Karaterisasi Bakteri Endofit Penghasil Volatile Organic Compounds (Vocs) Untuk Meningkatkan Ketahanan Tanaman Kentang Terhadap Penyakit Layu Bakteri
KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL
VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS (VOCs) UNTUK
MENINGKATKAN KETAHANAN TANAMAN
KENTANG TERHADAP PENYAKIT LAYU BAKTERI
ALINA AKHDIYA
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ”Karaterisasi Bakteri Endofit
Penghasil Volatile Organic Compounds (VOCs) untuk Meningkatkan Ketahanan
Tanaman Kentang terhadap Penyakit Layu Bakteri” adalah karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, 17 Juli 2014
Alina Akhdiya
NIM: G361090021
RINGKASAN
ALINA AKHDIYA. Karaterisasi Bakteri Endofit Penghasil Volatile Organic
Compounds (VOCs) untuk Meningkatkan Ketahanan Tanaman Kentang terhadap
Penyakit Layu Bakteri. Dibawah bimbingan ARIS TRIWAHYUDI, ABDUL
MUNIF, dan LATIFAH K DARUSMAN.
Kebutuhan kentang nasional terus meningkat seiring dengan peningkatan
populasi dan pendapatan penduduk serta industri pengolahan makanan. Namun
upaya peningkatan produksi kentang di Indonesia menghadapi berbagai kendala
diantaranya serangan hama penyakit serta kualitas bibit kentang yang rendah.
Ralstonia solanacearum adalah patogen penyebab penyakit layu bakteri pada
tanaman kentang. Pada varietas-varietas yang rentan, tingkat kehilangan hasil
yang ditimbulkan oleh penyakit ini dapat mencapai 100%.
Produksi bibit kentang yang berkualitas tinggi dalam skala besar dapat
dilakukan dengan teknologi perbanyakan in vitro (kultur jaringan). Perbanyakan
secara in vitro dilakukan pada kondisi yang steril dan terkontrol. Sebagai
konsekuensinya, bibit tanaman yang dihasilkan banyak kehilangan
mikroorganisme berguna yang turut berperan dalam ketahanan tanaman terhadap
patogen. Inokulasi dini bakteri endofit merupakan saah satu alternatif yang baik
untuk melindungi dan meningkatkan ketahanan bibit tanaman hasil kultur invitro
terhadap penyakit layu bakteri. Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mengisolasi
dan menapis bakteri endofit yang mampu meningkatkan ketahanan bibit kentang
terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum, (2)
mengkarakterisasi isolat bakteri endofit terpilih, dan (3) menelaah kemampuan
kolonisasi isolat bakteri endofit terpilih pada planlet kentang.
Bakteri endofit kentang diisolasi dari dua varietas tanaman kentang
(Granola dan Atlantic) yang diambil dari Pasir Wangi, Garut dan Kebun
Percobaan Balai Penelitian Tanaman Sayuran di Lembang. Penapisan isolat
dilakukan berdasarkan pengujian-pengujian berikut : uji aktivitas hemolitik, uji
hipersensitif respon (HR) pada daun tembakau, uji patogenisitas terhadap planlet
kentang, serta uji peningkatan ketahanan tanaman kentang yang ditanam pada
kondisi tidak steril dan steril.
Sebanyak 214 bakteri endofit berhasil diisolasi dari kedua varietas tanaman
kentang tersebut. Diantara isolat-isolat tersebut, 168 bersifat non-hemolitik dan
tidak menimbulkan reaksi HR pada daun tembakau. Dari 168 isolat, 119
diantaranya non-patogenik terhadap planlet kentang. Empat isolat yaitu G053,
G062, G0196, dan L-12 mampu menurunkan DI layu bakteri dan meningkatkan
pertumbuhan tanaman kentang pada uji ketahanan yang dilakukan pada kondisi
tidak steril. Penapisan berikutnya menunjukkan hanya 2 isolat bakteri endofit
yaitu G053 dan G062 yang secara nyata mampu meningkatkan ketahanan dan
pertumbuhan tanaman kentang. Kedua isolat tersebut diisolasi dari batang
tanaman kentang varietas Atlantic yang diambil dari Garut.
Isolat G053 merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus dengan
diameter sel 0.9-1.4 µm. Koloni G053 berbentuk bulat cembung dengan warna
kuning pucat. Isolat G062 adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang dengan
ukuran sel 0.59-0,89 µm x 1.85-3.3 µm. Koloni G062 berbentuk bulat dengan
warna krem sampai kecoklatan. Berdasarkan sekuen 16S rDNA-nya kedua isolat
tersebut teridentifikasi berturut-turut sebagai M. endophyticus (98%) dan
Paracoccus halophylus (98%). Kedua bakteri endofit tersebut mampu
menghasilkan senyawa serupa fitohormon dan siderofor, serta menambat
nitrogen. Kemampuan fiksasi nitrogen kedua bakteri endofit tersebut dapat
meningkatkan ketersediaan nitrogen tanaman inang, sehingga tanaman inang
tumbuh lebih baik dari pada tanaman kontrol yang tidak diperkaya dengan bakteri
endofit tersebut. M. endophyticus G053 juga mengemisikan berbagai senyawa
organik volatil (VOCs) dan mengekskresikan kitinase, sedangkan P. halophylus
G062 juga mampu menghasilkan enzim pelarut fosfat.
Untuk menelaah perubahan fisiologis tumbuhan inang terkait respon induksi
resistensi oleh kedua bakteri endofit terpilih terhadap infeksi R. solanacearum,
dilakukan pengukuran kadar protein daun dan aktivitas enzim (peroksidase,
polifenol oksidase atau PPO, dan askorbat peroksidase atau APX) terhadap
tanaman yang diperkaya dengan bakteri endofit tersebut . Duapuluh empat jam
setelah inokulasi R. solanacearum, kadar protein, aktivitas polifenol oksidase
(PPO), askorbat peroksidase (APX), dan peroksidase tanaman G053 meningkat
lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol dan G062. Peningkatan kadar
protein total, aktivitas PPO, APX, dan peroksidase tanaman yang diperkaya isolat
G053 berturut-turut mencapai 4.6%, 2075%, 111%, dan 42%, sedangkan pada
tanaman G062 hanya meningkat aktivitas enzim peroksidase (126%) dan kadar
protein totalnya (0.09%). Telaah lebih lanjut menunjukkan bahwa setelah infeksi
R. solanacearum, emisi etilen oleh tanaman G053 lebih tinggi dibandingkan
dengan tanaman kontrol. Kandungan lignin tanaman G053 yang diinfeksi R.
solanacearum juga meningkat 23.5%, sebaliknya lignin tanaman kontrol turun
26.7%.
VOCs yang diemisikan M. endophyticus G053 merupakan campuran dari
sedikitnya 16 senyawa volatil. Metil eugenol (ME) merupakan komponen utama
VOCs M. endophyticus G053. Kompleks VOCs tersebut juga mengandung
heksadekan dalam konsentrasi yang lebih rendah. Paparan VOCs M. endophyticus
G053 terhadap planlet yang diinfeksi R. solanacearum mampu mereduksi nilai DI
layu bakteri sebesar 46.7%. Hal ini diduga disebabkan oleh komponen
heksadekan dalam VOCs tersebut. Heksadekan merupakan kandidat senyawa
sinyal baru untuk menginduksi ekspresi protein PR1 yang berperan dalam
mekanisme ketahanan tumbuhan melalui lintasan Systemic Acquired Resistance
(SAR). Paparan kompleks VOCs dan ME juga terbukti dapat menekan produksi
EPS bakteri patogen ini. Perbedaan EPS yang diproduksi oleh kultur R.
solanacearum A dan B yang dipapar dan tidak dipapar VOCs berturut-turut
mencapai 34% dan 155%. Selisih kadar EPS tersebut hanya mencapai 4.7% dan
75% berturut-turut untuk R. solanacearum galur A dan B ketika kultur patogen ini
dipapar dengan ME. Pengamatan kemampuan kolonisasi M. endophyticus G053
dan Paracoccus halophylus G062 yang dilakukan dengan teknik reisolasi dan
pengamatan mikroskopis menggunakan scanning electron microscope
menunjukkan bahwa kedua bakteri endofit tersebut memiliki kemampuan
kolonisasi dan persistensi yang tinggi pada planlet dan tanaman kentang.
Berdasarkan karakter-karakter yang dimiliki dan hasil uji ketahanan
tanaman yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa bakteri endofit M.
endophyticus G053 mampu mengaktifkan SAR dan ISR tanaman kentang secara
paralel. Akumulasi efek aktivasi kedua lintasan resistensi dan kemampuan
kolonisasi serta persistensinya yang tinggi menghasilkan peningkatan resistensi
dan perlindungan yang kuat pada tanaman kentang terhadap penyakit. Sedangkan
P. halophylus G062 meningkatkan ketahanan tanaman kentang melalui aktivasi
ISR. Kedua bakteri endofit tersebut sangat potensial untuk dikembangkan
menjadi agen hayati yang unggul untuk ketahanan tanaman kentang terhadap
penyakit layu bakteri dan meningkatkan pertumbuhannya.
Kata kunci : Bakteri endofit, Micrococcus endophyticus, Paracoccus halophilus,
layu bakteri, induksi ketahanan, Volatil Organic Compouns (VOCs).
SUMMARY
ALINA AKHDIYA. Characterization of Endophytic Bacteria Producing Volatile
Organic Compounds (VOCs) to Enhance Potato Plant Resisantance Against
Bacterial Wilt Disease. Under supervision of ARIS TRIWAHYUDI, ABDUL
MUNIF, dan LATIFAH K DARUSMAN.
National potato demand is increasing due to growth of population,
increasing of public income and food processing industries. However in the
efforts to increase potato production in Indonesia, it faces many obstacles
including pests, diseases and low quality of the potato seedling. Ralstonia
solanacearum is important pathogens for potato plant. Yield loss caused by the
disease could reach up to 100% on the susceptible cultivars.
Production of high-quality potatoes seedling on a large scale could done
by in vitro propagation (tissue culture). In vitro propagation was carried out in
sterile and controlled conditions. As a consequence, the seedlings are lost many
useful microorganisms that play an important role in plant growth and resistance
against pathogens. Early inoculation of bacterial endophytes is one of good
alternative way to protect and increase resistance of seedling produced by tissue
culture against bacterial wilt.
This research was conducted to (1) isolate and screen the endophytic
bacteria that can increase the resisitance of potato plant (G0) against Ralstonia
Solanacearum, (2) identify the bacterial compounds indicating had an important
role in increasing of plant resistance mechanism, and (3) observe the colonization
ability of selected endophytic bacteria in potato plantlets. The endophytic bacteria
were isolated from 2 cultivars (Granola and Atlantic) from Pasir Wangi, Garut
and the research station of the Research Center of Horticultural Crop (BALITSA)
Lembang, Bandung. Screening of the isolates was based on haemolytic test,
hypersensitive response (HR) on tobacco leaves, pathogenecity against potato
plantlets test, and ability of the isolates to induce potato plant resistant on unsterile
and sterile conditions.
As many as 214 endophytic bacterial isolates were successfully isolated.
Among the isolates, 168 isolates were non-haemolytic and did not cause HR
reaction on tobacco leaves. A hundred and nineteen isolates of them were nonpathogenic against potato plantlets. Four isolates i.e. G062, G0196, dan L-12
isolates showed their ability to decrease bacterial wilt DI and to promote potato
plant growth on the plant resistance test conducting on unsterile condition. Further
screening showed that only 2 endophytic isolates i.e G053 and G062 could
enhance the plants resistance against bacterial wilt and promote plant growth
significantly. Both isolates were isolated from the stem of potato plants cv.
Atlantic which were taken from Garut.
G053 isolate was Gram positive bacterium, coccus in shape, and 0.9-1.4
µm in diameter. Its morphology of colony was round, convex, and pale yellow in
color. However G062 isolate was Gram negative bacterium with short rod or rod
cell in shape and 0.59-0,89 µm x 1.85-3.3 µm in size. Its morphology of colony
was round with cream to light brown in color. Based on 16S rDNA sequences,
G053 isolate was closely related to Micrococcus endophyticus YIM 56238 (98%),
while G062 isolate was closely related to P. halophylus HN-182 (98%). Both
isolates could produce phytohormone like compounds and siderophore, and fix
nitrogen. Nitrogen fixation ability of both endophytic bacteria could provide
nitrogen for their host plants, so the plants could grow better than the control
plants that were not enriched with the endophytes. Additionally, M. endophyticus
G053 emitted volatile organic compounds (VOCs) and excreted chitinase, while
P. halophylus G062 produced phosphate solubilizing enzyme.
To study physiological change of the host plants due to resistant induction
response by the both of selected endophytic bacteria against R. Solanacearum
infection, analysis of protein content and enzyme activity (peroxydase,
polyphenol oxydase and ascorbate oxydase) were conducted to the endophytic
bacteria enriched and control plants. Twenty four hours after R. solanacearum
infection, the leaf protein content, polyphenol oxidase (PPO) activity, ascorbic
peroxidase (APX), and peroxidase activity of the G053 enriched plants were
increased higher than that of the control and G062 enriched plants. Increasing of
the total protein content, and activity of PPO, APX, and peroxidase of G053
plants were 4.6%, 2075%, 111%, and 42% respectively. On the othe hand, the
G062 enriched plants were olny increased for the protein content (0.09%) and
peroxidase activity (126%). Further studies showed that the G053 plants emitted
higher level of ethylene than that of the control plants after infected with the
pathogen. In addition, lignin content of G053 treated plants was increase by
23.5%, but it was decrease by 26.7% on the control plants.
