Filogeni Kerbau Rawa (Bubalus bubalis) Berdasarkan Genom Mitokondria

FILOGENI KERBAU RAWA (Bubulus bubalis)
BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA

SYLVIA NOVITA PALUPI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAIIUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

ABSTRAK
SYLVIA NOVITA PALUPI. Filogeni Kerbau Rawa (Bubalus bubalis) berdasarkan Genom
Mitokondria. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI.
Kerbau yang ada saat ini merupakan hasil domestikasi kerbau liar Asia, Btrbalus arnee.
Kerbau basil domestikasi dibedakan menjadi dua jenis, yaitu kerbau rawa dati kerbau sungai.
Keduanya berbeda baik secara fisik, kariotipe dan pola penyebar'mya. Penelitian ini dilakukan
untuk mengetahui posisi filogeni B. bubalis dalam Bovidae dan mempelajari pola penyebarannya
berdasarkan genom mitokondria. Sampel yang digunakan adalah kerbau rawa lokal yang berasal
dari Sumatera Utara, Banten, Jawa Tengah dan NTB. Amplifikasi dilakukan secara in vilro dengan
teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Produk amplifikasi sebesar 1145 pb dirunutkan dan

dianalisis filogeninya. Empat dari delapan sampel berhasil diamplifikasi yaitu kerbau asal
Sumatera Utara, Banten dan NTB. Semua sampel kerbau rawa lokal mengelompok dalam
subfamili Bovinae dali famili Bovidae .Pola penyebaran kerbau mengikuti pola ekspansi pertanian
manusia dari daratan Cina, tempat nenek moyang kerbau, menuju ke semanjung Malaya (Sumatera
Utara) dan ke arah Jawa kemudian tnenuju ke Indonesia Timur. Hal ini merupakan penjelasan
bahwa sampel asal Sumatera Utara adalah haplotipe yang berbeda tlari sanlpel asal Banten dan
NTB berdasarkan aualisis ~ne~lggunakan
dua basa pertama pada tiap kodon C:yt b.
ABSTRACT
SYLVIA NOVITA PALUPI. Phylogeny of Swamp Buffalo (Btrbnhrs bubnlis) Based on
Mitochondrial Genome. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and D Y N I PERWITASARI.
Wild asiatic buffalo namely Bubalus arnee is the ancestor of the domesticated buffalo. The
domesticated buffalo is broadly classified into swamp and river buffalo. Both are different in
tnorphology, karyotype and its spreading pattern. This research was conducted to investigate the
phylogeny of B. bubalis alllong bovidae and its spreading pattern based on mitocho~ldrialgenome.
Samples used in this research were local swamp buffalo from north Sumatera, Banten, Central
Java and Nusa Tenggara Barat (NTB). Amplification was done ill vitlv using Polymerase Cliain
Reaction (PCR) method yielded 1145 bp, for hrther analyzed. Four G o ~ neight samples were
successfully amplified that were from North Sumatera, Banten and NTB. All of four samples were
grouped into Subfamily of Bovinae and Family of Bovidae. The spreading pattern of buffalo

followed the human cultivation expansion pattern from China were buffalo's ancestor origin
tluough Malay's cape (North Sumatera) and Java, then through to the east of Itidonesia. The result
explained that local swamp buffalo in North Sumatera was significantly dicferent haplotype from
local swamp buffalo in Banten and NTB.

FILOGENI KERBAU RAWA (Bubalus bubalis)
BERDASARKAN GENOM MITOKOmEUA

SYLVIA NOVITA PALUPI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk me~nperolehg e l a
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAEIUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Judul Skripsi
Nama
NIM

: Filogeni Kerbau Rawa (Bubal~is
bubalis) berdasarkan Genom Mitokondria
: Sylvia Novita Palupi
: G34050562

Menyetujui:

Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP. 19650427 199002 1002

a

Dr. Ir. R. R Dyah Perwitasari, M.Sc
NIP 1 660403 199003 2 001

$. Dekau Fakultas Mate~natikadan Ilmu Pengetahuan Alan
Institut Pertanian Bogor

Tanggal Lulus:

'2 1 J U L 2009

1

~

1

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt. atas segala karunia dan berkat-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Achnad Farajallah M.Si dan Ibu
Dr. Ir. R. R. Dyab Penvitasari, M.Sc. Di sampinbg itu, penghnrgaan penulis sampaikan kepada staf
pengajar Zoologi, kepada Pak Chairul, Bu Bibah, Mbak Tini, Mbak Ani, I'ak Adi, Kak Wildan,
Kak Erik, Kak Ogi, Kak Ruth, Kak Uce, Ichay, Jazy, Dewi, Ika, Prista serta teman-teman Biologi

khususnya Bio 42 atas persahabatan yang indah selama ini. Ucapan terima kasih tak terhingga
penulis berikan untuk Mama, Papa dan Mas Panji atas segala doa, kasih saynng, dan dukungannya
kepada penulis.
Semoga kalya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, Juli 2009

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jember pada tanggal 28 November 1986 dari ayahanda Supamo, SE
dan ibunda Subaida. Penulis merupakan putri tunggal.
Tahun 2005 penulis lulus dari SMAN 1 Jember dan pada tal~unyang sanla lulus
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memasuki Program Shldi Biologi, Falmltas
Mateinatika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pemah
menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007 dan 200812009,
Stmktur Hewan pada tahun ajaran 200812009 dau pengantar Genetika Molekuler pada tahun ajaran
200812009. Pada tahun 2007 penulis 1010s dalaln Program Kreativilas Mahasiswa (PKM) dengan
judul Kernalnpuan Anti 0-Laktamase Streptomyces lavertdt~lae I W - 1 sebagai senyawa
pendukung P-Laktam penghambat sintesis dinding sel EPEC K1-1 dan mer~jadimoderator dalam
seminar Public Speaking: Let's Talk Let's Action. Pada tahun yang sama, penulis n~elakukan
praktik lapangan di PT Saung Mirwan dengan judul Budidaya Bung? IG-isan (Cli~ysa~~theti~u,,z

sp.)
dalam pot di PT Saung Miman.

