Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin
KERAGAMAN GENETIK
ISOLAT Escherichia coli DARI RONGGA MULUT BIAWAK (Varalllls)
DAN KLONING GEN PENYANDI RESISTENSI AMPISILIN
YOGIARA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarj ana Sains
. pada
Program Studi Biologi
." ""
JURUSAN BIOLOGI ... "
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul : Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak
(Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin
Nanla : Yogiara
NIM :G31.1556
Menyetujui,
Df. If. Antonius Suwanto. M.Sc.
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 28 Desember 1998
-
Dra. Amarila Malik. M.Si.
Pembimbing II
RINGKASAN
YOGIARA. Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan
Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin (Genetic Diversity Analyses a/Escherichia coli isolatedfrom
Oral 0/ Biawak Monilor [Varanus]) and Clonning 0/ Ampicillin Resistance Gene. Dibimbing oleh
ANTONWS SUWANTO dan AMARILA MALIK.
Biawak merupakan reptilia yang tidak memiliki kelenjar bisa. Namun ternyata gigitannya dapat
menyebabkan infeksi (bakteremia). Diduga infeksi ini disebabkan oleh mikrobe yang hidup pada oral
biawak tersebut. Infonnasi mengenai gen penyandi resistensi terhadap antibiotika yang diperoleh dari
mikrobe yang hidup di alam masih sedikit. Pada penelitian ini diperoleh 12 bakteri Escherichia coli yang
resisten terhadap antibiotika ampisilin dari 13 isolat E. coli yang berhasil diisolasi. Analisa keragaman
genetik terhadap 12 isolat E. coli yang resisten menghasilkan 9 profil schizotyping Spel yang beragam.
Tiga isolat lainnya tidak dapat menghasilkan pola pita DNA yang diskrit kemungkinan dikarenakan
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak berhasil diinaktivasi saat penyiapan DNA genom
utuh.
Selanjutuya pada penelitian ini juga diperoleh transfonnan E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
rekombinan pAS901 berukuran 15 kb, dan transforman E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
endogenous pVar2.2 berukuran 5,8 kb. Hal ini juga menginformasikan ballWa sifat resistensi terhadap
ampisilin, yang dimiliki oleh isolat E. coli yang diisolasi dari oral biawak, dikodekan ole11 gen yang
terdapat di dalam plasmid.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal19 Januari 1975 sebagai anak kedua dari empat bersaudara,
anak dari pasangan H. Sarjo Nitiatmaja dan Ratih Sugiarti.
Tahun 1993 penulis lulus dari SMU Negeri 78 Jakarta Barat dan pada tahun yang sarna lulus Ujian
Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) diterima di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Fakultas
Pertanian, Universitas Padjadjaran, BandlIng. Pada tahun 1994 penulis mengikuti kembali UMPTN dan
diterima di Institut Pertanian Bogar, Pada tahun 1995 penulis memilih Program Studi Biologi, junlsan
Biologi, Fakultas Matematika dan I1mu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penuHs pemah menjadi asisten program Humaniora untuk cabang o1ah
raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada tahun ajaran 199411995, 199511996, dan
199611997, pelatih olah raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada mata kuliah Olah Raga dan
Seni untuk tahun ajaran 199711998 dan 199811999, asisten luar biasa mata kuliah Biologi Dasar I pada
tahun ajaran 199611997 dan 199711998, mata kuliah Rekayasa Genetika pada tahun ajaran 199711998, se11a
mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Bakteri pada tahun ajaran 1998/1999. Pada tahun 1998 penulis
bekerja sebagai pengajar Biologi di Lembaga Pendidikan TEKNOS cabang Bogor.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Januari 1998 ini ialah Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus)
dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantn penyelesaian
karya ilmiah ini, antara lain Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing I atas
bimbingannya yang luar biasa serta kesempatan yang diberikan sebagai asisten praktikum pada beberapa
mata kuliah yang beliau asuh, Ibu Dra. Amarila Malik, M.Si. selaku pembimbing II atas saran dan
pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ihniah ini. Di samping itn penghargaan diberikan
kepada Bapak Husen Samhari yang telah membantn pelaksanaan penelitian, Bapak Dr. Drs. Yaya
Rukayadi, M.Si., Bapak Drs.Samsul A. Yani
kasih
atas saran dan pengarahan selama penelitian ini. Terima
penulis ucapkan pula kepada ayah, ibu, Ang Dida, Nola, Neli, ternan-ternan sepeIjuangan:
Triwidodo, Ronald, Sari, lin, dan lain-lain yang tidak mungkin disebutkan satn persatn, atas segala doa
dan dukungan yang diberikan.
Sernoga karya ilmiah ini dapat bennanfaat.
Bogor, Desember 1998
Yogiara
DAFTARISI
DAFTAR GAMBAR ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .....
Halaman
v
DAFTAR TABEL ...... .................. ... ......... ..................... ... ... ... ...... ......... ... .....
v
DAFTARLAMPIRAN ....................................................................................
vi
PENDAHULUA.!'I ...... ......... ........................ .................. ... ... ... ...... ............ .....
1
BAHAN DAN METODE
Galur bakteri, plasmid dan spesimen asa! sampel .......................................... .
Pengambilan sampel ............................................................................ .
Isolasi dan Seleksi Bakteri Resisten Ampisilin ............................................. .
Identifikasi Bakteri ............................................................................. .
Analisis Keragaman Genetik .................................................................. .
Kloning dan Transformasi DNA Genom .................................................... .
2
2
4
4
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Penapisan E. coli Resisten Ampisilin ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. ...
Analisis Keragaman Genetik ... .. . ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . ... . .. ... ... ... .. . ... ....
Kloning dan Transformasi Gen Penyandi Resistensi Ampisilin ..................... ... ...
6
KESIlvIPULAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .....
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
4
6
II
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Pengambilan sampel cairan dari rongga mulu! biawak ..................... ... ... . . . . . . ... ...
2
2.
A. Profil schizo typing beberapa isola! E. coli yang diisolasi dari oral biawak.
Lajur M: DNA genom Rhodobacter sphaeroides yang dipotong dengan
enzim restriksi AseI sebagai penanda molekuIer. Lajur 1: isolat 5-1,
lajur 2: isolat 7-1, lajur 3: isolat 30-1, lajur 4: isolat 31-2, lajur 5: isolat 30-2,
lajur 6: isolat 23-2, lajur 7: isolat 31-4, lajur 8: isolat 4-1, lajur 9: isolat 6-1.
Kondisi pemisahan (running) DNA: 0.9% high melting point agarose (HMA),
0.5 x lamtan penyangga Tris-Borat EDTA (TEE), subu lamtan penyangga 14°C,
waktu pulsa ramping/ramping pulse lime 2-40 detik, waktu pemisahan 20 jam,
tegangan 5.4 volt (28-30 mAl.
B. Diagram profil schizotyping SpeI isolat E. coli hasil interpretasi PFGE ............ ...
7
A.Hasii elektroforesis pemotongan p Var2.2 dengan enzim restriksi
XhoI+HindIll(I); EcoRl(2); EcoRl+XhoI(3); EcoRl+HindIII(4);
penanda molekuler I kb DNA ladder (M). B. Hasil pemotongan
plasmid pVar30.2. Plasmid pVar30.2 utub (1 dan 3); pVar30.2
dipotong enzim restriksi EcoRl (2 dan 4); penanda lkb DNA ladder (M).
C.Hasii pemotongan pAS901. Penanda molekuler I kb DNA ladder (M),
plasmid rekombinan pAS901 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl (1),
HindIII(2), EcoRl+HindIII (3),XhoI (4), danXhoI+HindIII (5) ... ...... ... ... ... ... ... .....
8
Peta restriksi plasmid pAS90 1 dan P Var2.2 .......................... ......................................
9
3.
4.
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Bakteri dan plasmid ...............................................; .............; ............................................. .
2
2.
Daftar spesimen biawak (Varanus) yang digunakan sebagai sampel .............................. .
3
3.
Hubungan antara isolat,spesies spesimen, daerah asal spesimen, pakan,
dan karakter fisiologi .............................................................................. .
5
Pengamatan basil transformasi DNA genom secara langsung .......................................... .
6
4.
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Tabel pengamatan morfologi koloni isolat E. coli pada media
Cawan agar EMB ...................................................................................... .
12
2.
Tabel isolat Escherichia coli hasil seleksi antibiotika ampisilin (100 flglml) ............ .
13
3.
Tabel identifikasi isolat E. coli resisten ampisilin (l00 flglml) melalui
uji fisiologis sederhana ............................................................................... .
13
Tabel hasil identifrkasi dengan menggunakan Microbact®
24E (l2E/12A+ 12B) .............................................................................. .
14
S.
Hasil pemotongan pAS90 1 dengan sejumlah enzim restriksi ............................... .
IS
6.
Hasil pemotongan pVar2.2 dengan sejumlah enzim restriksi ................................
IS
7.
Stnrktur kimia beberapa antibiotika keluarga penisilin, tanda panall
menunjukkan situs aktivitas enzim ｾＭｬ｡ｫｴｭｳ･＠
............................................................. .
