disimpan di
rumah kaca. Padi yang ditanam adalah padi IR 64, Gajah Mungkur, dan Bio-148
dengan masing-masing tiga ulangan (Trijatmiko 2011).
Parameter yang diamati dan diukur adalah tinggi tanaman, umur berbunga,
jumlah malai per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan
sekunder, bobot 1000 butir. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah sampai
ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan
software statistik SAS 7.
Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA padi menggunakan modifikasi Dellaporta et al. (1983)
Sebanyak 0.1 gram daun padi potongan kecil (IR64, Gajah Mungkur, dan Bio148) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang berisi satu grinding
ball, kemudian penggerusan menggunakan alat tissue lyser hingga menjadi serbuk
dan disiram dengan nitrogen cair. Sebanyak 1000 µL bufer ekstraksi dan 68 µL
SDS 20%, dipipet kedalam tabung yang berisi sampel, diinkubasi selama 15 menit
pada suhu 65oC di dalam penangas air dan setiap 2 menit tabung dibolak-balikan
agar tercampur dengan rata. Ditambahkan kalium asetat 5 M dipipet sebanyak 334
µL, dibolak-balik kembali hingga tercampur dengan rata, kemudian diinkubasi
selama 1 jam di dalam es.
Tabung-tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm, sebanyak 800 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL baru.
Ditambahkan 600 µL isopropanol tabung dibolak-balik hingga tercampur rata
kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam freezer (-20oC). Selanjutnya
disentrifugasi selama 10 menit pada 12000 rpm. Supernatan dibuang,
disentrifugasi kembali 30 detik, 12000 rpm. Sisa supernatan dipipet menggunakan
pipet mikro.
Tabung yang berisi pelet di oven 10 menit, 65oC. Ditambahkan 200 µL
ddH2O dan 2 µL RNAse, diinkubasi dalam penangas air 65oC, 30 menit sambil
tabung dibolak-balik setiap 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi 10 menit, 12000
rpm. Supernatan dipindahkan kedalam tabung baru dengan ukuran 1.5 mL.
Ditambahkan 25 µL natrium asetat 3 M dan 150 µL isopropanol dingin, dikocok
dan diinkubasi -20oC, 30 menit. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm, 5 menit dan supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran
disentrifugasi kembali 10 menit, 12000 rpm. Kemudian disentrifugasi kembali
pada 12000 rpm, 30 detik. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam oven 65oC, 10
menit. Pelet yang telah kering dilarutkan kembali dengan buffer pada saat akan
dianalisi lebih lanjut.
4
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Nanodrop
Alat diatur untuk pengukuran konsentrasi DNA (Thermo Fisher Scientific
2009). Larutan bufer TE digunakan sebagai blanko. Sebanyak 2 µL larutan TE
dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, nanodrop ditutup kemudian
tombol read blank pada komputer ditekan. Setelah sisa buffer TE dibersihkan
dengan tissue, 2 µL dimasukkan ke dalam lubang ukur, kemudian dipilih menu
read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian sampel akan muncul
dalam satuan konsentrasi ng/µL.
Amplifikasi DNA dengan PCR mikrosatelit (SSR)
Amplifikasi DNA menggunakan metode Praetiyono (2010). Sebanyak 20
µL yang terdiri atas 15 µL larutan cocktail (1.8 µL buffer, 0.2 µL MgCl2 25 mM,
2 µL dNTP mix 1 mM, 2 µL enzim DNA taq polimerase 5 U/µL, dan 9 µL
akuabides); 3 µL primer forward dan reverse, dan 2 µL DNA (25 ng/µL)
diamplifikasi PCR dengan marka SSR_PD dengan kondisi amplifikasi: pra
denaturasi (94oC, 5 menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing (55oC, 30
detik), elongasi (72oC, 45 detik); siklus 35x dan pasca amplifikasi (72oC, 7 menit).
Elektroforesis Hasil PCR
Pembuatan gel akrilamid dilakukan dengan cara mencampurkan 60 mL
larutan akrilamid 8%, 600 µL APS, dan 60 µL TEMED. Campuran larutan
tersebut dituangkan ke dalam cetakan kaca yang telah dirangkai menggunakan
klip. Sebanyak 3 µL loading dye ditambahkan pada hasil amplifikasi DNA, lalu
dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan daya 85 watt
selama 100 menit. Gel akrilamid diwarnai dengan larutan etidium bromida (20
mg/L) selama 8 menit, kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan air selama 16
menit. Pita-pita DNA divisualisasikan dengan chemidoc gel system (BIORAD)
(Sambrook 2001).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakter Unggulan
Hasil karakter unggul yang teramati pada Bio-148, IR64 dan Gajah
Mungkur adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman,
jumlah biji per malai, bobot 1000 butir disajikan pada Tabel 1. Padi Bio-148
memiliki tinggi tanaman diantara kedua tetuanya, yaitu IR64 dan Gajah Mungkur.