DAFTAR IS1

DAFTAR TABE
viii
...
DAFRAT GAMBAR
VIII
...
DAETAR LAMPIRAN ...........................................................................................................VIII
PENDAHULUAN
...............................................................................................
Latar Belakang .............
.
Tujuan .............................................................................................................................

1

1

BAHAN DAN METODE

HASIL
Alnplifikasi dan Visualisasi Fraglnel~DNA
Pelunutall Produk PCR .................................................................................................
Analisis Filoge~

2
3
3

PEMBAFIASAN
5

5

G
SIMPULAN ............................................................................................................................. 7

S A R A N ..............
.
.
.
.
...........................................................................................................

7

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................................

7

DAPTAR TABEL

1

. .
Panjang mas hasil pensejajaran (nt) .............................................................................

3

2

Hasil pensejajaan nukleotida DNA yang berheda ..............................
.
.
..................

3

3

Nilai jarak genetik (bawah diagonal) dan standar eror (atas diagonal) antar B. bttbalis
dari beberapa lokasi berdasarkan metode Kimttra-2-paranieter ....................................

5

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1

Hasil an~plifikasiluas D-loop dalanl PAGE 6% dengan pewarnaan sensitif pcrak .........

2

2

Hasil I-ekonstruksi pohon filogeni herdasarkan dua basa pertaina (A) dan ketiga basa
(B) pada tiap kodon dari gen Cyt b tnenggunakan n~etodeNJ dengan bor~lstrrrp1000X.

4

Hasil rekonstruksi pollon filogeografi berdasarkan ruas D-loop mtDN.4 menggunakan
metode NJ dengan bootstrap 1000X..................... .
.
.
..................................................

4

3

DAFTAR LAMPIRAN
flalarna~~
1

Spesies pelnbanding dalaln analisis filogeni yang diperoleh da1-i GuleB017k................... 10

2

EIasil penjajaran DNA ruas Cyt b dan D-loop genonl nlitokondria kerbau rawa
(B. bubalis) ....................
.
.
...................................................................................... 11

3

Pola ekspansi manusia .....................................................................................................

13

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kerbau (Bubalus bubalis) me~upakan
anggota Famili Bovidae, Subfaniili Bovinae,
genus Bubalus (Williamson & Payne 1993).
Bubalus memiliki morfologi berbeda dari
Bovinae lailmya yaitu Bos, Bison, Pseudoryx,
dan Syncerus. Tanduknya cenderung bersudut
bahkan membentuk sabit. Selain itu,
telinganya berukuran kecil dan tulang
tengkoraknya
panjang
dan
senipit
(Willianlson & Payne 1993).
Ulrbalus b~~bulis
dikenal sebagai kerbau
Indian yang diduga hasil dotnestikasi kerbau
liar Asia, Bubalis anlee (Lau el a1 1998).
Kerbau hasil domestikasi bisa dibedakan
menjildi kehau rawa (swanzp bufiff dan
kcrbau sungai (rh~erb~rffnlo).Kerbau rawa
~ilenliliki kulit benvarna hitam abu-abu
dengan tanda putih abu-abu pada lipatan
bagiati bawah leliernya dan tanduk yang
tunlbuh ~nelengkungke belakang seperti sabit.
Tubuh kerbau sungai berukuran lebih besar
dibandingkan kerbau rawa, kulit dominan
berwarna hitam dengan tanda putih di bagian
dahi dan ujung ekor, dan tanduk berukuran
relatif pendek, melengkung ke depan, ke
bawah atau ke belakang. Selain itu, jumlah
krotnosom kerbau rawa 2n=4S sedangkan
kerbau sungai 2n=50 (FIilmi 1991). Pola
penyebaran keduanyapun berbeda. Kerbau
rawa tersebar di daratan India, Timur Tengah
dan Eropa bagian barat, sedangkan kerbau
sungai tersebar di Cina, Bangladesh, negaranegara di Asia Tenggara dan Barat daya India.
Filogeni adalah sejarah mengenai garis
evolusi suatu kelo~npokorganisme. Analisis
filogeni pada satu spesies yang nienyebar
nlengikuti pola geografi dikenal dengan istilah
filogeografi. Salah satu penanda molekular
yang banyak digunakan dalam analisis
filogeui maupun filogeografi adalah genoni
mitokondria (mtDNA) (Coccone 1999).
Perbedaan penggunaan mtDNA baik untuk
analisis filogeni maupun filogeografi adalah
pada karakter laju mutasi autar bagian-bagian
mtDNA. Bagian mtDNA yang paling stabil
dan banyak digunakan untuk menganalisis
filogeni pada tingkat interspesies adalah
tRNA dan rRNA. Bagian genom yang
menyandikan protein yang paling sering
digunakan untuk menganalisis filogeni
anggota taksa dibawah ordo atau famili adalah
Cyt b. Bagian D-loop dari genom adalah yang
paling cepat laju mutasinya sehingga sangat
populer digunakan untuk menganalisis