VOCs emitted by M. endophyticus G053 were mixed of at least 16 volatile
compounds. Methyl eugenol (ME) was primary VOCs of M. endophyticus G053.
The VOCs also contained hexadecane in lower concentration. VOCs exposured to
the plantlet infected by R. solanacearum could reduce DI of bacterial wilt by
46.7%. It was presumably caused by hexadecan component in the VOCs.
Hexadecan was a new signaling compound candidate to induce gene expression of
PR1 protein that involved in Systemic Acquired Resistance (SAR) pathway.
Additionally, VOCs and ME exposure could reduce EPS production by the
pathogen. The difference between EPS production by R. solanacearum strains A
and B that were exposed and unexposed to the VOCs were 34% and 155%
subsequently. While there were only 4.7% dan 75% for the strain A dan B
subsequently when the pathogen cultures exposed to ME. Observation of M.
endophyticus G053 colonization ability conducted by reisolation technique and
scanning electron microscope showed that M. endophyticus G053 and P.
halophylus G062 were endophytic bacteria having high colonization ability and
persistency in potato plantlets and plants.
Based on the characters and plant resistance test results, it was concluded
that bacterial endophyte M. endophyticus G053 could activate SAR and ISR of the
potato plant pararely. Accumulation effect of both resistance pathways and its
high colonization and persistance ability resulted the strong enhancement and
protection against the disease. While resistance enhancement activated by P.
halophylus G062 was through the ISR pathways. Both of the endophytic bacteria
had a great potent to be developed as a great biological agent to enhance potato
plant resistance against bacterial wilt disease and to promote the plant growth.
Key words : Endophytic bacteria, Micrococcus endophyticus,Paracoccus
halophilus , bacterial wilt, induction of plant resistance, Volatil
Organic Compouns (VOCs)
© Hak cipta milik IPB, tahun 2014
Hak cipta dilindungi Undang-Undang. Dilarang mengutip sebagian atau
seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya.
Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan
pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang
mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam
bentuk apapun tanpa izin IPB.
KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL
VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS (VOCs) UNTUK
MENINGKATKAN KETAHANAN TANAMAN
KENTANG TERHADAP PENYAKIT LAYU BAKTERI
ALINA AKHDIYA
Disertasi sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Doktor
pada Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada ujian tertutup :
1.
Dr Giyanto, MSi. (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
IPB).
2.
Dr Rakhmat Sutarya, MS. (Balai Penelitian Tanaman Sayuran, Badan
Litbang Pertanian, Lembang).
Penguji pada ujian terbuka :
1.
Dr Yulin Lestari MS. (Departemen Biologi, FMIPA, IPB).
2.
Prof Dr Supriadi (Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat, Badan
Litbang Pertanian, Bogor)
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah penulis ucapkan atas rahmat, kasih sayang,
kekuatan, serta kesabaran yang telah dilimpahkan Allah SWT sehingga penulis
berhasil menyelesaikan disertasi yang berjudul “Karakterisasi Bakteri endofit
yang Efektif untuk Meningkatkan Ketahanan Tanaman Kentang terhadap
Penyakit Layu Bakteri” ini. Kentang merupakan komoditas pertanian introduksi
yang telah diterima dengan baik oleh masyarakat Indonesia sebagai salah satu
bahan pangan komplemen serta memiliki nilai ekonomi yang relatif tinggi.
Budidaya kentang yang sangat rentan terhadap serangan berbagai penyakit
mendorong petani untuk mengaplikasikan pestisida sintetik secara tidak rasional
untuk menyelamatkan tanamannya. Kecenderungan praktek budidaya kentang
yang tidak ramah lingkungan tersebut menjadi salah satu pertimbangan penulis
dalam untuk memilih topik penelitian ini.
Penelitian dan disertasi ini terwujud atas dukungan dan bantuan berbagai
pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak
tersebut :
1.
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi., Dr Abdul Munif, MSc. Agr. dan Prof Dr
Latifah K Darusman selaku pembimbing atas bimbingan dan arahan yang
diberikan selama penelitian dan penulisan disertasi.
2.
SEAMEO BIOTROP sebagai pengelola program PhD Research Grant atas
dana penelitian yang diberikan untuk pelaksanaan sebagian penelitian ini.
3.
Bpk. Rahmat dan Ajat (Gapoktan Multi Tani Jayagiri Desa Cipendawa,
Pasir Cina Cianjur) atas segala bantuan penggunaan fasilitas screen house
dan perawatan tanaman.
4.
Tira Nur Afiah SSi., Ari Fina Bintarti, MSi., Andri Ferbianto, SSi., Herni
Widiatuti SSi. (Laboratorium BrMC SEAMEO BIOTROP) dan rekan
peneliti serta teknisi di kelti Biak Sel dan Jaringan dan Biokimia BBBIOGEN atas bantuannya selama pelaksanaan penelitian.
5.
Pegawai Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB,
atas segala bantuan, fasilitas dan penggunaan alat.
6.
Prof Dr Akira Yokota atas bimbingannya dalam melakukan analisa FAME
dan GC-content.
7.
Prof Dr Ika Mariska S atas masukan dan diskusinya tentang aspek fisiologi
tumbuhan dan Prof Dr Supriadi atas kesediaanya mengoreksi manuskrip
publikasi.
8.
Dr Giyanto, MSi. (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB)
dan Dr Rakhmat Sutarya (Balai Penelitian Tanaman Sayuran) atas
kesediannya sebagai penguji dan saran perbaikan yang diberikan pada ujian
tertutup.
9.
Dr Yulin Lestari dan Prof Dr Supriadi atas kesediannya sebagai penguji
dan saran perbaikan yang diberikan pada ujian terbuka.
10.
Suami dan anak-anakku, Ibu serta seluruh keluarga atas segala doa,
pengertian, dan dukungan tulus yang diberikan.
Penulis berharap hasil penelitian ini dapat menyumbangkan informasi
ilmiah yang berguna dalam bidang mikrobiologi dan pengelolaan hama dan
penyakit tanaman di Indonesia serta dapat dikembangkan menjadi teknologi
alternatif yang baik untuk meningkatkan produksi kentang melalui teknik
budidaya pertanian yang berkelanjutan dan ramah lingkungan.
Bogor, Juli 2014
Alina Akhdiya
DAFTAR ISI
HALAMAN PERNYATAAN .................................................................
RINGKASAN ...........................................................................................
SUMMARY .............................................................................................
HALAMAN HAK CIPTA ......................................................................
HALAMAN JUDUL ...............................................................................
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................
PRAKATA ..............................................................................................
DAFTAR ISI ...........................................................................................
DAFTAR TABEL ....................................................................................
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................
i
iii
vi
viii
x
xi
xiii
xv
xviii
xix
xxiii
PENDAHULUAN ....................................................................................
Latar Belakang ..................................................................................
Tujuan ...............................................................................................
Manfaat Penelitian ............................................................................
Kerangka Pemikiran .........................................................................
Novelty ..............................................................................................
Hipotesis ...........................................................................................
Kerangka Penelitian ..........................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................
Ralstonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri .............
Bakteri Endofit .................................................................................
Peran Bakteri Endofit dalam Meningkatkan Ketahanan Tanaman.
VOCs Sebagai Penginduksi Ketahanan Tanaman ............................
Aplikasi Bakteri Endofit untuk Meningkatkan Resistensi,
Pertumbuhan, dan Produktivitas Tanaman ..............................
5
5
5
6
10
BAHAN DAN METODE ..........................................................................
.
Prosedur Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit ............
Contoh tanaman .......................................................................
Optimasi sterilisasi permukaan akar ......................................
Sterilisasi permukaan batang dan daun ................................
Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman kentang ......
.
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap I ..........................
Bioesei Respon Hipersentif (HR) ...........................................
Uji hemolitik ...........................................................................
Uji patogenisitas isolat terhadap plantlet kentang ..................
Uji ketahanan tanaman Generasi 0 (G0) yang diperkaya
isolat bakteri endofit terhadap layu bakteri .......................
Pengukuran densitas sel bakteri ..............................................
13
13
13
13
15
15
16
17
18
18
11
18
19
.
Penapisan Bakteri Endofit Kentang Tahap II .................................
Evaluasi ketahanan tanaman G0 yang diperkaya isolat
bakteri endofit pada media steril ........................................
Evaluasi DI tanaman Generasi 1 (G1) pada media tidak steril
Analisis Respon Fisiologis Tumbuhan Terkait Ketahanan .....
a
Penentuan kandungan protein total................................
b
Pengukuran aktivitas enzim peroksidase .......................
c
Pengukuran aktivitas enzim polifenol oksidase ..............
d
Pengukuran aktivitas enzim askorbat peroksidase ..........
e
Pengukuran emisi etilen ..................................................
f
Penetapan kandungan lignin like compounds .................
Pengamatan Pertumbuhan Tanaman dan Produktivitas Umbi ..........
Uji Kolonisasi ....................................................................................
Pengamatan tampilan morfologi akar planlet yang diperkaya
dengan bakteri endofit ........................................................
Pengamatan secara mikroskopis ............................................
Reisolasi M. endophyticus G053 dari tanaman dan planlet .....
Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit Terpilih ...................................
Identifikasi dan karakterisasi molekuler ..................................
Karakterisasi fisiologis dan biokimia ......................................
a
Uji fisiologis dan biokimia umum ...................................
b
Uji aktivitas fiksasi nitrogen ...........................................
c
Uji kemampuan produksi plant growth hormone like
compounds .................................................................
d
Uji kemampuan produksi siderofor .................................
e
Analisa Fatty Acid Methyl Ester (FAME) ......................
f
Bioesei produksi VOCs dan aktivitas penghambatannya
terhadap kultur R. solanacearum ...............................
Pengamatan motilitas dan morfologi .......................................
Identifikasi Komponen VOCs dan Pengaruhnya terhadap
R. solanacearum dan Planlet Kentang ........................................
Trapping dan identifikasi komponen VOCs G053 .................
Uji pengaruh VOCs terhadap produksi EPS oleh
R.solanacearum ............................................................
Uji pengaruh VOCs terhadap munculnya gejala layu bakteri
pada planlet ........................................................................
Penyimpanan isolat ...........................................................................
19
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Optimasi Prosedur Sterilisasi Permukaan Akar ..............................
Isolasi bakteri Endofit .......................................................................
Isolat bakteri endofit terseleksi I .......................................................
Isolat bakteri endofit terseleksi II ....................................................
Profil Pertumbuhan Tanaman Kontrol dan Tanaman yang
Diperkaya dengan Isolat G053 dan Isolat G062 ..........................
30
30
31
35
38
19
20
20
20
20
21
21
21
21
22
22
22
22
22
23
24
25
25
25
26
26
27
27
28
28
28
28
29
29
44
Kolonisasi Bakteri Endofit G053 dan G062 pada Planlet dan
Tanaman Kentang ..........................................................................
Identitas dan Karakter Isolat Bakteri Endofit G053 dan G062 ........
Identitas dan Karakter molekuler ...........................................
Deskripsi karakter fisiologis dan biokimia ............................
Deskripsi karakter morfologi ...................................................
Identitas Komponen Senyawa VOCs M. endophyticus G053 ..........
Pengaruh VOCs Isolat G053 dalam Menekan Gejala Layu Bakteri
pada Planlet dan Produksi EPS ................................................
Peran M. endophyticus G053 dan P. halophilus G062 dalam Induksi
Resistensi Tanaman Kentang ......................................................
48
53
53
55
62
64
65
69
SIMPULAN ..............................................................................................
73
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................
75
LAMPIRAN .............................................................................................
85
RIWAYAT HIDUP ..................................................................................
91
DAFTAR TABEL
No
1.
2.