Hal serupa teramati pada bobot 1000 butir dan jumlah malai per tanaman. Umur
berbunga, bobot gabah isi dan jumlah gabah per malai Bio-148 lebih besar
dibandingkan kedua tetuanya.
5
Tabel 1 Karakter unggul padi
Varietas
Bobot (g)
1000 Gabah
butir
isi
Jumlah
Malai per
Gabah
tanaman
per malai
Ulangan
Tinggi
tanaman
(cm)
Umur
berbunga
(hari)
1
122
56
35.5
56.9
14
143.2
2
130
56
35.9
41.4
10
135.5
3
117
57
34.7
36.7
10
151.4
1
107.5
60
19.4
108
54
178.6
2
101
62
20.8
78.3
47
137.6
3
103
63
19.1
100.6
50
166.8
1
117.5
64
21.7
103.2
36
225
2
105.5
65
23.9
99.4
43
171.5
3
107.5
67
23.3
85.8
30
258.9
GM
IR64
Bio-148
Hasil pengamatan komponen hasil pada Bio-148, IR64 dan Gajah Mungkur
yang ditunjukkan pada Tabel 2. Panjang malai dan bobot 1000 butir Bio-148
diantara Gajah Mungkur dan IR64, sedangkan jumlah cabang primer, sekunder,
jumlah gabah isi, dan hampa Bio 148 lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur
dan IR64.
Tabel 2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi
Varietas Panjang malai (cm)
GM
IR64
Bio-148
Bobot 1000
butir (g)
Jumlah Cabang
primer Sekunder
Jumlah Gabah
Isi
Hampa
25.76a
35.37c
9.50b
25.47a
111.94a
26.23a
24.70b
19.75a
8.69a
23.07a
95.75b
23.96a
b
22.98
25.60a
10.68c
36.49b
117.42a
66.20b
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama, menunjukkan tidak berbeda
nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan
a
IR64
Bio-148
Gajah
Mungkur
Gambar 1 Malai tanaman padi
Hasil analisis koefisien korelasi Pearson pada komponen hasil disajikan
pada Tabel 3. Panjang malai berkolerasi positif terhadap jumlah cabang primer,
jumlah cabang sekunder, gabah isi, dan gabah hampa.
6
Tabel 3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil
Komponen
Hasil
P. Malai
J. C. Primer
J. C. Sekunder
J. G. Isi
J. G. Hampa
Jumlah
Cabang
Primer
Panjang
Malai
Jumlah
Cabang
Sekunder
Jumlah
Gabah
Hampa
Jumlah
Gabah Isi
1
0.622**
1
0.688**
0.895**
1
0.743**
0.714**
0.818**
1
0.18**
0.636**
0.62**
*berbeda nyata pada taraf 5%, **berbeda nyata pada taraf 1%
0.123*
1
Isolasi DNA
Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada Bio-148, IR64 dan
Gajah Mungkur ditunjukkan pad Tabel 4. Konsentrasi hasil isolasi Bio-148
memiliki nilai yang terendah dibandingkan varietas lainnya, akan tetapi memiliki
kemurnian yang sama dengan IR64 dan lebih tinggi dibanding Gajah Mungkur.
Hal ini cukup baik bagi ketiga sampel karena berada pada kisaran 1.8 sampai 2
yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA.
Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA
Varietas
Konsentrasi (ng/µL)
GM
IR64
Bio-148
A260/280
1.8
1.9
1.9
261.3
385.6
95.3
Amplifikasi DNA Padi
Hasil elektroforesis amplikon 16 primer kromosom 1-3 (Gambar 2)
menunjukkan 9 primer (RM 5, 104, 233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) yang
memberikan pola yang sama dengan Bio-148 maupun IR64.
5
3
6
4
8
9
1
7
2
M
Gambar 2 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 1-9 menunjukkan amplikon dengan marka RM 5, 104,
233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186. Masing-masing no. terdiri atas 3
sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur.
7
Sedangkan penggunaan 16 primer kromosom 4-7 (Gambar 3) menunjukkan
13 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
13
17
18
15
10
19
11 12
21
20
22
16
14
M
Gambar 3 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 10-22 menunjukkan amplikon dengan marka RM 255, 13,
31, 153, 159, 161, 178, 188, 162, 118, 125, 172, 214. Masing-masing
no. terdiri atas 3 sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah
Mungkur.
Hasil elektroforesis amplikon 21 primer kromosom 8-12 (Gambar 4)
menunjukan 12 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
40
29
23
24
25
26
28
30
35 36
34
31
27
37
38
42
39
43
41
33
32
Gambar 4 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR
M=marker, 23-43 menunjukkan amplikon dengan marka RM 72, 152,
210, 230, 264, 105, 201, 215, 242, 147, 171, 222, 244, 21R, 167, 209,
254, 4A, 20A, 179, 247. Masing-masing no. terdiri atas 3 sampel
dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur.