keragaman intraspesies atau filogeografi
(Farajallah A 8 Juni 2009, komunikasi
pribadi). Ruas genonl mitokondria yang
banyak digunakan sebagai penanda molekuler
untuk menganalisis filogeni pada B~rbalus
yakni Cyt b (Lau et ul. 1993, Hassanin &
Douzety 1999) dan D-loop (Lau et al. 1993).
Parma et nl. (2004) menjabarkan posisi
filogenetik Bubalus dalam kelima matnalia
lainnya, yaitu sapi (Bos inclicus), kambing,
domba, rusa (Mcuitiacus nzwztjak) dan Ilama
(Lanta pacos) berdasarkan 13 gen penyandi
protein mtDNA. Bubalus berkerabat dekat
dengau sapi sebagai ang,aota run~inausia
besar. ICeduanyn niengelo~i~pokdengan
kambing dan domba sebagai anggota dari
mminansia kecil. Elubungan kekerabatan
Bubalus jauh dengan rusa dati Ilama.
Tujuan
Penelitan ini be]-tujuan mempelajari
posisi filogeni B. b~fbalis dalanl Fnniili
Bovidae dari berbagai daerah di Indonesia dan
menipelajari pola penyebal-annya berdasarkan
genom mitokondria.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel darah kerbau rawa yaug
digunakan dalam penelitian ini adalah sampel
darah yang diawetkan dalam alkohol 70%
koleksi Bagian Fungsi Hnyati dan Perilaku
Hewan Departemen Biolog~. Sebailyak
delapan sampel dipilih dari keenlpat lokasi
yang berbeda, yaitu Surnatera Utara (SU181
dan SU182), Nusa Tenggara Barat (NTB)
(NTB76 dan NTB77), Banten (B73 dan I374)
dan Jawa Tengah (JT38 dan JT39). Sa~npel
asal Suniatera Utara dipilih berdasarkan
infonnasi yang diberikan ole11 Ta~winangsih
(2009) sebagai haplotipe yang berbeda
berdasarkan metode PCR-RFLP.
Waktu dan Ternpat P e ~ ~ c l i t i a ~ l
Penelitian i ~ i idilaksanakan pada bulan
Feb~uarisampai dengan Mei 2009 bertempat
di Laboratoriu~uBagian Fungsi Hayati dan
Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Metode
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan tnenggunakau
Genomic DNA nziici kit (Geneaid) for blood
yaug dimodifikasi. Sel-sel darali diendapkan
dengan sentrihgasi kemudian dicuci dengan
air destilata dua kali. Eudapan sel-sel darah

yang sudah bersih dari alkohol kemudian
disuspensikan dalam bufer STE (NaCI lM,
Tris-HCI lOmM, EDTA 0,) mM, pH 8,O)
sampai volume 350 p1. Sel-sel darah dilisis
dengan SDS 1% dan proteinase K 0,125
mglml, kemudian dimkubasi pada suhu 55'C
selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode
ekshaksi DNA selanjutnya mengikuti
petunjuk Genolnic DNA mini kit (Geneaid)
for blood.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
Amplifikasi
genom
mitokondria
menggunakan pasangan primer koleksi Dr.Ir.
Achmad Farajallah, M. Si, yaitu AF22 (5'GCGTACGCAATCTTACGAT CA-3') yang
menempel pada basa ke-15357 dan AF23 (5'ATGCAGTTAAGTCCAGCTAC-3')
yang
menempel pada basa ke-143. Pasangan primer
ini mengapit mas D-loop mulai dari bagian
akhir gen Cyt b sampai ke bagian akhir Dloop dengan panjang 1145 pb. Knmposisi
reaksi PCR dengan volume 25 p1 terdiri atas
sampel DNA 2 PI, Taq Polymerase (RBC)
0.75 unit beserta bufernya, MgC12 0.2 mM,
dNTPs mix 0.2 mM dan masing-masing
primer 1 nM.
Reaksi PCR dilakukan menggunakan
mesin Thern~ocyclerTaKaRa MP4 dengan
kondisi sebagai berikut: tahap denaturasi
awal pada suhu 94 OC selama lima menit;
tahap kedua yang terdiri dari 30 siklus yang
masing-masing siklus terdiri dari denaturasi
pada suhu 94 OC selama satu menit,
penempelan primer pada suhu 59 OC selama
dua menit dan pemanjangan pada suhu 72 OC
selama dua menit; tahap terakhir yaitu
pemanjangan akhir pada suhu 72 OC selama
sepuluh menit. Kualitas produk PCR diuji
menggunakan PAGE 6% dalam bufer 1X
TBE (10 mM Tris-HCI, 1 M asam borat, 0.1
mM EDTA) yang dijalankan pada kondisi 180
mV selama 40 menit. Selanjutnya DNA
diwarnai dengan pewamaan sensitif p e r k
(Tegelshom 1986).
Perunutan Prnduk PCR
Produk PCR bempa pita tunggal
berukuran sesuai desain primer dimurnikan
dengan QIAQuick PCR Purification Kit
(QIAGEN). Produk PCR yang sudah
diiumikan kemudian dijadikan sampel dalam
reaksi PCR untuk perunutan nukleotida
dengan metode Dye Dideoxi Terminator
menggunakan primer AF 22 (PT. CHAROEN
POKPHAND INDONESIA).
Perunutan
nukleotida menggunakan mesin ABI Prism
3700-Avant Genetic Analyzer.

Anaiisis Filogeni
Runutan nukleotida yang dipcroleh diedit
secara manual lnenggunaban program Bioedit
versi 7.0.9.0 berdasarkan pada kromatogram
hasil perunutan. Runutan nukleotida yang
telah diedit disejajarkau dengan urutan
nukleotida beberapa spesies lain yang
bomolog dari GeneBank (Lampiran 1). Proses
pensejajaran
dilakukan
menggunakan
program Clustal W1.8 dalam MEGA 4.0 yang
kemudian diedit secara manual. Perhitungan
komposisi nukleotida, tipe subtitusi, jarak
genetik dan konstruksi pohon filogeni
dilakukan menggunaka~iprogram MEGA 4.0
dengan
metode
Ki~ntrra-2-parameter.
Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan mas
Cyt b, sedangkan rekonstmksi pohon
filogeogmfi bet'dasarltan mas D-loop.
Rekonshuksi keduanya menggunakan metode
Neighboor Joining (NJ) dengan bootshap
lOOOX (Nei & Kumar 2000).
HASIL