Halaman
n
Beberapa senyawa dan determinan bakteri penginduksi
ketahanan pada beberapa tumbuhan (Chodhary dan Johri 2009)
9
Komposisi campuran reaksi PCR untuk amplifikasi 16S rDNA
G053 dan G062
24
3.
Kondisi reaksi PCR amplifikasi 16S rDNA G053 dan G062
24
4.
Peningkatan emisi etilen dan kadar lignin tanaman G053dan
kontrol setelah infeksi R. solanacearum
42
5.
Densitas isolat G053 pada planlet dan tanaman kentang
50
6.
Karakter fisiologis dan biokimia M. endophyticus G053
56
7.
Aktivitas fiksasi nitrogen dan produksi
senyawa
mirip
fitohormon (IAA, Giberellin, zeatin, dan ABA like) oleh
M. endophyticus G053 dan aracoccus halophilus G062
57
Komposisi asam lemak sel M. endophyticus G053 YIM 56238,
K. rosea DSMZ 20447 dan K. erythromyxa ATCC 187
58
9.
Karakter fisiologis dan biokimia P..halophilus G052
60
10
Karakter P. halophilus G062, strain pembanding, serta beberapa
spesies terdekat
61
Komposisi VOCs M. endophyticus G053 yang tertangkap
dengan hexan
64
Nilai DI layu bakteri pada kelompok plantlet yang tidak dipapar
dan dipapar dengan VOCs dari M. endophyticus G053
65
Perbedaan kadar EPS kultur R. solanacearum yang dipapar
VOCs isolat G053 dan metil eugenol dengan yang tidak dipapar
volatil
68
8.
11.
12.
13.
DAFTAR GAMBAR
No.
Halamann
1. Diagram alir kegiatan penelitian yang dilakukan
4
2. Lintasan induksi resistensi tanaman oleh bakteri patogen
dan rhizobacteria (Vallad dan Goodman 2004)
7
3. Model induksi ISR dan SAR secara paralel (Saskia et al.
2000)
8
4. Diagram alir prosedur sterilisasi permukaan akar
14
5. Diagram alir isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
16
6. Diagram alir penapisan isolat bakteri endofit dan kajian
perubahan fisiologis inang
17
7. Diagram alir kegiatan karakterisasi isolat bakteri endofit
terpilih yang dilakukan dalam penelitian ini
23
8. Rata-rata jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA
yang berasal dari air bilasan terakhir empat prosedur sterilisasi
permukaan akar
31
9. Perbandingan densitas bakteri endofit tanaman kentang (G4)
varietas Granola dan Atlantic asal Garut berdasarkan jumlah
koloni yang terisolasi
32
10. Densitas bakteri endofit akar kentang berdasarkan hasil isolasi
yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA 20%,
dan NMS bebas Nitrogen
33
11. Densitas bakteri endofit batang kentang berdasarkan hasil
isolasi yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA
20%, dan NMS bebas Nitrogen
34
12. Densitas bakteri endofit daun kentang berdasarkan hasil
isolasi yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA
20%, dan NMS bebas Nitrogen
34
13. Tampilan koloni isolat bakteri endofit yang bersifat hemolitik
dan nonhemolitik pada medium agar darah
36
14. Reaksi jaringan daun tembakau pada 24 jam (A) dan 96 jam
(B) setelah diinfiltrasi dengan suspensi R. solanacearum
(kontrol positif) dan isolat bakteri endofit
36
15. Tampilan morfologi planlet yang diperkaya dengan bakteri
endofit
16.
Parameter pertumbuhan tanaman G0 yang diinokulasi dengan
empat isolat terpilih yang ditanam pada media tidak steril
37
38
17. Disease Insidence (DI) tanaman G0 kontrol dan yang
diperkaya dengan bakteri endofit G053 dan G062 yang
ditanam pada media tanam steril
39
18. Nilai Disease Insidence (DI), tinggi tanaman, berat umbi, dan
jumlah umbi tanaman G1 kontrol, G053, dan G062
39
19. Peningkatan kadar protein tanaman G0 pada 24 jam dan 48
jam setelah infeksi (jsi) R. solanacearum
40
20. Peningkatan aktivitas enzim APX peroksidase, peroksidase,
dan polifenol oksidase tanaman kentang (G0) 24 jam setelah
infeksi Ralstonia solanacearum
41
21. Lintasan biosintesis dan regulasi etilen pada tanaman
43
22. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat kering
tajuk tanaman kentang G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
44
23. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat kering
akar tanaman kentang G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
45
24. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap jumlah umbi
kentang pada tanaman G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
45
25. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat umbi
kentang dari tanaman G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
46
26. Tampilan tanaman G0 yang diperkaya dengan isolat G053 dan
G062, serta kontrol yang ditanam pada media tanam yang
telah disteril
46
27. Tampilan tanaman G1 kontrol dan tanamana yang diperkaya
dengan isolat G053 dan G062, serta kontrol yang ditanam
pada media tidak steril
47
28. Nilai Disease Insidence (DI), tinggi tanaman, berat umbi, dan
jumlah umbi tanaman G1 kontrol, G053, dan G062
47
29. Tampilan akar planlet setelah diinokulasi dengan bakteri
endofit
49
30. Mikrograf elektron payar jaringan batang plantlet kontrol
pada perbesaran 1000X
50
31. Mikrograf elektron payar jaringan batang plantlet yang
diinokulasi isolat bakteri endofit G053 pada perbesaran
1000X
51
32. Mikrograf elektron payar jaringan xilem planlet yang
dikolonisasi oleh isolat G053 pada perbesaran 7500X
51
33. Mikrograf elektron payar kolonisasi isolat G062 disekitar
jaringan bunga karang pada batang planlet kentang pada
perbesaran 750X
52
34. Mikrograf elektron payar koloni isolat G062 disekitar jaringan
bunga karang dalam batang planlet kentang pada perbesaran
10000X
52
35. Pohon filogenetik M. endophyticus G053 dan beberapa bakteri
yang berkerabat dekat
53
36. Pohon filogenetik Paracoccus halophilus G062 dan beberapa
bakteri yang berkerabat dekat
54
37. Produk PCR gen senyawa antifungi dari Paracoccus
halophilus G062
55
38. Aktivitas kitinolitik M. endophyticus G053 (A) dan pelarutan
fosfat isolat oleh P. halophilus G062 (B)
56
39. Produksi VOCs oleh M. endophyticus G053 yang berpengaruh
terhadap R.solanacearum
57
40. Hasil pewarnaan Gram dan morfologi koloni M. endophyticus
G053 dan P. halophilus G062 yang tumbuh pada media TSA
62
41. Foto mikrograf elektron payar M. endophyticus G053 (A) dan
P. halophilus G062 (B) pada perbesaran 10000X
63
42. Pengaruh paparan VOCs isolat bakteri endofit G053 terhadap
munculnya gejala layu bakteri pada planlet
66
43. Struktur molekul heksadekan (A) dan metil eugenol (B)
67
44. Model hipotetik induksi resistensi sistemik hibrid tanaman
kentang oleh M. endophyticus G053
70
45. Produksi etilen dan kaitannya dengan ISR (Pieterse et al.
2001)
71
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang (Solanum tuberosum Linn.) merupakan bahan makanan pokok di
dunia setelah beras, gandum, dan jagung. Kentang juga merupakan salah satu
komoditas hortikultura yang memiliki harga yang cukup tinggi dalam
perdagangan domestik maupun internasional. Kebutuhan kentang nasional terus
meningkat seiring dengan peningkatan populasi dan pendapatan penduduk serta
industri pengolahan makanan. Dalam rangka memenuhi kebutuhan kentang
nasional, pemerintah
menjadikan kentang sebagai salah satu prioritas
pengembangan komoditas hortikultura nasional. Upaya peningkatan produksi
kentang di Indonesia menghadapi berbagai kendala diantaranya serangan hama
penyakit serta kualitas bibit kentang yang rendah. Layu bakteri merupakan
penyakit penting pada budidaya kentang. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri
patogen Ralstonia solanacearum. Bakteri ini merupakan bakteri fitopatogen
paling merusak di seluruh dunia karena keragamannya yang sangat tinggi terkait
dengan asal geografis dan inangnya (Genin 2010). Survey yang dilakukan
terhadap 458 anggota komunitas internasional bacterial pathologist bekerjasama
dengan Jurnal Molecular Plant Pathology menempatkan R. solanacearum pada
peringkat kedua setelah P. syringae untuk kategori bakteri fitopatogen yang
penting secara ilmiah dan ekonomi (Mansfield et al. 2012).
Kehilangan hasil yang disebabkan oleh penyakit layu bakteri di wilayah
Sumatera, Jawa, Bali, Lombok, dan Sulawesi berkisar 15%-95% (Machmud
2005). Survei dan inventarisasi patogen tular-tanah di lahan pertanaman kentang
di Kabupaten purbalingga yang dilakukan pada tahun 2008-2009 menunjukkan
persentase populasi R. solanacearum mencapai 71.6% dan menempati peringkat
pertama dari 7 spesies mikroba fitopatogen tular-tanah (R. solanacearum,
Fusarium oxysporum, F. solani, Curvularia sp. Phytophtora infestans,
Helminthosporium purpureum, Pseudomonas berpendar) yang ditemukan
(Soesanto et al. 2011). Pada umumnya petani kentang mengaplikasikan pestisida
sintetik untuk melindungi tanamannya dari serangan penyakit. Namun aplikasi
pestisida sintetik secara tidak rasional dan berlebihan dalam jangka panjang
menimbulkan masalah serius bagi lingkungan dan meningkatkan residu dalam
umbi kentang.
Bibit yang bebas patogen, tahan penyakit, dan memiliki produktivitas yang
tinggi merupakan kriteria untuk bibit kentang berkualitas tinggi. Produksi bibit
kentang yang berkualitas tinggi dalam skala besar dilakukan dengan teknologi
perbanyakan in vitro (kultur jaringan). Perbanyakan secara in vitro dilakukan pada
kondisi yang steril dan terkontrol. Sebagai konsekuensinya, bibit tanaman yang
dihasilkan banyak kehilangan mikroorganisme berguna yang turut berperan dalam
pertumbuhan dan ketahanan tanaman terhadap patogen. Inokulasi dini bakteri
endofit akan meningkatkan ketahanan bibit tanaman hasil kultur in vitro terhadap
cekaman biotik dan abiotik. Selain itu, kemampuan bakteri endofit untuk hidup
dan berkembang di dalam jaringan tumbuhan dapat melindungi tanaman inang
dari kolonisasi dan dominansi fitopatogen yang berhasil masuk ke dalam jaringan
tanaman.
2
Berbagai hasil penelitian di luar negeri yang berkaitan dengan eksplorasi
dan eksperimen aplikasi bakteri endofit sebagai agensia biokontrol fitopatogen
pada bibit dan tanaman telah banyak dilaporkan (Andreotte et al. 2010; Hoon et
al. 2007). Namun demikian, studi tentang aplikasi bakteri endofit pada planlet
dan pengaruhnya terhadap ketahanan bibit kentang terhadap penyakit belum
pernah dilaporkan di Indonesia. Oleh karena itu, eksplorasi karakterisasi, dan
percobaan aplikasi bakteri endofit dari Indonesia sangat penting untuk dilakukan,
karena sebagai negara tropis Indonesia memiliki kondisi dan iklim yang berbeda.
Tujuan
Secara umum penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang
terhadap penyakit layu bakteri. Tujuan umum tersebut dicapai melalui beberapa
tahap penelitian dengan tujuan khusus untuk :
1. Mengisolasi dan menapis bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan
ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan
oleh Ralstonia solanacearum.
2. Mengamati kemampuan kolonisasi isolat bakteri endofit terpilih pada planlet
dan tanaman kentang.
3. Menguji kemampuan bakteri endofit terpilih dalam menghasilkan Volatile
Organic Compounds (VOCs) yang berperan dalam meningkatkan ketahanan
tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri
4. Mengkarakterisasi isolat bakteri endofit yang terpilih.
Manfaat Penelitian
1.
2.
3.
Memberikan kontribusi informasi ilmiah bagi penelitian dan pengembangan
agen hayati untuk penyakit layu bakteri yang baik dan unggul di Indonesia
Tersedianya kandidat agen hayati yang terkarakterisasi dengan baik serta
memiliki kemampuan tinggi dalam meningkatkan pertumbuhan serta
resistensi dan atau melindungi tanaman kentang dari penyakit layu bakteri.
Meeningkatan kualitas dan produktivitas bibit kentang.
