UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN FOTOPROTEKTIF FRAKSI ETILASETAT EKSTRAK ETANOLIK KULIT BUAH NAGA MERAH (Hylocereus polyrhizus)

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN FOTOPROTEKTIF FRAKSI ETILASETAT EKSTRAK ETANOLIK KULIT BUAH NAGA MERAH

(Hylocereus polyrhizus)

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun oleh

NURHASNA SUSHMITA SARI 20120350015

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

ETILASETAT EKSTRAK ETANOLIK KULIT BUAH NAGA MERAH (Hylocereus polyrhizus)

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun oleh

NURHASNA SUSHMITA SARI 20120350015

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

Nama : Nurhasna Sushmita Sari

NIM : 20120350015

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau yang dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantum dalam Daftar Pustaka dibagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.

Apabila dikemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Yogyakarta, 23 Juni 2016 Yang membuat pernyataan

Nurhasna Sushmita Sari NIM: 20120350015

(jawablah), bahwasanya Aku adalah dekat. Aku mengabulkan permohonan orang yang berdoa apabila ia memohon kepadaKu, maka hendaklah mereka itu

memenuhi (segala perintah)Ku dan hendaklah mereka beriman kepadaKu, agar mereka selalu berada dalam kebenaran” (Al Baqarah ayat 186)

“Jadilah alasan kebahagiaan orang lain, sedangkan alasan kebahagiaan diri sendiri biarlah Allah yang melakukannya” (Mario Teguh)

“Watch your thoughts, they become words. Watch your words, they become actions. Watch your actions, they become habits. Watch your habits, they become character. Watch your character, it becomes your destiny” (Lao Tzu)

“Bila kamu tak tahan lelahnya belajar, bersiaplah menanggung perihnya kebodohan” (Imam Syafi’i)

“Hiduplah seperti huruf aksara jawa, huruf itu akan tetap hidup dan bisa dibaca walau di ‘wulu’, di ‘suku’, di ‘taling’, di ‘pepet’, di ‘layar’, di ‘cecak’, tapi akan mati dan menjadi huruf konsonan ketika di ‘pangkon’” (Emha Ainun Najib)

kupanjatkan serta memberikan berbagai nikmat yang tak terhitung jumlahnya.

Karya Tulis Ilmiah ini kupersembahkan kepada:

Kedua orang tuaku yang sangat aku hormati dan sayangi, bapak dan ibu yang selalu menyelipkan namaku di setiap doanya, menyayangi dan mencintaiku tak

kenal lelah, menjadi motivasiku dalam mencapai citaku

Untuk adikku Nur Allisia Rahmasari yang selalu memberiku semangat, dukungan, doa dan telah menjadi adik terbaik yang aku miliki.

Untuk keluarga besarku yang selalu mendoakanku.

Untuk sahabat kecilku, Nur, Anggun, Tita, Nita, Putri, teman- teman almamater SD Muhammadiyah Wirobrajan 3 Yogyakarta, SMP Negeri 7 Yogyakarta, dan

SMA Negeri 4 Yogyakarta

Untuk Ratih, Seftina, Hida, Jihan, Indah, Anggi, Nopril, dan Neng terimakasih telah memberi warna baru dalam hidupku.

Serta untuk guru- guruku yang telah memberikan ilmu, mendidik dan membuatku hingga menjadi seperti ini.

Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh

Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah dengan judul “Uji Aktivitas Antioksidan dan Fotoprotektif Fraksi Etilasetat Ekstrak Etanolik Kulit Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus)” sebagai tugas akhir untuk memenuhi persyaratan dalam memperoleh gelar sarjana Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Karya Tulis Ilmiah ini dapat selesai karena dukungan dan bimbingan dari berbagai pihak diantaranya kepada:

1. Ibu Sabtanti Harimurti, M.Sc., Ph.D., Apt. selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

2. Bapak Hari Widada, M., Sc., Apt., selaku dosen pembimbing. Terimakasih atas bimbingan, ilmu, dan kepercayaan yang diberikan kepada penulis selama penulis melakukan penelitian dan menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

3. Bapak Andy Eko Wibowo., M.Sc., Apt., selaku dosen penguji 1. Terimakasih atas saran yang diberikan kepada penulis sehingga Karya Tulis Ilmiah ini dapat menjadi lebih baik lagi.

4. Ibu Sri Tasminatun, M. Si., Apt., selaku dosen penguji 2 dan Dosen Pembimbing Akademik penulis. Terimakasih atas segala nasihat, saran, dan semangat yang diberikan kepada penulis selama menempuh pendidikan di prodi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

5. Mas Satria, Mbak Linggar, Mbak Zelmi yang telah membantu penelitian di Laboratorium di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

6. Mbak Linda Karlina (farmasi angkatan 2011) dan Aditya Dwi Pamungkas (farmasi angkatan 2012) yang telah menjadi rekan seperjuangan dalam menyelesaikan penelitian di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

7. Kepala LP3M UMY yang telah memberikan dana penelitian melalui program Hibah Penelitian Kemitraan.

8. Teman-teman farmasi angkatan 2012 yang telah menjadi saudara baru bagi penulis. Semoga persaudaraan ini dapat terus berjalan meskipun telah lulus dari Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

9. Teman-teman KKN 05 tahun 2015 yang telah memberikan semangat dan dukungan.

10. Semua pihak yang terkait dalam penelitian ini. Terimakasih atas dukungan yang diberikan baik yang bersifat material maupun non material, alunan doa, dukungan serta bimbingan selama penulisan Karya Tulis Ilmiah.

Penulis menyadari bahwa Karya Tulis Ilmiah ini masih banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang InsyaAllah akan membuat Karya Tulis Ilmiah ini menjadi lebih baik lagi dan bermanfaat bagi penulis maupun pembaca.

Wassalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Yogyakarta, 23 Juni 2016 Penulis

HALAMAN PENGESAHAN... ii

PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN...iii

MOTTO... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN... v

KATA PENGANTAR... vi

DAFTAR ISI... viii

DAFTAR TABEL...x

DAFTAR GAMBAR...xi

DAFTAR LAMPIRAN... xii

INTISARI... xii

ABSTRACT...xiv

BAB I Pendahuluan... 1

A. Latar Belakang...1

B. Perumusan Masalah... 3

C. Keaslian Penelitian...4

D. Tujuan Penelitian... 5

E. Manfaat Penelitian... 5

BAB II Tinjauan Pustaka...6

A. Radikal bebas...6

B. Efek radikal bebas...7

C. Radiasi Ultraviolet Dan Fotoprotektif...8

D. Antioksidan...10

E. Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus)...13

F. Metode Ekstraksi... 16

I. Spektrofotometri UV-Vis...19

J. Kerangka Konsep...20

G. Hipotesis... 22

BAB III Metode Penelitian... A. Desain Penelitian... B. Tempat Dan Waktu Penelitian... C. Sampel Penelitian...23

D. Identifikasi Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...24

1. Variabel Penelitian... 24

2. Definisi Operasional...24

E. Instrumen Penelitian... 26

F. Cara Kerja... 27

G. Skema langkah kerja...32

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 33

A. Penyiapan sampel...33

B. Analisis Kualitatif Flavonoid dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).... 35

C. Penetapan Kuantitatif Kandungan Flavonoid Total...36

D. Analisis Kuantitatif Kandungan Fenolik Total...38

E. Uji Antioksidan Metode DPPH... 40

F. Panjang Gelombang Maksimal dan SPF secara in vitro...42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 44

A. Kesimpulan... 44

B. Saran... 44

DAFTAR PUSTAKA... 45

Tabel 2. ROS dan antioksidan yang berperan ...11

Tabel 3. Tingkat aktivitas antioksidan dengan metode DPPH...13

Tabel 4. Pelarut dan parameternya ...16

Tabel 5. Panjang gelombang dan nilai EE (λ) x I (λ) ...31

Tabel 6. Warna tiap bercak sampel uji pada Plat KLT... 36

Tabel 7. Uji Flavonoid total standar kuersetin...37

Tabel 8. Kandungan total flavonoid Fraksi KBNM-AcOEt...37

Tabel 9. Uji Fenolik Standar Asam Galat...38

Tabel 10. Perhitungan Konsentrasi fenol sampel fraksi KBNM- AcOEt...39

Tabel 11. Uji penangkapan radikal bebas DPPH...40

Tabel 12. Scanning panjang gelombang maksimal fraksi KBNM-AcOEt...42

Tabel 13. Uji Flavonoid total standar kuersetin...56

Tabel 14. Uji Flavonoid total Fraksi KBNM-AcOEt... 56

Tabel 15. Standar asam galat... 58

Tabel 16. Uji penangkapan radikal bebas DPPH kuersetin replikasi 1... 60

Tabel 17. Uji penangkapan radikal bebas DPPH kuersetin replikasi 2... 60

Tabel 18. Uji penangkapan radikal bebas DPPH kuersetin replikasi 3... 60

Tabel 19. Uji penangkapan radikal bebas DPPH fraksi KBNM-AcOEt...61

Gambar 2. Struktur kuersetin ...10

Gambar 3. Resonansi radikal bebas fenol ...11

Gambar 4. Tanaman buah naga merah ...13

Gambar 5. Kerangka konsep...20

Gambar 6. Skema langkah kerja... 32

Gambar 7. Hasil uji kualitatif menggunakan plat KLT... 35

Gambar 8. Kurva standar kuersetin pada uji total flavonoid... 56

Gambar 9. Kurva standar asam galat... 58

Gambar 10. Grafik uji aktivitas antioksidan kuersetin... 61

Gambar 11. Grafik uji aktivitas antioksidan fraksi KBNM- AcOEt...68

Gambar 12. Perajangan kulit buah naga merah... 68

Gambar 13. Proses maserasi... 68

Gambar 14. Proses Evaporasi... 68

Gambar 15. Proses fraksinasi...68

Gambar 16. Penangkapan Radikal Bebas DPPH...68

Hasil Determinasi Tanaman...53

Perhitungan nilai rendemen... 54

Perhitungan Rf... 55

Analisis Total Flavonoid sampel uji... 56

Analisis kandungan fenolik total... 58

Uji aktivitas antioksidan sampel uji...60

Uji SPF...63

(Hyloeereus polyrhizus) Disusun o[eh

NURHASNASUSHMUTASAIU

20 [20350015

Te lah disetujui dan disemi narkan pada tanggal23 Jun i 2016 Dosen Pembimbing,

Hari Wi da, M., Sc., Apt. N UC 1977072 1 201004 1731 20

Dosen Penguji 2

Sri Tasmin atun, M. Si .. Apt NlK. 19880602 20 1504173237 Nil<. 197 1 1[ 06 19990417 303 6

Mengetahui.

Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan IImu Kesehatan

ｕ ｮｩ ｶ･ｲｳｩｴ ｡ ｾ＠ Muhammadiyah Yogyakarta

Ｍ［Ｌｵｾ

s··

'l ＺＧｾＮＢＧＢ It _ｾＧ＠ ,

ｾ｜ｾｾ＠

',

..