IS
Vektor kloning plasmid pAS900 ................................................................ .
16
1.
4.
8.
1
PENDAHULUAN
Mikroorganisme,
khususnya
bakteri
memiliki habitat alami yang sangat beragam.
Bakteri dapat ditemukan mulai dari dasar laut
sampai PWlCak gWlWlg. Beberapa di antaranya
hidup pada organisme lain, baik sebagai patogen
maupWl mikrobiota normal. Bahkan ada bakteri
yang mampu hidup pada kondisi lingkungan yang
ekstrem, misalnya pada temperatur atau kadar
garam yang tinggi (Brock dan Madigan, 1991).
Berkaitan dengan habitat alami tersebut,
Auffenberg (1981) telah mengidentifikasi beberapa
spesies bakteri yang hidup pada komodo (Varanus
komodoensis), yaitu Proteus morganii, Proteus
vulgaris, Providencia sp., dan Staphylococcus sp ..
Setelah pemeliharaan komodo selama tujuh tahWl
maka keempat spesies ini tidak dapat ditemukan,
yang ada hanya Pseudomonas sp. Ketiadaan
keempat spesies tersebut mWlgkin disebabkan oleh
pakan dan lingkWlgan penangkaran yang berbeda
dengan habitat aslinya. Oleh karena Varanus tidak
memiliki kelenjar bisa (Zug, 1993) maka
Auffenberg (1981) menduga bahwa keberadaan
bakteri inilah yang menyebabkan teIjadinya infeksi
yang dapat menimbulkan kematian pada luka
gigitan komodo.
Untuk mengetahui lebih jauh tentang
mikroorganisme yang berasosiasi dengan biawak
perlu dilakukan serangkaian penelitian tentang
jenis dan karakteristik mikroorganisme yang hidup
pada biawak. Habitat biawak merupakan habitat
alam yang relatif jauh dari campur tangan manusia.
Informasi tentang bakteri yang hidup di lingkWlgan
alarniah, seperti yang ·hidup pada biawak sangat
penting terutama yang berhubWlgan dengan sifat
Menurut
resistensi t"rhadap antibiotika.
Desselberger (1998) data mengenai keberadaan
gen penyandi resistensi antibiotika pada bakteri
yang hidup di lingkWlgan alami masih langka.
Sementara itu peningkatan isolat bakteri (termasuk
E. coli ) sekarang ini mendapat perhatian yang
cukup serius. Neu (1992) melaporkan bahwa 40%75% isolat E. coli yang diisolasi dari rumah sakit
memiliki sifat resistensi terhadap berbagai
antibiotika dari keluarga Penisilin. Desselberger
(1998) juga melaporkan adanya peningkatan yang
nyata dari mikrobe yang resistensi terhadap
sejumlall bahan antimikrobe.
Ampisilin merupakan antibiotik keluarga fllaktam yang menghambat pembentukan dinding sel
bakteri. Penghambatan pembentukan dinding sel
teIjadi pada saat bakteri memasuki fase log
pertumbuharmya.
Pada fase ini sel bakteri
membelah dengan laju yang konstan, massa sel
menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama,
dengan aktivitas metabolisme yang konstan.
Penambahan ampisilin setelah 20 menit pada kultur
bakteri menyebabkan penonjolan pada bagian
dinding sel bakteri. Penonjolan ini menyebabkan
dinding sel menjadi rentan terhadap tekanan
internal sebingga mudah rusakJpecah. Selain itu
juga dinding sel dapat langsung mengalami
kerusakanlpecah (Gale et al., 1981, dan Alcamo,
1997).
Resistensi terhadap ampisilin antara lain
disebabkan oleh fungsi katalitik enzim fllaktamase. Enzim ini diekspresikah oleh gen bla
yang dapat memutus cincin fl-Iaktam pada
ampisilin. Akibat putusnya atau rusalmya cincin fllaktam, ampisilin tidak dapat lagi menjadi
penghambat sintesis dinding sel bakteri (Gale et
al., 1981).
Pada penelitian ini, keragaman bakteri
dilillat melalui analisis keragaman genetik secara
schizo typing atau Macrorestriction Fragment
Length
Polymorphisms
(MFLP)
dengan
menggWlakan Pulsed Field Gel Electrophoresis
(pFGE). Schizotyping merupakan analisis total
DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA
yang telall dipotong oleh enzim restriksi yang
memotong jarang (Suwanto dan Kaplan, 1992).
PFGE merupakan teknologi pemisahan DNA
berukuran besar. Teknik ini dapat memisahkan
DNA berukuran lebih dati 50 kilo pasang basa
(kb).
Suwanto (1994) menjelaskan ballwa semua
molekul DNA linier utas ganda yang lebih besar
dari ukuran tertentu (biasanya lebih dati 50 kb)
akan bergerak dalam gel agarosa pada kecepatan
yang sama. Batas kemampuan pemisahan ini akan
tercapai bila jari-jari girase DNA dupleks linier
tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Molekul
DNA tersebut tidak dapat disaring melalui poripori gel berdasarkan ukurarmya tetapi hams
bergerak dati ujung ke ujung. Cara pemindallan
moleknl DNA seperti ini disebut reptasi. Untuk
dapat keluar dari kondisi reptasi, molekul DNA
hams mengubah orientasi pergerakannya.
Pada PFGE moleknl-molekul
DNA
dipisahkan berdasarkan kemampuan orientasinya
dalam medan listrik, semakin besar moleknl DNA
semakin lama waktu orientasinya. Moleknl DNA
yang berukuran besar akan terperangkap dalam
kondisi reptasinya setiap kali arah medan listrik
diubah
dan
tidak
mampu
melanjutkan
perpindahannya di dalam gel sampai terjadi
2
Tabel I. Bakteri dan plasmid
Bakteri, plasmid
KarakteIistik yang reI evan
Escherichia coli
TOPIO
F mcrA t> (mrr-hsdIFMS-mcrBC) 080lacZ MIS
MacX74 recAI deaR araD139 t> (ara-Ieu) 7697
galU ga/K rpsL (SuR) e"dAr nupG
Plasmid
pAS900
pAS901
pVar2.2
Turunan dari [email protected] (Invitrogen, Co.), Situs
pengldonan ganda (multiple cloning sile) satu situs
EcoRl, Km' (derivat Tn5), t>Ap' dengan delesi pada
situs Xillal dan Scal
Km'; 11,2 kb fragmen penyandi Ap' dari E. coli 2-2EcoRl yang diklon pada pAS900 - EcoRl,
5,8 kb plasmid endogenous E. coli 2-2 yang
menyandikan Ap'
orientasi kembali sepanjang sumbu yang barn pada
medan listrik tersebut.
Seltingga jika waktu
orientasi molekul DNA kurang dari periode waktu
pergantian medan listrik (waktu pulsa/ramping
pulse lime) maka DNA dapat dipisahkan
berdasarkan ukurarmya (Cantor el al., 1988).
Menurnt Poh el al. (1992), pencirian yang
berdasarkan pada analisis genom dengan
menggunakan PFGE memberikan hasil yang lebih
diskriminatif dibandingkan dengan analisis
ribotyping. Schizotyping telall digunakan untuk
analisis keragaman galur-galur Brucella (Allardet
el al., 1988); Lisleria (Howard el 01., 1992);
Sirepiomyces ambo/aciens (Leblond el 01., 1990);
Xanlhomonas campeslris pv glycines (Rukayadi,
1995); Pseudomonas aeruginosa (poh el 01,. 1992);
Escherichia coli (Bergthorsson dan Oclunan,
1995), dan Laclococcus (Tanskanen, el 01., 1990;
La Bourgeois el 01., 1989).
T1uuan penelitian Ill! adalah unluk
melakukan penapisan Escherichia coli yang
resisten ampisilin yang diisolasi dari rongga mulut
berbagai jenis biawak, menganalisis keragaman
genetiknya
dengan
Pulsed
Field
Gel
Eleclrophoresis (PFGE), dan mengisolasi gen
penyandi resistensi terhadap ampisilin.
Sumber atau referensi
Invitrogen, California
A. Snwanto (tidak
dipublikasi)
Penelitian ini
Penelitian ini
Galur balded, plasmid dan spesimen asal
sampel
Galur bakteri dan plasmid yang digunakan
di dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel I.
Daftar spesimen asal sampel terdapat pada Tabel 2.
Pengambilan Sampel
Spesimen biawak
berasal dari koleksi
Fraak Yuwono, Jakarta. Contoh oral biawak
diambil dengan menggunakan ujllng tusuk sate
yang sudah dibalut kapas (steril), diusapkan di
anlara gigi, lalu disuspensikan dalam 2 m1 0,85%
lamlan garam fisiologis steril.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan mulai bulan J anuari
1998 sampai dengan November 1998, di
LaboratorilUn Biologi Molekuler SEAMEO
BIOTROP, Tajur-Bogor, dan Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB
Bogor.
Gambar I. Pengambilan sampel cairan dari rongga
mulut biawak.
KERAGAMAN GENETIK
ISOLAT Escherichia coli DARI RONGGA MULUT BIAWAK (Varalllls)
DAN KLONING GEN PENYANDI RESISTENSI AMPISILIN
YOGIARA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarj ana Sains
. pada
Program Studi Biologi
." ""
JURUSAN BIOLOGI ... "
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul : Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak
(Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin
Nanla : Yogiara
NIM :G31.1556
Menyetujui,
Df. If. Antonius Suwanto. M.Sc.
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 28 Desember 1998
-
Dra. Amarila Malik. M.Si.
Pembimbing II
RINGKASAN
YOGIARA. Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan
Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin (Genetic Diversity Analyses a/Escherichia coli isolatedfrom
Oral 0/ Biawak Monilor [Varanus]) and Clonning 0/ Ampicillin Resistance Gene. Dibimbing oleh
ANTONWS SUWANTO dan AMARILA MALIK.
Biawak merupakan reptilia yang tidak memiliki kelenjar bisa. Namun ternyata gigitannya dapat
menyebabkan infeksi (bakteremia). Diduga infeksi ini disebabkan oleh mikrobe yang hidup pada oral
biawak tersebut. Infonnasi mengenai gen penyandi resistensi terhadap antibiotika yang diperoleh dari
mikrobe yang hidup di alam masih sedikit. Pada penelitian ini diperoleh 12 bakteri Escherichia coli yang
resisten terhadap antibiotika ampisilin dari 13 isolat E. coli yang berhasil diisolasi. Analisa keragaman
genetik terhadap 12 isolat E. coli yang resisten menghasilkan 9 profil schizotyping Spel yang beragam.
Tiga isolat lainnya tidak dapat menghasilkan pola pita DNA yang diskrit kemungkinan dikarenakan
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak berhasil diinaktivasi saat penyiapan DNA genom
utuh.
Selanjutuya pada penelitian ini juga diperoleh transfonnan E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
rekombinan pAS901 berukuran 15 kb, dan transforman E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
endogenous pVar2.2 berukuran 5,8 kb. Hal ini juga menginformasikan ballWa sifat resistensi terhadap
ampisilin, yang dimiliki oleh isolat E. coli yang diisolasi dari oral biawak, dikodekan ole11 gen yang
terdapat di dalam plasmid.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal19 Januari 1975 sebagai anak kedua dari empat bersaudara,
anak dari pasangan H. Sarjo Nitiatmaja dan Ratih Sugiarti.
Tahun 1993 penulis lulus dari SMU Negeri 78 Jakarta Barat dan pada tahun yang sarna lulus Ujian
Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) diterima di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Fakultas
Pertanian, Universitas Padjadjaran, BandlIng. Pada tahun 1994 penulis mengikuti kembali UMPTN dan
diterima di Institut Pertanian Bogar, Pada tahun 1995 penulis memilih Program Studi Biologi, junlsan
Biologi, Fakultas Matematika dan I1mu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penuHs pemah menjadi asisten program Humaniora untuk cabang o1ah
raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada tahun ajaran 199411995, 199511996, dan
199611997, pelatih olah raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada mata kuliah Olah Raga dan
Seni untuk tahun ajaran 199711998 dan 199811999, asisten luar biasa mata kuliah Biologi Dasar I pada
tahun ajaran 199611997 dan 199711998, mata kuliah Rekayasa Genetika pada tahun ajaran 199711998, se11a
mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Bakteri pada tahun ajaran 1998/1999. Pada tahun 1998 penulis
bekerja sebagai pengajar Biologi di Lembaga Pendidikan TEKNOS cabang Bogor.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Januari 1998 ini ialah Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus)
dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantn penyelesaian
karya ilmiah ini, antara lain Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing I atas
bimbingannya yang luar biasa serta kesempatan yang diberikan sebagai asisten praktikum pada beberapa
mata kuliah yang beliau asuh, Ibu Dra. Amarila Malik, M.Si. selaku pembimbing II atas saran dan
pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ihniah ini. Di samping itn penghargaan diberikan
kepada Bapak Husen Samhari yang telah membantn pelaksanaan penelitian, Bapak Dr. Drs. Yaya
Rukayadi, M.Si., Bapak Drs.Samsul A. Yani
kasih
atas saran dan pengarahan selama penelitian ini. Terima
penulis ucapkan pula kepada ayah, ibu, Ang Dida, Nola, Neli, ternan-ternan sepeIjuangan:
Triwidodo, Ronald, Sari, lin, dan lain-lain yang tidak mungkin disebutkan satn persatn, atas segala doa
dan dukungan yang diberikan.
Sernoga karya ilmiah ini dapat bennanfaat.
Bogor, Desember 1998
Yogiara
DAFTARISI
DAFTAR GAMBAR ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .....
Halaman
v
DAFTAR TABEL ...... .................. ... ......... ..................... ... ... ... ...... ......... ... .....
v
DAFTARLAMPIRAN ....................................................................................
vi
PENDAHULUA.!'I ...... ......... ........................ .................. ... ... ... ...... ............ .....
1
BAHAN DAN METODE
Galur bakteri, plasmid dan spesimen asa! sampel .......................................... .
Pengambilan sampel ............................................................................ .
Isolasi dan Seleksi Bakteri Resisten Ampisilin ............................................. .
Identifikasi Bakteri ............................................................................. .
Analisis Keragaman Genetik .................................................................. .
Kloning dan Transformasi DNA Genom .................................................... .
2
2
4
4
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Penapisan E. coli Resisten Ampisilin ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. ...
Analisis Keragaman Genetik ... .. . ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . ... . .. ... ... ... .. . ... ....
Kloning dan Transformasi Gen Penyandi Resistensi Ampisilin ..................... ... ...
6
KESIlvIPULAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .....
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
4
6
II
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Pengambilan sampel cairan dari rongga mulu! biawak ..................... ... ... . . . . . . ... ...
2
2.
A. Profil schizo typing beberapa isola! E. coli yang diisolasi dari oral biawak.
Lajur M: DNA genom Rhodobacter sphaeroides yang dipotong dengan
enzim restriksi AseI sebagai penanda molekuIer. Lajur 1: isolat 5-1,
lajur 2: isolat 7-1, lajur 3: isolat 30-1, lajur 4: isolat 31-2, lajur 5: isolat 30-2,
lajur 6: isolat 23-2, lajur 7: isolat 31-4, lajur 8: isolat 4-1, lajur 9: isolat 6-1.
Kondisi pemisahan (running) DNA: 0.9% high melting point agarose (HMA),
0.5 x lamtan penyangga Tris-Borat EDTA (TEE), subu lamtan penyangga 14°C,
waktu pulsa ramping/ramping pulse lime 2-40 detik, waktu pemisahan 20 jam,
tegangan 5.4 volt (28-30 mAl.
B. Diagram profil schizotyping SpeI isolat E. coli hasil interpretasi PFGE ............ ...
7
A.Hasii elektroforesis pemotongan p Var2.2 dengan enzim restriksi
XhoI+HindIll(I); EcoRl(2); EcoRl+XhoI(3); EcoRl+HindIII(4);
penanda molekuler I kb DNA ladder (M). B. Hasil pemotongan
plasmid pVar30.2. Plasmid pVar30.2 utub (1 dan 3); pVar30.2
dipotong enzim restriksi EcoRl (2 dan 4); penanda lkb DNA ladder (M).
C.Hasii pemotongan pAS901. Penanda molekuler I kb DNA ladder (M),
plasmid rekombinan pAS901 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl (1),
HindIII(2), EcoRl+HindIII (3),XhoI (4), danXhoI+HindIII (5) ... ...... ... ... ... ... ... .....
8
Peta restriksi plasmid pAS90 1 dan P Var2.2 .......................... ......................................
9
3.
4.
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Bakteri dan plasmid ...............................................; .............; ............................................. .
2
2.
Daftar spesimen biawak (Varanus) yang digunakan sebagai sampel .............................. .
3
3.
Hubungan antara isolat,spesies spesimen, daerah asal spesimen, pakan,
dan karakter fisiologi .............................................................................. .
5
Pengamatan basil transformasi DNA genom secara langsung .......................................... .
6
4.
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Tabel pengamatan morfologi koloni isolat E. coli pada media
Cawan agar EMB ...................................................................................... .
12
2.
Tabel isolat Escherichia coli hasil seleksi antibiotika ampisilin (100 flglml) ............ .
13
3.
Tabel identifikasi isolat E. coli resisten ampisilin (l00 flglml) melalui
uji fisiologis sederhana ............................................................................... .
13
Tabel hasil identifrkasi dengan menggunakan Microbact®
24E (l2E/12A+ 12B) .............................................................................. .
14
S.
Hasil pemotongan pAS90 1 dengan sejumlah enzim restriksi ............................... .
IS
6.
Hasil pemotongan pVar2.2 dengan sejumlah enzim restriksi ................................
IS
7.
Stnrktur kimia beberapa antibiotika keluarga penisilin, tanda panall
menunjukkan situs aktivitas enzim ｾＭｬ｡ｫｴｭｳ･＠
............................................................. .
IS
Vektor kloning plasmid pAS900 ................................................................ .
16
1.
4.
8.
1
PENDAHULUAN
Mikroorganisme,
khususnya
bakteri
memiliki habitat alami yang sangat beragam.
Bakteri dapat ditemukan mulai dari dasar laut
sampai PWlCak gWlWlg. Beberapa di antaranya
hidup pada organisme lain, baik sebagai patogen
maupWl mikrobiota normal. Bahkan ada bakteri
yang mampu hidup pada kondisi lingkungan yang
ekstrem, misalnya pada temperatur atau kadar
garam yang tinggi (Brock dan Madigan, 1991).
Berkaitan dengan habitat alami tersebut,
Auffenberg (1981) telah mengidentifikasi beberapa
spesies bakteri yang hidup pada komodo (Varanus
komodoensis), yaitu Proteus morganii, Proteus
vulgaris, Providencia sp., dan Staphylococcus sp ..
Setelah pemeliharaan komodo selama tujuh tahWl
maka keempat spesies ini tidak dapat ditemukan,
yang ada hanya Pseudomonas sp. Ketiadaan
keempat spesies tersebut mWlgkin disebabkan oleh
pakan dan lingkWlgan penangkaran yang berbeda
dengan habitat aslinya. Oleh karena Varanus tidak
memiliki kelenjar bisa (Zug, 1993) maka
Auffenberg (1981) menduga bahwa keberadaan
bakteri inilah yang menyebabkan teIjadinya infeksi
yang dapat menimbulkan kematian pada luka
gigitan komodo.
Untuk mengetahui lebih jauh tentang
mikroorganisme yang berasosiasi dengan biawak
perlu dilakukan serangkaian penelitian tentang
jenis dan karakteristik mikroorganisme yang hidup
pada biawak. Habitat biawak merupakan habitat
alam yang relatif jauh dari campur tangan manusia.
Informasi tentang bakteri yang hidup di lingkWlgan
alarniah, seperti yang ·hidup pada biawak sangat
penting terutama yang berhubWlgan dengan sifat
Menurut
resistensi t"rhadap antibiotika.
Desselberger (1998) data mengenai keberadaan
gen penyandi resistensi antibiotika pada bakteri
yang hidup di lingkWlgan alami masih langka.
Sementara itu peningkatan isolat bakteri (termasuk
E. coli ) sekarang ini mendapat perhatian yang
cukup serius. Neu (1992) melaporkan bahwa 40%75% isolat E. coli yang diisolasi dari rumah sakit
memiliki sifat resistensi terhadap berbagai
antibiotika dari keluarga Penisilin. Desselberger
(1998) juga melaporkan adanya peningkatan yang
nyata dari mikrobe yang resistensi terhadap
sejumlall bahan antimikrobe.
Ampisilin merupakan antibiotik keluarga fllaktam yang menghambat pembentukan dinding sel
bakteri. Penghambatan pembentukan dinding sel
teIjadi pada saat bakteri memasuki fase log
pertumbuharmya.
Pada fase ini sel bakteri
membelah dengan laju yang konstan, massa sel
menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama,
dengan aktivitas metabolisme yang konstan.
Penambahan ampisilin setelah 20 menit pada kultur
bakteri menyebabkan penonjolan pada bagian
dinding sel bakteri. Penonjolan ini menyebabkan
dinding sel menjadi rentan terhadap tekanan
internal sebingga mudah rusakJpecah. Selain itu
juga dinding sel dapat langsung mengalami
kerusakanlpecah (Gale et al., 1981, dan Alcamo,
1997).
Resistensi terhadap ampisilin antara lain
disebabkan oleh fungsi katalitik enzim fllaktamase. Enzim ini diekspresikah oleh gen bla
yang dapat memutus cincin fl-Iaktam pada
ampisilin. Akibat putusnya atau rusalmya cincin fllaktam, ampisilin tidak dapat lagi menjadi
penghambat sintesis dinding sel bakteri (Gale et
al., 1981).
Pada penelitian ini, keragaman bakteri
dilillat melalui analisis keragaman genetik secara
schizo typing atau Macrorestriction Fragment
Length
Polymorphisms
(MFLP)
dengan
menggWlakan Pulsed Field Gel Electrophoresis
(pFGE). Schizotyping merupakan analisis total
DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA
yang telall dipotong oleh enzim restriksi yang
memotong jarang (Suwanto dan Kaplan, 1992).
PFGE merupakan teknologi pemisahan DNA
berukuran besar. Teknik ini dapat memisahkan
DNA berukuran lebih dati 50 kilo pasang basa
(kb).
Suwanto (1994) menjelaskan ballwa semua
molekul DNA linier utas ganda yang lebih besar
dari ukuran tertentu (biasanya lebih dati 50 kb)
akan bergerak dalam gel agarosa pada kecepatan
yang sama. Batas kemampuan pemisahan ini akan
tercapai bila jari-jari girase DNA dupleks linier
tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Molekul
DNA tersebut tidak dapat disaring melalui poripori gel berdasarkan ukurarmya tetapi hams
bergerak dati ujung ke ujung. Cara pemindallan
moleknl DNA seperti ini disebut reptasi. Untuk
dapat keluar dari kondisi reptasi, molekul DNA
hams mengubah orientasi pergerakannya.
Pada PFGE moleknl-molekul
DNA
dipisahkan berdasarkan kemampuan orientasinya
dalam medan listrik, semakin besar moleknl DNA
semakin lama waktu orientasinya. Moleknl DNA
yang berukuran besar akan terperangkap dalam
kondisi reptasinya setiap kali arah medan listrik
diubah
dan
tidak
mampu
melanjutkan
perpindahannya di dalam gel sampai terjadi
2
Tabel I. Bakteri dan plasmid
Bakteri, plasmid
KarakteIistik yang reI evan
Escherichia coli
TOPIO
F mcrA t> (mrr-hsdIFMS-mcrBC) 080lacZ MIS
MacX74 recAI deaR araD139 t> (ara-Ieu) 7697
galU ga/K rpsL (SuR) e"dAr nupG
Plasmid
pAS900
pAS901
pVar2.2
Turunan dari [email protected] (Invitrogen, Co.), Situs
pengldonan ganda (multiple cloning sile) satu situs
EcoRl, Km' (derivat Tn5), t>Ap' dengan delesi pada
situs Xillal dan Scal
Km'; 11,2 kb fragmen penyandi Ap' dari E. coli 2-2EcoRl yang diklon pada pAS900 - EcoRl,
5,8 kb plasmid endogenous E. coli 2-2 yang
menyandikan Ap'
orientasi kembali sepanjang sumbu yang barn pada
medan listrik tersebut.
Seltingga jika waktu
orientasi molekul DNA kurang dari periode waktu
pergantian medan listrik (waktu pulsa/ramping
pulse lime) maka DNA dapat dipisahkan
berdasarkan ukurarmya (Cantor el al., 1988).
Menurnt Poh el al. (1992), pencirian yang
berdasarkan pada analisis genom dengan
menggunakan PFGE memberikan hasil yang lebih
diskriminatif dibandingkan dengan analisis
ribotyping. Schizotyping telall digunakan untuk
analisis keragaman galur-galur Brucella (Allardet
el al., 1988); Lisleria (Howard el 01., 1992);
Sirepiomyces ambo/aciens (Leblond el 01., 1990);
Xanlhomonas campeslris pv glycines (Rukayadi,
1995); Pseudomonas aeruginosa (poh el 01,. 1992);
Escherichia coli (Bergthorsson dan Oclunan,
1995), dan Laclococcus (Tanskanen, el 01., 1990;
La Bourgeois el 01., 1989).
T1uuan penelitian Ill! adalah unluk
melakukan penapisan Escherichia coli yang
resisten ampisilin yang diisolasi dari rongga mulut
berbagai jenis biawak, menganalisis keragaman
genetiknya
dengan
Pulsed
Field
Gel
Eleclrophoresis (PFGE), dan mengisolasi gen
penyandi resistensi terhadap ampisilin.
Sumber atau referensi
Invitrogen, California
A. Snwanto (tidak
dipublikasi)
Penelitian ini
Penelitian ini
Galur balded, plasmid dan spesimen asal
sampel
Galur bakteri dan plasmid yang digunakan
di dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel I.
Daftar spesimen asal sampel terdapat pada Tabel 2.
Pengambilan Sampel
Spesimen biawak
berasal dari koleksi
Fraak Yuwono, Jakarta. Contoh oral biawak
diambil dengan menggunakan ujllng tusuk sate
yang sudah dibalut kapas (steril), diusapkan di
anlara gigi, lalu disuspensikan dalam 2 m1 0,85%
lamlan garam fisiologis steril.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan mulai bulan J anuari
1998 sampai dengan November 1998, di
LaboratorilUn Biologi Molekuler SEAMEO
BIOTROP, Tajur-Bogor, dan Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB
Bogor.
Gambar I. Pengambilan sampel cairan dari rongga
mulut biawak.
ISOLAT Escherichia coli DARI RONGGA MULUT BIAWAK (Varalllls)
DAN KLONING GEN PENYANDI RESISTENSI AMPISILIN
YOGIARA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarj ana Sains
. pada
Program Studi Biologi
." ""
JURUSAN BIOLOGI ... "
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul : Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak
(Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin
Nanla : Yogiara
NIM :G31.1556
Menyetujui,
Df. If. Antonius Suwanto. M.Sc.
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 28 Desember 1998
-
Dra. Amarila Malik. M.Si.
Pembimbing II
RINGKASAN
YOGIARA. Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan
Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin (Genetic Diversity Analyses a/Escherichia coli isolatedfrom
Oral 0/ Biawak Monilor [Varanus]) and Clonning 0/ Ampicillin Resistance Gene. Dibimbing oleh
ANTONWS SUWANTO dan AMARILA MALIK.
Biawak merupakan reptilia yang tidak memiliki kelenjar bisa. Namun ternyata gigitannya dapat
menyebabkan infeksi (bakteremia). Diduga infeksi ini disebabkan oleh mikrobe yang hidup pada oral
biawak tersebut. Infonnasi mengenai gen penyandi resistensi terhadap antibiotika yang diperoleh dari
mikrobe yang hidup di alam masih sedikit. Pada penelitian ini diperoleh 12 bakteri Escherichia coli yang
resisten terhadap antibiotika ampisilin dari 13 isolat E. coli yang berhasil diisolasi. Analisa keragaman
genetik terhadap 12 isolat E. coli yang resisten menghasilkan 9 profil schizotyping Spel yang beragam.
Tiga isolat lainnya tidak dapat menghasilkan pola pita DNA yang diskrit kemungkinan dikarenakan
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak berhasil diinaktivasi saat penyiapan DNA genom
utuh.
Selanjutuya pada penelitian ini juga diperoleh transfonnan E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
rekombinan pAS901 berukuran 15 kb, dan transforman E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
endogenous pVar2.2 berukuran 5,8 kb. Hal ini juga menginformasikan ballWa sifat resistensi terhadap
ampisilin, yang dimiliki oleh isolat E. coli yang diisolasi dari oral biawak, dikodekan ole11 gen yang
terdapat di dalam plasmid.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal19 Januari 1975 sebagai anak kedua dari empat bersaudara,
anak dari pasangan H. Sarjo Nitiatmaja dan Ratih Sugiarti.
Tahun 1993 penulis lulus dari SMU Negeri 78 Jakarta Barat dan pada tahun yang sarna lulus Ujian
Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) diterima di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Fakultas
Pertanian, Universitas Padjadjaran, BandlIng. Pada tahun 1994 penulis mengikuti kembali UMPTN dan
diterima di Institut Pertanian Bogar, Pada tahun 1995 penulis memilih Program Studi Biologi, junlsan
Biologi, Fakultas Matematika dan I1mu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penuHs pemah menjadi asisten program Humaniora untuk cabang o1ah
raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada tahun ajaran 199411995, 199511996, dan
199611997, pelatih olah raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada mata kuliah Olah Raga dan
Seni untuk tahun ajaran 199711998 dan 199811999, asisten luar biasa mata kuliah Biologi Dasar I pada
tahun ajaran 199611997 dan 199711998, mata kuliah Rekayasa Genetika pada tahun ajaran 199711998, se11a
mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Bakteri pada tahun ajaran 1998/1999. Pada tahun 1998 penulis
bekerja sebagai pengajar Biologi di Lembaga Pendidikan TEKNOS cabang Bogor.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Januari 1998 ini ialah Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus)
dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantn penyelesaian
karya ilmiah ini, antara lain Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing I atas
bimbingannya yang luar biasa serta kesempatan yang diberikan sebagai asisten praktikum pada beberapa
mata kuliah yang beliau asuh, Ibu Dra. Amarila Malik, M.Si. selaku pembimbing II atas saran dan
pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ihniah ini. Di samping itn penghargaan diberikan
kepada Bapak Husen Samhari yang telah membantn pelaksanaan penelitian, Bapak Dr. Drs. Yaya
Rukayadi, M.Si., Bapak Drs.Samsul A. Yani
kasih
atas saran dan pengarahan selama penelitian ini. Terima
penulis ucapkan pula kepada ayah, ibu, Ang Dida, Nola, Neli, ternan-ternan sepeIjuangan:
Triwidodo, Ronald, Sari, lin, dan lain-lain yang tidak mungkin disebutkan satn persatn, atas segala doa
dan dukungan yang diberikan.
Sernoga karya ilmiah ini dapat bennanfaat.
Bogor, Desember 1998
Yogiara
DAFTARISI
DAFTAR GAMBAR ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .....
Halaman
v
DAFTAR TABEL ...... .................. ... ......... ..................... ... ... ... ...... ......... ... .....
v
DAFTARLAMPIRAN ....................................................................................
vi
PENDAHULUA.!'I ...... ......... ........................ .................. ... ... ... ...... ............ .....
1
BAHAN DAN METODE
Galur bakteri, plasmid dan spesimen asa! sampel .......................................... .
Pengambilan sampel ............................................................................ .
Isolasi dan Seleksi Bakteri Resisten Ampisilin ............................................. .
Identifikasi Bakteri ............................................................................. .
Analisis Keragaman Genetik .................................................................. .
Kloning dan Transformasi DNA Genom .................................................... .
2
2
4
4
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Penapisan E. coli Resisten Ampisilin ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. ...
Analisis Keragaman Genetik ... .. . ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . ... . .. ... ... ... .. . ... ....
Kloning dan Transformasi Gen Penyandi Resistensi Ampisilin ..................... ... ...
6
KESIlvIPULAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .....
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
4
6
II
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Pengambilan sampel cairan dari rongga mulu! biawak ..................... ... ... . . . . . . ... ...
2
2.
A. Profil schizo typing beberapa isola! E. coli yang diisolasi dari oral biawak.
Lajur M: DNA genom Rhodobacter sphaeroides yang dipotong dengan
enzim restriksi AseI sebagai penanda molekuIer. Lajur 1: isolat 5-1,
lajur 2: isolat 7-1, lajur 3: isolat 30-1, lajur 4: isolat 31-2, lajur 5: isolat 30-2,
lajur 6: isolat 23-2, lajur 7: isolat 31-4, lajur 8: isolat 4-1, lajur 9: isolat 6-1.
Kondisi pemisahan (running) DNA: 0.9% high melting point agarose (HMA),
0.5 x lamtan penyangga Tris-Borat EDTA (TEE), subu lamtan penyangga 14°C,
waktu pulsa ramping/ramping pulse lime 2-40 detik, waktu pemisahan 20 jam,
tegangan 5.4 volt (28-30 mAl.
B. Diagram profil schizotyping SpeI isolat E. coli hasil interpretasi PFGE ............ ...
7
A.Hasii elektroforesis pemotongan p Var2.2 dengan enzim restriksi
XhoI+HindIll(I); EcoRl(2); EcoRl+XhoI(3); EcoRl+HindIII(4);
penanda molekuler I kb DNA ladder (M). B. Hasil pemotongan
plasmid pVar30.2. Plasmid pVar30.2 utub (1 dan 3); pVar30.2
dipotong enzim restriksi EcoRl (2 dan 4); penanda lkb DNA ladder (M).
C.Hasii pemotongan pAS901. Penanda molekuler I kb DNA ladder (M),
plasmid rekombinan pAS901 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl (1),
HindIII(2), EcoRl+HindIII (3),XhoI (4), danXhoI+HindIII (5) ... ...... ... ... ... ... ... .....
8
Peta restriksi plasmid pAS90 1 dan P Var2.2 .......................... ......................................
9
3.
4.
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Bakteri dan plasmid ...............................................; .............; ............................................. .
2
2.
Daftar spesimen biawak (Varanus) yang digunakan sebagai sampel .............................. .
3
3.
Hubungan antara isolat,spesies spesimen, daerah asal spesimen, pakan,
dan karakter fisiologi .............................................................................. .
5
Pengamatan basil transformasi DNA genom secara langsung .......................................... .
6
4.
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Tabel pengamatan morfologi koloni isolat E. coli pada media
Cawan agar EMB ...................................................................................... .
12
2.
Tabel isolat Escherichia coli hasil seleksi antibiotika ampisilin (100 flglml) ............ .
13
3.
Tabel identifikasi isolat E. coli resisten ampisilin (l00 flglml) melalui
uji fisiologis sederhana ............................................................................... .
13
Tabel hasil identifrkasi dengan menggunakan Microbact®
24E (l2E/12A+ 12B) .............................................................................. .
14
S.
Hasil pemotongan pAS90 1 dengan sejumlah enzim restriksi ............................... .
IS
6.
Hasil pemotongan pVar2.2 dengan sejumlah enzim restriksi ................................
IS
7.
Stnrktur kimia beberapa antibiotika keluarga penisilin, tanda panall
menunjukkan situs aktivitas enzim ｾＭｬ｡ｫｴｭｳ･＠
............................................................. .
IS
Vektor kloning plasmid pAS900 ................................................................ .
16
1.
4.
8.
1
PENDAHULUAN
Mikroorganisme,
khususnya
bakteri
memiliki habitat alami yang sangat beragam.
Bakteri dapat ditemukan mulai dari dasar laut
sampai PWlCak gWlWlg. Beberapa di antaranya
hidup pada organisme lain, baik sebagai patogen
maupWl mikrobiota normal. Bahkan ada bakteri
yang mampu hidup pada kondisi lingkungan yang
ekstrem, misalnya pada temperatur atau kadar
garam yang tinggi (Brock dan Madigan, 1991).
Berkaitan dengan habitat alami tersebut,
Auffenberg (1981) telah mengidentifikasi beberapa
spesies bakteri yang hidup pada komodo (Varanus
komodoensis), yaitu Proteus morganii, Proteus
vulgaris, Providencia sp., dan Staphylococcus sp ..
Setelah pemeliharaan komodo selama tujuh tahWl
maka keempat spesies ini tidak dapat ditemukan,
yang ada hanya Pseudomonas sp. Ketiadaan
keempat spesies tersebut mWlgkin disebabkan oleh
pakan dan lingkWlgan penangkaran yang berbeda
dengan habitat aslinya. Oleh karena Varanus tidak
memiliki kelenjar bisa (Zug, 1993) maka
Auffenberg (1981) menduga bahwa keberadaan
bakteri inilah yang menyebabkan teIjadinya infeksi
yang dapat menimbulkan kematian pada luka
gigitan komodo.
Untuk mengetahui lebih jauh tentang
mikroorganisme yang berasosiasi dengan biawak
perlu dilakukan serangkaian penelitian tentang
jenis dan karakteristik mikroorganisme yang hidup
pada biawak. Habitat biawak merupakan habitat
alam yang relatif jauh dari campur tangan manusia.
Informasi tentang bakteri yang hidup di lingkWlgan
alarniah, seperti yang ·hidup pada biawak sangat
penting terutama yang berhubWlgan dengan sifat
Menurut
resistensi t"rhadap antibiotika.
Desselberger (1998) data mengenai keberadaan
gen penyandi resistensi antibiotika pada bakteri
yang hidup di lingkWlgan alami masih langka.
Sementara itu peningkatan isolat bakteri (termasuk
E. coli ) sekarang ini mendapat perhatian yang
cukup serius. Neu (1992) melaporkan bahwa 40%75% isolat E. coli yang diisolasi dari rumah sakit
memiliki sifat resistensi terhadap berbagai
antibiotika dari keluarga Penisilin. Desselberger
(1998) juga melaporkan adanya peningkatan yang
nyata dari mikrobe yang resistensi terhadap
sejumlall bahan antimikrobe.
Ampisilin merupakan antibiotik keluarga fllaktam yang menghambat pembentukan dinding sel
bakteri. Penghambatan pembentukan dinding sel
teIjadi pada saat bakteri memasuki fase log
pertumbuharmya.
Pada fase ini sel bakteri
membelah dengan laju yang konstan, massa sel
menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama,
dengan aktivitas metabolisme yang konstan.
Penambahan ampisilin setelah 20 menit pada kultur
bakteri menyebabkan penonjolan pada bagian
dinding sel bakteri. Penonjolan ini menyebabkan
dinding sel menjadi rentan terhadap tekanan
internal sebingga mudah rusakJpecah. Selain itu
juga dinding sel dapat langsung mengalami
kerusakanlpecah (Gale et al., 1981, dan Alcamo,
1997).
Resistensi terhadap ampisilin antara lain
disebabkan oleh fungsi katalitik enzim fllaktamase. Enzim ini diekspresikah oleh gen bla
yang dapat memutus cincin fl-Iaktam pada
ampisilin. Akibat putusnya atau rusalmya cincin fllaktam, ampisilin tidak dapat lagi menjadi
penghambat sintesis dinding sel bakteri (Gale et
al., 1981).
Pada penelitian ini, keragaman bakteri
dilillat melalui analisis keragaman genetik secara
schizo typing atau Macrorestriction Fragment
Length
Polymorphisms
(MFLP)
dengan
menggWlakan Pulsed Field Gel Electrophoresis
(pFGE). Schizotyping merupakan analisis total
DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA
yang telall dipotong oleh enzim restriksi yang
memotong jarang (Suwanto dan Kaplan, 1992).
PFGE merupakan teknologi pemisahan DNA
berukuran besar. Teknik ini dapat memisahkan
DNA berukuran lebih dati 50 kilo pasang basa
(kb).
Suwanto (1994) menjelaskan ballwa semua
molekul DNA linier utas ganda yang lebih besar
dari ukuran tertentu (biasanya lebih dati 50 kb)
akan bergerak dalam gel agarosa pada kecepatan
yang sama. Batas kemampuan pemisahan ini akan
tercapai bila jari-jari girase DNA dupleks linier
tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Molekul
DNA tersebut tidak dapat disaring melalui poripori gel berdasarkan ukurarmya tetapi hams
bergerak dati ujung ke ujung. Cara pemindallan
moleknl DNA seperti ini disebut reptasi. Untuk
dapat keluar dari kondisi reptasi, molekul DNA
hams mengubah orientasi pergerakannya.
Pada PFGE moleknl-molekul
DNA
dipisahkan berdasarkan kemampuan orientasinya
dalam medan listrik, semakin besar moleknl DNA
semakin lama waktu orientasinya. Moleknl DNA
yang berukuran besar akan terperangkap dalam
kondisi reptasinya setiap kali arah medan listrik
diubah
dan
tidak
mampu
melanjutkan
perpindahannya di dalam gel sampai terjadi
2
Tabel I. Bakteri dan plasmid
Bakteri, plasmid
KarakteIistik yang reI evan
Escherichia coli
TOPIO
F mcrA t> (mrr-hsdIFMS-mcrBC) 080lacZ MIS
MacX74 recAI deaR araD139 t> (ara-Ieu) 7697
galU ga/K rpsL (SuR) e"dAr nupG
Plasmid
pAS900
pAS901
pVar2.2
Turunan dari [email protected] (Invitrogen, Co.), Situs
pengldonan ganda (multiple cloning sile) satu situs
EcoRl, Km' (derivat Tn5), t>Ap' dengan delesi pada
situs Xillal dan Scal
Km'; 11,2 kb fragmen penyandi Ap' dari E. coli 2-2EcoRl yang diklon pada pAS900 - EcoRl,
5,8 kb plasmid endogenous E. coli 2-2 yang
menyandikan Ap'
orientasi kembali sepanjang sumbu yang barn pada
medan listrik tersebut.
Seltingga jika waktu
orientasi molekul DNA kurang dari periode waktu
pergantian medan listrik (waktu pulsa/ramping
pulse lime) maka DNA dapat dipisahkan
berdasarkan ukurarmya (Cantor el al., 1988).
Menurnt Poh el al. (1992), pencirian yang
berdasarkan pada analisis genom dengan
menggunakan PFGE memberikan hasil yang lebih
diskriminatif dibandingkan dengan analisis
ribotyping. Schizotyping telall digunakan untuk
analisis keragaman galur-galur Brucella (Allardet
el al., 1988); Lisleria (Howard el 01., 1992);
Sirepiomyces ambo/aciens (Leblond el 01., 1990);
Xanlhomonas campeslris pv glycines (Rukayadi,
1995); Pseudomonas aeruginosa (poh el 01,. 1992);
Escherichia coli (Bergthorsson dan Oclunan,
1995), dan Laclococcus (Tanskanen, el 01., 1990;
La Bourgeois el 01., 1989).
T1uuan penelitian Ill! adalah unluk
melakukan penapisan Escherichia coli yang
resisten ampisilin yang diisolasi dari rongga mulut
berbagai jenis biawak, menganalisis keragaman
genetiknya
dengan
Pulsed
Field
Gel
Eleclrophoresis (PFGE), dan mengisolasi gen
penyandi resistensi terhadap ampisilin.
Sumber atau referensi
Invitrogen, California
A. Snwanto (tidak
dipublikasi)
Penelitian ini
Penelitian ini
Galur balded, plasmid dan spesimen asal
sampel
Galur bakteri dan plasmid yang digunakan
di dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel I.
Daftar spesimen asal sampel terdapat pada Tabel 2.
Pengambilan Sampel
Spesimen biawak
berasal dari koleksi
Fraak Yuwono, Jakarta. Contoh oral biawak
diambil dengan menggunakan ujllng tusuk sate
yang sudah dibalut kapas (steril), diusapkan di
anlara gigi, lalu disuspensikan dalam 2 m1 0,85%
lamlan garam fisiologis steril.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan mulai bulan J anuari
1998 sampai dengan November 1998, di
LaboratorilUn Biologi Molekuler SEAMEO
BIOTROP, Tajur-Bogor, dan Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB
Bogor.
Gambar I. Pengambilan sampel cairan dari rongga
mulut biawak.
KERAGAMAN GENETIK
ISOLAT Escherichia coli DARI RONGGA MULUT BIAWAK (Varalllls)
DAN KLONING GEN PENYANDI RESISTENSI AMPISILIN
YOGIARA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarj ana Sains
. pada
Program Studi Biologi
." ""
JURUSAN BIOLOGI ... "
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul : Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak
(Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin
Nanla : Yogiara
NIM :G31.1556
Menyetujui,
Df. If. Antonius Suwanto. M.Sc.
Pembimbing I
Tanggal Lulus: 28 Desember 1998
-
Dra. Amarila Malik. M.Si.
Pembimbing II
RINGKASAN
YOGIARA. Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan
Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin (Genetic Diversity Analyses a/Escherichia coli isolatedfrom
Oral 0/ Biawak Monilor [Varanus]) and Clonning 0/ Ampicillin Resistance Gene. Dibimbing oleh
ANTONWS SUWANTO dan AMARILA MALIK.
Biawak merupakan reptilia yang tidak memiliki kelenjar bisa. Namun ternyata gigitannya dapat
menyebabkan infeksi (bakteremia). Diduga infeksi ini disebabkan oleh mikrobe yang hidup pada oral
biawak tersebut. Infonnasi mengenai gen penyandi resistensi terhadap antibiotika yang diperoleh dari
mikrobe yang hidup di alam masih sedikit. Pada penelitian ini diperoleh 12 bakteri Escherichia coli yang
resisten terhadap antibiotika ampisilin dari 13 isolat E. coli yang berhasil diisolasi. Analisa keragaman
genetik terhadap 12 isolat E. coli yang resisten menghasilkan 9 profil schizotyping Spel yang beragam.
Tiga isolat lainnya tidak dapat menghasilkan pola pita DNA yang diskrit kemungkinan dikarenakan
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak berhasil diinaktivasi saat penyiapan DNA genom
utuh.
Selanjutuya pada penelitian ini juga diperoleh transfonnan E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
rekombinan pAS901 berukuran 15 kb, dan transforman E. coli TOPIO yang mengandung plasmid
endogenous pVar2.2 berukuran 5,8 kb. Hal ini juga menginformasikan ballWa sifat resistensi terhadap
ampisilin, yang dimiliki oleh isolat E. coli yang diisolasi dari oral biawak, dikodekan ole11 gen yang
terdapat di dalam plasmid.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal19 Januari 1975 sebagai anak kedua dari empat bersaudara,
anak dari pasangan H. Sarjo Nitiatmaja dan Ratih Sugiarti.
Tahun 1993 penulis lulus dari SMU Negeri 78 Jakarta Barat dan pada tahun yang sarna lulus Ujian
Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) diterima di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Fakultas
Pertanian, Universitas Padjadjaran, BandlIng. Pada tahun 1994 penulis mengikuti kembali UMPTN dan
diterima di Institut Pertanian Bogar, Pada tahun 1995 penulis memilih Program Studi Biologi, junlsan
Biologi, Fakultas Matematika dan I1mu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penuHs pemah menjadi asisten program Humaniora untuk cabang o1ah
raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada tahun ajaran 199411995, 199511996, dan
199611997, pelatih olah raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada mata kuliah Olah Raga dan
Seni untuk tahun ajaran 199711998 dan 199811999, asisten luar biasa mata kuliah Biologi Dasar I pada
tahun ajaran 199611997 dan 199711998, mata kuliah Rekayasa Genetika pada tahun ajaran 199711998, se11a
mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Bakteri pada tahun ajaran 1998/1999. Pada tahun 1998 penulis
bekerja sebagai pengajar Biologi di Lembaga Pendidikan TEKNOS cabang Bogor.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Januari 1998 ini ialah Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus)
dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantn penyelesaian
karya ilmiah ini, antara lain Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing I atas
bimbingannya yang luar biasa serta kesempatan yang diberikan sebagai asisten praktikum pada beberapa
mata kuliah yang beliau asuh, Ibu Dra. Amarila Malik, M.Si. selaku pembimbing II atas saran dan
pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ihniah ini. Di samping itn penghargaan diberikan
kepada Bapak Husen Samhari yang telah membantn pelaksanaan penelitian, Bapak Dr. Drs. Yaya
Rukayadi, M.Si., Bapak Drs.Samsul A. Yani
kasih
atas saran dan pengarahan selama penelitian ini. Terima
penulis ucapkan pula kepada ayah, ibu, Ang Dida, Nola, Neli, ternan-ternan sepeIjuangan:
Triwidodo, Ronald, Sari, lin, dan lain-lain yang tidak mungkin disebutkan satn persatn, atas segala doa
dan dukungan yang diberikan.
Sernoga karya ilmiah ini dapat bennanfaat.
Bogor, Desember 1998
Yogiara
DAFTARISI
DAFTAR GAMBAR ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .....
Halaman
v
DAFTAR TABEL ...... .................. ... ......... ..................... ... ... ... ...... ......... ... .....
v
DAFTARLAMPIRAN ....................................................................................
vi
PENDAHULUA.!'I ...... ......... ........................ .................. ... ... ... ...... ............ .....
1
BAHAN DAN METODE
Galur bakteri, plasmid dan spesimen asa! sampel .......................................... .
Pengambilan sampel ............................................................................ .
Isolasi dan Seleksi Bakteri Resisten Ampisilin ............................................. .
Identifikasi Bakteri ............................................................................. .
Analisis Keragaman Genetik .................................................................. .
Kloning dan Transformasi DNA Genom .................................................... .
2
2
4
4
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Penapisan E. coli Resisten Ampisilin ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. ...
Analisis Keragaman Genetik ... .. . ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . ... . .. ... ... ... .. . ... ....
Kloning dan Transformasi Gen Penyandi Resistensi Ampisilin ..................... ... ...
6
KESIlvIPULAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .....
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
4
6
II
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Pengambilan sampel cairan dari rongga mulu! biawak ..................... ... ... . . . . . . ... ...
2
2.
A. Profil schizo typing beberapa isola! E. coli yang diisolasi dari oral biawak.
Lajur M: DNA genom Rhodobacter sphaeroides yang dipotong dengan
enzim restriksi AseI sebagai penanda molekuIer. Lajur 1: isolat 5-1,
lajur 2: isolat 7-1, lajur 3: isolat 30-1, lajur 4: isolat 31-2, lajur 5: isolat 30-2,
lajur 6: isolat 23-2, lajur 7: isolat 31-4, lajur 8: isolat 4-1, lajur 9: isolat 6-1.
Kondisi pemisahan (running) DNA: 0.9% high melting point agarose (HMA),
0.5 x lamtan penyangga Tris-Borat EDTA (TEE), subu lamtan penyangga 14°C,
waktu pulsa ramping/ramping pulse lime 2-40 detik, waktu pemisahan 20 jam,
tegangan 5.4 volt (28-30 mAl.
B. Diagram profil schizotyping SpeI isolat E. coli hasil interpretasi PFGE ............ ...
7
A.Hasii elektroforesis pemotongan p Var2.2 dengan enzim restriksi
XhoI+HindIll(I); EcoRl(2); EcoRl+XhoI(3); EcoRl+HindIII(4);
penanda molekuler I kb DNA ladder (M). B. Hasil pemotongan
plasmid pVar30.2. Plasmid pVar30.2 utub (1 dan 3); pVar30.2
dipotong enzim restriksi EcoRl (2 dan 4); penanda lkb DNA ladder (M).
C.Hasii pemotongan pAS901. Penanda molekuler I kb DNA ladder (M),
plasmid rekombinan pAS901 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl (1),
HindIII(2), EcoRl+HindIII (3),XhoI (4), danXhoI+HindIII (5) ... ...... ... ... ... ... ... .....
8
Peta restriksi plasmid pAS90 1 dan P Var2.2 .......................... ......................................
9
3.
4.
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Bakteri dan plasmid ...............................................; .............; ............................................. .
2
2.
Daftar spesimen biawak (Varanus) yang digunakan sebagai sampel .............................. .
3
3.
Hubungan antara isolat,spesies spesimen, daerah asal spesimen, pakan,
dan karakter fisiologi .............................................................................. .
5
Pengamatan basil transformasi DNA genom secara langsung .......................................... .
6
4.
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Tabel pengamatan morfologi koloni isolat E. coli pada media
Cawan agar EMB ...................................................................................... .
12
2.
Tabel isolat Escherichia coli hasil seleksi antibiotika ampisilin (100 flglml) ............ .
13
3.
Tabel identifikasi isolat E. coli resisten ampisilin (l00 flglml) melalui
uji fisiologis sederhana ............................................................................... .
13
Tabel hasil identifrkasi dengan menggunakan Microbact®
24E (l2E/12A+ 12B) .............................................................................. .
14
S.
Hasil pemotongan pAS90 1 dengan sejumlah enzim restriksi ............................... .
IS
6.
Hasil pemotongan pVar2.2 dengan sejumlah enzim restriksi ................................
IS
7.
Stnrktur kimia beberapa antibiotika keluarga penisilin, tanda panall
menunjukkan situs aktivitas enzim ｾＭｬ｡ｫｴｭｳ･＠
............................................................. .
IS
Vektor kloning plasmid pAS900 ................................................................ .
16
1.
4.
8.
1
PENDAHULUAN
Mikroorganisme,
khususnya
bakteri
memiliki habitat alami yang sangat beragam.
Bakteri dapat ditemukan mulai dari dasar laut
sampai PWlCak gWlWlg. Beberapa di antaranya
hidup pada organisme lain, baik sebagai patogen
maupWl mikrobiota normal. Bahkan ada bakteri
yang mampu hidup pada kondisi lingkungan yang
ekstrem, misalnya pada temperatur atau kadar
garam yang tinggi (Brock dan Madigan, 1991).
Berkaitan dengan habitat alami tersebut,
Auffenberg (1981) telah mengidentifikasi beberapa
spesies bakteri yang hidup pada komodo (Varanus
komodoensis), yaitu Proteus morganii, Proteus
vulgaris, Providencia sp., dan Staphylococcus sp ..
Setelah pemeliharaan komodo selama tujuh tahWl
maka keempat spesies ini tidak dapat ditemukan,
yang ada hanya Pseudomonas sp. Ketiadaan
keempat spesies tersebut mWlgkin disebabkan oleh
pakan dan lingkWlgan penangkaran yang berbeda
dengan habitat aslinya. Oleh karena Varanus tidak
memiliki kelenjar bisa (Zug, 1993) maka
Auffenberg (1981) menduga bahwa keberadaan
bakteri inilah yang menyebabkan teIjadinya infeksi
yang dapat menimbulkan kematian pada luka
gigitan komodo.
Untuk mengetahui lebih jauh tentang
mikroorganisme yang berasosiasi dengan biawak
perlu dilakukan serangkaian penelitian tentang
jenis dan karakteristik mikroorganisme yang hidup
pada biawak. Habitat biawak merupakan habitat
alam yang relatif jauh dari campur tangan manusia.
Informasi tentang bakteri yang hidup di lingkWlgan
alarniah, seperti yang ·hidup pada biawak sangat
penting terutama yang berhubWlgan dengan sifat
Menurut
resistensi t"rhadap antibiotika.
Desselberger (1998) data mengenai keberadaan
gen penyandi resistensi antibiotika pada bakteri
yang hidup di lingkWlgan alami masih langka.
Sementara itu peningkatan isolat bakteri (termasuk
E. coli ) sekarang ini mendapat perhatian yang
cukup serius. Neu (1992) melaporkan bahwa 40%75% isolat E. coli yang diisolasi dari rumah sakit
memiliki sifat resistensi terhadap berbagai
antibiotika dari keluarga Penisilin. Desselberger
(1998) juga melaporkan adanya peningkatan yang
nyata dari mikrobe yang resistensi terhadap
sejumlall bahan antimikrobe.
Ampisilin merupakan antibiotik keluarga fllaktam yang menghambat pembentukan dinding sel
bakteri. Penghambatan pembentukan dinding sel
teIjadi pada saat bakteri memasuki fase log
pertumbuharmya.
Pada fase ini sel bakteri
membelah dengan laju yang konstan, massa sel
menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama,
dengan aktivitas metabolisme yang konstan.
Penambahan ampisilin setelah 20 menit pada kultur
bakteri menyebabkan penonjolan pada bagian
dinding sel bakteri. Penonjolan ini menyebabkan
dinding sel menjadi rentan terhadap tekanan
internal sebingga mudah rusakJpecah. Selain itu
juga dinding sel dapat langsung mengalami
kerusakanlpecah (Gale et al., 1981, dan Alcamo,
1997).
Resistensi terhadap ampisilin antara lain
disebabkan oleh fungsi katalitik enzim fllaktamase. Enzim ini diekspresikah oleh gen bla
yang dapat memutus cincin fl-Iaktam pada
ampisilin. Akibat putusnya atau rusalmya cincin fllaktam, ampisilin tidak dapat lagi menjadi
penghambat sintesis dinding sel bakteri (Gale et
al., 1981).
Pada penelitian ini, keragaman bakteri
dilillat melalui analisis keragaman genetik secara
schizo typing atau Macrorestriction Fragment
Length
Polymorphisms
(MFLP)
dengan
menggWlakan Pulsed Field Gel Electrophoresis
(pFGE). Schizotyping merupakan analisis total
DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA
yang telall dipotong oleh enzim restriksi yang
memotong jarang (Suwanto dan Kaplan, 1992).
PFGE merupakan teknologi pemisahan DNA
berukuran besar. Teknik ini dapat memisahkan
DNA berukuran lebih dati 50 kilo pasang basa
(kb).
Suwanto (1994) menjelaskan ballwa semua
molekul DNA linier utas ganda yang lebih besar
dari ukuran tertentu (biasanya lebih dati 50 kb)
akan bergerak dalam gel agarosa pada kecepatan
yang sama. Batas kemampuan pemisahan ini akan
tercapai bila jari-jari girase DNA dupleks linier
tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Molekul
DNA tersebut tidak dapat disaring melalui poripori gel berdasarkan ukurarmya tetapi hams
bergerak dati ujung ke ujung. Cara pemindallan
moleknl DNA seperti ini disebut reptasi. Untuk
dapat keluar dari kondisi reptasi, molekul DNA
hams mengubah orientasi pergerakannya.
Pada PFGE moleknl-molekul
DNA
dipisahkan berdasarkan kemampuan orientasinya
dalam medan listrik, semakin besar moleknl DNA
semakin lama waktu orientasinya. Moleknl DNA
yang berukuran besar akan terperangkap dalam
kondisi reptasinya setiap kali arah medan listrik
diubah
dan
tidak
mampu
melanjutkan
perpindahannya di dalam gel sampai terjadi
2
Tabel I. Bakteri dan plasmid
Bakteri, plasmid
KarakteIistik yang reI evan
Escherichia coli
TOPIO
F mcrA t> (mrr-hsdIFMS-mcrBC) 080lacZ MIS
MacX74 recAI deaR araD139 t> (ara-Ieu) 7697
galU ga/K rpsL (SuR) e"dAr nupG
Plasmid
pAS900
pAS901
pVar2.2
Turunan dari [email protected] (Invitrogen, Co.), Situs
pengldonan ganda (multiple cloning sile) satu situs
EcoRl, Km' (derivat Tn5), t>Ap' dengan delesi pada
situs Xillal dan Scal
Km'; 11,2 kb fragmen penyandi Ap' dari E. coli 2-2EcoRl yang diklon pada pAS900 - EcoRl,
5,8 kb plasmid endogenous E. coli 2-2 yang
menyandikan Ap'
orientasi kembali sepanjang sumbu yang barn pada
medan listrik tersebut.
Seltingga jika waktu
orientasi molekul DNA kurang dari periode waktu
pergantian medan listrik (waktu pulsa/ramping
pulse lime) maka DNA dapat dipisahkan
berdasarkan ukurarmya (Cantor el al., 1988).
Menurnt Poh el al. (1992), pencirian yang
berdasarkan pada analisis genom dengan
menggunakan PFGE memberikan hasil yang lebih
diskriminatif dibandingkan dengan analisis
ribotyping. Schizotyping telall digunakan untuk
analisis keragaman galur-galur Brucella (Allardet
el al., 1988); Lisleria (Howard el 01., 1992);
Sirepiomyces ambo/aciens (Leblond el 01., 1990);
Xanlhomonas campeslris pv glycines (Rukayadi,
1995); Pseudomonas aeruginosa (poh el 01,. 1992);
Escherichia coli (Bergthorsson dan Oclunan,
1995), dan Laclococcus (Tanskanen, el 01., 1990;
La Bourgeois el 01., 1989).
T1uuan penelitian Ill! adalah unluk
melakukan penapisan Escherichia coli yang
resisten ampisilin yang diisolasi dari rongga mulut
berbagai jenis biawak, menganalisis keragaman
genetiknya
dengan
Pulsed
Field
Gel
Eleclrophoresis (PFGE), dan mengisolasi gen
penyandi resistensi terhadap ampisilin.
Sumber atau referensi
Invitrogen, California
A. Snwanto (tidak
dipublikasi)
Penelitian ini
Penelitian ini
Galur balded, plasmid dan spesimen asal
sampel
Galur bakteri dan plasmid yang digunakan
di dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel I.
Daftar spesimen asal sampel terdapat pada Tabel 2.
Pengambilan Sampel
Spesimen biawak
berasal dari koleksi
Fraak Yuwono, Jakarta. Contoh oral biawak
diambil dengan menggunakan ujllng tusuk sate
yang sudah dibalut kapas (steril), diusapkan di
anlara gigi, lalu disuspensikan dalam 2 m1 0,85%
lamlan garam fisiologis steril.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan mulai bulan J anuari
1998 sampai dengan November 1998, di
LaboratorilUn Biologi Molekuler SEAMEO
BIOTROP, Tajur-Bogor, dan Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB
Bogor.
Gambar I. Pengambilan sampel cairan dari rongga
mulut biawak.