Kerangka Pemikiran
R. solanacearum merupakan bakteri fitopatogen yang memiliki kisaran
inang yang sangat luas dan menjadi masalah di negara-negara subtropis maupun
tropis. Karakter R. solanacearum yang menjadikan jaringan xilem sebagai
sasaran aktivitas patogeniknya serta persistensinya yang tinggi ketika berada di
tanah menjadikannya sulit dikendalikan. Pemanfaatan bakteri endofit sebagai agen
hayati untuk meningkatkan ketahanan tanaman sekaligus mengendalikan
fitopatogen ini merupakan alternatif strategi yang baik dan tepat karena kedua
jenis bakteri ini memiliki relung ekologi yang sama tetapi memiliki karakter yang
berbeda.
Indonesia sebagai salah satu negara “Mega biodiversity” memiliki potensi
keragaman mikroba endofit yang sangat tinggi. Oleh karena itu kegiatan
eksplorasi untuk mendapatkan bakteri endofit jenis baru atau yang memiliki
karakteristik baru seperti penghasil VOCs serta pengkajian potensinya untuk
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit seperti layu bakteri perlu
3
dilakukan. Isolasi bakteri endofit, penapisan, interaksi isolat terpilih dengan
tanaman inang dan Ralstonia solanacearum, kemampuan kolonisasi, serta
karakter-karakter isolat terpilih perlu dikaji secara seksama untuk mendapatkan
kandidat agen hayati yang efektif, unggul, dan aman untuk meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap penyakit ini.
Novelty
Hasil penelusuran yang telah dilakukan menunjukkan bahwa sampai saat ini
belum ada laporan dari dalam atau luar negeri tentang kajian pemanfaatan bakteri
endofit yang menghasilkan Volatile Organic Compounds (VOCs) untuk
meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum. Pemanfaatan bakteri penghasil VOCs sebagai
agen penginduksi ketahanan tanaman merupakan salah satu topik riset dalam
bidang mikrobiologi dan fitopatologi yang baru dalam kurun waktu 10 tahun
terakhir. Oleh karena itu penemuan jenis-jenis bakteri baru, mode of action baru,
atau dengan potensi menghasilkan senyawa-senyawa volatil dengan jenis atau
komposisi baru, berpotensi besar untuk dimanfaatkan dan dikembangkan sebagai
agen untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit.
Hipotesis
1.
2.
3.
Terdapat sejumlah bakteri endofit kentang yang efektif dalam meningkatkan
ketahanan dan melindungi bibit kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum.
Efektivitas bakteri endofit dalm meningkatkan ketahanan tanaman kentang
terhadap R. solanacearum melibatkan berbagai senyawa bioaktif antara lain
Volatile Organic Compounds (VOCs).
Isolat bakteri endofit yang diperoleh mampu mengkolonisasi jaringan bibit
tanaman kentang untuk melindunginya dari serangan penyakit layu bakteri.
Kerangka Penelitian
Berdasarkan tujuan dan hipotesis penelitian yang telah dipaparkan
sebelumnya, dirancang suatu penelitian dengan tahapan-tahapan sebagai berikut
(Gambar 1) :
1.
Isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
2.
Penapisan isolat bakteri endofit yang mampu meningkatkan ketahanan
tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri
3.
Telaah respon fisiologis inang yang berkaitan dengan ketahanan
4.
Uji kemampuan kolonisasi bakteri endofit kentang terpilih
5.
Karakterisasi isolat bakteri endofit kentang terpilih
4
Gambar 1 Diagram alir kegiatan penelitian yang dilakukan
5
TINJAUAN PUSTAKA
Ralstonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri
R. solanacearum adalah bakteri Gram negatif yang semula dikenal sebagai
Pseudomonas solanacearum. Bakteri ini termasuk dalam kelompok beta
Proteobacteria (Sequira,1992). Ralstonia solanacearum merupakan patogen
penting pada tanaman kentang. Bakteri ini menyerang akar tanaman melalui luka
yang diantaranya disebabkan oleh munculnya akar lateral. Di dalam tanaman
inang yang rentan, bakteri ini berkembang biak dengan cepat di jaringan korteks
untuk selanjutnya menyerang bagian xylem. Dalam beberapa jam, terjadi
kolonisasi R. solacearum secara agresif di tabung xylem, lalu melalui sistem
jaringan pembuluh menyebar ke bagian tajuk dan batang mengikuti aliran
transpirasi dan akhirnya menyebabkan kelayuan yang mematikan. Gejala penyakit
layu bakteri meliputi kekuningan dan layu, diikuti dengan nekrosis dan kematian
tanaman (Vasse et al. 1995; Tan-Kersten et al. 2001).
R. solacearum adalah salah satu patogen tanaman yang sulit dikendalikan
karena bakteri ini memiliki kisaran inang yang luas. Lebih dari 200 famili
tumbuhan telah diketahui sebagai inang R. solacearum (Hayward, 1990). Di
daerah penanaman kentang di Pangalengan Jawa Barat telah diketahui lebih dari
70 gulma yang menjadi inang R. solacearum (Gunawan, 2006). Selain itu, bakteri
ini memiliki persistensi yang tinggi di dalam tanah walaupun tanpa tanaman inang
(Jackson dan Gonzales, 1979).
Genom R. solanacearum strain tropis GMI1000 terdiri dari 1 kromosom
sirkuler berukuran 3.7 Mb dan 1 megaplasmid berukuran 2.1 Mb. Megaplasmid
mengandung gen-gen yang berperan penting untuk kebugaran dan kemampuan
adaptasi bakteri ini pada berbagai kondisi serta semua gen hrp yang diperlukan
dalam proses kolonisasi relung ekologi spesifik serta patogenesis. Analisis sekuen
genom menunjukkan keberadaan struktur mozaik yang membuktikan adanya gengen yang diperoleh dari transfer gen secara horizontal. Ada 10 gen yang diduga
terlibat dalam detoksifikasi ROS, 6 gen haemolysin-like, beberapa gen peptide
atau polyketide synthase, gen toxin syringomycin synthase, gen pengkode protein
pelekat AttM dan AttZ, serta puluhan gen yang terkait dengan biogenesis dan
struktur berbagai pili. Tingginya jumlah dan variasi gen pengkode pili serta faktor
pelekat lainnya sangat mendukung kemampuan adaptasi yang tinggi dari bakteri
ini (Salanoubat et al. 2002). Berdasarkan analisis genom, diperkirakan patogen
ini mengekresikan ratusan protein yang berperan sebagai efektor dalam proses
patogenisitasnya terhadap inang (Poueymiro dan Genin 2009).
Bakteri Endofit
Deskripsi awal tentang mikroorganisme nonpatogenik dalam jaringan akar
tanaman pertama kali dilaporkan oleh Perotti pada 1926 dan berikutnya Hennig
dan Villforth pada tahun 1940 melaporkan keberadaan bakteri di dalam 28 jenis
daun, batang, dan akar tanaman sehat. Namun penelitian tentang bakteri endofit
pada berbagai tanaman mulai banyak dilakukan sejak Hollis dari Universitas
Nebraska USA melaporkan keberadaan bakteri endofit pada tanaman kentang
(Mano dan Morisaki 2008). Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang
dapat diisolasi dari dalam jaringan tanaman atau dari jaringan yang telah
6
disterilisasi permukaannya serta tidak membahayakan tanaman (Hallmann et al.
1997).
Dewasa ini, perkembangan bidang mikrobiologi dan bioteknologi telah
membuktikan bahwa keberadaan bakteri endofit berperan penting bagi
pertumbuhan dan ketahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik dan abiotik.
Beberapa bakteri endofit diketahui dapat berperan sebagai penambat nitrogen,
penghasil fitohormon, biokontrol patogen, serta penginduksi ketahanan tumbuhan
terhadap cekaman biotik dan abiotik (Andreotte et al. 2010, Mano dan Morisaki
2008). Penemuan bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman
gramineae pada tahun 1980 telah memicu berbagai penelitian tentang aplikasi
bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman-tanaman tidak
berbintil dari golongan serealia diantaranya padi.
Bakteri endofit juga terbukti berperan dalam meningkatkan pasokan Fe
bagi tanaman inang. Percobaan inplanta menggunakan bakteri endofit
Streptomyces sp. GMKU 3100 dan mutan gen desD-like (penyandi enzim kunci
pada akhir lintasan biosintesis siderofor) membuktikan bahwa tanaman padi dan
kacang hijau yang diinokulasi Streptomyces sp. GMKU 3100 tipe liar memiliki
biomasa tanaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan dengan tanaman yang
diinokulasi dengan Streptomyces sp. GMKU 3100 mutan (Siriwan et al. 2012).
Sebelumnya, Dimkpa et al. (2009) juga telah mempublikasikan hasil
penelitiannya yang membuktikan bahwa pemberian supernatan bebas sel
Streptomyces sp. tipe liar pada tanaman kacang tunggak (cowpea) dapat
meningkatkan penyerapan Fe, kadar klorofil, dan menghindari efek peroksidasi
lemak pada daun walaupun ditanam pada media tanam yang mengandung Al, Cu,
Mn, Ni dan U dalam konsentrasi cukup tinggi. Pemberian siderophore tersebut
juga menurunkan pembentukan radikal bebas sehingga melindungi auksin yang
diproduksi mikroba dari degradasi dan pada akhirnya dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman. Uji penyerapan kompleks Fe-pyoverdin menggunakan
tanaman kacang hijau juga membuktikan bahwa tanaman mampu menyerap
komplek tersebut (Vansuyt et al. 2007). Percobaan menggunakan tanaman
tembakau transgenik over ekspresi ferritin menunjukkan bahwa kadar Fe pada
tanaman transgenik lebih tinggi dibandingkan tanaman non-transgeniknya (Robin
et al. 2006). Hasil-hasil penelitian tersebut secara tidak langsung membuktikan
bahwa selain meningkatkan penyerapan Fe, ekspresi siderofor di dalam jaringan
tanaman juga tidak berbahaya bagi tanaman.
Kemampuan bakteri endofit dalam melarutkan fosfat diduga juga berperan
dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Selain meningkatkan ketersedian
nutrisi seperti Nitrogen Fe, dan Fosfat untuk tumbuhan, berbagai senyawa bioaktif
seperti fitohormon dan vitamin yang diproduksi oleh beberapa bakteri endofit juga
berguna dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman inangnya (Ryan et al. 2008;
Tsavkevlova et al. 2006; Rosenblueth dan Romero 2006).
Peran Bakteri Endofit dalam Meningkatkan Ketahanan Tanaman
Tumbuhan memiliki sistem imunitas basal dan respon pertahanan berlapis
yang dapat di picu secara sistematik untuk menurunkan tingkat kejadian dan
keparahan penyakit. Berdasarkan agen penginduksinya, sistem resistensi pada
tumbuhan dapat dibedakan atas Systemic Acquired Resistance (SAR) dan Induced
Systemic Resistance (ISR). Infeksi patogen akan mengaktifkan sistem ketahanan
7
tumbuhan yang akan melindunginya dari berbagai mikroorganisme (broad
spectrum) untuk jangka panjang. Ketahanan tumbuhan yang timbul akibat infeksi
patogen ini dikenal sebagai Systemic Acquired Resistance (SAR) (Francis et al.
2010). Lintasan SAR bersifat salicylic acid (SA) dependent (Choudhary dan Johri
2009; Kloepper dan Ryu 2006) (Gambar 5). Sebagai respon terhadap patogen,
tumbuhan akan memproduksi reactive oxygen species (ROS), protein-protein
terkait patogenesis (PR- proteins), penebalan dinding-dinding sel, serta produksi
fitoaleksin. Fitoaleksin adalah metabolit sekunder berberat molekul rendah yang
memiliki aktivitas antimikroba. Kelompok senyawa ini merupakan salah satu
marka untuk ketahanan tumbuhan terhadap penyakit. Berbagai fitoaleksin telah
berhasil diisolasi dan didentifikasi dari berbagai tumbuhan, namun sampai saat ini
mekanisme dan lintasan biosintesisnya belum diketahui dengan pasti. Capsidiol
dan scopoletin adalah senyawa fitoaleksin utama yang dihasilkan oleh tumbuhan
Solanaceae. (Ahuja et al. 2011).