ＺＺｾ＠ Ｚｾ＠

Sabtlinti Han 1 M .Sc. Ph.D. A t.

NlK.:

1973 2320131 0 173 127

ABSTRACT

Free radicals can be caused by exposure of UV rays. Free radicals in the body can be a trigger of many diseases. Photoprotective agent can protected the skin from exposure of UV rays. In addition, antioxidant compound can also reduced a negative impact of free radicals. Red dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) was one of the fruits which contain a flavonoid compound. This compound can acted as photoprotective and antioxidant agents. This study aims to know the content of flavonoid in the peel of red dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) and knowing the antioxidants and photoprotective activities.

The peel of red dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) extracted within ethanol then macerate fractionated with ethylacetate. The content of phenolic and flavonoid compounds of ethylacetate fraction of the red dragon fruit (KBNM-AcOEt) tested with TLC method, Folin-Ciocalteu method, and chelation AlCl3 method. Furthermore, the free radical (DPPH) scavenging test was be done to found out the antioxidant activities of KBNM-AcOEt and in vitro test with spectrophotometry method was conducted to found out the SPF value of KBNM-AcOEt.

The Total Phenolic Content of KBNM-AcOEt was 1493,4641 ± 14,9757 mg GAE/100g and the Total Flavonoid Content of KBNM-AcOEt was 16,5278 ± 0,3612 % b/b EQ. Antioxidant activities of KBNM-AcOEt was weak (> 150 g/mL). It was seen from the IC50 value of KBNM-AcOEt (491.9421 g/mL). Meanwhile, the SPF value of KBNM-AcOEt was very low (0.0069 ± 0.0071). The KBNM-AcOEt at a concentration of 5, 25, 50 and 100 mg / L does not have photoprotective activities.

INTISARI

Radikal bebas dapat disebabkan oleh paparan radiasi sinar UV. Kadar radikal bebas yang tinggi di dalam tubuh dapat menyebabkan berbagai macam penyakit. Suatu agen fotoprotektif dapat melindungi kulit dari paparan sinar UV. Selain itu, senyawa antioksidan juga dapat mengurangi efek negatif radikal bebas. Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) merupakan salah satu buah yang mengandung senyawa flavonoid yang dapat bertindak sebagai agen fotoprotektif dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan flavonoid dalam kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) serta mengetahui daya antioksidan dan daya fotoprotektifnya.

Kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) diekstraksi dengan etanol dan difraksinasi cair-cair menggunakan etilasetat. Kandungan senyawa fenolik dan flavonoid fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah

(KBNM-AcOEt) diuji dengan metode KLT, metode Folin-Ciocalteu, dan metode khelasi AlCl3. Selanjutnya, uji penangkapan radikal bebas DPPH dilakukan untuk

mengetahui daya antioksidan fraksi KBNM-AcOEt dan uji secara in vitro dengan metode spektrofotometri dilakukan untuk mengetahui nilai SPF fraksi

KBNM-AcOEt.

Kandungan fenolik total fraksi KBNM-AcOEt adalah 1493,4641 ± 14,9757 mg GAE/100g dan kandungan total flavonoid fraksi KBNM-AcOEt

adalah 16,5278 ± 0,3612 % b/b EQ. Daya antioksidan fraksi KBNM-AcOEt

diketahui bersifat lemah (>150 μg/mL). Hal ini dilihat dari nilai IC50 fraksi

KBNM-AcOEt yaitu 491,9421 g/mL. Sementara itu, nilai SPF yang dihasilkan oleh fraksi KBNM-AcOEt sangat rendah yaitu sebesar 0,0069 ± 0,0071. Hal ini menunjukkan fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 5, 25, 50 dan 100 mg/L tidak memiliki daya fotoprotektif.

BAB I Pendahuluan

A. Latar Belakang

Matahari merupakan sumber energi terbesar bagi bumi. Berbagai manfaat dapat diperoleh dari sinar matahari. Salah satunya adalah untuk meningkatkan suplai vitamin D bagi manusia melalui paparan radiasi UVB (Ultraviolet B) (Mead, 2008). Manfaat tersebut didapatkan ketika radikal bebas yang terbentuk dari paparan radiasi UV berada pada konsentrasi normal. Kadar radikal bebas yang tidak normal atau tinggi di dalam tubuh akan menghasilkan stres oksidatif yang dapat menyebabkan berbagai macam penyakit seperti kanker kulit, arthritis, penuaan, gangguan autoimun, jantung dan penyakit neurodegeneratif (Pham-Huy et al., 2008).

World Health Organization (WHO) memperkirakan akan terjadi peningkatan kejadian kanker kulit non-melanoma sebesar 300.000 dan melanoma sebanyak 4.500 akibat penipisan lapisan ozon (WHO, 2015). Tabir surya atau suatu agen fotoprotektif dapat melindungi kulit dari paparan sinar UV dengan menyerap, memantulkan, serta menyebar (scatter) sinar matahari (Mishra et al., 2011). Tubuh kita membutuhkan suatu senyawa yang dapat membantu menangkal radikal bebas atau sering disebut dengan antioksidan (Pietta, 1999). Senyawa antioksidan yang umum digunakan adalah vitamin E atau α-tokoferol, BHA, dan BHT (Fessenden, 1986). Senyawa antioksidan juga dapat ditemukan dalam buah-buahan. Salah satu jenis buah atau makanan

yang dapat digunakan sebagai antioksidan dan fotoprotektif adalah buah naga merah (Hylocereus polyrhizus). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa kandungan antioksidan kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) lebih tinggi dibanding daging buahnya (Nurliyana et al., 2010). Penggunaan kulit buah naga merah yang memiliki berat 22% dari berat buah ternyata belum dimanfaatkan secara optimal (Jamilah, 2011). Pemanfaatan tumbuhan telah dijelaskan dalam Al-Quran surat Asy- Syu’ara ayat 7 yang berbunyi:

Artinya: “Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, berapakah banyaknya Kami tumbuhkan di bumi itu berbagai macam tumbuh-tumbuhan yang baik?”

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui daya antioksidan dari kulit buah naga merah. Pranata (2013) mengambil senyawa dalam kulit buah naga merah (Hylocereus lemairei Britton dan Rose) yang bersifat semipolar dalam bentuk fraksi kloroform ekstrak kloroform dengan hasil nilai IC50 sebesar 3349,936 g/mL, sedangkan Budilaksono et al. (2014)

mengambil senyawa non polar dari ekstrak yang bersifat semipolar dalam bentuk fraksi n-heksana ekstrak kloroform yang menghasilkan nilai IC50

sebesar 206,591 g/mL. Kuersetin adalah salah satu kelas flavonoid (flavonol) yang bersifat semipolar yang mempunyai aktivitas antioksidan lebih tinggi dibanding vitamin C dengan perbandingan 4,7:1 (Sugrani et al., 2009). Kuersetin pada konsentrasi 10% juga diketahui memiliki nilai SPF yang sama dengan homosalat (agen tabir surya sintetik) (Choquenet et al.,

2008). Oleh karena itu, penelitian ini ingin mengambil senyawa yang bersifat semipolar dari ekstrak yang bersifat polar dalam bentuk fraksi etilasetat ekstrak etanol sehingga senyawa flavonoid seperti kuersetin dapat diambil dan dapat diketahui daya antioksidan dan fotoprotektif untuk mencegah paparan sinar ultraviolet yang berlebihan.

B. Perumusan Masalah

1. Apakah terdapat kandungan flavonoid dan fenolik dalam fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) yang diuji dengan uji KLT, metode khelasi AlCl3, serta metode Folin-Ciocalteu?

2. Bagaimana daya antioksidan fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dilihat dari nilai IC50 yang diuji

menggunakan metode DPPH?

3. Bagaimana daya fotoprotektif fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dilihat dari nilai SPF yang diuji menggunakan metode spektrofotometri?

C. Keaslian Penelitian

No Judul Penelitian

(Penulis, tahun) Hasil Persamaan Perbedaan

1

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform Kulit

Buah Naga Merah (Hylocereus lemairei

Britton dan Rose) Menggunakan Metode

DPPH (1,1-Difenil-2- Pikrilhidrazil) (Pranata, 2013)

Nilai IC50 pada fraksi

kloroform kulit buah naga merah

(Hylocereus lemairei Britton dan Rose) adalah 3349,936

g/mL.

Sampel yang digunakan adalah kulit buah naga merah, namun beda spesies (penelitian ini menggunakan

Hylocereus polyrhizus)

1. Sampel yang digunakan oleh Pranata adalah fraksi kloroform ekstrak kloroform (semipolar dari ekstrak semipolar), sedangkan penelitian ini menggunakan fraksi etilasetat ekstrak etanolik (semipolar dari ekstrak polar) 2. Kontrol positif yang digunakan Pranata

adalah vitamin C, sedangkan kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah kuersetin.

2

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi n-Heksana Kulit

Buah Naga Merah (Hylocereus lemairei

Britton dan Rose) Menggunakan Metode

DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil) (Budilaksono et al., 2014)

Nilai IC50 pada fraksi

n-heksana kulit buah naga merah (Hylocereus lemairei Britton dan Rose) adalah 206,591

g/mL.

Sampel yang digunakan adalah kulit buah naga merah, namun beda spesies (penelitian ini menggunakan

Hylocereus polyrhizus)

1. Sampel yang digunakan oleh

Budilaksono et al. adalah fraksi n-heksan ekstrak kloroform (non polar dari ekstrak semipolar), sedangkan penelitian ini menggunakan fraksi etilasetat ekstrak etanolik (semipolar dari ekstrak polar) 2. Kontrol positif yang digunakan

Budilaksono et al. adalah vitamin C, sedangkan kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah kuersetin.

D. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui adanya senyawa flavonoid dan fenolik dalam fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) yang diuji dengan uji KLT, metode khelasi AlCl3, serta metode Folin-Ciocalteu.

2. Mengetahui daya antioksidan fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dengan nilai IC50 yang diuji

menggunakan metode DPPH.

3. Mengetahui daya fotoprotektif fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dengan nilai SPF yang diuji menggunakan metode spektrofotometri.

E. Manfaat Penelitian

Apabila terbukti pada fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) memiliki daya antioksidan dan daya fotoprotektif, maka dapat digunakan sebagai landasan ilmiah untuk pengembangan sediaan tabir surya dengan bahan alam sebagai kandungan aktifnya.

A. Radikal bebas

Radikal bebas merupakan suatu atom atau gugus atom yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, bersifat sangat reaktif dan mempunyai energi yang tinggi. Simbol dari suatu radikal bebas adalah sebuah titik yang menggambarkan elektron yang tidak berpasangan (Fessenden, 1986).

OH• O2 • NO •

Hidroksil Superoksid Nitrit oksid

NO2• ROO• LOO•

Nitrogen dioksid Peroxyl Lipid peroxyl

Mekanisme reaksi radikal bebas dapat dibagi menjadi 3, yaitu:

1. Inisiasi

Tahap inisiasi adalah pembentukan awal dari radikal-radikal bebas (Fessenden, 1986).

