4
II. BAHAN DAN METODE
2.1 Rancangan Perlakuan
Penelitian ini terdiri dari lima perlakuan dengan masing-masing tiga kali ulangan Tabel 1. Perendaman hanya dilakukan satu kali, dan dilakukan dalam
plastik kemas yang biasa digunakan untuk pengemasan post-larva udang vaname Lampiran 2.
Pemeliharaan post-larva udang vaname dilakukan di Laboratorium Nutrisi Balai Budidaya Air Payau BBAP Situbondo. Post-larva udang vaname
dipelihara selama 18 hari dan diberi pakan khusus post-larva berupa flake merek green marine
dengan kadar protein 48, dan naupli Artemia. Pakan diberikan sekenyangnya ad libitum dan diberikan 7 kalihari; 5 kali pakan buatan dan 2
kali naupli Artemia. Pergantian air dilakukan saat pembersihan sisa pakan dilakukan setiap hari pada pagi hari dan pergantian air dilakukan 2 hari sekali. Air
yang digunakan untuk pemeliharaan sebelumnya telah diberi perlakuan terlebih dahulu dengan menggunakan kaporit dan tiosulfat.
Tabel 1. Rancangan perlakuan perendaman rGH Perlakuan Notasi
Lama perendaman dan dosis rHP 1
P1 3 mgL rGH+ BSA 0,01+ 1 jam perendaman
2 P2
3 mgL rGH+ BSA 0,01+ 2 jam perendaman 3
P3 3 mgL rGH+ BSA 0,01+ 3jam perendaman
4 K
0 mg+ 0 BSA 5
KpCold 10 mgL protein Escherchia coli tanpa rGH+
0,01BSA
2.2 Produksi Protein rGH
Bakteri yang digunakan adalah E. coli BL21 yang mengandung konstruski pCold-I vektor ekspresi dan ElGH hormon pertumbuhan kerapu kertang
Lesmana 2010. pCold konstruksi vektor ekspresi tersebut mengandung gen GH ikan kerapu kertang ElGH. Bakteri dikultur awal pada tabung L dalam 6 mL
media kultur LB+NaOH cair yang mengandung ampisilin, tabung L yang berisi kultur bakteri diinkubasi di dalam shaker selama 16-18 jam dengan kecepatan 200
rpm pada suhu 37ºC. Subkultur dilakukan dengan cara mengambil 1 dari kultur
5 bakteri awal dan dimasukan ke dalam 100 mL media LB+NaOH cair yang baru,
kemudian media subkultur diinkubasi di dalam shaker selama 2 jam dengan kecepatan 200 rpm dan suhu 37ºC. Setelah subkultur diinkubasi selama 2 jam,
induksi produksi rGH dilakukan dengan cara memberikan kejutan suhu 15ºC pada subkultur selama 30 menit. Setelah perlakuan kejutan suhu, IPTG isopropyl-b-D-
thiogalac-topyranoside ditambahkan sebanyak 600 µL, dan kemudian subkultur
diinkubasi di dalam shaker selama 24 jam dengan kecepatan 250 rpm dan suhu 15ºC. Bakteri hasil subkultur dikumpulkan dengan cara sentrifugasi media kultur
cair bakteri dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4ºC. Sentrifugasi menghasilkan natan dan supernatant. Supernatant kemudian
dibuang, proses ini dilakukan sampai semua bakteri hasil kultur habis. Pelet bakteri yang dihasilkan dari sentrifugasi kemudian dicuci dengan PBS phosphate
buffer salin sebanyak 2 kali untuk menghilangkan kotoran ataupun sisa media
kultur. Pelet bakteri yang telah dicuci dengan PBS dapat disimpan di deep-freezer -80ºC atau langsung dilisis. Alur kultur bakteri dapat dilihat di Lampiran 1.
Lisozim digunakan untuk melisis dinding sel bakteri. Pelet hasil sentrifugasi dicuci dengan 1 mL bufer 1x tris-EDTA TE dengan cara pipeting
sampai rata. Setelah itu campuran pelet dan 1 mL buffer 1xTE diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37ºC, disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15
menit pada suhu 4ºC, dan kemudian supernatant di dalam tube dibuang. Tahap selanjutnya adalah menambahkan 500 µL larutan lisozim 10 mg lisozim dalam 1
mL bufer 1xTE. Campuran larutan lisozim dan pelet dihomogenasi menggunakan pipet, diinkubasi pada suhu 37ºC selama 20 menit, disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit, dan supernatant kemudian dibuang. Pelet yang terbentuk merupakan protein rGH dalam bentuk badan
inklusi. Pelet rGH dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali seperti pencucian pada saat pemanenan bakteri subkultur, pelet yang telah dicuci kemudian disimpan di deep-
freezer -80ºC hingga digunakan.
6
2.3 Parameter Yang Diamati
Kategori