Berbeda dengan SAR yang diaktifkan oleh patogen, ISR dapat diaktifkan
diantaranya oleh kolonisasi bakteri kelompok Plant Growth Promoting (PGP)
(Francis et al. 2010). Sebagian besar laporan penelitian menunjukkan bahwa ISR
diinduksi oleh strain-strain bakteri akar yang hidup bebas. Tetapi akhir-akhir ini
berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri endofit juga dapat
merangsang Induced Systemic Resistance (ISR) sebagaimana kelompok bakteri
PGP (Jimtha et al. 2014; Choudhary dan Johri 2009; Ryan et al. 2008; Compant et
al. 2005). Berbeda dengan SAR yang bersifat salicylic acid (SA) dependent,
lintasan ISR bersifat salicylic ac
VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS (VOCs) UNTUK
MENINGKATKAN KETAHANAN TANAMAN
KENTANG TERHADAP PENYAKIT LAYU BAKTERI
ALINA AKHDIYA
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ”Karaterisasi Bakteri Endofit
Penghasil Volatile Organic Compounds (VOCs) untuk Meningkatkan Ketahanan
Tanaman Kentang terhadap Penyakit Layu Bakteri” adalah karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, 17 Juli 2014
Alina Akhdiya
NIM: G361090021
RINGKASAN
ALINA AKHDIYA. Karaterisasi Bakteri Endofit Penghasil Volatile Organic
Compounds (VOCs) untuk Meningkatkan Ketahanan Tanaman Kentang terhadap
Penyakit Layu Bakteri. Dibawah bimbingan ARIS TRIWAHYUDI, ABDUL
MUNIF, dan LATIFAH K DARUSMAN.
Kebutuhan kentang nasional terus meningkat seiring dengan peningkatan
populasi dan pendapatan penduduk serta industri pengolahan makanan. Namun
upaya peningkatan produksi kentang di Indonesia menghadapi berbagai kendala
diantaranya serangan hama penyakit serta kualitas bibit kentang yang rendah.
Ralstonia solanacearum adalah patogen penyebab penyakit layu bakteri pada
tanaman kentang. Pada varietas-varietas yang rentan, tingkat kehilangan hasil
yang ditimbulkan oleh penyakit ini dapat mencapai 100%.
Produksi bibit kentang yang berkualitas tinggi dalam skala besar dapat
dilakukan dengan teknologi perbanyakan in vitro (kultur jaringan). Perbanyakan
secara in vitro dilakukan pada kondisi yang steril dan terkontrol. Sebagai
konsekuensinya, bibit tanaman yang dihasilkan banyak kehilangan
mikroorganisme berguna yang turut berperan dalam ketahanan tanaman terhadap
patogen. Inokulasi dini bakteri endofit merupakan saah satu alternatif yang baik
untuk melindungi dan meningkatkan ketahanan bibit tanaman hasil kultur invitro
terhadap penyakit layu bakteri. Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mengisolasi
dan menapis bakteri endofit yang mampu meningkatkan ketahanan bibit kentang
terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum, (2)
mengkarakterisasi isolat bakteri endofit terpilih, dan (3) menelaah kemampuan
kolonisasi isolat bakteri endofit terpilih pada planlet kentang.
Bakteri endofit kentang diisolasi dari dua varietas tanaman kentang
(Granola dan Atlantic) yang diambil dari Pasir Wangi, Garut dan Kebun
Percobaan Balai Penelitian Tanaman Sayuran di Lembang. Penapisan isolat
dilakukan berdasarkan pengujian-pengujian berikut : uji aktivitas hemolitik, uji
hipersensitif respon (HR) pada daun tembakau, uji patogenisitas terhadap planlet
kentang, serta uji peningkatan ketahanan tanaman kentang yang ditanam pada
kondisi tidak steril dan steril.
Sebanyak 214 bakteri endofit berhasil diisolasi dari kedua varietas tanaman
kentang tersebut. Diantara isolat-isolat tersebut, 168 bersifat non-hemolitik dan
tidak menimbulkan reaksi HR pada daun tembakau. Dari 168 isolat, 119
diantaranya non-patogenik terhadap planlet kentang. Empat isolat yaitu G053,
G062, G0196, dan L-12 mampu menurunkan DI layu bakteri dan meningkatkan
pertumbuhan tanaman kentang pada uji ketahanan yang dilakukan pada kondisi
tidak steril. Penapisan berikutnya menunjukkan hanya 2 isolat bakteri endofit
yaitu G053 dan G062 yang secara nyata mampu meningkatkan ketahanan dan
pertumbuhan tanaman kentang. Kedua isolat tersebut diisolasi dari batang
tanaman kentang varietas Atlantic yang diambil dari Garut.
Isolat G053 merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus dengan
diameter sel 0.9-1.4 µm. Koloni G053 berbentuk bulat cembung dengan warna
kuning pucat. Isolat G062 adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang dengan
ukuran sel 0.59-0,89 µm x 1.85-3.3 µm. Koloni G062 berbentuk bulat dengan
warna krem sampai kecoklatan. Berdasarkan sekuen 16S rDNA-nya kedua isolat
tersebut teridentifikasi berturut-turut sebagai M. endophyticus (98%) dan
Paracoccus halophylus (98%). Kedua bakteri endofit tersebut mampu
menghasilkan senyawa serupa fitohormon dan siderofor, serta menambat
nitrogen. Kemampuan fiksasi nitrogen kedua bakteri endofit tersebut dapat
meningkatkan ketersediaan nitrogen tanaman inang, sehingga tanaman inang
tumbuh lebih baik dari pada tanaman kontrol yang tidak diperkaya dengan bakteri
endofit tersebut. M. endophyticus G053 juga mengemisikan berbagai senyawa
organik volatil (VOCs) dan mengekskresikan kitinase, sedangkan P. halophylus
G062 juga mampu menghasilkan enzim pelarut fosfat.
Untuk menelaah perubahan fisiologis tumbuhan inang terkait respon induksi
resistensi oleh kedua bakteri endofit terpilih terhadap infeksi R. solanacearum,
dilakukan pengukuran kadar protein daun dan aktivitas enzim (peroksidase,
polifenol oksidase atau PPO, dan askorbat peroksidase atau APX) terhadap
tanaman yang diperkaya dengan bakteri endofit tersebut . Duapuluh empat jam
setelah inokulasi R. solanacearum, kadar protein, aktivitas polifenol oksidase
(PPO), askorbat peroksidase (APX), dan peroksidase tanaman G053 meningkat
lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol dan G062. Peningkatan kadar
protein total, aktivitas PPO, APX, dan peroksidase tanaman yang diperkaya isolat
G053 berturut-turut mencapai 4.6%, 2075%, 111%, dan 42%, sedangkan pada
tanaman G062 hanya meningkat aktivitas enzim peroksidase (126%) dan kadar
protein totalnya (0.09%). Telaah lebih lanjut menunjukkan bahwa setelah infeksi
R. solanacearum, emisi etilen oleh tanaman G053 lebih tinggi dibandingkan
dengan tanaman kontrol. Kandungan lignin tanaman G053 yang diinfeksi R.
solanacearum juga meningkat 23.5%, sebaliknya lignin tanaman kontrol turun
26.7%.
VOCs yang diemisikan M. endophyticus G053 merupakan campuran dari
sedikitnya 16 senyawa volatil. Metil eugenol (ME) merupakan komponen utama
VOCs M. endophyticus G053. Kompleks VOCs tersebut juga mengandung
heksadekan dalam konsentrasi yang lebih rendah. Paparan VOCs M. endophyticus
G053 terhadap planlet yang diinfeksi R. solanacearum mampu mereduksi nilai DI
layu bakteri sebesar 46.7%. Hal ini diduga disebabkan oleh komponen
heksadekan dalam VOCs tersebut. Heksadekan merupakan kandidat senyawa
sinyal baru untuk menginduksi ekspresi protein PR1 yang berperan dalam
mekanisme ketahanan tumbuhan melalui lintasan Systemic Acquired Resistance
(SAR). Paparan kompleks VOCs dan ME juga terbukti dapat menekan produksi
EPS bakteri patogen ini. Perbedaan EPS yang diproduksi oleh kultur R.
solanacearum A dan B yang dipapar dan tidak dipapar VOCs berturut-turut
mencapai 34% dan 155%. Selisih kadar EPS tersebut hanya mencapai 4.7% dan
75% berturut-turut untuk R. solanacearum galur A dan B ketika kultur patogen ini
dipapar dengan ME. Pengamatan kemampuan kolonisasi M. endophyticus G053
dan Paracoccus halophylus G062 yang dilakukan dengan teknik reisolasi dan
pengamatan mikroskopis menggunakan scanning electron microscope
menunjukkan bahwa kedua bakteri endofit tersebut memiliki kemampuan
kolonisasi dan persistensi yang tinggi pada planlet dan tanaman kentang.
Berdasarkan karakter-karakter yang dimiliki dan hasil uji ketahanan
tanaman yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa bakteri endofit M.
endophyticus G053 mampu mengaktifkan SAR dan ISR tanaman kentang secara
paralel. Akumulasi efek aktivasi kedua lintasan resistensi dan kemampuan
kolonisasi serta persistensinya yang tinggi menghasilkan peningkatan resistensi
dan perlindungan yang kuat pada tanaman kentang terhadap penyakit. Sedangkan
P. halophylus G062 meningkatkan ketahanan tanaman kentang melalui aktivasi
ISR. Kedua bakteri endofit tersebut sangat potensial untuk dikembangkan
menjadi agen hayati yang unggul untuk ketahanan tanaman kentang terhadap
penyakit layu bakteri dan meningkatkan pertumbuhannya.
Kata kunci : Bakteri endofit, Micrococcus endophyticus, Paracoccus halophilus,
layu bakteri, induksi ketahanan, Volatil Organic Compouns (VOCs).
SUMMARY
ALINA AKHDIYA. Characterization of Endophytic Bacteria Producing Volatile
Organic Compounds (VOCs) to Enhance Potato Plant Resisantance Against
Bacterial Wilt Disease. Under supervision of ARIS TRIWAHYUDI, ABDUL
MUNIF, dan LATIFAH K DARUSMAN.
National potato demand is increasing due to growth of population,
increasing of public income and food processing industries. However in the
efforts to increase potato production in Indonesia, it faces many obstacles
including pests, diseases and low quality of the potato seedling. Ralstonia
solanacearum is important pathogens for potato plant. Yield loss caused by the
disease could reach up to 100% on the susceptible cultivars.
Production of high-quality potatoes seedling on a large scale could done
by in vitro propagation (tissue culture). In vitro propagation was carried out in
sterile and controlled conditions. As a consequence, the seedlings are lost many
useful microorganisms that play an important role in plant growth and resistance
against pathogens. Early inoculation of bacterial endophytes is one of good
alternative way to protect and increase resistance of seedling produced by tissue
culture against bacterial wilt.
This research was conducted to (1) isolate and screen the endophytic
bacteria that can increase the resisitance of potato plant (G0) against Ralstonia
Solanacearum, (2) identify the bacterial compounds indicating had an important
role in increasing of plant resistance mechanism, and (3) observe the colonization
ability of selected endophytic bacteria in potato plantlets. The endophytic bacteria
were isolated from 2 cultivars (Granola and Atlantic) from Pasir Wangi, Garut
and the research station of the Research Center of Horticultural Crop (BALITSA)
Lembang, Bandung. Screening of the isolates was based on haemolytic test,
hypersensitive response (HR) on tobacco leaves, pathogenecity against potato
plantlets test, and ability of the isolates to induce potato plant resistant on unsterile
and sterile conditions.
As many as 214 endophytic bacterial isolates were successfully isolated.
Among the isolates, 168 isolates were non-haemolytic and did not cause HR
reaction on tobacco leaves. A hundred and nineteen isolates of them were nonpathogenic against potato plantlets. Four isolates i.e. G062, G0196, dan L-12
isolates showed their ability to decrease bacterial wilt DI and to promote potato
plant growth on the plant resistance test conducting on unsterile condition. Further
screening showed that only 2 endophytic isolates i.e G053 and G062 could
enhance the plants resistance against bacterial wilt and promote plant growth
significantly. Both isolates were isolated from the stem of potato plants cv.
Atlantic which were taken from Garut.
G053 isolate was Gram positive bacterium, coccus in shape, and 0.9-1.4
µm in diameter. Its morphology of colony was round, convex, and pale yellow in
color. However G062 isolate was Gram negative bacterium with short rod or rod
cell in shape and 0.59-0,89 µm x 1.85-3.3 µm in size. Its morphology of colony
was round with cream to light brown in color. Based on 16S rDNA sequences,
G053 isolate was closely related to Micrococcus endophyticus YIM 56238 (98%),
while G062 isolate was closely related to P. halophylus HN-182 (98%). Both
isolates could produce phytohormone like compounds and siderophore, and fix
nitrogen. Nitrogen fixation ability of both endophytic bacteria could provide
nitrogen for their host plants, so the plants could grow better than the control
plants that were not enriched with the endophytes. Additionally, M. endophyticus
G053 emitted volatile organic compounds (VOCs) and excreted chitinase, while
P. halophylus G062 produced phosphate solubilizing enzyme.
To study physiological change of the host plants due to resistant induction
response by the both of selected endophytic bacteria against R. Solanacearum
infection, analysis of protein content and enzyme activity (peroxydase,
polyphenol oxydase and ascorbate oxydase) were conducted to the endophytic
bacteria enriched and control plants. Twenty four hours after R. solanacearum
infection, the leaf protein content, polyphenol oxidase (PPO) activity, ascorbic
peroxidase (APX), and peroxidase activity of the G053 enriched plants were
increased higher than that of the control and G062 enriched plants. Increasing of
the total protein content, and activity of PPO, APX, and peroxidase of G053
plants were 4.6%, 2075%, 111%, and 42% respectively. On the othe hand, the
G062 enriched plants were olny increased for the protein content (0.09%) and
peroxidase activity (126%). Further studies showed that the G053 plants emitted
higher level of ethylene than that of the control plants after infected with the
pathogen. In addition, lignin content of G053 treated plants was increase by
23.5%, but it was decrease by 26.7% on the control plants.