Cahaya UV atau kalor

Cl – Cl 2 Cl • --- persamaan 1

2. Propagasi

Pembentukan radikal bebas akan mengakibatkan terbentuknya radikal baru dengan suatu reaksi yang disebut reaksi rantai (Fessenden, 1986).

Cl • + CH4 CH3• + HCl --- persamaan 2

Cl2 + CH3• CH3Cl + Cl • --- persamaan 3 Gambar 1. Contoh radikal bebas (Pham-Huy et al., 2008)

Secara teoritis, proses ini akan berlangsung terus menerus karena sebuah Cl • akan mengalami reaksi yang menyebabkan terbentuknya sebuah Cl • yang lain (Fessenden, 1986).

3. Terminasi

Reaksi rantai yang terjadi akan berhenti pada tahap terminasi yaitu ketika radikal bebas bergabung dengan radikal bebas yang lain sehingga tidak membentuk radikal bebas yang baru (Fessenden, 1986).

Cl • + • CH3 CH3Cl --- persamaan 4

Sumber radikal bebas dapat dibagi menjadi 3, yaitu (Kumar, 2011):

1. Sumber internal: berasal dari reaksi enzimatik yang menghasilkan suatu radikal bebas seperti pada reaksi pernafasan, fagositosis, sintesis prostaglandin, serta dalam sistem sitokrom P450.

2. Sumber eksternal: asap rokok, polutan lingkungan, radiasi, sinar UV, ozon, obat-obatan, anestesi, pestisida, dan pelarut industri.

3. Faktor fisiologis: status mental seperti stres, emosi dan kondisi penyakit yang dapat memicu terbentuknya radikal bebas.

B. Efek radikal bebas

Radikal bebas mempunyai peran positif bagi tubuh manusia (Droge, 2002). Namun, ketika kadarnya di dalam tubuh melebihi batas normal maka radikal bebas menjadi suatu senyawa yang berbahaya bagi manusia. Akumulasi radikal bebas yang terjadi akan menyebabkan terjadinya stres oksidatif sehingga memicu berbagai macam penyakit kronis dan degeneratif.

Penyakit yang dapat ditimbulkan dari adanya stres oksidatif diantaranya adalah kanker, gangguan autoimun, penuaan dini, katarak, rheumatoid arthritis, jantung dan penyakit neurodegeneratif (Pham-Huy et al., 2008). Mekanisme terjadinya kanker sebagian besar disebabkan oleh adanya mutasi pada gen p53 atau gen yang berperan dalam proses apoptosis (Thomas, 2009). Oleh karena itu, keseimbangan antara dua efek antagonis dari radikal bebas menjadi aspek penting bagi kehidupan manusia (Pham-Huy et al., 2008).

C. Radiasi Ultraviolet Dan Fotoprotektif

Radiasi ultraviolet (UV) merupakan bagian dari spektrum

elektromagnetik yang berada diantara area sinar-X dan sinar tampak atau antara 40 dan 400 nm (30-3 eV) (Webber, 1997). Berdasarkan spektrum elektromagnetik, wilayah ultraviolet dibagi menjadi 3 yaitu ultraviolet A (UVA: 320-400 nm), ultraviolet B (UVB: 290 -320 nm) dan ultraviolet C (UVC: 200-290 nm) (Dutra, 2004). Radiasi UVA yang mencapai permukaan bumi yaitu sebesar 95-98%, radiasi UVB sebanyak 2-5%, sedangkan UVC diabsorbsi oleh lapisan ozon pada bagian stratosfer (McKinlay, 1987).

Radiasi ultraviolet dapat masuk ke dalam kulit melalui kromofor atau suatu molekul tertentu yang dapat menangkap gelombang elektromagnetik pada panjang gelombang tertentu (Lucas, 2015). Ketika kulit dirangsang oleh radiasi ultraviolet, kulit akan melakukan beberapa mekanisme sebagai perlindungan diri. Pertama, epidermis akan membengkak akibat adanya radiasi UVB. Hal ini akan meningkatkan perlindungan pada kulit sebesar 3-4 kali. Kedua, sintesis melanin akan meningkat akibat radiasi UVB dan UVA,

sehingga akan memberikan perlindungan terhadap kulit 2-3 kali (Mishra et al., 2011). UVB dapat menyebabkan kejadian sunburn 1000 kali lebih banyak dibanding dengan UVA dan UVA 1000 kali lebih efektif dalam membuat efek

tanning akibat dari melanin pada lapisan epidermis yang membuat kulit lebih gelap dibandingkan UVB (Brenner & Hearing, 2008; Saewan et al., 2013).

Tabir surya dapat digunakan sebagai agen fotoprotektif karena dapat melindungi kulit dari paparan UV dengan menyerap, memantulkan, serta menyebar (scatter) sinar matahari (Mishra et al., 2011). Tingkat efektif suatu tabir surya didasarkan pada pengukuran nilai SPF (Sun Protection Factor). Semakin tinggi nilai SPF suatu tabir surya, maka kemampuan dalam melindungi kulit dari terjadinya sunburn juga semakin besar (Kaur & Saraf, 2010) (Tabel 1). SPF (Sun Protection Factor) adalah nilai yang diperoleh dengan membandingkan waktu yang dibutuhkan untuk terjadinya sunburn

pada kulit yang dilindungi tabir surya dengan kulit yang tidak dilindungi tabir surya(Mishra et al., 2011).

Tabel 1. Tingkat kemampuan tabir surya (Wasitaadmatdja, 1997; Damogalad, 2013) Nilai SPF Keterangan

2-4 Minimal

4-6 Sedang

6-8 Ekstra

8-15 Maksimal

>15 Ultra

Senyawa kimia yang terkandung di dalam tabir surya umumnya adalah senyawa aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil. Struktur ini dapat menyerap energi yang tinggi dari matahari kemudian melepas energi tersebut menjadi lebih rendah (Rai et al., 2007). Senyawa yang biasa

digunakan sebagai tabir surya antara lain ozybenzon, sulisobenzon, dan oktil metoksi cinnamat (Saewan & Jimtaisong, 2013). Namun, bagi sebagian orang yang memiliki sensitifitas terhadap senyawa kimia tersebut tidak dapat memakai tabir surya yang mengandung bahan-bahan yang terkait. Para peneliti meyakini kosmetik yang menggunakan bahan herbal adalah pilihan yang tepat bagi kulit yang hipersensitif (Mishra et al., 2011).

Flavonoid adalah salah satu senyawa alami yang berpotensi sebagai agen fotoprotektif karena memiliki kemampuan dalam menyerap sinar UV serta dapat menjadi senyawa antioksidan (Saewan et al., 2013). Suatu agen fotoprotektif dari flavonol yaitu kuersetin (Gambar 2) dan rutin (kuersetin-3-O-rutinosida) sebesar 10% menunjukkan nilai SPF yang sama dengan homosalat (agen tabir surya sintetik) (Choquenet et al., 2008).

Gambar 2. Struktur kuersetin (Sing, 2007) D. Antioksidan

Inhibitor radikal bebas adalah suatu senyawa yang dapat bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas yang tidak reaktif dan bersifat relatif stabil. Suatu inhibitor yang berperan dalam menghambat auto-oksidasi atau oksidasi oleh udara disebut dengan antioksidan. Senyawa antioksidan tersebut dapat melawan radikal bebas karena memiliki gugus-gugus fenol atau gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Disamping itu, radikal

bebas yang terbentuk pada tahap propagasi dari senyawa antioksidan akan terstabilkan secara resonansi sehingga menjadi radikal bebas yang tidak reaktif (Gambar 3) (Fessenden, 1986).

Gambar 3. Resonansi radikal bebas fenol (Fessenden, 1986)

Dibawah ini adalah senyawa antioksidan beserta radikal bebas yang dapat distabilkan (Tabel 2):

Tabel 2. ROS dan antioksidan yang berperan (Pervical, 1996)

ROS Antioksidan

Radikal hidroksil (OH•) vitamin C, glutation, flavonoid, asam lipoat Radikal superoksida (O2• ) vitamin C, glutation, flavonoid, SOD

Hidrogen peroksida (H2O2) vitamin C, glutation, beta karoten, vitamin

E, CoQ10, flavonoid, asam lipoat

Lipid peroksida (LOOH) beta karoten, vitamin E, flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa dengan kerangka karbon C6-C3-C6 (Grotewold, 2006). Flavonoid yang paling besar ada 4, yaitu antosianin (pigmen merah sampai ungu), flavonol (kurang berwarna hingga pigmen kuning pucat), flavanol (pigmen yang kurang berwarna yang menjadi coklat setelah oksidasi), dan proantosianidin (Pas) (Petrussa et al, 2013). Flavonoid dibagi menjadi tiga kelas, antara lain:

1. Flavonoid (2-phenylbenzopyrans)

Flavonoid (2-phenylbenzopyrans) dibagi menjadi flavan, flavanon, flavon, flavonol, dihidroflavonol, flavon-3-ol, 4-ol, dan flavan-3,4-diol (Grotewold, 2006).

2. Isoflavonoid (3-benzopyrans)

Kelompok isoflavonoid (3-benzopyrans) terdiri dari isoflavan, isoflavon, isoflavanon, isoflav-3-en, isoflavanol, rotenoid, coumestan, 3-arilcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dan pterocarpan (Grotewold, 2006).

3. Neoflavonoid (4-benzopyrans)

Neoflavonoid terdiri dari 4-arilcoumarin, 3,4-dihidro-arilcoumarin, dan neoflaven (Grotewold, 2006).

Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) adalah metode yang paling umum digunakan untuk menentukan kapasitas antioksidan dalam makanan ataupun minuman karena bersifat cepat, sederhana, akurat, dan juga murah (Marinova & Batchvaron, 2011). Dasar dari uji DPPH adalah pada perubahan warna radikal DPPH akibat reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan oleh senyawa yang terkandung dalam bahan uji yang membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997). Tingkat aktivitas antioksidan suatu sampel dapat dilihat dari nilai IC50 (konsentrasi yang

ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan) (Ciptaningsih, 2012). Semakin kecil nilai IC50, maka semakin aktif sampel tersebut sebagai

Tabel 3. Tingkat aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Ariyanto, 2006)

IC50 Keterangan

<50 g/mL Sangat kuat

50 -100 g/mL Kuat

100- 150 g/mL Sedang

>150 g/mL Lemah

E. Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus) 1. Taksonomi

Klasifikasi

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivisio : Spermatophyta

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Subkelas : Hamamelidae

Ordo : Caryophyllales

Famili : Cactaceae

Genus : Hylocereus

Spesies : Hylocereus polyrhizus

(Kristanto, 2008)

2. Karakterisasi tanaman

Buah naga atau dalam Bahasa Inggris dikenal dengan nama “pitaya”

atau “pitahaya” merupakan buah yang berasal dari Meksiko, Amerika Tengah, dan Amerika Selatan (Puspita, 2011). Secara morfologis, tanaman ini termasuk tanaman yang tidak lengkap karena tidak memiliki daun.