Analisis Introgresi
Hasil pengamatan jumlah introgresi kromosom DNA Gajah Mungkur
terhadap galur Bio-148 disajikan pada Tabel 5. Gambar 5 menunjukkam hasil
analisis SSR introgresi segmen kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 (100-
8
200 pb) pada kelompok no. 11 (RM 13), no. 13 (RM 153) kromosom 5; no. 21
(RM 172) pada kromosom 7, dan no. 34 (RM 222) pada kromosom 10.
Gambar 5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148
Tabel 5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148
Kromosom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Total
Jumlah marka SSR
2
5
8
2
8
2
6
7
5
4
4
4
57
Jumlah marka mengkuti
GM
0
0
0
0
2
0
1
0
0
1
0
0
4
Persentase (%)
0
0
0
0
25
0
16.67
0
0
25
0
0
7.02
Pembahasan
Karakter Unggulan
Tinggi tanaman merupakan faktor penting yang mempengaruhi tingkat
kepadatan daun dan kemampuan untuk fotosintesis untuk menghasilkan asimilat.
Karakter tinggi tanaman untuk menjadi tanaman ideal dengan potensi hasil tinggi
adalah sekitar 100 cm (Peng et al. 2008). Pengamatan tinggi tanaman pada
penelitian ini dilakukan 12 minggu setelah masa tanam. Tinggi tanaman diukur
dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan Bio-148
9
memiliki tinggi rata-rata (110.2 cm) diantara IR64 (103.8 cm) dan Gajah Mungkur
(123 cm). Hasil pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya
membandingkan tinggi tetua dengan turunan. Berdasarkan tinggi tanaman, Bio148 potensial sebagai padi unggul. Hasil penelitian ini menunjukkan tinggi
tanaman yang didapatkan lebih tinggi dibandingkan galur Fatmawati/Way Rarem
(106.3 cm) (Herawati 2009).
Peralihan antara fase vegetatif menuju fase generatif ditunjukan dengan
mulai berbunganya tanaman padi. Apabila 50% dari tanaman dalam satu
hamparan bunganya telah keluar, maka pertanaman tersebut dianggap sudah
memasuki fase pembungaan (Manurung dan Ismunadji 1988). Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa umur berbunga padi Bio-148 (65 hari) diantara varietas
Gajah Mungkur (56 hari) dengan IR64 (62 hari) (Tabel 1). Secara statistik Hasil
pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya membandingkan umur
berbunga tetua dengan turunan. Perbedaan pembungaan merupakan sifat
agronomi yang dipengaruhi oleh faktor genetik dan fisiologi. Oleh sebab itu
diduga terjadi akumulasi alel-alel dari kedua tetua pada individu (Trijatmiko
2001). Hasil penelitian ini menunjukkan umur berbunga padi yang digunakan
lebih kecil dibandingkan galur Way Rarem (90 hari) dan Fatmawati (104 hari)
(Herawati 2009).
Untuk tipe tanaman ideal, bobot 1000 butir berkisar antara 28-30 g (Ma et
al. 2006). Hasil penelitian ini (Tabel 1) menunjukkan, walaupun bobot Bio-148
(23 g) sudah lebih besar dari tetua IR64 (19.8 g) tetapi masih lebih kecil dari tetua
Gajah Mungkur (35.4 g). Selain itu masih lebih kecil dari bobot ideal. Namun
demikian, hasil ini relatif lebih baik dibandingkan hasil persilangan
Fatmawati/SGJT-28 (17 g) (Herawati 2009). Analisis statistik (Tabel 2)
menunjukkan bobot ke 3 sampel pada penelitian ini berbeda nyata.
Jumlah malai per tanaman merupakan salah satu karakter yang terkait
dengan hasil gabah (Rahmawati 2006). Varietas unggul baru (VUB) umumnya
memiliki jumlah malai >20 per rumpun (LITBANG 2006). Jumlah malai per
tanaman padi Bio-148 (36) didapatkan diantara IR64 (50) Gajah Mungkur (11)
(Lampiran 2). Analisis statistik jumlah malai per tanaman tidak dilakukan karena
hanya membandingkan jumlah malai tetua dengan turunan. Jumlah malai Bio-148
yang diperoleh ini masih lebih kecil dibandingkan hasil persilangan
Fatmawati/Way Rarem (8) (Herawati 2009), namun sudah lebih besar umumnya
VUB (LITBANG 2006) sehingga cukup potensial sebagai VUB.
Tanaman ideal, jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan gabah isi
lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil jumlah gabah per malai padi Bio-148
(218.5) lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur (143.4) IR64 (161) (Tabel 1).
Analisis statistik (Tabel 2) menunjukkan jumlah gabah isi per malai Bio-148
berbeda nyata dengan IR64 sedangkan jumlah gabah hampa per malai Bio-148
berbeda nyata dengan kedua tetua. Hasil penelitian ini menunjukkan gabah per
malai Bio-148 lebih baik dari hasil persilangan Fatmawati/Way Rarem (164.7)
(Herawati 2009). Oleh karena itu Bio-148 potensial sebagai VUB.
