Isolasi, Seleksi, Dan Identifikasi Bakteri Endofit Sebagai Agens Penginduksi Ketahanan Tanaman Padi Terhadap Penyakit Hawar Daun Bakteri

ISOLASI, SELEKSI, DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
ENDOFIT SEBAGAI AGENS PENGINDUKSI KETAHANAN
TANAMAN PADI TERHADAP PENYAKIT HAWAR DAUN
BAKTERI

IDA PARIDA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi, Seleksi, dan
Identifikasi Bakteri Endofit sebagai Agens Penginduksi Ketahanan Tanaman Padi
terhadap Penyakit Hawar Daun Bakteri adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, April 2016
Ida Parida
NIM A352120161

i

RINGKASAN
IDA PARIDA. Isolasi, Seleksi, dan Identifikasi Bakteri Endofit sebagai Agens
Penginduksi Ketahanan Tanaman Padi terhadap Penyakit Hawar Daun Bakteri.
Dibimbing oleh GIYANTO dan TRI ASMIRA DAMAYNTI.
Hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan Xanthomonas oryzae pv.
oryzae menjadi salah satu masalah besar dalam produksi padi di Indonesia. Salah
satu upaya pengendalian yang dapat dilakukan yaitu dengan pemanfaatan agens
hayati seperti bakteri endofit. Bakteri endofit merupakan bakteri yang dapat
mengolonisasi jaringan internal tanaman tanpa menyebabkan kerusakan pada
inangnya. Bakteri ini memiliki mekanisme induksi ketahanan tanaman atau
dikenal dengan induced systemic resistance (ISR) dalam pengendalian penyakit.

Namun potensinya sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman terhadap
penyakit hawar daun bakteri serta pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan hasil
panen padi sejauh ini belum banyak diketahui.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi, menyeleksi, dan menguji kemampuan
bakteri endofit asal tanaman padi sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman
serta mengetahui pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan hasil panen padi. Selain
itu untuk mengidentifikasi bakteri endofit yang potensial sebagai agens
penginduksi ketahanan tanaman padi terhadap penyakit HDB. Penelitian
dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi
Tanaman, dan Rumah Kaca Cikabayan, IPB mulai bulan Juni 2013 sampai
Desember 2014. Bakteri endofit yang digunakan merupakan hasil isolasi dari
tanaman padi sehat yang berada diantara tanaman sakit akibat HDB. Isolat bakteri
endofit hasil isolasi diseleksi berdasarkan viabilitas dan morfologi koloni,
pengaruhnya terhadap induksi ketahanan dan pertumbuhan padi di pembibitan,
serta uji reaksi hipersensitif pada tanaman tembakau. Bakteri endofit hasil seleksi
selanjutnya diuji pada percobaan rumah kaca. Parameter yang digunakan meliputi
ekspresi gen PR1 dan PBZ1, aktivitas enzim peroksidase, periode inkubasi, dan
perkembangan penyakit HDB. Selain itu juga diamati pengaruhnya terhadap
pertumbuhan dan hasil panen padi dengan parameter daya berkecambah, indeks
vigor benih, pertambahan tinggi tanaman, jumlah anakan maksimum, jumlah

anakan produktif, bobot kering, dan kadar air gabah. Perlakuan bakteri endofit di
rumah kaca terdiri dari W1 (aplikasi bakteri endofit pada benih saja), W2 (aplikasi
bakteri endofit pada benih dan 4 MST), dan W3 (aplikasi bakteri endofit pada
benih, 4, dan 6 MST). Bakteri endofit yang potensial sebagai agens penginduksi
ketahanan tanaman padi dan berpengaruh baik terhadap pertumbuhan dan hasil
panen padi selanjutnya diidentifikasi menggunakan teknik molekuler berdasarkan
sekuen 16S rRNA.
Hasil isolasi diperoleh 549 isolat bakteri endofit. Isolat bakteri endofit dari
bagian akar sebanyak 225 isolat (38%), dari bagian batang sebanyak 236 isolat
(40%), dan dari bagian daun sebanyak 133 isolat (22%). Hasil seleksi
menunjukkan bahwa 370 isolat dari 549 isolat bakteri endofit hasil isolasi
memiliki viabilitas yang baik dan morfologi koloni yang berbeda. Selanjutnya 14
dari 370 isolat menunjukkan kemampuan menginduksi ketahanan atau memacu
pertumbuhan padi di pembibitan, namun hanya 7 isolat diantaranya yang tidak

ii
menyebabkan reaksi hipersensitif pada tanaman tembakau. Tujuh isolat bakteri
endofit tersebut adalah EA2 154, EB3 307, EB4 451, EB4 452, EB6 748, ED1 63,
dan ED4 467. Hasil pengujian di rumah kaca menunjukkan bahwa ketujuh isolat
yang diujikan mampu menginduksi ekspresi gen PR1 dan PBZ1, dan 4

diantaranya mampu meningkatkan aktivitas enzim peroksidase (EB4 451, EB4
452, EB6 748, dan ED4 467). Selain itu 4 isolat mampu memperpanjang periode
inkubasi (EA2 154, EB4 451, EB6 748, dan ED4 467) dan 2 isolat mampu
menghambat perkembangan penyakit HDB (EB4 451 dan ED1 63). Secara umum
perlakuan bakteri endofit tidak berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan dan hasil
panen padi, kecuali terhadap daya berkecambah, yaitu EB6 748 yang
mempengaruhi daya berkecambah lebih rendah dibandingkan kontrol dan
perlakuan lain. Diantara 7 isolat yang diuji, hanya isolat EB4 451 yang konsisten
mampu menginduksi ekspresi gen PR1 dan PBZ1, meningkatkan aktivitas enzim
peroksidase, memperpanjang periode inkubasi, menekan perkembangan penyakit,
serta berpengaruh baik terhadap pertumbuhan dan hasil panen padi. Hasil
identifikasi dengan teknik molekuler diketahui bahwa EB4 451 memiliki persen
homologi sebesar 98% dengan Bacillus subtilis.
Berdasarkan penelitian ini bakteri endofit yang diisolasi dari bagian tanaman
padi berpotensi sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman dan bermanfaat
dalam upaya pengendalian penyakit HDB. B. subtilis merupakan salah satu
bakteri endofit yang secara konsisten mampu menginduksi ketahanan tanaman
padi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri endofit sebagai agens hayati
dapat dimanfaatkan untuk pengendalian HDB.
Kata kunci: bakteri endofit, gen PR1 dan PBZ1, padi, ISR.

iii

SUMMARY
IDA PARIDA. Isolation, Selection and Identification of Endophytic Bacteria as
Inducers Sistemic Resistance Agents to Bacterial Leaf Blight Disease on Rice.
Supervised by GIYANTO and TRI ASMIRA DAMAYNTI.
Bacterial leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae
become one of the major problems on rice production in Indonesia. One of the
control method is by utilizing endophytic bacteria as biocontrol. Endophytic
bacteria is a bacteria which colonize the internal tissues of plants without causing
damage to the host. These bacteria play a role as plant resistance inducer, known
as induce systemic resistance (ISR) in controlling the disease. However, its
potential as inducer of plant resistance agents to bacterial leaf blight disease, its
influence on the growth and yield of rice so far is not much known.
This study aims to isolate, select and test the ability of endophytic bacteria
from rice plant as inducers plant resistance agents and their influence on the
growth and yield of rice, besides to identifying potential endophytic bacteria as
inducers plant resistance agents to BLB on rice. Research conducted at the
Laboratory of Plant Bacteriology, Department of Plant Protection, and Cikabayan