Gambar 4. Tanaman buah naga merah (Hylocereus polyrhizus)

Akar buah naga tidak terlalu panjang dan berupa akar serabut yang sangat tahan pada kondisi tanah yang kering dan tidak tahan genangan yang cukup lama. Bunga buah berukuran besar dan mekar penuh pada malam hari dan menyebarkan bau yang harum (Dembitsky et al., 2011).

Buah naga memiliki bentuk bulat agak lonjong yang terletak di ujung cabang atau batang dengan ketebalan kulit buah sekitar 2-3 cm dengan sisik seperti naga dikulit buahnya. Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) memiliki kulit berwarna merah dan daging yang berwarna merah keunguan dengan kadar kemanisan 13-15% briks (Puspita, 2011). Biji buah naga berbentuk bulat berukuran kecil dengan warna hitam dan setiap buah terdapat sekitar 1200-2300 biji (Kristianto, 2008). Biasanya, buah naga akan banyak ditemukan pada bulan April-Mei dan September-November (Dembitsky et al., 2011).

3. Kandungan buah naga merah (Hylocereus polyrhizus)

Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) mengandung berbagai senyawa bioaktif seperti asam stearat, asam oleat, campesterol, stigmasterol, asam asetat, betanin, isobetanin, fenolik, dan flavonoid (Foong et al., 2012). Asam stearat, asam oleat, serta fitosterol dapat

digunakan untuk mengurangi konsentrasi LDL-kolesterol dan

menghambat penyerapan kolesterol (Fong et al., 2012; Isabelle et al., 2009). Kandungan tujuh betacyanin pada buah naga merah (betanin, isobetanin, betanidin, isobetanidin, phyllocactin, isophyllocactin, dan

bougainvillein-R-I) dapat menjadi pewarna alami, antioksidan, dan untuk menurunkan kolesterol (Foong et al., 2012).

Senyawa fenolik seperti flavonoid juga bersifat sebagai antioksidan sehingga berpotensi untuk mengurangi risiko penyakit seperti penyakit jantung koroner dan kanker. Selain bersifat sebagai antioksidan, flavonoid juga bersifat sebagai penghambat enzim dan mempunyai efek terhadap bakteri (Fong et al., 2012). Kulit buah naga merah juga mengandung beberapa senyawa seperti triterpenoid, betasianin, alkaloid, steroid, dan flavonoid (flavon dan flavonol) (Pranata, 2013; Budilaksono et al., 2014).

Menurut Wee Sim Choo dan Wee Khing Yong (2011), daging dan kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) memiliki nilai EC50

sebesar 11,34 ± 0,22 mg/mL atau memiliki daya antioksidan lebih besar daripada daging dan kulit buah naga putih (Hylocereus undatus) dengan nilai EC50 sebesar 14,61 ± 0,82 mg/mL. Namun, daging dan kulit buah

naga putih memiliki total fenolik lebih besar (20,14 ± 1,15 mg GAE/100g) daripada daging dan kulit buah naga merah (15,92 ± 1,28 mg GAE/100g).

Nurliyana et al. (2010) juga menyatakan bahwa daya antioksidan (nilai IC50) tertinggi terdapat di kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus), diikuti kulit buah naga putih (Hylocereus undatus), daging buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dan daging buah naga putih (Hylocereus undatus). Total fenolik tertinggi terdapat di kulit buah naga putih (Hylocereus undatus), diikuti kulit buah naga merah (Hylocereus

polyrhizus), daging buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dan daging buah naga putih (Hylocereus undatus).

F. Metode Ekstraksi

Ekstraksi adalah istilah yang digunakan dalam bidang farmasi yang menggambarkan akan adanya proses pemisahan bagian aktif tanaman atau jaringan hewan dari komponen yang tidak aktif atau inert menggunakan pelarut yang dipilih secara selektif dengan mengikuti standar prosedur ekstraksi (CSI-UNIDO, 2008). Selama ekstraksi, pelarut akan berdifusi ke dalam bahan tanaman dan melarutkan senyawa yang memiliki kepolaran yang sama (Pandey, 2014). Senyawa flavonoid yang kurang polar misalnya isoflavon, flavanone, flavon yang termetilasi, dan flavonol dapat diekstraksi dengan pelarut seperti diklorometana, kloroform, dietil eter atau etil asetat, sementara glikosida flavonoid dan aglikon yang lebih polar diekstraksi dengan pelarut polar seperti alkohol atau campuran alkohol-air (Andersen et al, 2006).

Tabel 4. Pelarut dan parameternya (Barwick, 1997)

Pelarut Indeks polaritas Berat jenis (g/mL)

Heksan 0,1 0,65

Kloroform 4,1 1,48

Etilasetat 4,4 0,90

Metanol 5,1 0,79

Etanol 5,2 0,79

Air 9,0 1,00

Semakin besar nilai indeks polaritas suatu pelarut maka semakin polar pelarut tersebut (Sadek, 2002). Oleh karena itu, urutan pelarut diatas apabila diurutkan dari yang non polar ke polar adalah heksan, kloroform, etilasetat, metanol, etanol dan air. Etilasetat dan kloroform merupakan pelarut yang bersifar semi polar (Wikanta, 2012; Mangindaan, 2013).

Metode dalam ekstraksi tanaman diantaranya adalah maserasi, infus, perkolasi, digesti, soxhlet, sonikasi, dan destilasi (Pandey, 2014). Ada beberapa parameter yang digunakan untuk memilih metode ekstraksi dengan tepat. Pertama, bagian simplisia yang dapat mengganggu dihilangkan terlebih dahulu. Simplisia yang akan digunakan adalah bagian dari tanaman yang benar dan untuk mengendalikan kualitas simplisia maka usia tanaman, waktu, musim, dan tempat pengambilan sebaiknya dicatat. Selanjutnya, proses pengeringan dilakukan tergantung pada sifat kimia dari simplisia (CSI-UNIDO, 2008).

Serbuk simplisia yang didapatkan diayak dengan ayakan yang sesuai untuk mendapatkan ukuran yang seragam, biasanya menggunakan mesh ukuran 30-40. Jika senyawa yang akan diukur bersifat non polar maka pelarut yang digunakan adalah yang bersifat non polar, begitu pula sebaliknya. Apabila senyawa yang akan diambil bersifat termolabil, metode ekstraksi seperti maserasi dingin, perkolasi, dan CCE (Counter-Current Extraction) lebih dianjurkan. Namun, apabila senyawa yang akan diambil bersifat termostabil maka dapat dilakukan dengan ekstraksi soxhlet (jika menggunakan pelarut bukan air) dan dekoksi (CSI-UNIDO, 2008).

Apabila mengambil senyawa seperti flavonoid dan fenil propanoid sebaiknya berhati-hati ketika menggunakan pelarut organik karena dapat mendegradasi senyawa tersebut. Ketika menggunakan metode ekstraksi panas, maka suhu yang tinggi harus dihindari karena beberapa glikosida dapat mengalami kerusakan. Standardisasi waktu ekstraksi merupakan hal yang

penting karena waktu ekstraksi yang terlalu lama akan menyebabkan senyawa yang tidak diinginkan juga dapat terekstraksi. Kualitas pelarut yang digunakan juga perlu diperhatikan. Proses pengeringan harus aman dan dapat menjaga stabilitas senyawa yang diambil. Parameter yang terakhir adalah parameter analisis ekstrak seperti TLC (Thin Layer Chromatography) dan HPLC harus didokumentasikan untuk memantau kualitas ekstrak dari batch yang berbeda (CSI-UNIDO, 2008).

Maserasi merupakan proses ekstraksi yang banyak digunakan karena bersifat sederhana (Mahdi, 2010). Proses maserasi secara umum adalah dengan menempatkan bahan tanaman dalam bentuk bubuk serbuk kedalam bejana tertutup dengan menambahkan pelarut selama tujuh hari dengan sesekali diaduk. Bejana dalam keadaan tertutup untuk mencegah penguapan pelarut selama periode ekstraksi. Pelarut akan berdifusi masuk melalui dinding sel untuk melarutkan konstituen dalam sel kemudian pelarut akan berdifusi keluar. Proses difusi tanpa pengadukan akan berjalan sangat lambat. Faktor yang mempengaruhi proses maserasi diantaranya kecepatan pelarut masuk kedalam serbuk bahan, tingkat kelarutan dari senyawa yang larut dengan pelarut, kecepatan pelarut keluar dari senyawa yang tidak larut (CSI-UNIDO, 2008).

Metode maserasi termasuk kedalam golongan ekstraksi padat-cair, sedangkan ekstraksi cair-cair dilakukan dengan cara fraksinasi. Fraksinasi merupakan proses pemisahan antara zat cair dengan zat cair berdasarkan tingkat kepolarannya. Senyawa yang memiliki sifat non polar akan larut dalam

pelarut non polar, yang semi polar akan larut dalam pelarut semi polar, dan yang bersifat polar akan larut kedalam pelarut polar (Harborne 1987). Fraksinasi dilakukan menggunakan corong pisah. Pada akhir proses fraksinasi, larutan dalam corong pisah akan menghasilkan dua lapisan. Pelarut yang mempunyai berat jenis lebih besar akan berada di lapisan bawah, sedangkan pelarut dengan berat jenis yang lebih kecil akan berada di lapisan atas (Suwendiyanti, 2014).

I. Spektrofotometri UV-Vis

Sinar ultraviolet (200-400 nm) dan sinar tampak (400-750 nm) merupakan salah satu radiasi elektromagnetik dan energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Jika suatu molekul dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi (panjang gelombang) yang sesuai sehingga energi molekul tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul (Gandjar dan Abdul Rohman, 2012).

Suatu zat dapat dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis apabila mempunyai zat tersebut memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Kromofor merupakan ikatan rangkap yang terkonjugasi atau gugus atau atom dalam senyawa organik yang mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak (misalnya, gugus alken, alkin, karbonil, karboksil, amido, azo, nitro, nitroso, dan nitrat). Auksokrom atau suatu gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas seperti OH, -O, -NH2, dan –OCH3 (Gandjar dan Abdul Rohman, 2012).

Lampu Wolfram merupakan sumber cahaya tampak pada spektrofometer UV-Vis, sedangkan lampu hidrogen atau deuterium sebagai sumber radiasi ultraviolet. Sumber cahaya tersebut dipancarkan melalui monokromator. Monokromator akan menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat tertentu. Cahaya atau energi radiasi dari monokromator diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet. Jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka (Triyati, 1985).