VOCs emitted by M. endophyticus G053 were mixed of at least 16 volatile
compounds. Methyl eugenol (ME) was primary VOCs of M. endophyticus G053.
The VOCs also contained hexadecane in lower concentration. VOCs exposured to
the plantlet infected by R. solanacearum could reduce DI of bacterial wilt by
46.7%. It was presumably caused by hexadecan component in the VOCs.
Hexadecan was a new signaling compound candidate to induce gene expression of
PR1 protein that involved in Systemic Acquired Resistance (SAR) pathway.
Additionally, VOCs and ME exposure could reduce EPS production by the
pathogen. The difference between EPS production by R. solanacearum strains A
and B that were exposed and unexposed to the VOCs were 34% and 155%
subsequently. While there were only 4.7% dan 75% for the strain A dan B
subsequently when the pathogen cultures exposed to ME. Observation of M.
endophyticus G053 colonization ability conducted by reisolation technique and
scanning electron microscope showed that M. endophyticus G053 and P.
halophylus G062 were endophytic bacteria having high colonization ability and
persistency in potato plantlets and plants.
Based on the characters and plant resistance test results, it was concluded
that bacterial endophyte M. endophyticus G053 could activate SAR and ISR of the
potato plant pararely. Accumulation effect of both resistance pathways and its
high colonization and persistance ability resulted the strong enhancement and
protection against the disease. While resistance enhancement activated by P.
halophylus G062 was through the ISR pathways. Both of the endophytic bacteria
had a great potent to be developed as a great biological agent to enhance potato
plant resistance against bacterial wilt disease and to promote the plant growth.
Key words : Endophytic bacteria, Micrococcus endophyticus,Paracoccus
halophilus , bacterial wilt, induction of plant resistance, Volatil
Organic Compouns (VOCs)
© Hak cipta milik IPB, tahun 2014
Hak cipta dilindungi Undang-Undang. Dilarang mengutip sebagian atau
seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya.
Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan
pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang
mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam
bentuk apapun tanpa izin IPB.
KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL
VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS (VOCs) UNTUK
MENINGKATKAN KETAHANAN TANAMAN
KENTANG TERHADAP PENYAKIT LAYU BAKTERI
ALINA AKHDIYA
Disertasi sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Doktor
pada Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada ujian tertutup :
1.
Dr Giyanto, MSi. (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
IPB).
2.
Dr Rakhmat Sutarya, MS. (Balai Penelitian Tanaman Sayuran, Badan
Litbang Pertanian, Lembang).
Penguji pada ujian terbuka :
1.
Dr Yulin Lestari MS. (Departemen Biologi, FMIPA, IPB).
2.
Prof Dr Supriadi (Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat, Badan
Litbang Pertanian, Bogor)
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah penulis ucapkan atas rahmat, kasih sayang,
kekuatan, serta kesabaran yang telah dilimpahkan Allah SWT sehingga penulis
berhasil menyelesaikan disertasi yang berjudul “Karakterisasi Bakteri endofit
yang Efektif untuk Meningkatkan Ketahanan Tanaman Kentang terhadap
Penyakit Layu Bakteri” ini. Kentang merupakan komoditas pertanian introduksi
yang telah diterima dengan baik oleh masyarakat Indonesia sebagai salah satu
bahan pangan komplemen serta memiliki nilai ekonomi yang relatif tinggi.
Budidaya kentang yang sangat rentan terhadap serangan berbagai penyakit
mendorong petani untuk mengaplikasikan pestisida sintetik secara tidak rasional
untuk menyelamatkan tanamannya. Kecenderungan praktek budidaya kentang
yang tidak ramah lingkungan tersebut menjadi salah satu pertimbangan penulis
dalam untuk memilih topik penelitian ini.
Penelitian dan disertasi ini terwujud atas dukungan dan bantuan berbagai
pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak
tersebut :
1.
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi., Dr Abdul Munif, MSc. Agr. dan Prof Dr
Latifah K Darusman selaku pembimbing atas bimbingan dan arahan yang
diberikan selama penelitian dan penulisan disertasi.
2.
SEAMEO BIOTROP sebagai pengelola program PhD Research Grant atas
dana penelitian yang diberikan untuk pelaksanaan sebagian penelitian ini.
3.
Bpk. Rahmat dan Ajat (Gapoktan Multi Tani Jayagiri Desa Cipendawa,
Pasir Cina Cianjur) atas segala bantuan penggunaan fasilitas screen house
dan perawatan tanaman.
4.
Tira Nur Afiah SSi., Ari Fina Bintarti, MSi., Andri Ferbianto, SSi., Herni
Widiatuti SSi. (Laboratorium BrMC SEAMEO BIOTROP) dan rekan
peneliti serta teknisi di kelti Biak Sel dan Jaringan dan Biokimia BBBIOGEN atas bantuannya selama pelaksanaan penelitian.
5.
Pegawai Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB,
atas segala bantuan, fasilitas dan penggunaan alat.
6.
Prof Dr Akira Yokota atas bimbingannya dalam melakukan analisa FAME
dan GC-content.
7.
Prof Dr Ika Mariska S atas masukan dan diskusinya tentang aspek fisiologi
tumbuhan dan Prof Dr Supriadi atas kesediaanya mengoreksi manuskrip
publikasi.
8.
Dr Giyanto, MSi. (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB)
dan Dr Rakhmat Sutarya (Balai Penelitian Tanaman Sayuran) atas
kesediannya sebagai penguji dan saran perbaikan yang diberikan pada ujian
tertutup.
9.
Dr Yulin Lestari dan Prof Dr Supriadi atas kesediannya sebagai penguji
dan saran perbaikan yang diberikan pada ujian terbuka.
10.
Suami dan anak-anakku, Ibu serta seluruh keluarga atas segala doa,
pengertian, dan dukungan tulus yang diberikan.
Penulis berharap hasil penelitian ini dapat menyumbangkan informasi
ilmiah yang berguna dalam bidang mikrobiologi dan pengelolaan hama dan
penyakit tanaman di Indonesia serta dapat dikembangkan menjadi teknologi
alternatif yang baik untuk meningkatkan produksi kentang melalui teknik
budidaya pertanian yang berkelanjutan dan ramah lingkungan.
Bogor, Juli 2014
Alina Akhdiya
DAFTAR ISI
HALAMAN PERNYATAAN .................................................................
RINGKASAN ...........................................................................................
SUMMARY .............................................................................................
HALAMAN HAK CIPTA ......................................................................
HALAMAN JUDUL ...............................................................................
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................
PRAKATA ..............................................................................................
DAFTAR ISI ...........................................................................................
DAFTAR TABEL ....................................................................................
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................
i
iii
vi
viii
x
xi
xiii
xv
xviii
xix
xxiii
PENDAHULUAN ....................................................................................
Latar Belakang ..................................................................................
Tujuan ...............................................................................................
Manfaat Penelitian ............................................................................
Kerangka Pemikiran .........................................................................
Novelty ..............................................................................................
Hipotesis ...........................................................................................
Kerangka Penelitian ..........................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................
Ralstonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri .............
Bakteri Endofit .................................................................................
Peran Bakteri Endofit dalam Meningkatkan Ketahanan Tanaman.
VOCs Sebagai Penginduksi Ketahanan Tanaman ............................
Aplikasi Bakteri Endofit untuk Meningkatkan Resistensi,
Pertumbuhan, dan Produktivitas Tanaman ..............................
5
5
5
6
10
BAHAN DAN METODE ..........................................................................
.
Prosedur Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit ............
Contoh tanaman .......................................................................
Optimasi sterilisasi permukaan akar ......................................
Sterilisasi permukaan batang dan daun ................................
Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman kentang ......
.
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap I ..........................
Bioesei Respon Hipersentif (HR) ...........................................
Uji hemolitik ...........................................................................
Uji patogenisitas isolat terhadap plantlet kentang ..................
Uji ketahanan tanaman Generasi 0 (G0) yang diperkaya
isolat bakteri endofit terhadap layu bakteri .......................
Pengukuran densitas sel bakteri ..............................................
13
13
13
13
15
15
16
17
18
18
11
18
19
.
Penapisan Bakteri Endofit Kentang Tahap II .................................
Evaluasi ketahanan tanaman G0 yang diperkaya isolat
bakteri endofit pada media steril ........................................
Evaluasi DI tanaman Generasi 1 (G1) pada media tidak steril
Analisis Respon Fisiologis Tumbuhan Terkait Ketahanan .....
a
Penentuan kandungan protein total................................
b
Pengukuran aktivitas enzim peroksidase .......................
c
Pengukuran aktivitas enzim polifenol oksidase ..............
d
Pengukuran aktivitas enzim askorbat peroksidase ..........
e
Pengukuran emisi etilen ..................................................
f
Penetapan kandungan lignin like compounds .................
Pengamatan Pertumbuhan Tanaman dan Produktivitas Umbi ..........
Uji Kolonisasi ....................................................................................
Pengamatan tampilan morfologi akar planlet yang diperkaya
dengan bakteri endofit ........................................................
Pengamatan secara mikroskopis ............................................
Reisolasi M. endophyticus G053 dari tanaman dan planlet .....
Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit Terpilih ...................................
Identifikasi dan karakterisasi molekuler ..................................
Karakterisasi fisiologis dan biokimia ......................................
a
Uji fisiologis dan biokimia umum ...................................
b
Uji aktivitas fiksasi nitrogen ...........................................
c
Uji kemampuan produksi plant growth hormone like
compounds .................................................................
d
Uji kemampuan produksi siderofor .................................
e
Analisa Fatty Acid Methyl Ester (FAME) ......................
f
Bioesei produksi VOCs dan aktivitas penghambatannya
terhadap kultur R. solanacearum ...............................
Pengamatan motilitas dan morfologi .......................................
Identifikasi Komponen VOCs dan Pengaruhnya terhadap
R. solanacearum dan Planlet Kentang ........................................
Trapping dan identifikasi komponen VOCs G053 .................
Uji pengaruh VOCs terhadap produksi EPS oleh
R.solanacearum ............................................................
Uji pengaruh VOCs terhadap munculnya gejala layu bakteri
pada planlet ........................................................................
Penyimpanan isolat ...........................................................................
19
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Optimasi Prosedur Sterilisasi Permukaan Akar ..............................
Isolasi bakteri Endofit .......................................................................
Isolat bakteri endofit terseleksi I .......................................................
Isolat bakteri endofit terseleksi II ....................................................
Profil Pertumbuhan Tanaman Kontrol dan Tanaman yang
Diperkaya dengan Isolat G053 dan Isolat G062 ..........................
30
30
31
35
38
19
20
20
20
20
21
21
21
21
22
22
22
22
22
23
24
25
25
25
26
26
27
27
28
28
28
28
29
29
44
Kolonisasi Bakteri Endofit G053 dan G062 pada Planlet dan
Tanaman Kentang ..........................................................................
Identitas dan Karakter Isolat Bakteri Endofit G053 dan G062 ........
Identitas dan Karakter molekuler ...........................................
Deskripsi karakter fisiologis dan biokimia ............................
Deskripsi karakter morfologi ...................................................
Identitas Komponen Senyawa VOCs M. endophyticus G053 ..........
Pengaruh VOCs Isolat G053 dalam Menekan Gejala Layu Bakteri
pada Planlet dan Produksi EPS ................................................
Peran M. endophyticus G053 dan P. halophilus G062 dalam Induksi
Resistensi Tanaman Kentang ......................................................
48
53
53
55
62
64
65
69
SIMPULAN ..............................................................................................
73
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................
75
LAMPIRAN .............................................................................................
85
RIWAYAT HIDUP ..................................................................................
91
DAFTAR TABEL
No
1.
2.
Halaman
n
Beberapa senyawa dan determinan bakteri penginduksi
ketahanan pada beberapa tumbuhan (Chodhary dan Johri 2009)
9
Komposisi campuran reaksi PCR untuk amplifikasi 16S rDNA
G053 dan G062
24
3.