Greenhouse, IPB, started in June 2013 until December 2014. The endophytic
bacteria are isolated from healthy rice plants. Endophytic bacteria isolates were
selected based on the viability and morphology of the colony, its influence on the
induction of resistance and plant growth in the nursery, and hypersensitive
reaction test on tobacco plants. Endophytic bacteria of selection results were
tested in greenhouse trials with parameters PR1 and PBZ1 gene expression,
peroxidase enzyme activity, the incubation period, and disease progression. And
than they influence on the growth and yield of rice with parameters germination,
seed vigor index, increase plant height, number of maximum tillers, number of
productive tillers, dry weight, and water content of grain. The treatment of
endophytic bacteria consisted of W1 (application endophytic bacteria on the seed
alone), W2 (application endophytic bacteria on the seed and 4 week after plants),
and W3 (application endophytic bacteria on the seed, 4, and 6 week after plants).
Identification of potential endophytic bacteria as inducer plant resistance and have
better effect on growth and yield of rice was conducted by sequencing of the 16S
rRNA.
Isolation results obtained 594 isolates of endophytic bacteria. Endophytic
bacteria from the roots are 225 isolates (38%), from the stems are 236 isolates
(40%), and from the leaves are 133 isolates (22%). Selection results showed that
370 isolates of 549 isolate of endophytic bacteria isolation results have good

viability and different morphology of colonies. Furthermore, 14 of 370 isolates
showed the ability to induce plant resistance or promot the growth of rice plants in
the nursery, however only 7 isolates which does not cause a hypersensitive
reaction on tobacco plants. Seven isolates of endophytic bacteria are EA2 154,
EB3 307, EB4 451, EB4 452, EB6 748, ED1 63, and ED4 467. The test results in
the greenhouse showed that 7 isolates were able to induce PR1 and PBZ1 gene
expression, and 4 of them can increase the peroxidase enzyme activity (EB4 451,
EB4 452, EB6 748, and ED4 467). In addition there are 4 isolates could prolong

iv
the incubation period (EA2 154, EB4 451, EB6 748, and ED4 467) and 2 isolates
could inhibit the disease progression (EB4 451 and ED1 63). In general, the
application of endophytic bacteria had no significant effect on the growth and
yield of rice, except for germination, ie EB6 748 affecting lower germination than
control and other treatment. Among 7 isolates tested, only EB4 451 were
consistent to induce PR1 and PBZ1 gene expression, increases the peroxidase
enzyme activity, prolong the incubation period, suppress the disease progression,
and good influence on the growth and yield of rice. Results of identification by
molecular techniques known that EB4 451 has 98% homology with Bacillus
subtilis.

Endophytic bacteria isolated from the rice plant is potentially as inducer
plant resistance agents to control BLB. B. subtilis is one of endophytic bacteria
was consistently able to induce plant resistance related PR1 and PBZ1 gene
expression, peroxidase enzyme activity, prolong incubation period, lower disease
development, and having better effect on plant growth and yield of rice. Based on
the present results showed that utilizing endophytic bacteria might be considerated
as biocontrol agent of BLB.
Key words: endophytic bacteria, PR1 and PBZ1 gene, rice, ISR.

v

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

vi

vii

ISOLASI, SELEKSI, DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
ENDOFIT SEBAGAI AGENS PENGINDUKSI KETAHANAN
TANAMAN PADI TERHADAP PENYAKIT HAWAR DAUN
BAKTERI

IDA PARIDA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2016

viii

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi

x

xi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan
rahmat dan hidayah sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul
“Isolasi, Seleksi, dan Identifikasi Bakteri Endofit sebagai Agens Penginduksi
Ketahanan Tanaman Padi terhadap Penyakit Hawar Daun Bakteri”.
Penulis menyadari bahwa banyak pihak yang telah berjasa dalam
memberikan bimbingan, dukungan, arahan dan bantuan dalam menyelesaikan
tesis ini. Penulis sampaikan ucapan terima kasih terutama kepada Dr Ir Giyanto,
MSi dan Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr yang telah memberikan bimbingan

dan saran dengan penuh kesabaran selama pengerjaan tesis. Terima kasih kepada
Program KKP3N, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementrian
Pertanian, Indonesia atas pendanaan penelitian ini sebagai bagian dari kerjasama
dengan nomor kontrak: 50/PL.220/I.1/2014.K10, serta beasiswa pendidikan dari
Provinsi Jawa Barat dengan nomor kontrak: 073/08/Yansos dan
1683/IPB/DL/2013. Terima kasih kepada Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi
selaku penguji luar komisi, dan Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc yang
telah memberikan saran dalam penulisan tesis.
Penulis sampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada keluarga,
terutama Ibu Titi Rositi dan Bapak Ai Ruhaeman SPd.I (almarhum) yang selama
hidupnya selalu memberikan kasih sayang, dukungan, doa, dan semangat belajar.
Terima kasih kepada suami tercinta Apan Iskandar SPd atas saran, dukungan, doa,
dan semangat dalam pengerjaan tesis, dan terima kasih kepada anak tercinta
Muhammad Sajjad Iskandar yang selalu menjadi penyemangat bagi penulis.
Selain itu penulis sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan dukungan baik moril maupun materil, terutama para sahabat Rita
Kurnia Apindiati, Lutfi Afifah, Tatit Sastrini, Risma Junita, Ima Karimah, dan
Rindu Dwi Malateki. Terima kasih kepada keluarga besar Laboratorium
Bakteriologi Tumbuhan PTN dan keluarga besar Fitopatologi 2012 atas dukungan
saran dan semangat.
Semoga tesis ini bermanfaat bagi penulis maupun pembaca. Penulis
menyadari bahwa dalam tesis ini masih banyak kekurangan. Sebab itu penulis
mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun.