J. Kerangka Konsep

Fraksi Etilasetat Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Merah Masuk ke kulit akumulasi Penyakit

Antioksidan Fotoprotektif

gugus fenol atau gugus – OH yang terikat pada karbon cincin aromatik

senyawa aromatis yang terkonjugasi dengan

gugus karbonil

Kulit buah naga merah mengandung flavonoid (flavon dan flavonol) Radiasi Ultraviolet radikal bebas

Radiasi sinar UV merupakan salah satu sumber radikal bebas (Kumar, 2011). Radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh dan mengalami akumulasi akan memicu berbagai macam penyakit seperti kanker, gangguan autoimun, penuaan dini, katarak, rheumatoid arthritis, jantung dan penyakit neurodegeneratif (Pham-Huy et al., 2008). Flavonoid merupakan salah satu contoh senyawa yang dapat berperan sebagai antioksidan karena mempunyai gugus fenol yang bertugas untuk melawan radikal bebas (Kumar, 2011). Radikal bebas yang terbentuk pada tahap propagasi dari senyawa antioksidan akan terstabilkan secara resonansi sehingga menjadi radikal bebas yang tidak reaktif (Fessenden, 1986).

Selain sebagai antioksidan, flavonoid juga dapat digunakan sebagai agen fotoprotektif karena memiliki kemampuan dalam menyerap sinar UV (Saewan and Jimtaisong, 2013). Senyawa kimia dalam tabir surya sintetik umumnya adalah senyawa aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil. Struktur ini dapat menyerap energi yang tinggi dari matahari kemudian melepas energi tersebut menjadi lebih rendah (Rai et al., 2007).

Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) merupakan buah yang mengandung berbagai senyawa bioaktif, salah satunya adalah senyawa fenolik dan flavonoid (Foong et al., 2011). Daya antioksidan kulit buah naga merah dapat diketahui dengan melakukan analisis kadar fenolik total dan uji DPPH. Kadar fenol akan menentukan bagaimana daya antioksidan kulit buah naga merah. Daya fotoprotektif kulit buah naga merah diketahui dengan melakukan uji KLT, analisis kadar flavonoid total, dan uji SPF. Hasil dari uji

KLT dan analisis kadar flavonoid total menyatakan bagaimana kandungan flavonoid dalam kulit buah naga merah. Kandungan flavonoid akan menentukan bagaimana daya fotoprotektif kulit buah naga merah.

G. Hipotesis

Hipotesis pada penelitian ini adalah:

1. Fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) mengandung flavonoid yang diuji menggunakan uji KLT dan metode khelasi AlCl3 serta mengandung senyawa fenolik yang diuji

menggunakan metode Folin-Ciocalteu.

2. Fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) memiliki daya antioksidan yang kuat dilihat dari nilai IC50

yang diuji dengan metode DPPH.

3. _{Fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus}

polyrhizus) memiliki daya fotoprotektif dilihat dari nilai SPF yang diuji menggunakan metode spektrofotometri.

A. Desain Penelitian

Jenis penelitian ini adalah observasional laboratorik untuk mengetahui kandungan fenolik total, kandungan flavonoid total, nilai IC50 serta nilai SPF pada fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus

polyrhizus)sebagai agen antioksidan dan fotoprotektif.

B. Tempat Dan Waktu Penelitian 1. Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmasi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

2. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan dari bulan November 2014 sampai dengan Juni 2015. C. Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah naga merah

(Hylocereus polyrhizus). Buah naga merah yang digunakan berasal daerah

Banyuwangi (diambil pada bulan November 2014). Kulit buah naga merah diambil dari 20 kg buah naga merah. Kulit buah naga merah kemudian dikeringkan dan diekstraksi dengan etanol λ5% menjadi ekstrak etanolik kulit buah naga merah. Selanjutnya ekstrak kental difraksinasi untuk mendapatkan fraksi etilasetat.

a. Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus).

b. Variable tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar fenolik total, kadar flavonoid total, nilai IC50, serta panjang gelombang absorbsi maksimum dan nilai SPF.

2. Definisi Operasional

Definisi operasional pada penelitian ini adalahμ

a. Kadar fenolik total merupakan kadar senyawa fenolik dalam sampel yang dinyatakan sebagai ekuivalen asam galat atau Gallic Acid

Equivalent (GAE). Kadar fenolik total didapatkan dari perhitungan

menggunakan rumus TPC (Total Phenolic Content), dimana nilai C (kadar fenol total larutan) atau sumbu x didapatkan dengan memasukkan nilai absorbansi sampel ke dalam sumbu y pada persamaan regresi linier standar asam galat. Persamaan regresi ini didapatkan dari hubungan antara konsentrasi asam galat (10, 20, 30, 40, dan 50 µg/mL) dan absorbansi asam galat. Absorbansi didapatkan dari hasil pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan metode Folin-Ciocalteau. Metode ini merupakan reaksi oksidasi-reduksi antara reagen Folin (asam fosfomolibdat dan asam

(Wisesa dan Widjanarko, 2014).

b. Kadar flavonoid total merupakan kadar flavonoid dalam sampel yang dinyatakan sebagai ekuivalen kuersetin (EQ). Kadar flavonoid total didapatkan dari perhitungan menggunakan rumus Total Flavonoid, dimana kadar flavonoid dalam sampel (sumbu x) diketahui dengan memasukkan absorbansi sampel ke dalam sumbu y pada persamaan regresi linier kuersetin. Persamaan regresi linier kuersetin dibuat dari hubungan antara konsentrasi kuersetin (400, 800, 1200, 1600 dan 2000 g /mL) dengan absorbansi kuersetin. Absorbansi didapatkan dari hasil pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan metode kolorimetri mengunakan khelasi AlCl3.Metode ini merupakan reaksi AlCl3 yang akan membentuk kompleks dengan gugus keto pada atom C-4 dan juga dengan gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-4 yang bertetangga dari flavon dan flavonol (Desmiaty, 200λ).

c. IC50(Inhibitory Concentration) merupakan konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan atau efek menangkap radikal bebas (Ciptaningsih, 2012; Marxen et al., 2007). IC50 digunakan sebagai parameter yang menunjukkan aktivitas antioksidan yang didapatkan dengan menggunakan uji DPPH. Absorbansi DPPH biasanya diukur pada panjang gelombang 515-520 nm (Marxen et al, 2007). Prinsip uji DPPH adalah perubahan warna radikal DPPH akibat

membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning (Josephy, 1λλ7).

d. Panjang gelombang absorbsi maksimum dan nilai SPF ditentukan dengan metode spektrofotometri menggunakan daerah serapan UVB yaitu antara 2λ0 hingga 320 nm. Nilai SPF didapatkan dari perhitungan menggunakan rumus SPF yang telah dikembangkan oleh Mansuret al. (1λ86) (Dutra, 2004).

E. Instrumen Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan adalah sebagai berikutμ 1. Alat

Oven, bejana maserasi, bejana KLT, Blender (Philips®_{), cawan porselen,}

Rotary evaporator(IKA® _{RV10), waterbath (Memmert}®_{), plat selulosa (E}

merck®_{), pipa kapiler, kipas angin (Sekai}®_{), lampu UV 254 dan UV 366} nm, termometer, timbangan analitik (Mettler Toledo®_{), corong pisah} (Pyrex®_{), rak tabung reaksi, mikropipet (Socorex}®_{), pipet tetes, sendok} tanduk, tabung reaksi (Pyrex®_{), erlenmeyer (Pyrex}®_{), gelas ukur (Pyrex}®_), labu takar (Pyrex®_{), vortex, propipet, pipet volume (Pyrex}®_{), kuvet,} Spektrofotometer UV-Vis mini-1240 (Shimadzu®_).

2. Bahan

Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus), alkohol λ6% (pro analisis, E Merck), etanol λ5% (teknis, Bratac), etanol 70% (teknis, Bratac), etilasetat

(pro analisis, E Merck), aquades (teknis, Bratac), Folin-ciocalteu (E Merck), Na2CO3(E Merck), kuersetin standard (Sigma), AlCl3(E Merck), NaNO2(E Merck), NaOH (J.T. Baker), DPPH (E Merck).

F. Cara Kerja

1. Bahan tumbuhan

Kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dipisahkan dengan daging buahnya karena hanya kulit buahnya yang digunakan sebagai sampel. Setelah itu, kulit buah naga merah dipotong kecil-kecil (± 5mm) kemudian dikeringkan dengan bantuan sinar matahari dalam keadaan tertutup kain hitam. Namun, dikarenakan kulit buah naga yang tidak segera mengering maka dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 500_{C. Kulit buah naga merah yang sudah kering} dihaluskan dengan cara diblender sehingga didapatkan serbuk kering kulit buah naga merah.

2. Ekstraksi

Serbuk kering kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dimaserasi dengan etanol λ5% dengan perbandingan bahanμpelarut (1μ10) selama 7 hari (5 hari maserasi dan 2 hari remaserasi) pada suhu kamar dalam bejana kedap cahaya. Larutan ekstrak kemudian disaring dan dipekatkan mengunakan rotary evaporator pada suhu 500_{C dilanjutkan} dengan menggunakan waterbath pada suhu 500_-700_{C sehingga didapatkan}

3. Fraksinasi

KBNM-EtOH dilarutkan dalam campuran H2O-MeOH (3μ7). Selanjutnya, dilakukan fraksinasi cair-cair dengan etilasetat (AcOEt) sehingga diperoleh fraksi metanol ekstrak etanolik kulit buah naga merah (KBNM-MeOH) dan fraksi etilasetat ekstak etanolik kulit buah naga merah (KBNM-AcOEt). Fraksi KBNM-AcOEt dipekatkan menggunakan kompor listrik suhu 500_{C. Fraksi kental digunakan untuk melakukan} berbagai pengujian selanjutnya (Junioret al.,2013).

4. Analisis Kualitatif Flavonoid dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Mula-mula bejana kromatografi dijenuhi dengan uap fase gerak n-butanolμasam asetatμair (4μ1μ5 v/v, lapisan atas). Penjenuhan fase gerak dilakukan dengan cara memasukkan kertas saring ke dalam bejana kromatografi yang terisi fase gerak dalam keadaan tertutup rapat hingga fase gerak mencapai ujung atas kertas saring. Plat KLT selulosa dioven pada suhu 70°C selama 10 menit untuk menghilangkan kadar air. Selanjutnya, standar kuersetin dan fraksi KBNM-AcOEt ditotolkan pada plat KLT selulosa dengan menggunakan pipet kapiler pada jarak 1 cm dari bagian bawah. Bercak penotolan dibiarkan hingga kering kemudian dielusi dalam bejana kromatografi. Jarak elusi yang digunakan adalah 8 cm. Pengamatan plat KLT selulosa dilakukan dibawah sinar tampak, UV 254

5. Penetapan Kuantitatif Kandungan Flavonoid Total

Kadar flavonoid total ditetapkan dengan cara khelasi AlCl3. Sebanyak 0,4 mL fraksi KBNM-AcOEt ditambahkan dengan 0,6 mL aquadest dan 0,06 mL NaNO2 (5%). Larutan diinkubasi selama 6 menit pada suhu kamar lalu ditambahkan 0,06 mL AlCl3(10%), setelah 5 menit kemudian tambahkan NaOH 0,4 mL (1mM). Selanjutnya absorbansi diukur pada panjang gelombang 510 nm mengunakan spektrofotometer UV-Vis. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali (Sainiet al., 2011).