Amplifikasi &an Visualisasi Fragmen DNA
Dari kedelapdn sampel yang digunakan,
sebanyak empat san~pel yang berhasil
diamplifikasi, yaitu sampel kerbau rawa asal
Sumatera Utara (SUI&l), NTB (NTB76), dan
Banten (B73 dan B74). Amplifikasi
menggunakan pasangan primer AF22 dan
AF23 menghasilkan pita tunggal bem6mn
sekitar 1145 pb (Gambar 1). Sampel asal
Sumatera Utara (SU182), NTB (NTB77) dan
Jawa Tengah (JT38 dan JT39) tidak berhasil
diamplifikasi sehingga sampel ini tidak
dilakukan perunutan nukleotida.
M

I

2

3

4

Gambar 1 I-Iasil mplifilrasi mas D-loop dalam
PAGE 6% dei~gmpewmaan sensitif

perak. Keterangan: blom M= penanda
100 pb, kolom 1= sampel asal
Sumatera Utara (SUIXI), kolom 2=
sampel asal Banten (B73), kolom 3=
samltel asal Banten (874) dan kolom
4= sampel asal NTB (NTB77).

Perunutan Produk PCR
Perunutan DNA dilakukan dari arah
primer AF 22. Panjang DNA hasil perunutan
setelah diedit bervariasi yakni 572 nt untuk
sampel SUl 81, 563 nt untuk sampel NTB76,
525 nt untuk sampel B73 dan 527 nt unhlk
sampel B74.

Analisis Filogeni
Proses pensejajaran menghasilkan runutan
sepanjang 516-518 nt dengan rata-rata
komposisi nukleotida A=35.6%; T=23.9%;
G=13.5%; dan C=27%. Presentase A+T
(59.5%) lebih besar daripada C+G (40.5%).
Berdasarkan hasil pensejajaran dengan data
dari GeneBnnk (Lampiran 1) dapat diketahui
bahwa hasil perunutatl keempat san~pel
tersebut n~eliputienlpat domain, yaitu bagian
akhir Cyt b (203 nt), tRNA Tlx (70 nt), tRNA
Pro (65 nt) dan bagian awal D-loop (178-180
111) (Tabel 1). Panjang gel1 Cyt b dan tRNA
stabil antar satnpel sedangkan paiijang D-loop
beragam karena terdapat insersi pada basa ke159 sa~npelasal NTB (NTB76) atau delesi
pada basa ke-67 sampel Sumatera Utara
(SU18 1) (lainpiran 2).
Ruas yang digunakan untuk analisis filogeui
B. bllbnlis adalah gen Cyt b. Hasil
peusejajaran dengan data dari GnleBank
menunjukkan 172 nt yang identik dan 31 nt

yang berbeda. Basa yang berbeda disebabkan
ole11 substitusi basa, baik transisi maupun
transversi (Tabel 2). Contoh transisi pada luas
Cyt b menyebabkan pe~ubahanasatn amino
Met menjadi Val pada basa ke-174 dan Ile
menjadi Val pada basa ke-177, sedangkan
transisi pada basa ke-44 tidak merubah asam
amino dimungkinkan karena terjadi pada basa
ketiga dari kodon.
Topologi pohon filogeni hasil NJ dua
basa pertama pada tiap kodon menunjukkan
Hasil rekonstritksi berdasarkan dua basa
pertama
dari
tiap
kodon
Cyt
b
tnetigelolnpokkan Subfamili Capriliae dan
Subfamili bovinae dalam salu percabangan
melnbentuk kelounpok Fanlili Bovidae. Fa~nili
Cervidae berada di luar percabangan
liienlbentuk sister grorrp dengan Falnili
Bovidae (Ganlbar 2A). Lain halnya dengan
hasil rekonstruksi herdasarkan tiga basa dal-i
tiap kodon yang ~uembcntukpolitotiii antara
Subfatuili Bovinae, Subfamili Caprinae dan
Fan~iliCervidae (Gamnbar 28).
Secara filogeografi, sample kerbau rawa
Sulilatera Utara te~pisahdetigan ketiga sampel
kerbau rawa lainnya dan n~engelonlpok
dengan kerbau dari India, Jern~an,Irlandia,
Itali dan Mesir ((ianlbar 3). Sa~npelkerbau
rawa asal Banten dan NTB ~nengelompok
dengan sampel kerbau dari Cina.

Tabel 1 Panjang mas hasil pensejajaran (nt)
Satnpel keibvu

Cyt-b

tRNA Thr

IRNA Pro

D-loop

Pnnjang scluruh nl:s

Surnateta Utv~a(SUISl)

203

70

65

178

516

NTB (NTB76)

203

70

65

I SO

518

Bnnte~l(873)

203

70

65

179

517

Bullle11 (874)

203

70

65

179

517

Tabel 2 Hasil pensejajaran nukleotida DNA yang berbeda

Sampel kerbau

Sumaten Utan (SU18 1)
NTB (NTB76)
Ballten (B73)
Banten (B74)

Cyt-b
I I
4 7 7
4 4 7
CGG
TAA
TAA
TAA

1
11
364

D-loop
1 1 1 I II
1 2 4 456
8 3 6 991

I1
66
48

ctfb

T : ~ GG C G TC
T;C,~A c~$,:A A T A .r T
T'GA C,CA A T A TT
CiktA A , ~ AC T

TMA

Keterangan: Nomor posisi nukleotida dibaca secara vertikal di tiga baris pe~tama.Bagia11
bemama biru menunjukkan adanya transversi.