Kondisi reaksi PCR amplifikasi 16S rDNA G053 dan G062
24
4.
Peningkatan emisi etilen dan kadar lignin tanaman G053dan
kontrol setelah infeksi R. solanacearum
42
5.
Densitas isolat G053 pada planlet dan tanaman kentang
50
6.
Karakter fisiologis dan biokimia M. endophyticus G053
56
7.
Aktivitas fiksasi nitrogen dan produksi
senyawa
mirip
fitohormon (IAA, Giberellin, zeatin, dan ABA like) oleh
M. endophyticus G053 dan aracoccus halophilus G062
57
Komposisi asam lemak sel M. endophyticus G053 YIM 56238,
K. rosea DSMZ 20447 dan K. erythromyxa ATCC 187
58
9.
Karakter fisiologis dan biokimia P..halophilus G052
60
10
Karakter P. halophilus G062, strain pembanding, serta beberapa
spesies terdekat
61
Komposisi VOCs M. endophyticus G053 yang tertangkap
dengan hexan
64
Nilai DI layu bakteri pada kelompok plantlet yang tidak dipapar
dan dipapar dengan VOCs dari M. endophyticus G053
65
Perbedaan kadar EPS kultur R. solanacearum yang dipapar
VOCs isolat G053 dan metil eugenol dengan yang tidak dipapar
volatil
68
8.
11.
12.
13.
DAFTAR GAMBAR
No.
Halamann
1. Diagram alir kegiatan penelitian yang dilakukan
4
2. Lintasan induksi resistensi tanaman oleh bakteri patogen
dan rhizobacteria (Vallad dan Goodman 2004)
7
3. Model induksi ISR dan SAR secara paralel (Saskia et al.
2000)
8
4. Diagram alir prosedur sterilisasi permukaan akar
14
5. Diagram alir isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
16
6. Diagram alir penapisan isolat bakteri endofit dan kajian
perubahan fisiologis inang
17
7. Diagram alir kegiatan karakterisasi isolat bakteri endofit
terpilih yang dilakukan dalam penelitian ini
23
8. Rata-rata jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA
yang berasal dari air bilasan terakhir empat prosedur sterilisasi
permukaan akar
31
9. Perbandingan densitas bakteri endofit tanaman kentang (G4)
varietas Granola dan Atlantic asal Garut berdasarkan jumlah
koloni yang terisolasi
32
10. Densitas bakteri endofit akar kentang berdasarkan hasil isolasi
yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA 20%,
dan NMS bebas Nitrogen
33
11. Densitas bakteri endofit batang kentang berdasarkan hasil
isolasi yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA
20%, dan NMS bebas Nitrogen
34
12. Densitas bakteri endofit daun kentang berdasarkan hasil
isolasi yang dilakukan menggunakan media TSA 20%, KBA
20%, dan NMS bebas Nitrogen
34
13. Tampilan koloni isolat bakteri endofit yang bersifat hemolitik
dan nonhemolitik pada medium agar darah
36
14. Reaksi jaringan daun tembakau pada 24 jam (A) dan 96 jam
(B) setelah diinfiltrasi dengan suspensi R. solanacearum
(kontrol positif) dan isolat bakteri endofit
36
15. Tampilan morfologi planlet yang diperkaya dengan bakteri
endofit
16.
Parameter pertumbuhan tanaman G0 yang diinokulasi dengan
empat isolat terpilih yang ditanam pada media tidak steril
37
38
17. Disease Insidence (DI) tanaman G0 kontrol dan yang
diperkaya dengan bakteri endofit G053 dan G062 yang
ditanam pada media tanam steril
39
18. Nilai Disease Insidence (DI), tinggi tanaman, berat umbi, dan
jumlah umbi tanaman G1 kontrol, G053, dan G062
39
19. Peningkatan kadar protein tanaman G0 pada 24 jam dan 48
jam setelah infeksi (jsi) R. solanacearum
40
20. Peningkatan aktivitas enzim APX peroksidase, peroksidase,
dan polifenol oksidase tanaman kentang (G0) 24 jam setelah
infeksi Ralstonia solanacearum
41
21. Lintasan biosintesis dan regulasi etilen pada tanaman
43
22. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat kering
tajuk tanaman kentang G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
44
23. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat kering
akar tanaman kentang G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
45
24. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap jumlah umbi
kentang pada tanaman G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
45
25. Pengaruh pengayaan bakteri endofit terhadap berat umbi
kentang dari tanaman G0 yang tidak diinfeksi dan diinfeksi
dengan R. solanacearum
46
26. Tampilan tanaman G0 yang diperkaya dengan isolat G053 dan
G062, serta kontrol yang ditanam pada media tanam yang
telah disteril
46
27. Tampilan tanaman G1 kontrol dan tanamana yang diperkaya
dengan isolat G053 dan G062, serta kontrol yang ditanam
pada media tidak steril
47
28. Nilai Disease Insidence (DI), tinggi tanaman, berat umbi, dan
jumlah umbi tanaman G1 kontrol, G053, dan G062
47
29. Tampilan akar planlet setelah diinokulasi dengan bakteri
endofit
49
30. Mikrograf elektron payar jaringan batang plantlet kontrol
pada perbesaran 1000X
50
31. Mikrograf elektron payar jaringan batang plantlet yang
diinokulasi isolat bakteri endofit G053 pada perbesaran
1000X
51
32. Mikrograf elektron payar jaringan xilem planlet yang
dikolonisasi oleh isolat G053 pada perbesaran 7500X
51
33. Mikrograf elektron payar kolonisasi isolat G062 disekitar
jaringan bunga karang pada batang planlet kentang pada
perbesaran 750X
52
34. Mikrograf elektron payar koloni isolat G062 disekitar jaringan
bunga karang dalam batang planlet kentang pada perbesaran
10000X
52
35. Pohon filogenetik M. endophyticus G053 dan beberapa bakteri
yang berkerabat dekat
53
36. Pohon filogenetik Paracoccus halophilus G062 dan beberapa
bakteri yang berkerabat dekat
54
37. Produk PCR gen senyawa antifungi dari Paracoccus
halophilus G062
55
38. Aktivitas kitinolitik M. endophyticus G053 (A) dan pelarutan
fosfat isolat oleh P. halophilus G062 (B)
56
39. Produksi VOCs oleh M. endophyticus G053 yang berpengaruh
terhadap R.solanacearum
57
40. Hasil pewarnaan Gram dan morfologi koloni M. endophyticus
G053 dan P. halophilus G062 yang tumbuh pada media TSA
62
41. Foto mikrograf elektron payar M. endophyticus G053 (A) dan
P. halophilus G062 (B) pada perbesaran 10000X
63
42. Pengaruh paparan VOCs isolat bakteri endofit G053 terhadap
munculnya gejala layu bakteri pada planlet
66
43. Struktur molekul heksadekan (A) dan metil eugenol (B)
67
44. Model hipotetik induksi resistensi sistemik hibrid tanaman
kentang oleh M. endophyticus G053
70
45. Produksi etilen dan kaitannya dengan ISR (Pieterse et al.
2001)
71
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang (Solanum tuberosum Linn.) merupakan bahan makanan pokok di
dunia setelah beras, gandum, dan jagung. Kentang juga merupakan salah satu
komoditas hortikultura yang memiliki harga yang cukup tinggi dalam
perdagangan domestik maupun internasional. Kebutuhan kentang nasional terus
meningkat seiring dengan peningkatan populasi dan pendapatan penduduk serta
industri pengolahan makanan. Dalam rangka memenuhi kebutuhan kentang
nasional, pemerintah
menjadikan kentang sebagai salah satu prioritas
pengembangan komoditas hortikultura nasional. Upaya peningkatan produksi
kentang di Indonesia menghadapi berbagai kendala diantaranya serangan hama
penyakit serta kualitas bibit kentang yang rendah. Layu bakteri merupakan
penyakit penting pada budidaya kentang. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri
patogen Ralstonia solanacearum. Bakteri ini merupakan bakteri fitopatogen
paling merusak di seluruh dunia karena keragamannya yang sangat tinggi terkait
dengan asal geografis dan inangnya (Genin 2010). Survey yang dilakukan
terhadap 458 anggota komunitas internasional bacterial pathologist bekerjasama
dengan Jurnal Molecular Plant Pathology menempatkan R. solanacearum pada
peringkat kedua setelah P. syringae untuk kategori bakteri fitopatogen yang
penting secara ilmiah dan ekonomi (Mansfield et al. 2012).
Kehilangan hasil yang disebabkan oleh penyakit layu bakteri di wilayah
Sumatera, Jawa, Bali, Lombok, dan Sulawesi berkisar 15%-95% (Machmud
2005). Survei dan inventarisasi patogen tular-tanah di lahan pertanaman kentang
di Kabupaten purbalingga yang dilakukan pada tahun 2008-2009 menunjukkan
persentase populasi R. solanacearum mencapai 71.6% dan menempati peringkat
pertama dari 7 spesies mikroba fitopatogen tular-tanah (R. solanacearum,
Fusarium oxysporum, F. solani, Curvularia sp. Phytophtora infestans,
Helminthosporium purpureum, Pseudomonas berpendar) yang ditemukan
(Soesanto et al. 2011). Pada umumnya petani kentang mengaplikasikan pestisida
sintetik untuk melindungi tanamannya dari serangan penyakit. Namun aplikasi
pestisida sintetik secara tidak rasional dan berlebihan dalam jangka panjang
menimbulkan masalah serius bagi lingkungan dan meningkatkan residu dalam
umbi kentang.
Bibit yang bebas patogen, tahan penyakit, dan memiliki produktivitas yang
tinggi merupakan kriteria untuk bibit kentang berkualitas tinggi. Produksi bibit
kentang yang berkualitas tinggi dalam skala besar dilakukan dengan teknologi
perbanyakan in vitro (kultur jaringan). Perbanyakan secara in vitro dilakukan pada
kondisi yang steril dan terkontrol. Sebagai konsekuensinya, bibit tanaman yang
dihasilkan banyak kehilangan mikroorganisme berguna yang turut berperan dalam
pertumbuhan dan ketahanan tanaman terhadap patogen. Inokulasi dini bakteri
endofit akan meningkatkan ketahanan bibit tanaman hasil kultur in vitro terhadap
cekaman biotik dan abiotik. Selain itu, kemampuan bakteri endofit untuk hidup
dan berkembang di dalam jaringan tumbuhan dapat melindungi tanaman inang
dari kolonisasi dan dominansi fitopatogen yang berhasil masuk ke dalam jaringan
tanaman.
2
Berbagai hasil penelitian di luar negeri yang berkaitan dengan eksplorasi
dan eksperimen aplikasi bakteri endofit sebagai agensia biokontrol fitopatogen
pada bibit dan tanaman telah banyak dilaporkan (Andreotte et al. 2010; Hoon et
al. 2007). Namun demikian, studi tentang aplikasi bakteri endofit pada planlet
dan pengaruhnya terhadap ketahanan bibit kentang terhadap penyakit belum
pernah dilaporkan di Indonesia. Oleh karena itu, eksplorasi karakterisasi, dan
percobaan aplikasi bakteri endofit dari Indonesia sangat penting untuk dilakukan,
karena sebagai negara tropis Indonesia memiliki kondisi dan iklim yang berbeda.
Tujuan
Secara umum penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang
terhadap penyakit layu bakteri. Tujuan umum tersebut dicapai melalui beberapa
tahap penelitian dengan tujuan khusus untuk :
1. Mengisolasi dan menapis bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan
ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan
oleh Ralstonia solanacearum.
2. Mengamati kemampuan kolonisasi isolat bakteri endofit terpilih pada planlet
dan tanaman kentang.
3. Menguji kemampuan bakteri endofit terpilih dalam menghasilkan Volatile
Organic Compounds (VOCs) yang berperan dalam meningkatkan ketahanan
tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri
4. Mengkarakterisasi isolat bakteri endofit yang terpilih.
Manfaat Penelitian
1.
2.
3.
Memberikan kontribusi informasi ilmiah bagi penelitian dan pengembangan
agen hayati untuk penyakit layu bakteri yang baik dan unggul di Indonesia
Tersedianya kandidat agen hayati yang terkarakterisasi dengan baik serta
memiliki kemampuan tinggi dalam meningkatkan pertumbuhan serta
resistensi dan atau melindungi tanaman kentang dari penyakit layu bakteri.
Meeningkatan kualitas dan produktivitas bibit kentang.