Bogor, April 2016

Ida Parida

xii

xiii

DAFTAR ISI
Halaman
1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
3
Hipotesis
3
Alur Penelitian
4
2 TINJAUAN PUSTAKA
5
Penyakit Hawar Daun Bakteri Pada Padi
5
Peran Bakteri Endofit Sebagai Agens Hayati
6
Induksi Ketahanan Tanaman Padi
7
3 METODE PENELITIAN
10
Tempat dan Waktu
10
Bahan dan Alat
10
Metode
10
Pengambilan Sampel Tanaman Padi untuk Isolasi Bakteri Endofit
10
Isolasi Bakteri Endofit
10
Penyiapan Isolat X. oryzae pv oryzae
11
Seleksi Isolat Bakteri Endofit Potensial
11
Uji viabilitas dan morfologi koloni
11
Uji induksi ketahanan dan pemacu pertumbuhan di pembibitan 12
Uji reaksi hipersensitif (HR)
12
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Induksi Ketahanan dan
Pertumbuhan serta Hasil Padi pada Percobaan Rumah Kaca
12
Penyiapan tanaman uji
12
Perlakuan bakteri endofit
12
Peubah pengamatan
12
Rancangan percobaan
16
Identifikasi Bakteri Endofit Potensial sebagai Agens Penginduksi
Ketahanan Tanaman Padi terhadap Infeksi X. oryzae pv oryzae
16
Identifikasi berdasarkan karakter morfologi dan fisiologi
16
Identifikasi berdasarkan teknik molekuler
16
Analisis Data
17
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
18
Sampel Tanaman Padi untuk Isolasi Bakteri Endofit
18
Bakteri Endofit Hasil Isolasi
19
Isolat X. oryzae pv. oryzae
20
Seleksi Bakteri Endofit
21
Seleksi Bakteri Endofit Berdasarkan Viabilitas dan Morfologi
Koloni
21

xiv
Seleksi Berdasarkan Kemampuan Induksi Ketahanan dan Pemacu
Pertumbuhan Padi di Pembibitan
21
Bakteri Endofit Hasil Seleksi Berdasarkan Uji HR
23
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Induksi Ketahanan dan
Pertumbuhan serta Hasil Panen Padi di Rumah Kaca
23
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Ekspresi Gen PR1 dan
PBZ1
23
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Aktivitas Enzim
Peroksidase
27
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Periode Inkubasi HDB 29
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Perkembangan penyakit
HDB
30
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Perkecambahan, Tinggi
Tanaman, Anakan Maksimum, Anakan Produktif, Bobot Kering, dan
Kadar Air Gabah
31
Hasil Identifikasi Bakteri Endofit yang Berpotensi sebagai Agens
Penginduksi Ketahanan Tanaman Padi terhadap X. oryzae pv. oryzae
35
6 PEMBAHASAN UMUM
39
5 SIMPULAN DAN SARAN
41
Simpulan
41
Saran
41
7 DAFTAR PUSTAKA
42
LAMPIRAN
49
RIWAYAT HIDUP
59

DAFTAR TABEL
1 Distribusi isolat bakteri endofit
2 Pengaruh aplikasi bakteri endofit terhadap daya berkecambah dan
indeks vigor benih
3 Ciri morfologi isolat bakteri endofit kandidat agens penginduksi
ketahanan tanaman padi
4 Tingkat kemiripan basa nukleotida 16S rRNA isolat EB4 451 dengan
isolat B. subtilis yang terdaftar pada GenBank berdasarkan hasil
BLAST

19
32
36

38

xv

DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alur penelitian isolasi, seleksi, dan identifikasi bakteri endofit
sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman padi terhadap penyakit
hawar daun bakteri
2 Komposisi isolat bakteri endofit berdasarkan asal bagian tanaman
3 Koloni isolat X. oryzae pv oryzae patotipe IV (A), hasil uji reaksi
hipersensitif isolat X. oryzae pv oryzae patotipe IV (B), hasil uji
patogenisitas isolat X. oryzae pv oryzae patotipe IV pada tanaman padi
(C)
4 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap rata-rata panjang hawar
daun bakteri pada tanaman padi di pembibitan
5 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap tinggi dan panjang akar
tanaman padi di pembibitan
6 Ekspresi gen PR1 hasil RT-PCR pada perlakuan bakteri endofit
sebelum dan setelah inokulasi X. oryzae pv. oryzae, a = W1 sebelum
inokulasi X. oryzae pv. oryzae, b = W2 sebelum inokulasi X. oryzae pv.
oryzae, c = W3 sebelum inokulasi X. oryzae pv. oryzae, d = W1 setelah
inokulasi X. oryzae pv. oryzae, e = W2 setelah inokulasi X. oryzae pv.
oryzae, f = W3 setelah inokulasi X. oryzae pv. oryzae, W1 = aplikasi
pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST; W3 = aplikasi
pada benih, 4 dan 6 MST
7 Ekspresi gen PBZ1 hasil RT-PCR pada perlakuan bakteri endofit
sebelum dan setelah inokulasi X. oryzae pv. oryzae, a = W1 sebelum
inokulasi X. oryzae pv. oryzae, b = W2 sebelum inokulasi X. oryzae pv.
oryzae, c = W3 sebelum inokulasi X. oryzae pv. oryzae, d = W1 setelah
inokulasi X. oryzae pv. oryzae, e = W2 setelah inokulasi X. oryzae pv.
oryzae, f = W3 setelah inokulasi X. oryzae pv. oryzae, W1 = aplikasi
pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST; W3 = aplikasi
pada benih, 4 dan 6 MST
8 Aktivitas enzim peroksidase pada 3 waktu aplikasi bakteri endofit. W1
= aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST, W3 =
aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
9 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap periode inkubasi HDB.
W1 = aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST,
W3 = aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
10 Gejala hawar daun bakteri setelah inokulasi X. oryzae pv oryzae. (A)
gejala awal dan (B) gejala lanjutan
11 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap perkembangan penyakit
HDB. W1 = aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4
MST, W3 = aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
12 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap nilai AUHPGC, W1 =
aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST, W3 =
aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
13 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap jumlah anakan maksimum
dan anakan produktif. W1 = aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi
pada benih dan 4 MST, W3 = aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST

4
19

20
21
22

24

25

28

29
30

31

32

33

xvi
14 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap jumlah anakan produktif.
W1 = aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST,
W3 = aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
15 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap bobot kering gabah. W1 =
aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST, W3 =
aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
16 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap kadar air gabah. W1 =
aplikasi pada benih saja, W2 = aplikasi pada benih dan 4 MST, W3 =
aplikasi pada benih, 4 dan 6 MST
17 Bentuk koloni isolat bakteri endofit kandidat agens penginduksi
ketahanan padi terhadap X. oryzae pv oryzae. (a) EA2 154, (b) EB3
307, (c) EB4 451, (d) EB4 452, (e) EB6 748, (f) ED1 63, dan (g) ED4
467
18 Hasil pewarnaan Gram isolat EB4 451 yang menunjukkan hasil sebagai
Gram positif
19 Hasil pewarnaan endospora isolat EB4 451 yang menunjukkan dapat
menghasilkan endospora

34

34

35

36
37
37

DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis ragam pengaruh aplikasi bakteri bakteri endofit terhadap
induksi ketahanan tanaman padi di pembibitan
2 Analisis ragam pengaruh aplikasi bakteri endofit terhadap pertumbuhan
tanaman padi di pembibitan
3 Analisis ragam pengaruh aplikasi bakteri endofit terhadap periode
inkubasi dan perkembangan penyakit HDB
4 Analisis ragam pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap daya
berkecambah (DB) dan indeks vigor (IV) benih
5 Analisis ragam pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap
pertambahan tinggi (AUDPC), jumlah anakan maksimum, anakan
produktif
6 Analisis ragam pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap bobot
kering dan kadar air gabah
7 Urutan basa nukleotida isolat EB4 451 (teridentifikasi sebagai B.
subtilis)
8 Penjajaran basa nukleotida isolat EB4 451 dengan isolat B. subtilis
yang terdaftar pada GenBank dengan nomor aksesi HM753632.1,
HQ166109.1,GQ861469.1, dan JX683721.1