Kerbau rawa India

K. NTB (NTB76)
Kerbau rawa India

Domba Gantt
Karnbing Kacang

0.02

0.00

0.00

0.05

Gambar 2 Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan dua basa pertama (A) dan ketiga basa (B)
pada tiap kodon dari gen Cyt b menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000X.
Nomor menunjukkan nilai bootstrap. (
sub famili Bovinae; 0: sub famili Caprinae;
@
' : famili Cewidae). Garis merah merupakan benhlkan politomi.

A:

\
Jerman

Mesir

Kerbau rawa

Sumatera Utara (SUISI)
Banten (B73)
Banten (B74)

/J

0.1

Filipina

I

Kerbau sungai

Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeografi berdasarkan ruas D-loop intDNA menggunakan
metode NJ dengan bootstrap 1000X.

Tabel 3

Nilai jarak genetik (bawah diagonal) dan kesamaan genetik (atas diagonal) antar B.
bubalis dari beberapa lokasi berdasarkan metode Ki1nu1-u-2-para1neier
I

I

2
3
4
5
6

7
8
9
10
11
12

0.093
0.098
0.918
0.832
0.059
0.006
0.011
0,000
0.091
0.091
0.091

2
0.907
0.006
0.988
0.889
0.081
0.087
0.093
0.093
0.000
0.000
0.000

3
0.902
0.994
0.937
0.849
0.092
0.091
0.097
0.098
0.006
0.006
0.006

4
0.082
0.012
0.063
0.112
1.084
0.918
0.937
0.918
0.960
0.960
0.960

5
0.168
0.111
0.151
0.888
0.920
0.832
0.849
0.832
0.868
0.868
0.868

6
0.941
0.919
0.908
-0.084
0.080
0.053
0.059
0.059
0.086
0.086
0.086

7
0.994
0.976
0.909
0.082
0.168
0.947
0.006
0.006
0.085
0.085
0.085

8
0.989
0.907
0.903
0.063
0.151
0.941
0.994
0.011
0.091
0.091
0.091

9
1.000
0.975
0.902
0.082
0.168
0.941
0.994
0.989
0.091
0.091
0.091

10
0.909
1.000
0.994
0.040
0.132
0.814
0.915
0.909
0.909
0.0011
0.000

I1
0.909
1.000
0.994
0.040
0.132
0.814
0.915
0.909
0.909
1.000

12
0.909
1.000
0.994
0.040
0.132
0.814
0.915
0.909
0.909
1.000
1.000

0,000

Keterangan : (1) Cina, (2) Irlandia, (3) Mesir, (4) Filipina, (5) Itidia, (6) Sumatera Utara, (7)
Banten (73), (8) Banten (74), (9) NTB, (10) India, (1 1) Italia, (12) Jemian.
G=13.5%; dan C=27%. Presentase A t T
(59.5%) lebili besar daripada C+G (40.5%).
Berdasarkan hasil pensejajaran deilgan data
dari GeneBunk (Lampiran 1) dapnt diketahui
bahwa hasil pemnutan keempat sanipel
tersebut nieliputi empat domain, yaitu bagian
akhir Cyt b (203 nt), tRNA Thr (70 tit), tRNA
Pro (65 nt) dan bagian awal D-loop (178-180
nt) (Tabel 1). Panjang gen Cyt b dan tRNA
stabil antar sampel sedangkan paiijang D-loop
beragani karena terdapat insersi pada basa ke159 satlipel asal NTB (NTB76) atau delesi
pada basa ke-67 sa~npel Sumatera Utara
(SU181) (lainpiran 2).
Ruas yang digunakan untuk analisis filogeni
B. b~tbalis adalah gen Cyt b. Hasil
pensejajaran dengan data dari GeneBunk
nienunjukkan 172 nt yang identik dan 31 nt
yang berbeda. Basa yang berbeda disebabkan
oleh substitusi basa, baik tra~isisi niaupun
transversi (Tabel 2). Contoh transisi pada mas
Cyt b inenyebabkan pe~ubalianasam ainino
Met menjadi Val pada basa ke-174 dan Ile
menjadi Val pada basa ke-177, sedangkan
transisi pada basa ke-44 tidak inerubah asam
amino dimungkinkan karena terjadi pada basa
ketiga dari kodon.
Topologi pohon filogeni hasil NJ dua
basa pertama pada tiap kodon menunjukkan
Hasil rekonstruksi berdasarkan dua basa
pertama
dari
tiap
kodon
Cyt
b
mengelompokkan Subfamili Caprinae dan
Subfamili bovinae dalam satu percabangan
membentuk kelompok Famili Bovidae. Fa~nili
Cervidae berada di luar percabaigan
membentuk sister group dengan Famili
Bovidae (Gambar 2A). Lain halnya dengan
hasil rekonstruksi berdasarkan tiga basa dari

tiap kodon yang ~nenibentukpolitoiiii autara
SubCamili Bovinae, Subfamili Caprinae dan
Faulili Cervidae (Gamb;~r2B).
Secara filogeografi, sampel kerbau rawa
Surnatera Utara terpisah dengan ketiga sampel
kerbau rawa Iainnya dan rnengelompok
dengan kerbau dari India, Jcrman, Irlandia,
Itali dan Mesir (Gambar 3). Sanipel kerbau
rawa asal Ballten dan NTB ~nengelompok
dengan sa~npelkerbau dari Cina.
PEMBAIIASAN
An~plifikasidan Visualisnsi Fragmen DNA
Sampel kerbau rawa asal Sumatera Utara,
NTB, dan Ballten berhasil dianiplifikasi
menggunakati pasangan primer AF22 dan
AF23. Pita tunggal yang dihasilkan sesuai
dengall hasil a~nplifikasi desaiu primer
bemkuran sekitar 1145 pb (Gambar I).
Keetnpat sanipel lai~mya tidal< berhasil
dianiplifikasi (38, 39, 77 dan 182)
kemunglcinan karcna subu penempelan primer
(59'~) yang tidak sesuai sekalipun sampel
yang digu~iakan merupakan spesies yang
sama.
Perunutan Produk P C R
Produk amplifikasi sebesar 1145 pb
setelah dirunutkan menghasilkan panjang
DNA yang berbeda dan be~variasi(525-572
nt). Dalani proscs perunutan, basa bagian awal
dan akhir produk amplifikasi umumnya tidak
tidak keseluruhan
terbaca oleh mesin sehi~~gga
basa dari produk an~plifikasiterunutkan. Salah
satu cara mengatasi masalah tersebut adalah
mengkloningkan mas DNA yang akan