Kuersetin konsentrasi 400, 800, 1200, 1600 dan 2000 μg /mL diuji seperti prosedur diatas. Persamaan regresi linier kuersetin dibuat dari hubungan antara konsentrasi dengan nilai absorbansi kuersetin. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung kadar flavonoid dalam sampel. 6. Analisis Kuantitatif Kandungan Fenolik Total

Kandungan fenolik total diuji menggunakan reagen Folin-Ciocalteu, dimana sejumlah 400 L fraksi KBNM-AcOEt ditambahkan 3,16 mL aquadest dan 200 L reagen Folin-Ciocalteu, dicampur hingga homogen. Larutan digojog selama 6 menit. Selanjutnya, ditambahkan 600L larutan Na2CO3 2% untuk membentuk suasana basa dan dihomogenkan dengan cara divortex (Talapessiet al., 2013). Larutan didiamkan pada suhu kamar selama 2 jam. Absorbansi diamati pada panjang gelombang 760 nm

Asam galat konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 µg/mL diuji seperti prosedur diatas. Persamaan regresi linier asam galat dibuat dari hubungan antara konsentrasi dengan nilai absorbansi asam galat. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung kadar fenol total larutan.

7. Uji Penangkapan Radikal Bebas DPPH

Fraksi KBNM-AcOEt (kadar 100, 200, 300, 400 dan 500 µg/mL) masing-masing dicampur dengan 1 mL DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrasil) 0,4 mM dilarutkan dalam larutan etanol hingga 5 ml. Larutan didiamkan bereaksi pada temperatur ruangan dan gelap selama 30 menit. Absorbansi masing-masing larutan dibaca pada panjang gelombang 518 nm mengunakan spektrofotometer UV-Vis (Sumarny et al., 2014). Replikasi dilakukan 2 kali dengan masing-masing absorbansinya diukur sebanyak 2 kali.

Nilai absorbansi yang didapat adalah absorbansi sampel, sedangkan absorbansi kontrol adalah absorbansi yang didapatkan dari larutan yang berisi 1 mL DPPH dalam 5 mL etanol. % inhibisi dihitung menggunakan rumusμ

Persamaan regresi linier dibuat dari hubungan antara konsentrasi dan % inhibisi. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung nilai IC50.

8. Penetapan Panjang Gelombang Absorbsi Maksimum dan SPF

Untuk menetapkan panjang gelombang absorbsi maksimum ( maks), fraksi kental KBNM-AcOEt dilarutkan dalam etanol absolut sehingga didapatkan seri kadar 5, 25, 50 dan 100 mg/L. Selanjutnya, dilakukan scanning spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang antara 260-400 nm dengan interval 2 nm. Blanko yang digunakan adalah etanol (Junioret al.,2013).

Tabel 5.Panjang gelombang dan nilai EE ( ) x I ( ) (Junioret al., 2013) Panjang gelombang (nm) EE x I

2λ0 0.0150

2λ5 0.0817

300 0.2874

305 0.3278

310 0.1864

315 0.083λ

320 0.0180

Total 1.0000

Panjang gelombang maksimum yang didapatkan selanjutnya disesuaikan dengan nilai EE x I yang sudah ditentukan oleh Sayre et al. (1λ7λ) (Tabel 5). Nilai SPF dihitung menggunakan rumus yang telah dikembangkan oleh Mansuret al. (1λ86) yaitu (Dutra, 2004)μ

SPFSpektrofotometrik= CF x Σ2λ0-320EE ( ) x I ( ) x Abs ( ) Keteranganμ

EE ( ) μ Spektrum efek erythemal I ( ) μ Spektrum intensitas matahari Abs ( ) μ Absorbansi

H. Analisis data

Daya antioksidan dilihat dari nilai IC50 yang dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linier yang didapatkan dari hubungan antara konsentrasi sampel ( g/mL) dengan % inhibisi, sedangkan daya fotoprotektif dilihat dari nilai SPF ekstrak etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus

polyrhizus) fraksi etilasetat yang didapatkan dari perhitungan rumus SPF.

Gambar 6.Skema langkah kerja

Kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) kering Maserasi (etanol λ5%)

Fraksinasi (etilasetat)

Fraksi etilasetat ekstak etanolik kulit buah naga merah (KBNM-AcOEt)

Analisis kuantitatif kandungan fenolik

total

Penetapan absorbsi maksimum

dan SPF Uji

DPPH Analisis

kuantitatif kandungan

flavonoid total Analisis

kualitatif flavonoid dengan

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penyiapan sampel

Kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) dalam keadaan basah

yang didapatkan dari 20 kg buah naga merah utuh adalah sebanyak 7 kg. Kulit buah naga merah ini dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil (± 5mm) untuk mempercepat proses pengeringan (Sudewo, 2009). Proses pengeringan bertujuan untuk menghentikan proses enzimatik yang mungkin masih bisa terjadi, sehingga degradasi zat aktif dapat dikurangi. Pengeringan dilakukan dengan bantuan sinar matahari dalam keadaan tertutup kain hitam dikarenakan kain hitam dapat menyerap sinar ultraviolet sehingga UV protektor dari kulit buah naga merah tidak mengalami kerusakan akibat

paparan sinar matahari (Nuria et al., 2009).

Pengeringan dilanjutkan dengan bantuan oven pada suhu 50oC. Suhu

yang digunakan merupakan suhu yang tidak merusak senyawa flavonoid. Hal ini dikarenakan menurut Chet (2009), pemanasan yang dilakukan pada suhu

80oC dapat merusak senyawa flavonoid. Setelah proses pengeringan,

didapatkan kulit buah naga merah sebanyak 470 gram.

Kulit buah naga merah yang sudah kering diekstraksi dengan etanol

95%. Menurut Chaiwut et al. (2012), ekstraksi kulit buah naga menggunakan

pelarut etanol 95% akan menghasilkan kapasitas antioksidan tertinggi dengan metode DPPH (656,52 mgTEAC/g) dan kadar fenolik yang lebih besar (1,28

mgGAE/g sampel) dibanding menggunakan pelarut etanol 50% dan air. Perbandingan serbuk dengan pelarut yang digunakan adalah 1:10. Menurut

Handayani et al. (2016), perbandingan ini merupakan rasio terbaik untuk

mendapatkan kadar fenol, kadar flavonoid dan aktivitas antioksidan (IC50)

paling besar.

Ekstrak kental etanolik kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus)

(KBNM-EtOH) yang didapatkan adalah sebanyak 19,273 gram. Ekstrak kental KBNM-EtOH yang digunakan untuk fraksinasi cair-cair hanya sebanyak 5,046 gram. Fraksinasi cair-cair dilakukan untuk memisahkan senyawa yang bersifat polar dengan senyawa yang bersifat semi polar dalam ekstrak kental KBNM-EtOH. Senyawa yang bersifat polar (seperti betasianin

dan antosianin) akan tertarik ke dalam pelarut campuran H2O-MeOH,

sedangkan senyawa yang bersifat semipolar (senyawa flavonoid seperti

flavon dan flavonol) akan tertarik ke dalam pelarut etilasetat (AcOEt)

(Indriasari, 2012; Pranata, 2013; Budilaksono et al., 2014).

Ketika proses fraksinasi, fraksi campuran H2O-MeOH ekstrak etanolik

kulit buah naga merah (KBNM-MeOH) berada pada lapisan atas, sedangkan

fraksi etilasetat ekstrak etanolik kulit buah naga merah (KBNM-AcOEt)

berada pada lapisan bawah karena pelarut etilasetat memiliki massa jenis

yang lebih besar. Fraksi kental KBNM-AcOEt yang diperoleh adalah

sebanyak 2,886 gram. Oleh karena itu, dari hasil perhitungan didapatkan nilai

rendemen fraksi kental KBNM-AcOEt terhadap kulit buah naga kering

B. Analisis Kualitatif Flavonoid dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam dan fase gerak (Gandjar dan Abdul Rohman, 2012). Fase gerak yang digunakan adalah n-butanol:asam asetat:air (4:1:5) dan fase diam yang digunakan adalah selulosa. Pembanding yang digunakan pada uji KLT ini adalah kuersetin (salah satu golongan flavonoid). Campuran n-butanol:asam asetat:air yang diambil untuk fase gerak adalah pada lapisan atas karena pada lapisan ini mengandung air dan asam asetat yang terdispersi dalam n-butanol. Selulosa dipilih sebagai fase diam dikarenakan fase diam yang lain seperti silika dapat menyebabkan terbentuknya kompleks antara senyawa

flavonoid yang banyak mengandung gugus –OH dengan logam CaSO4 pada

silika. Fase gerak yang bersifat polar dan fase diam yang bersiat non polar mengakibatkan senyawa flavonoid (kuersetin) akan lebih tertarik pada fase gerak (Christinawati, 2007). Berikut adalah hasil uji KLT yang diamati dibawah sinar tampak, UV 254 nm, UV 366 nm sebelum dan setelah disemprot pereaksi sitroborat:

Gambar 7. Hasil uji KLT(A) Fraksi KBNM-AcOEt (B) Kuersetin Sinar tampak UV 254 nm UV 366 nm

sebelum disemprot

UV 366 nm setelah disemprot

Kandungan flavonoid (kuersetin) pada fraksi KBNM-AcOEt dapat

diketahui apabila nilai Rf fraksi KBNM-AcOEt sama dengan nilai Rf

kuersetin. Berdasarkan hasil perhitungan, nilai Rf fraksi KBNM-AcOEt

adalah 0,9812, sedangkan Rf kuersetin adalah 0,855 (Lampiran 3). Hal ini menunjukkan bahwa kedua nilai Rf berbeda.

Tabel 6. Warna tiap bercak sampel uji pada Plat KLT (A) Fraksi KBNM-AcOEt (B) Standard Kuersetin

Sampel Sinar tampak

UV 254 nm

UV 366 nm sebelum disemprot

sitroborat

UV 366 nm setelah disemprot

sitroborat

A Kuning Hitam Coklat kehitaman Coklat kehitaman

B kuning kuning Kuning kehitaman Flouresensi

kuning menyala

Warna bercak fraksi KBNM-AcOEt dan standar kuersetin ketika

diamati dibawah sinar tampak menunjukkan warna yang sama yaitu warna kuning (warna flavonoid apabila diamati dibawah sinar tampak). Oleh karena

itu, bercak fraksi KBNM-AcOEt dan standar kuersetin merupakan senyawa

flavonoid (Tabel 6). Bercak fraksi KBNM-AcOEt memiliki karakteristik nilai

Rf 98,12 (dikali 100) dengan warna coklat kehitaman yang diamati pada sinar UV, dimana karakteristik ini merupakan sifat senyawa biflavonil (kayaflavon)

(Harborne, 1987). Oleh karena itu, bercak fraksi KBNM-AcOEt diduga

merupakan senyawa biflavonil (kayaflavon).

C. Penetapan Kuantitatif Kandungan Flavonoid Total

Analisis flavonoid total fraksi KBNM-AcOEt dilakukan menggunakan

metode kolorimetri AlCl3 berdasarkan Zhinsen et al. (1999) yang telah

dimodivikasi oleh Saini et al. (2011). Kandungan flavonoid total dinyatakan

Rohman et al., 2007). Alasan pemilihan kuersetin sebagai standar adalah karena kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang dapat

membentuk kompleks dengan AlCl3 (Desmiaty et al., 2009). Berikut adalah

hasil uji kandungan flavonoid total kuersetin:

Tabel 7. Uji Flavonoid total standar kuersetin

konsentrasi (µg/mL) Rerata Absorbansi

400 0.2734

800 0.5196

1200 1.0402

1600 1.3925

2000 1.7219

Nilai absorbansi dan konsentrasi kuersetin dihubungkan untuk membuat suatu persamaan regresi linier. Persamaan regresi linier kuersetin yang didapat yaitu y=0.0009x - 0.1414 dengan R² = 0.9904 (Lampiran 4).

Apabila nilai absorbansi fraksi KBNM-AcOEt dimasukkan ke dalam sumbu y

dalam persamaan regresi linier kuersetin maka kadar flavonoid dalam sampel (sumbu x) dapat diketahui.

Tabel 8. Kandungan total flavonoid Fraksi KBNM-AcOEt Replikasi

ke- Absorbansi

Kadar flavonoid dalam sampel (ppm)

Total flavonoid (% b/b EQ)

1 0.0154 174.2222 16.7521

2 0.0151 173.8889 16.7201

3 0.0094 167.5556 16.1111

Rata- rata 171,8889 16,5278

SD 3,7565 0,3612

Dari hasil perhitungan, rata- rata kadar flavonoid dalam sampel fraksi

KBNM-AcOEt adalah 171,8889 ± 3,7565 ppm (Lampiran 4). Larutan stok

dibuat dengan melarutkan 10,4 mg fraksi KBNM-AcOEt kedalam 10 mL

yang didapatkan dari hasil perhitungan adalah 16,5278 ± 0,3612 % b/b EQ

(Lampiran 4). Artinya, tiap 100 gram fraksi KBNM-AcOEt ekuivalen atau

setara dengan 16,5278 gram senyawa flavonoid kuersetin. Apabila

dibandingkan dengan penelitian Chet (2009), fraksi KBNM-AcOEt

menunjukkan kadar flavonoid yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak

air kulit buah naga dengan rata-rata kadar flavonoid sebesar 1,8767 ± 0,3287

mg ekuivalen katekin/ 25 gram.

D. Analisis Kuantitatif Kandungan Fenolik Total

Kandungan fenolik total atau Total Phenolic Content (TPC) fraksi

KBNM-AcOEt dilakukan dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang

telah dikembangkan oleh Singleton dan Rossi (Rahmawati, 2009). Gallic

Acid Equivalent (GAE) merupakan acuan umum untuk mengukur sejumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu bahan. Pemilihan asam galat adalah berdasarkan ketersediaan substansi yang lebih stabil dan murni serta harga yang lebih murah dibandingkan senyawa standar yang lainnya (Rahmawati, 2009). Berikut adalah hasil uji kandungan fenolik total asam galat:

Tabel 9. Uji Fenolik Standar Asam Galat

Konsentrasi (µg/mL) Rerata Absorbansi

10 0,119

20 0,231

30 0,352

40 0,433

50 0,544

Hubungan antara nilai absorbansi dan konsentrasi asam galat akan menghasilkan suatu persamaan regresi linier. Persamaan regresi linier asam

galat yang didapat adalah y = 0,0105x + 0,0201 dengan nilai R² = 0,9968

(Lampiran 5). Kadar fenol total larutan fraksi KBNM-AcOEt (sumbu x)

dihitung dengan memasukkan nilai absorbansi sampel fraksi KBNM-AcOEt

kedalam sumbu y.

Tabel 10. Perhitungan Konsentrasi fenol sampel fraksi KBNM- AcOEt

Replikasi

ke- Absorbansi

Konsentrasi fenol total larutan (µg GAE/mL sampel)

Kadar Fenol Total (mg GAE/100g

sampel)

1 0.174 15.4 1509.8039

2 0.171 15.1 1480.3922

3 0.172 15.2 1490.1961

Rata- rata 15,2333 1493,4641

SD 0,1528 14,9757

Dari hasil perhitungan, rata- rata kadar fenol total larutan fraksi

KBNM-AcOEt (nilai C) adalah 15,2333 ± 0,1528 µg GAE/mL sampel

(Lampiran 5). Pengenceran tidak dilakukan dalam uji ini dan larutan stok

yang digunakan adalah 25,5 mg fraksi KBNM-AcOEt yang dilarutkan dalam

25 mL etanol. Oleh karena itu, rata- rata kadar fenol total (TPC) fraksi

KBNM-AcOEt yang didapat dari hasil perhitungan adalah 1493,4641 ±

14,9757 mg GAE/100g (Lampiran 5).

Artinya, setiap 100 gram fraksi KBNM-AcOEt setara dengan 1493,4641

mg asam galat. Apabila dibandingkan dengan penelitian Chet (2009), fraksi

KBNM-AcOEt menunjukkan kadar fenol total yang lebih tinggi dibandingkan

dengan ekstrak air kulit buah naga dengan rata-rata kadar fenol total sebesar 2,7533 ± 0,8879 mg GAE/25g.

E. Uji Antioksidan Metode DPPH

Daya antioksidan senyawa fenol dan flavonoid fraksi KBNM-AcOEt

dapat diketahui dengan melakukan uji penangkapan radikal bebas DPPH. Kuersetin dipilih sebagai pembanding karena kuersetin mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat. Bila vitamin C mempunyai aktivitas

antioksidan 1, maka kuersetin memiliki aktivitas antioksidan 4.7 (Sugrani et

al., 2009). Berikut adalah hasil uji penangkapan radikal bebas DPPH oleh

kuersetin dan fraksi KBNM-AcOEt:

Tabel 11. Uji penangkapan radikal bebas DPPH

Sampel Konsentrasi (µg/mL) Rerata % inhibisi

Kuersetin

1 31.132

2 46.275

3 61.829

4 75.568

5 86.357

Fraksi KBNM-AcOEt

100 13.70137

200 23.45538

300 29.74828

400 42.96339

500 50.60069

Nilai % inhibisi didapatkan dari perhitungan yang dilakukan dengan memasukkan nilai absorbansi kedalam rumus % inhibisi (Lampiran 6).

Konsentrasi kuersetin dan fraksi KBNM-AcOEt yang dihubungkan dengan

nilai % inhibisi akan menghasilkan suatu persamaan regresi linier. Persamaan regresi linier kuersetin yang didapat adalah y = 13,974x + 18,309 dengan R² =

0,9954, sedangkan persamaan regresi linier fraksi KBNM-AcOEt adalah y =

0,0933x + 4,1018 dengan R²=0.9904 (Lampiran 6). Persamaan regresi linier

memasukkan nilai 50 ke dalam sumbu y kedalam persamaan regresi linier yang didapat.

Dari hasil perhitungan, maka didapatkan nilai IC50 kuersetin sebesar

2,2679 g/mL dan IC50 fraksi KBNM-AcOEt adalah 491,9421 g/mL

(Lampiran 6). Artinya, pada fraksi KBNM-AcOEt membutuhkan konsentrasi

sebesar 491,9421 g/mL untuk menangkap radikal DPPH sebanyak 50%, sedangkan kuersetin hanya membutuhkan konsentrasi sebesar 2,2679 g/mL

untuk menangkap radikal DPPH sebanyak 50%. Nilai IC50 yang terlalu besar

atau daya antioksidan yang kecil diduga disebabkan karena senyawa flavonoid yang mengikat gugus samping yang dapat menghambat aktivitas antioksidan, sehingga flavonoid tidak dapat menyumbangkan hidrogen dan

elektron kepada DPPH (Harborne, 1987; Budilaksono et al., 2014).

Selain itu, gugus samping juga dapat menyebabkan flavonoid

termetilasi (gugus –H menjadi gugus –CH3), sehingga sumber proton untuk

menangkap DPPH berkurang (Mikamo et al, 2000; Pranata, 2013). Adanya

pengganggu seperti protein dan lemak dalam fraksi KBNM-AcOEt diduga

juga dapat mengganggu reaksi penangkapan radikal bebas DPPH

(Budilaksono et al., 2014). Walaupun, nilai IC50 dari ketiga fraksi masuk ke

dalam katagori lemah jika dilihat dari tingkat aktivitas antioksidan menurut

Ariyanto (2006) (>150 g/mL), namun nilai IC50 200-1000 g/mL dinyatakan

F. Panjang Gelombang Maksimal dan SPF secara in vitro

Uji SPF secara in vitro dilakukan dengan menetapkan panjang

gelombang absorbsi maksimum (λ _{maks) dengan metode spektrofotometri.}

Scanning spektrofotometer UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang antara 260-400 nm untuk mengetahui panjang gelombang maksimum fraksi KBNM-AcOEt pada masing- masing konsentrasi masuk kedalam rentang

UVA, UVB, atau UVC. Berikut adalah hasil uji SPF fraksi KBNM-AcOEt:

Tabel 12. Scanning panjang gelombang maksimal fraksi KBNM-AcOEt Konsentrasi

( g/mL) λ max (nm) Absorbansi

Daerah Ultraviolet

5 314 0.001 B

25 294 0.018 B

50 292 0.034 B

100 262 0.211 C

Panjang gelombang maksimum fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 5, 25, dan 50 g/mL diketahui berada pada rentang daerah UVB (290-320 nm), sedangkan panjang gelombang maksimum fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 100 g/mL berada pada rentang daerah UVC (200-290 nm) (Tabel 12).

Konsentrasi fraksi KBNM-AcOEt yang berada pada rentang UVB dapat

dilakukan perhitungan nilai SPF menggunakan rumus yang telah

dikembangkan oleh Mansur et al. (1986), sedangkan konsentrasi fraksi

KBNM-AcOEt yang berada pada rentang UVC tidak perlu dilakukan

perhitungan nilai SPF karena sinar radiasi UVC merupakan radiasi yang tidak sampai ke permukaan bumi karena terserap oleh lapisan ozon (McKinlay, 1987).

Rata- rata nilai SPF pada rentang daerah UVB fraksi KBNM-AcOEt

adalah 0.0069 ± _{0.0071 (Lampiran 7). Menurut Wasitaadmatdja (1997), nilai}

SPF minimal suatu tabir surya atau agen fotoprotektif adalah 2. Oleh karena

itu, dapat dikatakan bahwa fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 5, 25, 50 dan

100 mg/L tidak memiliki daya fotoprotektif. Rendahnya nilai SPF pada fraksi

KBNM-AcOEt (<2) diduga disebabkan oleh konsentrasi fraksi KBNM-AcOEt

yang digunakan terlalu rendah.

Menurut Widyastuti et al. (2015), konsentrasi ekstrak etanol kulit

buah naga super merah (Hylocereus costaricensis (F.A.C. Weber) Britton &

Rose) menunjukkan efektivitas yang baik sebagai tabir surya pada konsentrasi

900 ppm dengan nilai SPF 22,438, sedangkan pada konsentrasi 100 ppm ekstrak etanol kulit buah naga super merah tidak menunjukkan efektivitas sebagai tabir surya karena nilai SPF kurang dari 2 atau sebesar 1,419.

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN FOTOPROTEKTIF FRAKSI ETILASETAT EKSTRAK ETANOLIK KULIT BUAH NAGA MERAH

(Hylocereus polyrhizus)

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun oleh

NURHASNA SUSHMITA SARI 20120350015

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

DAFTAR PUSTAKA

Abdul Rohman, Riyanto, S., & Hidayati, N., 2007, Aktivitas Antioksidan, Kandungan Fenolik Total, dan Flavonoid Total Daun Mengkudu (Morinda

citrifoia L), Agritech, Vol.27 No.4.

Andersen, O.M. & Markham, K.R., 2006, Flavonoids, Chemistry, Biochemistry

and Applications, CRC Press, USA.

Ariesnawati, A.D., 2007, Identifikasi Flavonoida Hasil Fraksinasi dengan Kromatogram Kolom Vakum Ekstrak Metanol-Air Herba Pegagan Embun

(Hydrocotyle sibthorpoides Lmk.), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma.

Ariyanto, R., 2006, Uji Aktivitas Antioksidan, Penentuan Kandungan Fenolik dan Flavonoid Total Fraksi Kloroform dan Fraksi Air Ekstrak Metanolik Pegagan (Centella asiatica L. Urban), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Barwick, V.J., 1997, Strategies for Solvent Selection – a Literature Review,

Trends Anal Chem 16, 293-309.

Brenner, M., & Hearing, V.J., 2008, The Protective Role of Melanin Against UV Damage in Human Skin, Photochem Photobiol, 84: 539–549.

Budilaksono, W., Wahdaningsih, S., & Fahrurroji, A., 2014, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi N-Heksana Kulit Buah Naga Merah (Hylocereus lemairei Britton dan Rose) Menggunakan Metode DPPH (1,1 – Difenil – 2 - Pikrilhidrazil), Jurnal Mahasiswa Farmasi Fakultas Kedokteran UNTAN, vol.1 no.1.

Chaiwut, P., O-ki-la, A., Phuttisatien, I., Thitilertdecha, N., Pintathong, P., 2012, Extraction and Stability of Cosmetic Bioactive Compounds from Dragon Fruit Peel, Conference, School of Cosmetic Science Mae Fah Luang University, Thailand.

Chet, N.W., 2009, Total Phenolic and Total Flavonoids Content of Pitaya Peels by Water Extraction, Thesis, Faculty of Chemical and Natural Resources Engineering, Universiti Malaysia Pahang.

Christinawati, T., 2007, Identifikasi Flavonoid pada Herba Pegagan Embun

(Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) Hasil Isolasi Secara Kromatografi Lapis

Tipis Preparatif (KLTP), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.

Choo, W.S. & Yong, W.K., 2011, Antioxidant Properties of Two Species of Hylocereus Fruits, Advances in Applied Science Research, 2 (3): 418-425. Choquenet, B., Couteau, C., Paparis, E., & Coiffard, I.J., 2008, Quercetin and

Rutin as Potential Sunscreen Agents: Determination of Efficacy by an In Vitro Method, J Nat Prod, 71:1117–1118.

Ciptaningsih, E., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan dan Karakteristik Fitokimia pada Kopi Luwak Arabika dan Pengaruhnya terhadap Tekanan Darah Tikus Normal dan Tikus Hipertensi, Tesis, Universitas Indonesia, Depok.

Damogalad, V., Edy, H.J., Supriati, H.S., 2013, Formulasi Tabir Surya Ekstrak Kulit Nanas (Ananas Comosus L Merr) dan Uji In Vitro Nilai Sun

Protecting Factor (SPF), Pharmacon, Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT,

Vol.2 No.2.

Dembitsky, V.M., Poovarodom, S., Leontowicz, H., Leontowicz, M., Trakhtenberg, S., Gorinstein, S., & Vearasilp, S., 2011, The Multiple Nutrition Properties of Some Exotic Fruits: Biological Activity Andactive Metabolites, Food Research International, 44 (2011) 1671–1701.

Desmiaty, Y., Ratnawati, J., Andini, P., 2009, penentuan Jumlah Flavonoid Total Ekstrak Etanol Daun Buah Merah (Pandanus Conoideus Lamk) Secara Kolorimetri Komplementer, Presentasi Seminar Nasional POKJANAS TOI

XXXVI, Universitas Sanata Dharma.

Droge, W., 2002, Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function,

American Physiological Society, 82 : 47-95.

Dungir, G., Katja, D.G., & Kamu, V.S., 2012, Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fenolik dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L), Jurnal MIPA

UNSRAT ONLINE, 1(1) 11-15.

Dutra, E.A., Oliveira, D.A.G.C., Kedor-Hackmann, E.R.M., & Santoro, M.I.R.M., 2004, Determination of Sun Protection Factor (SPF) of Sunscreens by Ultraviolet Spectrophotometry, Rev Bras Cienc Farm., 40: 381-385.

Fessenden, R.J. & Fessenden, J.S., 1986, Kimia Organik, Jilid 1. Edisi Ketiga

Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D, Erlangga, Jakarta.

Foong, J.H., Hon, W.M., & Ho, C.W., 2012, Bioactive Compounds Determination In Fermented Liquid Dragon Fruit (Hylocereus Polyrhizus), Borneo Science,

volume 31.

Gandjar, I.G., & Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Grotewold, E., 2006, The Scince of Flavonoids, Springer Science + Business Media Inc, New York.

Handayani, H., Sriherfyna, F.H., Yunianta, 2016, Ekstraksi Antioksidan Daun Sirsak Metode Ultrasonic Bath (Kajian Rasio Bahan: Pelarut dan Lama Ekstraksi), Jurnal Pangan dan Agroindustri, vol.4 no.1 p.262-272.

Harborne, J., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Cetakan kedua, Penerjemah: Padmawinata,K. Dan I. Soediro,

Indriasari, I., 2012, Ekstrak Ethanol Buah Naga Merah (Hylocereus Polyrhizus) Memperbaiki Profil Lipid pada Tikus Wistar Jantan (Rattus Norvegicus) Dislipidemia, Tesis, Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik Program Pascasarjana, Universitas Udayana Denpasar.

Isabelle, D., Rouyanne, T.R., Henk, C.M., Guus, S.M., Linsie, M., Peter, L.Z., Johanna, M.G., & Elka, A.T, 2009, Continuous Dose-Response Relationship of the LDL-Cholesterol Lowering Effect of Phytosterol Intake, Journal of

Nutrition, 139: 271-284.

Jamilah, B., Shu, C.E., Kharidah, M., Dzulkifly, M.A., & Noranizan, A., 2011, Physico-chemical Characteristics of Red Pitaya (Hylocereus lemairei) Peel,

Int. Food. Res. J, 18 : 279-286.

Josephy, P.D., 1997, Molecular Toxicology, Oxford University Press, New York. Jung, K., Seifert, M., Herrling, Th., & Fuchs, J., 2008, UV-Generated Free

Radicals (FR) in Skin: Their Prevention by Sunscreens and Their Induction by Self-Tanning Agents, Elsevier, Volume 69, Issue 5, Pages 1423–1428. Junior, R.G.O., Araujo, C.S., Souza, G.R., Guimaraes, A.L., Oliveira, A.P.,

Lima-Saraiva, S.R.G., Morais, A.C.S., Santos, J.S.R., & Silva, A.J.R.G., 2013, In Vitro Antioxidant and Photoprotective Activities of Dried Extracts from Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae), Journal of Applied Pharmaceutical

Science, Vol. 3 (01), pp. 122-127.

Kaur, C. D., & Saraf, S., 2010, In Vitro Sun Protection Factor Determination of Herbal Oils Use in Cosmetics, Pharmacognosy Research, 2(1), 22–25. Kristanto, 2008, Buah Naga Pembudidayaan di Pot dan di Kebun, Penebar

Swadaya, Jakarta.

Kumar, S., 2011, Free Radicals and Antioxidants: Human and Food System,

Advances in Applied Science Research, 2 (1): 129-135.

Lucas, R.M., Norval, M., Neale, R.E., Young, A.R., de Gruijl, F.R., Takizawa, Y., & van der Leun, J.C., 2015, The Consequences for Human Health of Stratospheric Ozone Depletion in Association with Other Environmental Factors, Photochem. Photobiol. Sci.,14,53–87.

Mahdi, S., & Altikriti, Y., 2010, Extraction of natural products, Student

Presentation, Uppsala Universitet.

Mangindaan, R.E.P. & Lesnussa, M.S.P., 2013, Aktivitas Siototoksik dari Ekstrak Bintang Ular (Ophiomastix annulosa) terhadap Perkembangan Awal Embrio Bulu Babi (Tripneustes gratilla), Jurnal Pesisir dan Laut Tropis, Volume 3 Nomor 1.

Mansur, J.S., Breder, M.V.R., Mansur, M.C.A., Azulay, R.D., 1986, Determinação do fator de proteção solar por espectrofotometria. An Bras

63

Lampiran 7 Uji SPF

67

Tabel 20. Penetapan SPF Secara In Vitro Fraksi KBNM-AcOEt

konsentrasi

( g/mL) Absorbansi

λ max interval 2

nm

λ (nm) EE x I

(λ) SPF

5 0.001 314 315 0.0839 0.0008

25 0.018 294 295 0.0817 0.0147

50 0.034 292 290 0.015 0.0051

100 0.211 262 - - -

Rata- Rata 0.0069

SD 0.0071

Perhitungan SPF Rumus:

SPFSpektrofotometrik = CF x Σ290-320 EE (λ) x I (λ) x Abs (λ) Keterangan:

EE (λ) : Spektrum efek erythemal

I (λ) : Spektrum intensitas matahari

Abs (λ) : Absorbansi

CF : Faktor koreksi (= 10)

Fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 5 g/mL

SPFSpektrofotometrik = 10 x 0.0839 x 0.001 SPFSpektrofotometrik = 0.0008

Fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 25 g/mL

SPFSpektrofotometrik = 10 x 0.0817x 0.018 SPFSpektrofotometrik = 0.0147

Fraksi KBNM-AcOEt konsentrasi 50 g/mL

SPFSpektrofotometrik = 10 x 0.0150 x 0.034 SPFSpektrofotometrik = 0.0051

Lampiran 8

Foto dan dokumentasi

Uji

Gambar 12. Perajangan kulit buah naga merah

Gambar 14. Proses Evaporasi

Gambar 17. Uji Kandungan Fenolik Total

Gambar 13. Proses maserasi

Gambar 15. Proses fraksinasi

Gambar 16. Penangkapan Radikal Bebas DPPH