Hasil pengamatan gabah (Tabel 2) menunjukkan panjang malai Bio-148
lebih besar dari IR64 dan lebih kecil dari Gajah Mungkur. Hasil serupa teramati
pada bobot 1000 butir. Sementara untuk jumlah cabang primer dan sekunder Bio148 lebih besar dari IR64 dan Gajah Mungkur. Hal serupa teramati pada jumlah
gabah isi dan hampa. Hasil penelitian Peng et al. (2008) menunujukkan bahwa
10
untuk meningkatkan hasil padi tipe baru dibutuhkan tetua dengan karakter jumlah
gabah per malai dan ukuran malai yang besar. Fenomena segregasi transgresif dua
arah ini kemungkinan menunjukkan tidak satupun tetua membawa semua alel
positif atau alel negatif. Transgresi terjadi karena akumulasi alel-alel
komplementer yang diwariskan oleh kedua tetua pada individu tertentu
(Trijatmiko 2001).
Berdasarkan korelasi Pearson (Tabel 2), diperoleh informasi bahwa rata-rata
jumlah cabang primer, sekunder, jumlah gabah isi, dan hampa berkorelasi nyata
terhadap panjang malai pada taraf kepercayaan 5% sedangkan rata-rata jumlah
gabah hampa sangat berkorelasi nyata terhadap rata-rata jumlah gabah isi
berdasarkan taraf 1%. Karakter unggul akan lebih efektif meningkatkan hasil
apabila karakter unggul berkorelasi positif. Berdasarkan data pada Tabel 3
diketahui bahwa semua karakter unggul berupa panjang malai, jumlah cabang
primer, cabang sekunder, gabah isi dan gabah hampa berkolerasi positif.
Isolasi DNA Padi
Daun tanaman padi Bio-148 yang merupakan hasil persilangan digunakan
untuk isolasi DNA. Hasil isolasi DNA perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas
atau kemurnian DNA dan konsentrasi yang dibutuhkan untuk analisis PCR. Uji
kuantitatif menggunakan spektrofotometer melalui pengukuran konsentrasi
sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian sampel pada
perbandingan panjang gelombang 260/280 nm. Hasil isolasi ketiga varietas padi
memiliki kemurnian 1.8-1.9. Nilai kemurnian sampel yang baik menurut
Sambrook et al. (2001) adalah 1.8-2.0. Adanya kontaminasi protein terlihat dari
nilai kemurnian yang kurang dari 1.8, sedangkan nilai kemurnian sampel yang
lebih dari 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA. Uji kualitatif DNA dapat
dilakukan melalui elektroforesis gel akrilamid. Uji kualitatif ini berupa gambaran
untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA.
DNA padi diisolasi untuk melihat komponen padi unggulan dari segi
genotipe, diantaranya mendeteksi introgresi kromosom dari donor Gajah
Mungkur. Isolasi DNA padi dilakukan menggunakan metode modifikasi
Dellaporta et al. (1983). Konsentrasi DNA beragam (Tabel 4), secara umum
konsentrasi DNA hasil isolasi memiliki konsentrasi yang relatif baik dan sudah
cukup digunakan pada proses amplifikasi dengan mesin PCR. Hal ini juga sejalan
dengan hasil pengukuran konsentrasi DNA padi menggunakan metode Dellaporta,
sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Noferta (2011) yang memperlihatan
konsentrasi DNA hasil isolasi sebesar 75 ng/µL.
Amplifikasi DNA Padi
Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR TETRAD. DNA sampel
digunakan sebagai cetakannya untuk diperbanyak dengan 57 primer yang
ditargetkan pada kromosom 1-12. Tujuannya untuk mendapatkan primer-primer
yang memberikan pola amplikon yang sama terhadap Bio-148, IR64, dan Gajah
Mungkur. Hal ini akan menunjukkan sumber asal DNA pada Bio-148. Seleksi
(Gambar 2) dilakukan melihat kesamaan pola amplikon sampel Bio-148 dari tetua
(IR64 dan Gajah Mungkur). Hasil pengamatan kelompok primer kromosom 1-3
(Gambar 2) mendapatkan dari 16 primer, yang terlihat 9 primer (RM 5, 104,
233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) pola amplikon sampel Bio-148 sama dengan
11
IR64. Hal ini menunjukkan kromosom 1-3 Bio-148 tidak ada introgresi DNA dari
Gajah Mungkur.
Hasil pengamatan 16 kelompok primer pada kromosom 4-7 (Gambar 3)
terdapat 13 pola amplikon DNA. Pola amplikon DNA Bio-148 yang didapatkan, 3
kelompok primer yang mirip tetua Gajah Mungkur pada no. 11 (RM 13), no. 13
(RM 153) yang terletak pada kromosom 5, dan 21 (RM 172) yang terletak pada
kromosom 7 dengan ukuran berkisar antara 100-200 pb. Sedangkan, 11 primer
lainnya mirip tetua IR64. Kelompok primer no. 18 didapatkan pola polimorfik
pada Bio-148. Pita yang dihasilkan mengindikasikan bahwa penanda mikrosatelit
bersifat kodominan bagi organisme diploid yang dapat membedakan genotip
homozigot dan heterozigot (Pandin et al. 2008). Kromosom 5 dan 7 pada Bio-148
mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur sedangkan kromosom 4 dan 6 boleh
dikatakan masih asli tetua IR64.