dimnutkan seperti pada karakterisasi genom
mitokondria Platypus (Gemmell et a1 1994).
Analisis Filogeni
Rnas mtDNA harus perunutan mayoritas
tersusun atas basa A+T. Banyaknya basa A t T
pada D-loop erat kaitannya dengan karakter
D-loop yang memiliki banyak situs awal
replikasi untuk utas berat (Heavy slrand)
mtDNA dan promotor bagi utas berat tnaupun
utas ringan (Light strand) sebagai titik awal
transkripsi (Hoelzel AR et (11. 1994).
Panjang mas Cyt b stabil pada keempat
sample dan memiliki tingkat variabilitas yang
rendah. Hal ini terlihat dari sedikitnya situs
yang mengala~nisubtitusi (Tabel 2).
Transversi lianya dite~nukan pada luas
D-loop dengan rasio transisi terhadap
trausversi (tsltv) sebesar 4.5. Hal ini
menunjukkan baliwa subtitusi tranversi jarang
terjadi dibandingkan subtitusi twlsisi. Hasil
ini sejalan dengan yang dikemukakan oleh
Hixson & Brown (1986) bahwa pada 1ntDN.4
transisi lebih sering terjadi dibandingkan
transversi.
Hasil rekonstruksi pohon filogeni
herdasarkan urutan nukleotida Cyt b
dilaknkan dengan membandinglcan dua basa
pertanla dan ketiga basa pada tiap kodon.
Rekonstmksi pollon filogeni menggunakan
dua basa pertama pada tiap kodon lebih tepat
menjelaskan kedudnkan Famili Cervidae yang
merupakan sistei. group dari Famili Bovidae
(Gambar 2A) sesuai dengan klasifikasi
Williamson & Payne (1993) dan Kuznetsova
el a[. (2004). Rekonstruksi pohon filogeni
menggunakan ketiga basa pada tiap kodon
menghasilkan politotni antara Subfamili
Bovinae, Subfa~nili Capriiiae dan Famili
Cervidae
(Gambar
20).
Politotiii
mengindikasikan
adanya
liubungan
filogenetik yang tidak pasti (politon~ilunak).
Perbedaan hasil analisis antara dua basa
pertama dan ketiga basa dari tiap kodon
dimungkinkan karena posisi basa ketiga pada
tiap kodon Cyt b yang tidak stabil. Basa
ketiga pada tiap kodon tidak stabil karena
sering mengalami transisi (Tanaka et a/. 1994;
Matthee & Davis 2001). Kejadian transisi
pada basa ketiga dari tiap kodon tidak
berpengamh terhadap penyandian asam amino
Transisi pada basa ketiga dari tiap kodon
Cyt b (Tabel 2) merupakan mutasi bisn yang
tidak berpengaruh terhadap penyandian asam
amino. Basa pada Cyt b yang dibandingkan
merupakan sebagian dari mas Cyt b yang
seharusnya berukuran 2 1100 nt sehingga
asumsi bahwa transisi pada basa ketiga

melupakan jenis mutasi bisu belum kuat
dibuktikan.
Kerbau rawa asal Sumatera Utara lebih
berkerabat dekat dengan kerbau dari Irlandia,
Jerman, Itali, Mesir dan India dengan rata-rata
jarak genetik sebesar 0.0865 atau tingkat
kesamaan gennya sebesar 91.35%. Kerbau
rawa asal NTB dan Banten memiliki
kedekatan dengan kerbau dari Cina dengan
tingkat kesamaan gen sebesar 100% dan
91.5% (Tabel 3). Kerbau rawa asal Sumatera
Utara mernang merup;lkan haplotipe yang
berbeda dari kerbau rawa asal Baiiten dan
NTB, namun ketiganya tetap mengelotnpok
dala~n Subfamili Bovinae dengan nilai
bootstrap sebesar 99%. Hal ini ~nemunculkan
dugaan bahwa kerbau rawa asal Sumatera
Utara berasal dari nenek ~noyangyalig salna
dengan sampel asal Batilen daii NTB.
Pola persebaran kerbau yang luas diduga
tnengiknti jalur niigr;isi inanusia karena
kerbau merupakan lieu,an ~uminansia besar
yang mernbutuhki~nmedia untuk migrasinya.
Pola migrasi ~iianusiayang dijadikan acuali
yakni pada masa menetap dan bercocok tanam
yang
mempakan
penanda
beralihnya
kebudayaan berburu dan mengumpulkan
makanan dari zaman batu lama (Paleolitikum)
ke zaman batu baru li\ieolitikum). Daerah
pertanian awal yang meliputi tiga area, yakni
Asia barat daya, Cina dan Mesoamerica
(Bellwood 2001) diduga tnerupakan awal
tempat domestikasi hewnn, tern~asukkerbau.
Cockrill (1981) berasumsi bahwa tempat
domestikasi kerbau berawal di pusat
peradaban India yakni daerah Yangtze,
Eupluates and Tigris sekitar 5000 tahun lalu.
Berbeda dengan asumsi Chen & Li (1989)
yang menyebutkan baliwa Cilia merupakan
tempat awal donlestikasi kerbau sejak 6000
tal~nn yang lalu. Kedua lcontadibsi iiii
menguatkan dugaan ICu~uar et nl (2007)
bahwa kedua tipe kerbau merupakan hasil
dotnestikasi dari nenek nloyang yang sama
dan domestikasi kednanya dilaknkan secara
terpisah.
Dugaan Chen & Li (1989) yang
menyebutkan bahwa Cina sebagai tempat
awal mula domestikasi kerbau dirasa lebih
tepat. Masyaraltat pertanian di Cina
berekspansi arah Asia Tenggara (tertnasuk
Indonesia) dan Asia Selatan ([ndia) (Bellwood
2001). Ekspansi ke negara-negara Asia
Selatan terpecah menjadi dua arah, yaitu ke
arah
Borneo
(Kalimantan)
lalu
ke
semenanjung Malaya dan Ke arah Indonesia
Timur (Gray & Jordan 2000) (Lampiran 3).
Oleh karena itn, sampel kerbau rawa asal