Kerangka Pemikiran
R. solanacearum merupakan bakteri fitopatogen yang memiliki kisaran
inang yang sangat luas dan menjadi masalah di negara-negara subtropis maupun
tropis. Karakter R. solanacearum yang menjadikan jaringan xilem sebagai
sasaran aktivitas patogeniknya serta persistensinya yang tinggi ketika berada di
tanah menjadikannya sulit dikendalikan. Pemanfaatan bakteri endofit sebagai agen
hayati untuk meningkatkan ketahanan tanaman sekaligus mengendalikan
fitopatogen ini merupakan alternatif strategi yang baik dan tepat karena kedua
jenis bakteri ini memiliki relung ekologi yang sama tetapi memiliki karakter yang
berbeda.
Indonesia sebagai salah satu negara “Mega biodiversity” memiliki potensi
keragaman mikroba endofit yang sangat tinggi. Oleh karena itu kegiatan
eksplorasi untuk mendapatkan bakteri endofit jenis baru atau yang memiliki
karakteristik baru seperti penghasil VOCs serta pengkajian potensinya untuk
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit seperti layu bakteri perlu
3
dilakukan. Isolasi bakteri endofit, penapisan, interaksi isolat terpilih dengan
tanaman inang dan Ralstonia solanacearum, kemampuan kolonisasi, serta
karakter-karakter isolat terpilih perlu dikaji secara seksama untuk mendapatkan
kandidat agen hayati yang efektif, unggul, dan aman untuk meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap penyakit ini.
Novelty
Hasil penelusuran yang telah dilakukan menunjukkan bahwa sampai saat ini
belum ada laporan dari dalam atau luar negeri tentang kajian pemanfaatan bakteri
endofit yang menghasilkan Volatile Organic Compounds (VOCs) untuk
meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum. Pemanfaatan bakteri penghasil VOCs sebagai
agen penginduksi ketahanan tanaman merupakan salah satu topik riset dalam
bidang mikrobiologi dan fitopatologi yang baru dalam kurun waktu 10 tahun
terakhir. Oleh karena itu penemuan jenis-jenis bakteri baru, mode of action baru,
atau dengan potensi menghasilkan senyawa-senyawa volatil dengan jenis atau
komposisi baru, berpotensi besar untuk dimanfaatkan dan dikembangkan sebagai
agen untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit.
Hipotesis
1.
2.
3.
Terdapat sejumlah bakteri endofit kentang yang efektif dalam meningkatkan
ketahanan dan melindungi bibit kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum.
Efektivitas bakteri endofit dalm meningkatkan ketahanan tanaman kentang
terhadap R. solanacearum melibatkan berbagai senyawa bioaktif antara lain
Volatile Organic Compounds (VOCs).
Isolat bakteri endofit yang diperoleh mampu mengkolonisasi jaringan bibit
tanaman kentang untuk melindunginya dari serangan penyakit layu bakteri.
Kerangka Penelitian
Berdasarkan tujuan dan hipotesis penelitian yang telah dipaparkan
sebelumnya, dirancang suatu penelitian dengan tahapan-tahapan sebagai berikut
(Gambar 1) :
1.
Isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
2.
Penapisan isolat bakteri endofit yang mampu meningkatkan ketahanan
tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri
3.
Telaah respon fisiologis inang yang berkaitan dengan ketahanan
4.
Uji kemampuan kolonisasi bakteri endofit kentang terpilih
5.
Karakterisasi isolat bakteri endofit kentang terpilih
4
Gambar 1 Diagram alir kegiatan penelitian yang dilakukan
5
TINJAUAN PUSTAKA
Ralstonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri
R. solanacearum adalah bakteri Gram negatif yang semula dikenal sebagai
Pseudomonas solanacearum. Bakteri ini termasuk dalam kelompok beta
Proteobacteria (Sequira,1992). Ralstonia solanacearum merupakan patogen
penting pada tanaman kentang. Bakteri ini menyerang akar tanaman melalui luka
yang diantaranya disebabkan oleh munculnya akar lateral. Di dalam tanaman
inang yang rentan, bakteri ini berkembang biak dengan cepat di jaringan korteks
untuk selanjutnya menyerang bagian xylem. Dalam beberapa jam, terjadi
kolonisasi R. solacearum secara agresif di tabung xylem, lalu melalui sistem
jaringan pembuluh menyebar ke bagian tajuk dan batang mengikuti aliran
transpirasi dan akhirnya menyebabkan kelayuan yang mematikan. Gejala penyakit
layu bakteri meliputi kekuningan dan layu, diikuti dengan nekrosis dan kematian
tanaman (Vasse et al. 1995; Tan-Kersten et al. 2001).
R. solacearum adalah salah satu patogen tanaman yang sulit dikendalikan
karena bakteri ini memiliki kisaran inang yang luas. Lebih dari 200 famili
tumbuhan telah diketahui sebagai inang R. solacearum (Hayward, 1990). Di
daerah penanaman kentang di Pangalengan Jawa Barat telah diketahui lebih dari
70 gulma yang menjadi inang R. solacearum (Gunawan, 2006). Selain itu, bakteri
ini memiliki persistensi yang tinggi di dalam tanah walaupun tanpa tanaman inang
(Jackson dan Gonzales, 1979).
Genom R. solanacearum strain tropis GMI1000 terdiri dari 1 kromosom
sirkuler berukuran 3.7 Mb dan 1 megaplasmid berukuran 2.1 Mb. Megaplasmid
mengandung gen-gen yang berperan penting untuk kebugaran dan kemampuan
adaptasi bakteri ini pada berbagai kondisi serta semua gen hrp yang diperlukan
dalam proses kolonisasi relung ekologi spesifik serta patogenesis. Analisis sekuen
genom menunjukkan keberadaan struktur mozaik yang membuktikan adanya gengen yang diperoleh dari transfer gen secara horizontal. Ada 10 gen yang diduga
terlibat dalam detoksifikasi ROS, 6 gen haemolysin-like, beberapa gen peptide
atau polyketide synthase, gen toxin syringomycin synthase, gen pengkode protein
pelekat AttM dan AttZ, serta puluhan gen yang terkait dengan biogenesis dan
struktur berbagai pili. Tingginya jumlah dan variasi gen pengkode pili serta faktor
pelekat lainnya sangat mendukung kemampuan adaptasi yang tinggi dari bakteri
ini (Salanoubat et al. 2002). Berdasarkan analisis genom, diperkirakan patogen
ini mengekresikan ratusan protein yang berperan sebagai efektor dalam proses
patogenisitasnya terhadap inang (Poueymiro dan Genin 2009).
Bakteri Endofit
Deskripsi awal tentang mikroorganisme nonpatogenik dalam jaringan akar
tanaman pertama kali dilaporkan oleh Perotti pada 1926 dan berikutnya Hennig
dan Villforth pada tahun 1940 melaporkan keberadaan bakteri di dalam 28 jenis
daun, batang, dan akar tanaman sehat. Namun penelitian tentang bakteri endofit
pada berbagai tanaman mulai banyak dilakukan sejak Hollis dari Universitas
Nebraska USA melaporkan keberadaan bakteri endofit pada tanaman kentang
(Mano dan Morisaki 2008). Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang
dapat diisolasi dari dalam jaringan tanaman atau dari jaringan yang telah
6
disterilisasi permukaannya serta tidak membahayakan tanaman (Hallmann et al.
1997).
Dewasa ini, perkembangan bidang mikrobiologi dan bioteknologi telah
membuktikan bahwa keberadaan bakteri endofit berperan penting bagi
pertumbuhan dan ketahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik dan abiotik.
Beberapa bakteri endofit diketahui dapat berperan sebagai penambat nitrogen,
penghasil fitohormon, biokontrol patogen, serta penginduksi ketahanan tumbuhan
terhadap cekaman biotik dan abiotik (Andreotte et al. 2010, Mano dan Morisaki
2008). Penemuan bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman
gramineae pada tahun 1980 telah memicu berbagai penelitian tentang aplikasi
bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman-tanaman tidak
berbintil dari golongan serealia diantaranya padi.
Bakteri endofit juga terbukti berperan dalam meningkatkan pasokan Fe
bagi tanaman inang. Percobaan inplanta menggunakan bakteri endofit
Streptomyces sp. GMKU 3100 dan mutan gen desD-like (penyandi enzim kunci
pada akhir lintasan biosintesis siderofor) membuktikan bahwa tanaman padi dan
kacang hijau yang diinokulasi Streptomyces sp. GMKU 3100 tipe liar memiliki
biomasa tanaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan dengan tanaman yang
diinokulasi dengan Streptomyces sp. GMKU 3100 mutan (Siriwan et al. 2012).
Sebelumnya, Dimkpa et al. (2009) juga telah mempublikasikan hasil
penelitiannya yang membuktikan bahwa pemberian supernatan bebas sel
Streptomyces sp. tipe liar pada tanaman kacang tunggak (cowpea) dapat
meningkatkan penyerapan Fe, kadar klorofil, dan menghindari efek peroksidasi
lemak pada daun walaupun ditanam pada media tanam yang mengandung Al, Cu,
Mn, Ni dan U dalam konsentrasi cukup tinggi. Pemberian siderophore tersebut
juga menurunkan pembentukan radikal bebas sehingga melindungi auksin yang
diproduksi mikroba dari degradasi dan pada akhirnya dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman. Uji penyerapan kompleks Fe-pyoverdin menggunakan
tanaman kacang hijau juga membuktikan bahwa tanaman mampu menyerap
komplek tersebut (Vansuyt et al. 2007). Percobaan menggunakan tanaman
tembakau transgenik over ekspresi ferritin menunjukkan bahwa kadar Fe pada
tanaman transgenik lebih tinggi dibandingkan tanaman non-transgeniknya (Robin
et al. 2006). Hasil-hasil penelitian tersebut secara tidak langsung membuktikan
bahwa selain meningkatkan penyerapan Fe, ekspresi siderofor di dalam jaringan
tanaman juga tidak berbahaya bagi tanaman.
Kemampuan bakteri endofit dalam melarutkan fosfat diduga juga berperan
dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Selain meningkatkan ketersedian
nutrisi seperti Nitrogen Fe, dan Fosfat untuk tumbuhan, berbagai senyawa bioaktif
seperti fitohormon dan vitamin yang diproduksi oleh beberapa bakteri endofit juga
berguna dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman inangnya (Ryan et al. 2008;
Tsavkevlova et al. 2006; Rosenblueth dan Romero 2006).
Peran Bakteri Endofit dalam Meningkatkan Ketahanan Tanaman
Tumbuhan memiliki sistem imunitas basal dan respon pertahanan berlapis
yang dapat di picu secara sistematik untuk menurunkan tingkat kejadian dan
keparahan penyakit. Berdasarkan agen penginduksinya, sistem resistensi pada
tumbuhan dapat dibedakan atas Systemic Acquired Resistance (SAR) dan Induced
Systemic Resistance (ISR). Infeksi patogen akan mengaktifkan sistem ketahanan
7
tumbuhan yang akan melindunginya dari berbagai mikroorganisme (broad
spectrum) untuk jangka panjang. Ketahanan tumbuhan yang timbul akibat infeksi
patogen ini dikenal sebagai Systemic Acquired Resistance (SAR) (Francis et al.
2010). Lintasan SAR bersifat salicylic acid (SA) dependent (Choudhary dan Johri
2009; Kloepper dan Ryu 2006) (Gambar 5). Sebagai respon terhadap patogen,
tumbuhan akan memproduksi reactive oxygen species (ROS), protein-protein
terkait patogenesis (PR- proteins), penebalan dinding-dinding sel, serta produksi
fitoaleksin. Fitoaleksin adalah metabolit sekunder berberat molekul rendah yang
memiliki aktivitas antimikroba. Kelompok senyawa ini merupakan salah satu
marka untuk ketahanan tumbuhan terhadap penyakit. Berbagai fitoaleksin telah
berhasil diisolasi dan didentifikasi dari berbagai tumbuhan, namun sampai saat ini
mekanisme dan lintasan biosintesisnya belum diketahui dengan pasti. Capsidiol
dan scopoletin adalah senyawa fitoaleksin utama yang dihasilkan oleh tumbuhan
Solanaceae. (Ahuja et al. 2011).
Berbeda dengan SAR yang diaktifkan oleh patogen, ISR dapat diaktifkan
diantaranya oleh kolonisasi bakteri kelompok Plant Growth Promoting (PGP)
(Francis et al. 2010). Sebagian besar laporan penelitian menunjukkan bahwa ISR
diinduksi oleh strain-strain bakteri akar yang hidup bebas. Tetapi akhir-akhir ini
berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri endofit juga dapat
merangsang Induced Systemic Resistance (ISR) sebagaimana kelompok bakteri
PGP (Jimtha et al. 2014; Choudhary dan Johri 2009; Ryan et al. 2008; Compant et
al. 2005). Berbeda dengan SAR yang bersifat salicylic acid (SA) dependent,
lintasan ISR bersifat salicylic ac