Hasil pengamatan (Gambar 4) 21 kelompok primer pada kromosom 8-12,
primer no. 34 (RM 222) pada kromosom 10 menunjukkan DNA Bio-148 mirip
tetua Gajah Mungkur dengan ukuran 100-200 pb. Perbedaan ukuran pita yang
terjadi pada masing-masing primer menunjukkan adanya perubahan genomik.
Perubahan tersebut dapat terjadi dari alel yang bersifat homozigot (satu pita)
menjadi heterozigot (dua pita) atau sebaliknya (Megia dan Djuita 2010).
Kelompok 20 primer lainnya pola amplikon yang mirip dengan tetua IR64. Hal ini
menunjukkan kromosom 10 Bio-148 mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur
sedangkan kromosom 8, 9, 11, dan 12 masih asli tetua IR64.
Banyak faktor yang menyebabkan perbedaan jumlah dan intensitas pita
DNA yang terbentuk pada setiap primer dan pada masing-masing lokus. Tingey et
al. (1994) menyatakan bahwa variasi yang terjadi pada jumlah dan intensitas pita
DNA yang terbentuk setelah proses amplifikasi sangat tergantung pada cara
primer mengenal urutan DNA komplementernya pada cetakan DNA (DNA
template) yang digunakan. Kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan juga
berpengaruh. DNA cetakan yang mengandung kontaminan seperti polisakarida
dan senyawa fenolik, serta konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering
menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas (Weeden et al.
1992). Selain itu sebaran situs penempelan primer pada DNA cetakan dan adanya
kompetisi tempat penempelan primer pada DNA cetakan menyebabkan satu
fragmen diamplifikasi dalam jumlah banyak sementara fragmen lainnya hanya
sedikit. Weeden et al. (1992) juga menyatakan bahwa amplifikasi mungkin
diinisiasi pada beberapa tempat, tetapi hanya beberapa set yang dapat dideteksi
sebagai pita sesudah amplifikasi.
Analisis Introgresi
Total marka yang digunakan terdapat 4 marka yang mengikuti pola
amplikon tetua Gajah Mungkur. Kromosom 5 (Tabel 5) dari 8 marka, 2 marka
dapat mendeteksi kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI
2/8x100%=25%), sedangkan untuk primer kromosom 7 dari 6 marka, hanya 1
marka menunjukkan kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI
1/6x100%=16.67%). Sementara kromosom 10 dari 4 marka yang digunakan,
hanya 1 marka mirip tetua Gajah Mungkur (persentase introgresi / PI
1/4x100%=25%). Introgresi kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 dengan
cara silang baik (back cross) beberapa kali agar diperoleh introgresi
12
yangdiinginkan dan seminimal mungkin membawa introgresi negatif (linkage
drag) fragmen liar yang tidak diinginkan (Reyes-Valdes 2000). Hasil penelitian
Mulsanti (2011) diperoleh enam marka SSR yang polimorfis, yaitu RM 206, 263,
276, 346, 335, dan 570 yang dapat membedakan antara masing-masing tetua padi
hibrida yang diuji.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Introgresi segmen kromosom padi Gajah Mungkur meningkatkan karakter
(umur berbunga, panjang malai, bobot 1000 butir, jumlah cabang primer
dansekunder, jumlah gabah per malai, jumlah gabah isi dan hampa) padi Bio-148.
Introgresi kromosom padi Gajah Mungkur pada padi Bio-148 terjadi pada
kromosom 5,7, dan 10 yang terkait pada produktivitas.
Saran
Dilakukan penelitian lebih lanjut dalam menentukan gen pembawa sifat
unggul. Selain itu perlu dilakukan penelitian terkait karakter selain komponen
hasil.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan
padi varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS.
Chawla HS. 2004. Introduction to Plant Biotechnology second edition. India: Science
Pb.
Dellaporta SL, J Wood, and JB Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation:
Version II. Plant Mol. Biol. Reptr. 1:19-21.
Herawati R, Purwoko BS, Dewi IS. 2009. Keragaman genetik dan karakter
agronomi galur haploid padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru hasi kultur
antera. J Agron Indonesia 37(2):87-94.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with
heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105.
Manurung SO dan M Ismunadji. 1988. Morfologi dan Fisiologi Padi. dalam Padi.
PPPTP. Bogor: 55-98.
Megia R dan Djuita Nina R. 2010. Deteksi integritas genomic pisang hasil iradiasi
in vitro berdasarkan penanda mikrosatelit. MAKARA SAINS. 14 :151-157.
Mulsanti IW. 2011. Identifikasi dan evaluasi kemurnian genetik benih padihibrida
menggunakan marka mikrosatelit [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
13
Noferta A. 2011. Analisis genom geminivirus isolate agresif PSS 1-4 dari pesisir
selatan Sumatera Barat [tesis]. Padang: Universitas Andalas.
Pandin DS. 2010. Penanda DNA untuk pemuliaan tanaman kelapa (Cocos
nucifera L.). Perspektif. 9: 21-35.
Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype
breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38.
Prasetiyono J. 2010. Studi Efek Introgresi Pup (p Uptake 1) untuk Meningkatkan
Toleransi Padi Terhadap Defisiensi Fosfor [Disertasi]. Bogor: Program Studi
Agronomi, Institut Pertanian Bogor.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi
menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375.
Reyes-valdes MH. 2000. A model for Marker-Based Selection in Gene
Introgression Breeding Program. Crop Sci. 40:91–98.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Shivanna KR, Sawhney. 1997. Pollen Biotechnology for Crop Production and
Improvement. UK: Cambridge University Pr.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific Inc.
Tingey SV, Rafalski JA, Hanafey MK. 1994. Genetic analysis with RAPD
markers. In: Coruzzi C and Puidormenech (eds). Plant Molecular Biology.
Berlin: Springer-Verlag.
Trijatmiko KR, Aswidinnoor H, Moeljopawiro S, dan Sopandie D. 2001.
Keterpautan marka RAPD dengan sifat daya tembus akar tanaman padi
IRAT112. Jurnal Bioteknologi Pertanian 6:29-35.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analyses
of Transgenic Plants. NewYork: Springer Inc.
Utami DW, Hajrial A, Asep S, Sugiono M, dan Edi G. 2004. Aplikasi teknik
Marker Assisted Selection (MAS) dalam seleksi introgresi genotip tahan
patogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR 64. Zuriat 2:15.
Weeden NF, Timmerman GM, Hemmat M, Kneen BE & Lodhi MA. 1992.
Inheritance and Reliability of RAPD Markers. Application of RAPD
Technology to Plant Breeding. Joint Plant Breeding Symposia Series
CSSA/ASHS/AGA. Minneapolis, 1 November 1992.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram alur penelitian
Tanam benih (IR64, Bio-148, da Gajah Mungkur)
Identifikasi karakter unggul
Isolasi DNA
Analisis kuantitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforsesis
Analisis data
15
Lampiran 2 Primer SSR
No.
1
Primer
RM5
Forward
TGCAACTTCTAGCTGCTCGA
GGAAGAGGAGAGAAAGATGTGTGC
G
GTCCCCTCCACCCAATTC
CCAAATGAACCTACATGTTG
CCTTAATGGGTAGTGTGCAC
CATTCCGTCTCGGCTCAACT
CCCAGGCTAGCTCATGAACC
TTCGCCATGAAGTCTCTCG
GGTTTGGGAGCCCATAATCT
CCGTCGCCGTAGTAGAGAAG
CCAAAGATGAAACCTGGATTG
ATCTTGTTGTTTCGGCGGCGGC
GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC
TGCTGCTTGCCTGCTTCCTTT
TCCTCCATCTCCTCCGCTCCCG
TCCTCCCTCCCTTCGCCCACTG
TGTTGCGTGTGGAGATGTG
TCCAACATGGCAAGAGAGAG
GATCACGATCCACTGGAGCT
GCCTCTCTCGTCTCCTTCCT
GCCTCGAGCATCATCATCAG
2
RM104
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
RM6
RM233A
RM240
RM262
RM263
RM7
RM22
RM55
RM85
RM132
RM156
RM168
RM186
RM131
RM255
RM13
RM31
RM39
RM153
22
RM159
GGGGCACTGGCAAGGGTGAAGG
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
RM161
RM178
RM188
RM50
RM162
RM118
RM125
RM134
RM172
RM214
RM248
RM25
RM38
RM72
RM152
RM210
RM230
RM264
RM105
RM201
RM215
RM242
RM245
RM147
RM171
RM222
RM244
RM21R
TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC
TCGCGTGAAAGATAAGCGGCGC
TCCGCCTCTCCTCTCGCTTCCC
ACTGTACCGGTCGAAGACG
GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG
CCAATCGGAGCCACCGGAGAGC
ATCAGCAGCCATGGCAGCGACC
ACAAGGCCGCGAGAGGATTCCG
TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG
CTGATGATAGAAACCTCTTCTC
TCCTTGTGAAATCTGGTCCC
GGAAAGAATGATCTTTTCATGG
ACGAGCTCTCGATCAGCCTA
CCGGCGATAAAACAATGAG
GAAACCACCACACCTCACCG
TCACATTCGGTGGCATTG
GCCAGACCGTGGATGTTC
GTTGCGTCCTACTGCTACTTC
GTCGTCGACCCATCGGAGCCAC
CTCGTTTATTACCTACAGTACC
CAAAATGGAGCAGCAAGAGC
GGCCAACGTGTGTATGTCTC
ATGCCGCCAGTGAATAGC
TACGGCTTCGGCGGCTGATTCC
AACGCGAGGACACGTACTTAC
CTTAAATGGGCCACATGCG
CCGACTGTTCGTCCTTATCA
ACAGTATTCCGTAGGCACGG
51
RM167
GATCCAGCGTGAGGAACACGT
Reverse
GCATCCGATCTTGATGGG
K
1
TCAACAGACACACCGCCACCGC
1
TCGTCTACTGTTGGCTGCAC
GCATTGCAGACAGCTATTGA
TGTAACCATTCCTTCCATCC
CAGAGCAAGGTGGCTTGC
GCTACGTTTGAGCTACCACG
CCTCCCATCATTTCGTTGTT
CTGGGCTTCTTTCACTCGTC
TCCCGGTTATTTTAAGGCG
GCACAAGGTGAGCAGTCC
CATGGCGAGAATGCCCACGTCC
TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG
GAAACGAATCAATCCACGGC
GGGCGTGGTGGCCTTCTTCGTC
CGATGTTCGCCATGGCTGCTCC
CGAAACCGCTCAGTTCAAC
GGTGGCATTCGATTCCAG
AAGTCCATTACTCTCCTCCC
AATTCAAACTGCGGTGGC
ATCAACCTGCACTTGCCTGG
GCTTGTGCTTCTCTCTCTCTCTCT
CTCTC
TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG
GATCACCGTTCCCTCCGCCTGC
GCAACGCACAACCGAACCGAGC
AAATTCCACGTCAGCCTCC
CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG
CACATCCTCCAGCGACGCCGAG
AGGGGATCATGTGCCGAAGGCC
GCTCTCCGGTGGCTCCGATTGG
CAACCACGACACCGCCGTGTTG
AAGAACAGCTGACTTCACAA
GTAGCCTAGCATGGTGCATG
CTACCATCAAAACCAATGTTC
TCGGTCTCCATGTCCCAC
GCATCGGTCCTAACTAAGGG
CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG
CGAGGATGGTTGTTCACTTG
CACCGCAGTCACTTTTCAAG
GATCCGTGTCGATGATTAGC
TGGTCGAGGTGGGGATCGGGTC
CTACCTCCTTTCTAGACCGATA
TGAGCACCTCCTTCTCTGTAG
TATATGCCAAGACGGATGGG
CTGAGAATCCAATTATCTGGGG
CCCCCGAATCCCATCGAAACCC
ACGAGATACGTACGCCTTTG
CAAAGCTTCCGGCCAAAAG
CTGCTCTCGGGTGAACGT
GCTCCATGAGGGTGGTAGAG
AGTCCGACCACAAGGTGCGTTG
TC
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
10
10
10
10
11
11
16
No.
Primer
52
RM209
53
RM254
54
RM4A
55
RM20A
56
RM179
57
RM247
K= Kromosom
Forward
ATATGAGTTGCTGTCGTGCG
AGCCCCGAATAAATCCACCT
TTGACGAGGTCAGCACTGAC
ATCTTGTCCCTGCAGGTCAT
CCCCATTAGTCCACTCCACCACC
TAGTGCCGATCGATGTAACG
Reverse
CAACTTGCATCCTCCCCTCC
CTGGAGGAGCATTTGGTAGC
AGGGTGTATCCGACTCATCG
GAAACAGAGGCACATTTCATTG
CCAATCAGCCTCATGCCTCCCC
CATATGGTTTTGACAAAGCG
K
11
11
12
12
12
12
17
Lampiran 3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA)
a) Panjang malai
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
76.545a
2
38.272
6.090
.003
127283.872
1
127283.872
20252.706
.000
6.090
.003
Perlakuan
76.545
2
38.272
Error
1828.872
291
6.285
Total
Corrected
Total
186631.710
294
1905.417
293
b) Jumlah cabang primer
Source
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
Corrected
Model
Intercept
207.136a
2
103.568
47.155
.000
18151.190
1
18151.190
8264.271
.000
Perlakuan
207.136
2
103.568
47.155
.000
Error
639.136
291
2.196
Total
Corrected
Total
27020.000
294
846.272
293
c) Jumlah cabang sekunder
Source
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
Corrected
Model
Intercept
9784.373a
2
4892.187
43.372
.000
154218.328
1
154218.328
1367.238
.000
Perlakuan
9784.373
2
4892.187
43.372
.000
Error
32823.494
291
112.796
Total
Corrected
Total
268923.000
294
42607.867
293
d) Jumlah gabah isi
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
df
Mean
Square
F
Sig.
29562.758a
2
14781.379
7.591
.001
2314326.513
1
2314326.513
1188.481
.000
7.591
.001
Perlakuan
29562.758
2
14781.379
Error
566663.667
291
1947.298
18
Total
Corrected
Total
3819751.000
294
596226.425
293
e) Jumlah gabah hampa
Source
Corrected
Model
Intercept
Type III Sum
of Squares
Df
Mean
Square
F
Sig.
93171.371a
2
46585.686
77.452
.000
277573.188
1
277573.188
461.486
.000
77.452
.000
Perlakuan
93171.371
2
46585.686
Error
175029.829
291
601.477
Total
Corrected
Total
701983.000
294
268201.201
293
19
Lampiran 4 Analisis statistik dengan uji Duncan
a) Panjang malai
Duncana,,b,,c
Subset
1
2
24.5735
Varietas
N
IR64
151
Bio-148
109
25.5367
GM
34
25.7471
Sig.
1.000
.629
b) Jumlah cabang primer
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset
2
1
8.6689
3
9.5000
10.4771
1.000
1.000
1.000
c) Jumlah cabang sekunder
Duncana,,b,,c
Subset
Varietas
N
IR64
151
1
22.8940
GM
34
25.4118
Bio-148
109
Sig.
2
35.1927
.173
1.000
d) Jumlah gabah isi
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset
1
94.9868
2
112.8235
115.6514
1.000
.712
e) Jumlah gabah hampa
Duncana,,b,,c
Varietas
N
IR64
151
Subset
1
2
24.4834
GM
34
25.9412
Bio-148
109
Sig.
61.5963
.732
1.000
20
Lampiran 5 Reagen
Larutan / Bufer
TBE (TrisHCl-Boric Acid-EDTA) 10x
APS 10%
Akrilamid/bisakrilamid 40%
Akrilamid 8%
Marka 100 bp Ladder plus
Loading dye 6x
Gel akrilamid
Ekstraksi buffer 500 mL
20% SDS
5 M Kalium asetat
3 M Natrium asetat
TE 1 x
TE 0.1 x
Cara pembuatan
Sebanyak 108 g Tris HCL, EDTA 40 mL
pH 8, boric acid 55 g dilarutkan dengan
aquades hingga volume akhir 1 L
Amonium persulfat sebanyak 1 g
dlarutkan dengan akuades hingga 10 mL
Sebanyak 380 g akrilamid dan 20 g
bisakrilamid dilarutkan dengan akuades
hingga 1 L
Sebanyak
200
mL
akrilamid/
bisakrilamid 40% dan 50 mL TBE 10x
dilarutkan dengan akuades 750 mL
50 µL stock 100 bp Ladder plus ditambah
950 µL TrisEDTA untuk menjadikan
konsentrasi akhir 50 µg/ µL
Bromofenol biru 0.03%, 10 mM TrisHCL (pH 7.6), gliserol 60%, 60 mM
EDTA, dan xylenecyanol FF dilarutkan
dalam akuades.
Sebanyak 55 mL akrilamid 8%, 550 µL
APS 10%, dan 55 µL TEMED lalu
diaduk.
Sebanyak 50 mL Tris-HCl pH 8, 50 mL
0.5 M EDTA, 62.5 mL 4 M NaCl, dan
337.5 mL dH2O dicampur dan diaduk
hingga rata.
Sebanyak 200 gram SDS dilarutkan
dengan 800 mL akuades.
Sebanyak 49.07 gram kalium asetat
ditimbang dan ditambahkan dengan air
steril sebanyak 70 mL lalu di sterilisasi
kedalam autoklaf (121°C, 2atm, 20
menit).
Ditimbang sebanyak 204.15 g natrium
asetat kemudian dimasukkan 200 mL
air steril dan 90 mL asam asetat
20ncubat kemudian di sterilisasi ke
dalam autoklaf (121°C, 2atm, 20
menit).
Sebanyak 10 mL Tris HCl 1M (pH 8)
ditambah dengan 2 mL EDTA 0.5M
(pH 8) dan ditera hingga 1000 mL
menggunakan akuades.
Sebanyak 15 µL larutan TE 1 x
dilarutkan dengan akuades sebanyak
135 µL dengan volume akhir 150 µL
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banjarbaru, Kalimantan Selatan pada tanggal 14 Juli
1990 sebagai putra kedua dari ayah Bambang Tri Saputra dan ibu Noorhasanah.
Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 11 Bandung dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur
Undangan Saringan Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia
Dasar dan Biokimia Umum pada tahun ajaran 2010. Penulis pernah melakukan
Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Biak Sel dan Mikropropagasi Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor selama periode Juli –
Agustus 2011 dengan judul Pengaruh Asam Humat terhadap Pertumbuhan Planlet
Tebu (Saccharum officinarum L) Hasil Aklimatisasi.
Penulis juga aktif dalam organisasi kampus sebagai staf divisi
Biomolekuler dalam Research and Education Himpunan Profesi Mahasiswa
Biokimia (CREBs) 2010, ketua divisi Biomolekuler dalam Research and
Education Himpunan Profesi Mahasiswa Biokimia (CREBs) 2011.