Sumatera Utara berbeda dengan sampel
kerbau rawa asal Banten dan NTB. Meskipun
berbeda dalam ha1 proses domestikasi lebih
lanjut, kerbau rawa asal Sumatera Utara,
Banten, dan NTB tetap berasal dari nenek
moyang yang sama di Cina. Jawa (Banten)
dan Indonesia Timur (NTB).
Penyebaran hewan domestikasi memiliki
kecendemngan menghimdari hariel. geografi.
Kerbau dari Cina tidak menyebar ke arah
utara Asia karena adanya Gurun Gobi dan
tidak adanya ekspat~sidari J a m ke Sumatera
karena di Sumatera terdapat pegunu~lga~l
Bukit Barisan.
Kerbau berkenlbang di daerah dengan
agroekosiste~nyang bemariasi seperti padang
penggemhalaa~ldengan iklim kering di NTB,
NTT di daerah persawahan irigasi ~naupull
non irigasi (Banten); di daerah pegunungan
(Sumatera Utara) dan dataran rendah yang
berawa-rawa seperti di daerah Kalimantan
Selatan. Hal ini menunjukka~~bahwa daya
adaptasi kerbau pada berbagai koi~disi
agroekosistem sangat besar. Sebagai akibat
pengamh lingkungan telah terjadi semacam
evolusi sehingga timbul semacam sub gmp
pada kerbau di Indonesia, seperti (1)
timbulnya kerbau-kerbau yang berbadan besar
dan yang berbadan kecil, (2) perbedaan
terhadap daya tahan terhadap panas, dan (3)
kegenlaran hidup di dalam air (Fahimuddin
1975).

Hubuugan filogeni berdasarkan gen Cyt b
rnenempatkan Bubalus bubalis sebagai
anggota Subfamili Bovinae, Fa~niliBovidae.
Analisis filogeni n~enggut~akand ~ ~basa
a
pertama pada tiap kodot~Cyt b lehi11 stabil
dibandingkan ketiga basa pada tiap kodon Cyt
b. Kerbau rawa asal Sunlatera Utara
lnempakan haplotipe yang berbeda dari
kerbau rawa asal Banten dan NTB dalam
proses domestikasi lebih lanjut, namun tetap
berasal dari satu nenek moyang kerbau yang
sama yakni dari Cina. Pola persebaran kerbau
mengikuti pola ekspansi pertanian manusia.
SARAN
Ruas Cyt b dan D-loop yang digunakan
dalam menganalisis filogeni hendaknya
bemkuran lebih panjang mendekati ukuran
keselumhan. Basa ketiga dari tiap kodon
sebaiknya tidak diikutsertakan dalam analisis
filogeni.

DAFTAR I'USTAKA
Bellwood P. 2001. Early agriculturalist
population
diasporas?
farming,
- .
languages, and genes. Annu. Rev.
~n&i-oiol30:181-207.
Chen YS, Li XH. 1989. New evidence of the
oiigin and doinestication of the Chinese
swalno buffalo (Bubal~rs bubalis).
Buffalo / 1: 51-5.
Coccone A, Anlato G, Gratry OC, Bel~lerJ,
Powell JR. 1999. A nlolecular
phylogeny
of
four
endangered
madagascar tortoises based on mtDNA
sequences. Mol P/ij,/ Ei,oI 12:1-9.
Cockrill WR. 1981 The water buffalo: a
review. British Vet J 137: 8-16.
Fahimuddin M. 1975. Dor71estic Water
B t ~ ~ ~New
l o .Delhi: Oxrord & IBH.
Gray RD, Jordan EM. 2000. Languages trees
support the express train sequence of
Austronesia~~expansion. Nnf~rre 405:
1052-1055.
Gemmell NJ el ul. 1994. Cloning and
characterization
of
the
Platypus
mitochondrial genome. J Mol Evol 39:
200-205.
I-Iilmi M. 1991. Karyotypes of water buffalo
crosses (swamp x river). Di dalam:
Tulloh NH, editor. Buffr,lo and Goal in
Asir~: Genetic Dii~ersity arid its
Applicalion.
Proceedings
of
The
Atrstruliar~ Centre for Internationul
Agriccrltural Resem.ch; Kuala Lumpur,
10-14 Feb 1991. Canberra: Goa~ma.
1991. h l n ~53-56.
Hivsoi~JE, Brown WM. 1986. A comparison
of the snlall ribosomal RNA genes fion~
the mitochondrial DNA of the great apes
and humans: sequences, structure,
evolution, and phytogenetic imnplications.
MolBiolE1~ol3:I-15.
Hoelzel AR, Lopez JV, Dover GA, Brien JO.
1994. Rapid evolution of a heteroplasmic
repetitive sequences in the mitochondrial
DNA control region of carnivores. J Mol
Eva1 39: 191-199.
Kumar S, Nagarajan M, Sandhu JS, Ku~narN.
Behl V, Nishanth G. 2007. Mitochon
DNA analyses of Indian water bu
support a distinct genetic origin of river
and swamp buffalo. Anirn Gene1 38: 227232.
Kuznetsova MV, Khoiodova MV, Danilkin
AA. 2004. Molecular phylogeny of deer
(Cervidae: Artioclactyla). Russian J
Genetics 41:742-749.