51
51
52
52

53
53
54

55

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyakit tanaman yang menjadi masalah besar dalam produksi
padi adalah penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. Penyakit ini dapat menyebabkan kehilangan hasil antara 20
sampai 30%, bahkan dapat mencapai 50% (Verdier et al. 2011). Penyakit ini
dapat menyerang mulai dari fase vegetatif sampai generatif. Sembiring (2011)
menjelaskan bahwa penyakit ini menghasilkan dua gejala yang khas, yaitu kresek
dan hawar. Kresek adalah gejala yang terjadi pada tanaman yang berumur kurang
dari 30 hari dan biasanya muncul pada persemaian atau tanaman baru pindah
tanam. Gejala ini berupa daun berwarna hijau kelabu, melipat, dan menggulung.
Sedangkan hawar merupakan gejala yang umum terjadi pada fase tumbuh anakan
sampai pemasakan. Gejala diawali dengan bercak kuning kemudian berubah
menjadi kelabu dan putih jerami pada ujung dan tepian daun pada daun yang telah
berkembang sempurna. Bercak meluas sepanjang tulang daun, bergabung,
mengalami klorosis, kemudian menjadi nekrosis dan mengering.
Upaya pengendalian HDB sejauh ini mencakup kultur teknis, perakitan
varietas tahan, penggunaan bakterisida, dan penggunaan agens hayati. Pengaturan
jarak tanam dan pemupukan yang seimbang berperan penting dalam upaya
pengendalian penyakit. Beberapa galur tahan HDB telah dikembangkan seperti
yang dijelaskan Dewi et al. (2007). Varietas tahan seperti Angke, Conde,
Cigeulis, Cibodas, Kanawe, dan Singkil juga mulai dirilis (Suprihanto et al.
2010). Namun ada kelemahan dari penggunaan varietas tahan dalam pengendalian
penyakit HDB, yaitu ketahanan mudah terpatahkan oleh munculnya patotipe baru
dari X. oryzae pv. oryzae. Suparyono dan Suprihanto (2004) menjelaskan bahwa
sejauh ini di Indonesia terdapat 12 patotipe X. oryzae pv. oryzae. Patotipe yang
mendominasi diantaranya adalah patotipe III, IV, dan VIII. Di lain pihak
penggunaan bakterisida juga mulai dibatasi karena memiliki dampak negatif
seperti terjadinya resistensi organisme sasaran terhadap antibiotik yang
merupakan bahan dasar bakterisida serta terjadinya pencemaran lingkungan.
Upaya lain yang memiliki prospek baik dalam pengendalian HDB adalah
dengan pemanfaatan agens hayati seperti plant growth promoting rhizobacteria
(PGPR) dan bakteri endofit. Kelebihan dari penggunaan agens hayati diantaranya
sudah tersedia di alam, tidak menimbulkan resistensi organisme sasaran, tidak ada
efek samping, dan relatif murah. Umumnya bakteri sebagai agens hayati diisolasi
dari bagian tanah, rizosfer, permukaan tanaman, atau bagian internal tanaman
yang dikenal dengan bakteri endofit. Menurut Ryan et al. (2007) bakteri endofit
merupakan bakteri yang mengolonisasi bagian internal jaringan tanaman tanpa
menyebabkan kerusakan pada inangnya. Beberapa bakteri endofit dilaporkan
dapat memacu pertumbuhan, meningkatkan kebugaran tanaman (Kirchhof et al.
2001) dan dapat menjadi agens biokontrol (Shimizu et al. 2009). Bakteri endofit
yang telah dilaporkan dapat mengendalikan penyakit tanaman diantaranya
Steptomyces spp. yang dapat mengendalikan X. oryzae pv. oryzae (Hastuti et al.
2012), kelompok Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides yang dapat menekan
Erwinia carotovora subsp. atroseptica pada tanaman kentang (Reiter et al. 2002),

2
isolat bakteri endofit dari Sophora alopecuroides yang dapat menekan
Verticillium sp. (Lin et al. 2013), dan masih banyak yang lainnya. Selain itu
beberapa bakteri endofit juga dilaporkan memiliki kemampuan memacu
pertumbuhan tanaman seperti bakteri endofit asal padi gogo yang mampu memacu
pertumbuhan padi (Munif et al. 2012), bakteri endofit pemacu pertumbuhan tomat
(Munif et al. 2000), dan bakteri endofit pemacu pertumbuhan cabai
(Sundaramoorthy et al. 2012).
Salah satu mekanisme bakteri endofit yang dapat dimanfaatkan dalam
pengendalian penyakit tanaman adalah melalui induksi ketahanan tanaman atau
induced systemic resistance (ISR). ISR adalah fenomena dimana terjadi
peningkatan ketahanan tanaman terhadap infeksi patogen setelah terjadinya
rangsangan baik oleh faktor biotik maupun abiotik. Rangsangan tersebut
menyebabkan kondisi fisiologis yang mengatur sistem ketahanan yang dimiliki
tanaman menjadi aktif. Secara alami tanaman memiliki beragam respon
pertahanan terhadap serangan patogen. Reaksi pertahanan ini meliputi penebalan
dinding sel, akumulasi metabolit sekunder antimikrob dan ekspresi pathogenesis
related (PR) protein (Kim et al. 2001). Induksi ketahanan oleh bakteri endofit
dapat meningkatkan ketahanan dasar yang dimiliki tanaman terhadap serangan
patogen. Bakteri endofit diindikasi dapat menginduksi ketahanan tanaman
pertama kali diketahui pada tahun 1991 yaitu Pseudomonas fluoresens G8-4 yang
ditemukan dalam jaringan tanaman dan dapat menginduksi ketahanan mentimun
terhadap penyakit antraknosa (Wei et al. 1991). Pada tahun 1996 dilaporkan
bahwa Bacillus pumilus INR7 yang diisolasi dari tanaman mentimun dapat
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit layu yang disebabkan
Erwinia tracheiphila (Wei et al. 1996). Selain itu B. subtilis juga dilaporkan dapat
menginduksi ketahanan tomat terhadap Cucumber mosaic virus (CMV) (Zehnder
et al. 2000) dan beberapa bakteri endofit dapat meningkatkan ketahanan bawang
merah terhadap penyakit HDB (Resti et al. 2013). Pada padi, induksi ketahanan
tanaman terhadap HDB baru diteliti menggunakan rizobakteri sekitar perakaran
(Khaeruni et al. 2014). Penggunaan bakteri endofit sebagai agens penginduksi
ketahanan tanaman padi terhadap HDB belum banyak diketahui. Berdasarkan
informasi tersebut penelitian yang telah dilaksanakan ini bertujuan mendapatkan
isolat bakteri endofit asal tanaman padi, menyeleksi dan menguji kemampuan
isolat bakteri endofit sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman serta
pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan hasil panen padi, kemudian mengetahui
bakteri endofit yang potensial sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman padi
terhadap penyakit HDB.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan:
1) Mengisolasi bakteri endofit asal tanaman padi,
2) Menyeleksi dan menguji kemampuan isolat bakteri endofit sebagai agens
penginduksi ketahanan,
3) Mengamati pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap pertumbuhan dan
hasil panen padi,

3
4) Mengidentifikasi bakteri endofit yang potensial sebagai agens penginduksi
ketahanan tanaman terhadap penyakit HDB.

Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi manfaat berupa infomasi
bakteri endofit yang potensial sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman
terhadap X. oryzae pv. oryzae dan pengaruhnya terhadap sifat agronomi padi yang
dapat dimanfaatkan dalam pengendalian HDB.

Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini adalah:
1) Bakteri endofit dapat diisolasi dari bagian daun, batang, dan akar tanaman
padi,
2) Aplikasi bakteri endofit hasil isolasi dapat menginduksi ketahanan tanaman
terhadap X. oryzae pv. oryzae,
3) Semakin sering bakteri endofit diaplikasikan, maka semakin tinggi
pengaruhnya terhadap penekanan X. oryzae pv. oryzae,
4) Aplikasi bakteri endofit berpengaruh baik terhadap pertumbuhan serta hasil
panen padi.

4
Isolasi Bakteri Endofit

Seleksi Bakteri Endofit
 Viabilitas dan morfologi koloni
 Induksi ketahanan dan pemacu pertumbuhan di pembibitan
 Uji reaksi hipersensitif

Pengaruh Perlakuan Bakteri Endofit terhadap Induksi Ketahanan
Tanaman dan Pertumbuhan serta Hasil Panen Padi






Pengaruh terhadap ekspresi gen PR1 dan PBZ1
Pengaruh terhadap aktivitas enzim peroksidase
Pengaruh terhadap periode inkubasi HDB
Pengaruh terhadap perkembangan penyakit HDB
Pengaruh terhadap pertumbuhan dan hasil panen padi

Identifikasi Bakteri Endofit yang Potensial
Gambar 1 Diagram alur penelitian Isolasi, seleksi, dan identifikasi bakteri endofit
sebagai agens penginduksi ketahanan tanaman padi terhadap penyakit
hawar daun bakteri

5

2 TINJAUAN PUSTAKA
Penyakit Hawar Daun Bakteri pada Padi
Hawar daun bakteri (HDB) merupakan penyakit yang menyerang pembuluh
dan menyebabkan infeksi sistemik pada tanaman padi. Patogen hidup pada
jaringan pembuluh terutama xilem, melakukan multiplikasi, kemudian menyebar
ke seluruh jaringan tanaman (Nino-Liu et al. 2006). Penyakit HDB menghasilkan
dua gejala yang khas, yaitu kresek dan hawar. Kresek adalah gejala yang terjadi
pada tanaman yang berumur kurang dari 30 hari dan biasanya muncul pada
persemaian atau tanaman baru pindah tanam. Gejala ini berupa daun berwarna
hijau kelabu, melipat, dan menggulung. Sedangkan hawar merupakan gejala yang
umum terjadi pada fase tumbuh anakan sampai pemasakan (Sembiring 2011).
Gejala diawali dengan bercak kuning kemudian berubah menjadi kelabu dan putih
jerami pada ujung dan tepi daun pada daun yang telah berkembang sempurna.
Bercak meluas sepanjang tulang daun, bergabung, mengalami klorosis, kemudian
menjadi nekrosis yang disebut hawar dan kemudian mengering.
Penyebab penyakit HDB pada padi adalah bakteri X. oryzae pv. oryzae
(Swings et al. 1990). Semua spesies Xanthomonas merupakan patogen dan
ditemukan berasosiasi dengan tumbuhan atau bahan tumbuhan (Agrios 2005).
Bakteri ini berbentuk batang lurus dengan panjang 1.2 sampai 3.0 µm dan lebar
0.4 sampai 1.0 µm, bergerak dengan satu bulu cambuk polar, dan termasuk Gram
negatif. Koloni bakteri pada media YDCA berwarna kuning, cembung, dan
mukoid. Warna kuning dikarenakan bakteri memproduksi pigmen xanthomonadin
(Schaad et al. 2000).
Bakteri X. oryzae pv. oryzae menginfeksi bagian daun dengan cara masuk
melalui hidatoda pada ujung dan tepi daun (Nino-Liu et al. 2006). Bakteri dapat
pula menginfeksi melalui luka-luka pada daun akibat pemotongan, luka akibat
gesekan antar daun, dan luka akibat serangga. Menurut Singh dan Mathur (2004),
bakteri X. oryzae pv. oryzae dapat terbawa benih dan bertahan dalam waktu yang
cukup lama karena bakteri berada pada fase dorman ketika berada dalam benih.
Bakteri ini terdapat dalam endosperma benih dan dapat bertahan di benih selama
0.16 sampai 0.9 tahun (Agarwal & Sinclair 1996) atau 2 sampai 6 bulan (Singh &
Mathur 2004). Selain itu, penyebaran X. oryzae pv. oryzae di lapangan dapat
dibantu oleh angin, gesekan antara daun, dan melalui percikan air hujan (Nino-Liu
et al.2006)
Pengendalian penyakit kresek umumnya adalah dengan menanam varietas
padi yang tahan (Hifni & Kardin 1998). Selain itu, juga dengan tidak melakukan
pemotongan ujung daun pada bibit padi yang dipindah dari persemaian, dan
pemupukan yang seimbang. Penggunaan senyawa kimia atau bakterisida, seperti
nickel dimethyl dithiocarbamate, dithianone, phenazine, dan yang mangandung
tembaga dapat digunakan untuk pengendalian jika benar-benar diperlukan
(Gnanamanickam et al. 1994).
Salah satu kesulitan dalam pengendalian HDB yaitu keragaman patotipe X.
oryzae pv. oryzae yang tinggi. Suparyono dan Suprihanto (2004) menjelaskan
bahwa sejauh ini di Indonesia terdapat 12 patotipe X. oryzae pv. oryzae. Patotipe
yang mendominasi diantaranya adalah patotipe III, IV, dan VIII.

6
Peran Bakteri Endofit sebagai Agens Hayati
Mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman memiliki peranan
dalam mempengaruhi pertumbuhan, perkembangan, serta pertahanan tanaman.
Mikroba tersebut dikenal dengan bakteri atau cendawan endofit. Bakteri endofit
merupakan bakteri yang mengolonisasi bagian internal jaringan tanaman. Bakteri
endofit dapat mengolonisasi relung ekologi yang sama dengan patogen tanaman,
tetapi tidak menyebabkan kerusakan pada inangnya. Beberapa bakteri endofit
dilaporkan dapat memacu pertumbuhan, meningkatkan kebugaran tanaman
(Kirchhof et al. 2001) dan dapat menjadi agens biokontrol (Shimizu et al. 2009).
Beberapa laporan menunjukkan bahwa bakteri endofit banyak memberi
keuntungan terhadap inangnya. Keberadaan bakteri endofit di dalam jaringan
tanaman berperanan dalam perbaikan pertumbuhan tanaman karena
kemampuannya menghasilkan zat pemacu pertumbuhan, memfiksasi nitrogen,
memobilisasi fosfat, dan juga berperanan dalam kebugaran tanaman (plant health
promotion). Bakteri endofit diduga mampu meningkatkan sistem pertahanan
tanaman terhadap gangguan penyakit karena kemampuannya untuk memproduksi
senyawa antimikroba, enzim, asam salisilat, etilen dan senyawa sekunder lainnya
yang berperanan dalam menginduksi ketahanan tanaman (Backman & Sikora
2008).
Beberapa bakteri endofit telah dilaporkan dapat mengendalikan penyakit
tanaman seperti Steptomyces spp. yang dapat mengendalikan X. oryzae pv. oryzae
(Hastuti et al. 2012), kelompok Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides yang dapat
menekan Erwinia carotovora subsp. atroseptica pada tanaman kentang (Reiter et
al. 2002), isolat bakteri endofit dari Sophora alopecuroides yang dapat menekan
Verticillium sp. (Lin et al. 2013), dan masih banyak yang lainnya. Bakteri endofit
dari beberapa genus seperti Pseudomonas, Bacillus dan Azospirillum, dilaporkan
mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman, menguraikan dinding sel patogen,
dan menghambat pertumbuhan patogen dengan menghasilkan senyawa
antimikroba seperti siderofor (Chandrashekhara et al. 2007). Bakteri endofit dapat
melindungi inang dengan melawan patogen melului induksi pertahanan tanaman,
sekresi zat yang bersifat antagonis terhadap patogen atau melalui kompetisi untuk
memperoleh situs kolonisasi dan nutrisi (Reinhold-Hurek & Hurek 2011).
Potensi bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit tanaman
menyebabkan bakteri endofit diperhitungkan sebagai agens hayati. Bakteri endofit
diindikasi dapat menginduksi ketahanan tanaman pertama kali diketahui pada
tahun 1991 yaitu Pseudomonas fluoresens G8-4 yang ditemukan dalam jaringan
tanaman dan dapat menginduksi ketahanan mentimun terhadap penyakit
antraknosa (Wei et al. 1991). Pada tahun 1996 dilaporkan bahwa Bacillus pumilus
INR7 yang diisolasi dari tanaman mentimun dapat meningkatkan ketahanan
tanaman terhadap penyakit layu yang disebabkan Erwinia tracheiphila (Wei et al.
1996). Selain itu B. subtilis juga dilaporkan dapat menginduksi ketahanan tomat
terhadap Cucumber mosaic virus (CMV) (Zehnder et al. 2000) dan beberapa
bakteri endofit seperti B. cereus, Bacillus sp., dan Serratia marcescens dapat
meningkatkan ketahanan bawang merah terhadap penyakit HDB yang disebabkan
X. axonopodis pv. allii (Resti et al. 2013).
Beberapa kelebihan dari penggunaan bakteri endofit sebagai agens hayati
dibandingkan bakteri rizosfer diantaranya adalah mampu mengolonisasi jaringan

7
tanaman, lebih terlindungi dari stres akibat faktor abiotik, menempati relung yang
sama dengan patogen pada umumnya, dan proses translokasi senyawa metabolit
ke dalam jaringan tanaman yang lebih baik (Hallmann et al. 1997). Selain sebagai
agens pengendali patogen, bakteri endofit juga memiliki kemampuan memacu
pertumbuhan tanaman. Beberapa bakteri endofit yang dilaporkan dapat memacu
pertumbuhan tanaman adalah bakteri endofit asal padi gogo yang mampu memacu
pertumbuhan padi (Munif et al. 2012), tomat (Munif et al. 2000), dan cabai
(Sundaramoorthy et al. 2012).

Induksi Ketahanan Tanaman Padi
Tanaman akan bereaksi terhadap kehadiran suatu patogen dengan
mengaktifkan suatu sistem pertahanan. Pengaktifan sistem pertahanan diawali
dengan sinyal transduksi yang mengubah stimulus menjadi bentuk lain dengan
melibatkan urutan reaksi biokimia di dalam sel yang dilaksanakan oleh enzim dan
berhubungan melalui second messenger (Voet & Donald 1995). Ada tiga
mekanisme utama dalam proses penerimaan sinyal dan inisiasi transduksi sel
dalam merespon sinyal dari lingkungan, yaitu penerimaan sinyal oleh sel target,
penguatan sinyal, dan respon seluler terhadap sinyal. Sebagai contoh tanaman
padi yang terinduksi oleh serangan patogen blas akan mengaktifkan kelompok gen
yang menyandi PR protein (Gee et al. 2001).
Induksi ketahanan tanaman merupakan ketahanan yang berkembang setelah
tanaman diinokulasi dengan agens biotik, senyawa kimia, atau perlakuan fisik.
Tingkat ketahanan tanaman menjadi meningkat terhadap berbagai serangan
patogen. Sebagai contoh infeksi Tobacco mosaic virus (TMV) pada tanaman
tembakau menyebabkan ketahanan sistemik terhadap patogen itu sendiri dan
terhadap beberapa jenis virus lain, terhadap Phytophthora sp., terhadap
Pseudomonas tabaci, serta terhadap serangan kutu daun (Agrios 2005). Induksi
ketahanan juga dapat dilakukan dengan cara menginokulasi tanaman dengan spora
cendawan atau bakteri yang telah dimatikan dengan perlakuan panas, dan
inokulasi patogen pada fase tanaman belum rentan terhadap patogen. Agar
ketahanan terinduksi dapat muncul, maka harus ada lag period antara pemberian
agens penginduksi dan inokulasi tantangan (challenge inoculation). Waktu
tersebut dibutuhkan untuk menyintesis dan mendistribusikan zat-zat secara
sistemik dari bagian tanaman yang diberi perlakuan agens penginduksi ke bagian
lain tanaman tersebut. Ketahanan terinduksi yang bersifat lokal biasanya
berkembang 2 sampai 3 hari setelah perlakuan, sedangkan ketahanan terinduksi
yang bersifat sistemik berkembang 7 hari setelah perlakuan atau bahkan 3 sampai
5 minggu. Ketahanan terinduksi dapat berkembang jika sel-sel inang mampu
melakukan transkripsi dan menghasilkan enzim atau protein yang mengaktifkan
gen yang bertanggung jawab dalam mekanisme pertahanan tanaman tersebut.
Peningkatan aktivitas enzim peroksidase, fenilalanin amonia liase, fitoaleksin,
lignifikasi, dan proteinase inhibiting juga ditemukan pada beberapa tanaman yang
mengalami peningkatan pertahanan terinduksi (Agrios 2005).
Beberapa mekanisme alami yang dapat dimanfaatkan dalam penggunaan
agens hayati adalah dengan cara memanfaatkan hubungan antagonis antara
patogen dengan agens hayati secara langsung (antibiosis, kompetisi, parasitisme),

8
maupun secara tidak langsung (induksi ketahanan) (Janse 2005). Bakteri
nonpatogenik dapat menginduksi respons induce systemic resistance (ISR) pada
tanaman sebagaimana patogen dapat menginduksi sistem pertahanan systemic
acquired resistance (SAR). ISR terinduksi oleh bakteri nonpatogenik yang
bergantung pada respon dari asam jasmonat dan etilen. ISR efektif melawan
patogen dengan dibatasi oleh asam jasmonat dan etilen sebagai mekanisme
pertahanan dasar. Adanya induksi ketahanan dapat meningkatkan ketahananan
dasar inang dalam menghadapi patogen (Chaudary et al. 2007).
ISR pada dasarnya memiliki kesamaan dengan SAR. Perbedaan antara ISR
dengan SAR adalah ISR tidak menyebabkan adanya gejala tampak seperti lesio
nekrotik (Compant et al. 2005). Ramamoorthy et al. (2001) memaparkan bahwa
mekanisme ISR terjadi sebagai akibat perubahan fisiologi tanaman yang
kemudian menstimulasi terbentuknya senyawa kimia yang berguna dalam
pertahanan terhadap serangan patogen. Perubahan fisiologi tersebut dapat berupa
modifikasi struktural dinding sel atau perubahan reaksi biokimia pada tanaman
inang. Beberapa faktor yang dapat menyebabkan adanya induksi ketahanan
sistemik oleh bakteri yaitu adanya sumbangan lipopolisakarida oleh bakteri,
produksi siderofor, dan produksi asam salisilat yang dapat terjadi secara langsung
oleh bakteri ataupun secara tidak lansung (Van Loon et al.1998).
Gen PR1 dan PBZ1 merupakan PR protein, yaitu gen-gen yang aktif sebagai
reaksi tanaman terhadap infeksi patogen. PR protein ini dapat menghambat
patogenesis, mendegradasi dinding sel patogen yang tersusun oleh polisakarida,
meningkatkan ketahanan terhadap beberapa patogen tertentu, dan bersifat anti
mikroba (Gee et al. 2001). Menurut Agrawal et al. (2001) etilen terlibat dalam
ekspresi gen PR yang terdapat pada tanaman dikotil. Etilen juga mempengaruhi
tiga gen PR penting pada padi (kultivar Nipponbare) seperti gen PR1, PR5, dan
PR10 terhadap perkecambahan. Hasil ini menunjukkan adanya suatu peran etilen
terhadap induksi gen PR pada tanaman padi.
PR1 merupakan gen yang pertama kali berhasil diidentifikasi dan
merupakan kelompok yang paling dominan dari PR protein. Protein ini berfungsi
sebagai anticendawan (Selitrennikoff 2001). Protein PR1 terakumulasi oleh
infeksi patogen, induksi bahan kimia seperti salicylic acid (SA) dan benzo (1,2,3)
thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH) (Kim et al. 2002). Protein
PR1 terakumulasi dalam jumlah yang tinggi setelah terjadi infeksi oleh patogen.
Gen PR1 ini ditemukan di padi, gandum, tomat, tembakau, Arabidopsis thaliana,
barley dan beberapa tanaman lainnya. PR1 terakumulasi oleh infeksi patogen
diantaranya Uromyces fabae, Phytophthora infestans, Erysiphe graminis
(Selitrennikoff 2001). Pada tanaman padi gen PR1 diinduksi oleh Bipolaris
sorokiniana, P. syringae pv. syringae (Schweizer et al. 1997) dan Magnaporthe
grisea (Suharsono et al. 2002). Protein ini juga terinduksi oleh bahan kimia
seperti salicylic acid (SA), methyl 1-2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) dan
benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH) (Kim et al.
2001).
Gen PBZ1 mengkode PR protein intraseluler (Mizobuchi et al. 2002). Pada
tanaman padi gen ini berperan penting dalam peningkatan ketahanan tanaman
sebagai respon terhadap infeksi patogen (Midoh & Iwata 1996). Gen ini dapat
diinduksi oleh probenazole (3-allyloxy-1, 2 benzisothiazole-1, 1-dioxide) yang
dapat meningkatkan aktifitas enzim yang berkaitan dengan sistem pertahanan

9
pada tanaman, seperti peroksidase, polyphenoloxidase, ammonia-lyase dan
catechol-O-methyltransferase serta asam α-linolenik yang berfungsi sebagai
penghambat perkecambahan konidia cendawan (Nakashita et al. 2001). Gen PBZ1
pada tanaman padi juga dapat diinduksi oleh infeksi patogen M. grisea, namun
tidak oleh pelukaan biasa saja (Midoh & Iwata 1996).
Enzim peroksidase berperan dalam sistem pertahanan tanaman terhadap
patogen. Menurut Agrios (2005) peningkatan enzim peroksidase seringkali
berkorelasi dengan peningkatan ketahanan tanaman. Namun beberapa kasus
menunjukkan bahwa tidak semua tanaman yang mengalami peningkatan
ketahanan juga mengalami peningkatan aktivitas enzim peroksidase (Syukur et al.
2009). Peroksidase merupakan hemeprotein yang mengkatalisa pertukaran
hidrogen dan elektron dari donor ke aseptor. Hidrogen peroksida (H2O2.)
bertindak sebagai donor. Peroksidase berfungsi sebagai katalisator yang
mempercepat reduksi H2O2. Enzim peroksidase merupakan kelompok enzim
detoksifikasi yang berperan dalam mengurangi kadar racun.. Pada umumnya
aktivitas enzim peroksidase akan mengalami peningkatan pada tanaman yang
mengalami ketahanan terinduksi. Menurut Heldt (2005) ketika tanaman
mengalami cekaman baik karena faktor abiotik maupun biotik seperti adanya
serangan patogen, maka tanaman akan menutup stomatanya untuk mengurangi
penguapan. Akibatnya tanaman akan mengalami penurunan laju fotosintesis
karena CO2 yang masuk melalui stomata menjadi terhambat. Pada saat cahaya
tinggi keadaan ini akan mengakibatkan kerusakan yang serius karena energi yang
besar dari cahaya matahari tidak bisa dimanfaatkan untuk reaksi biokimia dengan
baik. Akibat kelebihan energi tersebut dapat menyebabkan terbentuknya senyawa
beracun yang dikenal dengan istilah reactive oxygen species (ROS), seperti
superoksida, singlet oksigen, dan peroksida. Senyawa-senyawa ini jika
terakumulsi dalam jaringan dapat merusak komponen lemak membran sehingga
menyebabkan kerusakan pada kloroplas. Enzim peroksidase berperan sebagai
enzim yang mereduksi H2O2 yang merupakan kelompok senyawa peroksida
menjadi air (H2O) yang tidak lagi beracun bagi tanaman. Umumnya enzim
peroksidase pada tanaman adalah askorbat peroksidase yang terdapat pada
membran tilakoid dan berfungsi sebagai antioksidan pada sel tanaman.

10

3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan
Departemen Proteksi Tanaman dan rumah kaca Cikabayan, IPB, mulai Juni 2013
sampai Desember 2014.

Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanaman
padi sehat sebagai sumber bakteri endofit, media agar dan cair untuk isolasi serta
pertumbuhan bakteri endofit, isolat X. oryzae pv. oryzae patotipe IV, benih padi
sehat varietas Ciherang, media tanam, bahan untuk analisis ekspresi gen PR1 dan
PBZ1, bahan untuk pengujian aktivitas enzim peroksidase, primer universal untuk
identifikasi bakteri endofit, serta alat dan bahan untuk uji Gram dan pewarnaan
endospora.

Metode
Pengambilan Sampel Tanaman Padi untuk Isolasi Bakteri Endofit
Pengambilan sampel tanaman padi dilakukan di tiga lokasi berbeda yang
mewakili 3 tipe sawah di Indonesia, yaitu lahan sawah tadah hujan, lahan sawah
irigasi, dan lahan sawah rawa pasang surut. Sampel tanaman padi yang diambil
merupakan tanaman sehat yang berada diantara tanaman padi yang terserang
penyakit hawar daun bakteri. Lokasi pengambilan sampel untuk lahan sawah
tadah hujan dilakukan di dua lokasi yaitu di Desa Widodomartani, Kecamatan
Ngemplak dan Desa Harjobinangun, Kecamatan Tratas, Kabupaten Sleman,
Yogyakarta. Pengambilan sampel untuk lahan sawah irigasi dilakukan di Desa
Gempol Sari, Kecamatan Patok Beusi, Kabupaten Subang, Jawa Barat. Lokasi
pengambilan sampel terakhir adalah di Desa Karang Indah, Kecamatan
Mandastana, Kabupaten Barito Kuala, Kalimantan Selatan.
Isolasi Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit dilakukan mengikuti metode yang digunakan Munif
et al. (2012) dengan sedikit modifikasi pada bagian sterilisasi sampel. Bagian
akar, batang, dan daun padi secara terpisah dipotong dan dicuci dengan air
mengalir, kemudian dikeringanginkan. Sebanyak 1 g sampel akar dan batang
disterilisasi permukaan dengan alkohol 70% selama 1 menit, direndam dalam
NaOCl 3% yang dicampur 0.05% Tween 20 selama 2.5 menit, dan dibilas dengan
akuades steril sebanyak 3 kali. Sebanyak 1 g sampel daun disterilisasi permukaan
dengan cara direndam pada alkohol 70% selama 30 detik, NaOCl 3% yang
dicampur 0.05% Tween 20 selama 2 menit, dan dibilas dengan air steril sebanyak
3 kali. Sebelum digerus, masing-masing sampel digoreskan pada media nutrient
agar (NA) (3 g beef extract, 5 bacto peptone, 15 agar, dan akuades sampai dengan

11
1 L) sebagai kontrol. Sterilisasi permukaan dianggap berhasil apabila kontrol
tidak ditumbuhi oleh koloni bakteri.
Akar, batang, dan daun digerus secara terpisah dengan mortar dan
ditambahkan 9 mL larutan fisiologis (0.85% NaCl). Ekstrak akar, batang dan daun
diencerkan sampai pengenceran 10-4. Sebanyak 0.1 mL ekstrak dari pengenceran
10-3 dan 10-4 disebar pada media Tryptic Soy Agar (TSA) 5% (0.75 g pancreatic
digest of casein, 0.25 g enzymatic digest of soybean meal, 0.75 g sodium chloride,
15 g agar, dan akuades sampai dengan volume 1 L), TSA 100% (15 g pancreatic
digenst of casein, 5 g enzymatic digest of soybean meal, 15 g sodium chloride, 15
g agar, dan akuades sampai dengan volume 1 L), NA, King’s B 100% (20 g
protease peptone, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4.7H2O, 15 ml gliserol, 15 g agar,
dan akuades sampai volume 1 L), water-yeast extract-agar (WYE) (0.25 g yeast
extract, 0.5 g K2HPO4, 15 g agar, dan akuades sampai volume 1 L), dan casamino
acids-yeast extract-glucose agar (YCED) (0.3 g yeast extract, 0.3 g casamino
acid, 0.3 g D-glukose, 2 g K2HPO4, dan akuades samapi volume 1 L) dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni bakteri yang tumbuh
dimurnikan kemudian disimpan dalam akuades steril.
Penyiapan Isolat X. oryzae pv. oryzae
Isolat bakteri X. oryzae pv oryzae patotipe IV diperoleh dari Balai Besar
Penelitian Padi. Isolat diremajakan pada media Wakimoto (kaldu dari 300 g
kentang, 7 g bacto peptone, 17 g sukrosa, 0.5 g Ca(NO3)2.4H2O, 1 g Na2HPO4.12
H2O, 17 g agar, dan akuades sampai volume 1 L). Uji reaksi hipersensitif (HR)
pada tanaman tembakau dilakukan sebagai konfirmasi bahwa isolat X. oryzae pv
oryzae yang digunakan merupakan bakteri patogen tumbuhan penyebab hawar
daun bakteri.
Uji HR dilakukan pada tanaman tembakau sehat mengikuti metode yang
digunakan Wahyudi et al. (2011). Suspensi X. oryzae pv oryzae patotipe IV dibuat
dengan cara mengambil bakteri sebanyak satu ujung jarum ose ke dalam 5 mL
media Wakimoto cair. Inokulasi dilakukan dengan cara menyuntikkan suspensi
menggunakan jarum suntik volume 1 mL ke bagian permukaan bawah daun tanpa
menembus lapisan daun bagian atas. Gejala diamati maksimal 24 jam setelah
inokulasi.
Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menyiapkan tanaman padi (IR64)
sehat beserta suspensi bakteri X. oryzae pv oryzae patotipe IV. Inokulasi
dilakukan dengan cara menggunting bagian daun menggunakan gunting steril
yang sebelumnya dicelupkan ke dalam suspensi bakteri X. oryzae pv oryzae
patotipe IV. Tanaman padi disungkup untuk menjaga kelembapan. Gejala diamati
setiap hari sampai 1 minggu setelah inokulasi.
Seleksi Isolat Bakteri Endofit Potensial
Uji viabilitas dan morfologi koloni. Bakteri endofit hasil isolasi diseleksi
berdasarkan viabilitas dan morfologi koloni. Bakteri endofit ditumbuhkan pada
media NA dan diinkubasi selama 24 sampai 72 jam. Penapisan dilakukan terhadap
isolat yang tidak tumbuh atau pertumbuhannya lambat. Ciri morfologi koloni
yang diamati diantaranya warna, bentuk, tepian, dan elevasi. Isolat yang memiliki
karakter morfologi sama dianggap sebagai satu isolat.

12
Uji induksi ketahanan dan pemacu pertumbuhan di pembibitan.
Bakteri endofit hasil seleksi berdasarkan viabilitas dan morf