I

Lau CH, Drinkwater RD, Yusoff K, Tan SG,
Hetzel DJS, Barker JSF. 1998. Genetic
diversity of Asian water buffalo (Bubalus
bubalis): mitochondrial DNA D-loop and
cytochrome b sequence variation. ilnin~
Genet 29(4): 253-264.
Matthee CA, Davis SK. 2001. Molecular
insights into the evolution of the family
Bovidae: a nuclear DNA perspective. Mol

BiolEvol18(7):1220-1230.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecldur Evolzltiorl
artd Phylogenetics. New York: Oxford
Univ Pr.
Parnla P, Era-Pujada M, Feligini M, Greppi
G, Enne G. 2004. Water buffalo (Bubalrrs
bubalis):
complete
nucleotide
mitochondrial genonie sequence. DNA
sequence 15: 369-373.
Tanaka T, Matsui M, Takenaka 0. 1994.
Estimation of phylogenetic relationships
among japanese brown frogs from
mitochondrial cytoclvon~e b gene
(Anlphibia: Anura). Zoo1 Sci 1l(5): 753757.
Taswinangsih W. 2009. Analisis keragaman
genetic kerbau lokal (BL~~NILIS
b~ibalis)
berdasarkan haplotipe DNA mitokondria

[skripsi]. Bogor: Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor.
Tegelstrom H. 1986. Mitochondria1 DNA in
natural populations: an improved routine
for the screening of genetic variation
based on sensilive silver staining.
Electrophoresis 7:226-229.
Williamson G, Payne WJA. 1993. Polgantar
Peter~mlratz cli Daeruh Tropis. Ed ke-3.
Darmadja SD, penerjernah; Djagra IB,
editor. Te~jemahandari: An Introdlrction
to Aninla1 N ~ ~ s b a i ~in~ the
i r y Tropics.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Spesies pembanding dalam analisis filogeni yang diperoleh dari GerzeBank
No
1
2

Nama spesies
Bttbalus bubalis
B~tbalusbtrbalis

Nama lokal
kerbau rawa
kerbau sungai (Carabao)

Lokasi
Cina
Filipina

No. Akses
AY702618
FJ873683

3
4

Bzrbalus bubalis
Bubaltrs bubalis

kerbau rawa
kerbau rawa

Ittdia
India-2

AF547270
FM179473

5
6

Bubaltts bubalis
Bubalus bubalis

Kerbau rawa
kerbau rawa

Itali
Irlandia

AY488491
DQ995713

7

Bubalcrs bubalis

Kerbau rawa

Jernian

AF197199

8

Bubalus bztbalis

kerbau rawa

Mesir

EU268909

Yak
Bison
Sapi angus
Sapi indicus
Dotnba barbary
Dotnba gamt
Kanibing kacang
Kij ang
Rusa kutub
Rusa sambar
Rusa sika
Unta

Cina
USA
USA
Jennan
Itali
Jerman
Itali
Cina

17
18
19
20

Bos grunniens
Bisorz bison
Bos faurus
Bos inn'ictrs
Anznlofragus lwvia
Ovis aries
Capra hircits
Mzrntincrts crinifr.ons
Rangifer furandus
Cervus mic color swinhoei
Cervus rzipporr fniovanrs
Car~tel~ts
Dacfrian~rs
fiirlts

Jepang
Taiwan
Taiwan
Cina

A8245426
EF035448
EF058308
EF212038

Lampiran 2

Hasil penjajaran DNA mas Cyt b dan D-loop genom mitokondria kerbau rawa
(Bubalus bubalis). Keterangan: nolnor posisi nukleotida dibaca secara vertil~aldi
tiga baris pertama

Ruas Cyt b
1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
Sumut-(SU181) GAAGTATGAT GTTCCGGCCA TTCAGCCAAT GCCTATTCTG AATCCTAGTA
Banten- (8731 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T.... . .
Banten-(B74) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T......
NTB- (NTB76) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T......

5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
Sumut_(SU181) TAGTGCTART ACCAACGGCC AGCGTAGTCG APJATPATCT C T T W T G A
Banten-(B73) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Banten-(B74) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
NTB- (NTB76)

123
Sumut-(SU181) AGA
Banten-(B73) . . .
Banten-(B74) . . .
NTB-(NTB76)
...

456
Smut-(SU181) CAA
Banten-(B73) ...
Banten (B74) ...
NTB- ( N T B ~ ~ )...

tRNA Thr

-

Banten-(B73)
Banten-(B74)
NTB- (NTB76)

..................................................
..................................................
..................................................

tRNA Pro

7890123456 78901
Sumut (SU181) TTTAAATACT CCCTG

!ll-:--ll?
:ij;5(:76??
l'fi. .V.'hrNl C?:C

.. -.
L,4;b'di!
Sunur - ( S U l i1
Banten-(B73)
Banten_(B74)
NTB-(NTB76)

r:r,C:.C'!Al

..T . . . . . . . . . . . .G..

:::!.:.>>:.
; 1:.:.%.;.14::.2
,!2ii2>,.'..2
1:.?35616;1
12j.l:~5-8,C 1 : : 4 : ( 7 5 i .
.' !:;!.4?3TC&AA
.>CNU%GC;LU. A'.;!.!;Zl-T'l

............................

..T . . . . . . . . . . . . G.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .T..... . . . . . . .G.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
~

~

~

~

~

1 2 ? L ! , C ' b S l 123.1-1C1190 1 2 3 < 5 6 - 8 3 0 I T ? : i i r - F ' L
Ecx-r - 1';161. 'I '!'C.ACTIL:JA (: I"I'CCTi-: