KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh:
Agitya Putra Kusuma
M0404018
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2008
i
PENGESAHAN
SKRIPSI
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Oleh:
Agitya Putra Kusuma
NIM M0404018
Telah dipertahankan di depan Tim Penguji
pada tanggal 28 Juli 2008
dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Surakarta,
Agustus 2008
Penguji I
Penguji II
Dr. Okid Parama Astirin, MS
NIP. 131 569270
Dr. Prabang Setyono, M.Si
NIP. 132 240 171
Penguji III
Penguji IV
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D
NIP. 131 472 192
Budi Saksono, M.Sc
NIP. 320 006 024
Mengesahkan
Dekan FMIPA
Ketua Jurusan Biologi
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D
NIP.131 649 948
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si
NIP. 130 676 864
ii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri
dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar
kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat
yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu
dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar
kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.
Surakarta,
Agustus 2008
Agitya Putra Kusuma
NIM M0404018
iii
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Agitya Putra Kusuma
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sebelas Maret, Surakarta
ABSTRAK
Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang
berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif.
Asetaldehida berperan penting dalam sintesis asam asetat, anhidrid asam asetat,
butanol, etil asetat dan piridin. Kebutuhan asetaldehida terus mengalami
peningkatan setiap tahun, sehingga memerlukan teknologi produksi yang efektif,
efisien dan ramah lingkungan. Rekayasa genetika dengan penerapan teknologi
DNA rekombinan diharapkan dapat dikembangkan sebagai teknologi alternatif
produksi asetaldehida dengan memanfaatkan metabolisme bakteri dan limbah
biomassa pertanian. Untuk mengembangkan teknologi tersebut, pada penelitian
ini telah dilakukan kloning dan ekspresi gen pdc penyandi pyruvate decarboxylase
dari Zymobacter palmae.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk (1) mengisolasi gen pdc dari
genom bakteri Z. palmae, (2) mendapatkan klon gen pdc pada vektor plasmid
pGEM-T easy, (3) menguji ekspresi gen pdc pada vektor plasmid pET21b.
Penelitian ini dimulai dengan studi bioinformatika yang bertujuan untuk mencari
sekuen gen pdc pada GenBank NCBI dan mendesain pasangan primer PCR
dengan memanfaatkan beberapa perangkat lunak seperti Genamics Expression,
BioEdit, FastPCR dan DNA Calculator Online.
Gen pdc didapatkan dengan metode PCR menggunakan genom Z. palmae
digunakan sebagai DNA cetakannya. Kloning dilakukan dengan membuat DNA
rekombinan antara gen pdc dan plasmid pGEM-T easy yang ditransformasikan ke
dalam E. coli DH5α untuk selanjutnya dilakukan konfirmasi tingkat keberhasilan
dengan isolasi plasmid. Uji ekspresi gen pdc dilakukan dengan menggunakan
plasmid pET21b dan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 DE3pLys.
Hasil dari penelitian ini adalah DNA rekombinan antara gen pdc hasil
amplifikasi dengan metode PCR dan pGEM-T easy telah berhasil diklon ke dalam
E. coli DH5α. Analisis restriksi dengan NdeI dan BamHI terhadap plasmid
rekombinan pGEM-T easy + pdc menghasilkan dua pita yang masing-masing
berukuran ± 3018 bp (identik dengan ukuran pGEM-T easy) dan ± 1671 bp
(identik dengan ukuran pdc Z. palmae). Uji ekspresi gen pdc pada pET21b
melalui E. coli BL21 DE3pLys belum berhasil dilakukan, sehingga memerlukan
kajian lebih mendalam mengenai metode yang digunakan dalam penelitian
tersebut.
Kata Kunci : Kloning, Ekspresi, Gen pdc, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter
palmae.
iv
CLONING AND EXPRESSION pdc GENE ENCODING PYRUVATE
DECARBOXYLASE FROM Zymobacter palmae
Agitya Putra Kusuma
Biology Department, Mathematics and Natural Sciences Faculty,
Sebelas Maret University, Surakarta
ABSTRACT
The pdc gene is encode of Pyruvate Decarboxylase (PDC) enzyme that
play a part in production process acetaldehyde according to homofermentatif.
Acetaldehyde play important role in synthesis acetic acid, anhidrid acetic acid,
butanol, etil acetic and pyridine. The requirement of acetaldehyde always increase
in every year, so that need effective production technology, efficient and friendly
environment. Genetics engineering with adjustment of DNA recombinant
technology supposed can be developed as production alternative technology of
acetaldehyde with make use bacteria metabolism and waste biomassa agriculture.
To develop of this technology, in this experiment have been done cloning and
expression of pdc gene from Zymobacter palmae.
The aims of this experiment were (1) to isolate pdc gene from genom Z.
palmae, (2) to get positive clon of pdc gene in vector plasmid pGEM-T easy pass
E. coli DH5α, (3) to examine expression of pdc gene in vector plasmid pET21b
pass E. coli BL21 DE3pLys. This experiment was begun with bioinformatical
studies in order to seek sequence pdc gene in GenBank NCBI and design a pair of
PCR primers using several softwares such as Genamics Expression, BioEdit,
FastPCR and DNA Calculator Online.
The results showed that pdc gene from Z. palmae has succesfully cloned
into pGEM-T easy. Restriction analysis with NdeI and BamHI towards plasmid
recombinant pGEM-T easy + pdc are produce two bands which else have a size
about 3018 bp (pGEM-T easy) and about 1671 bp (pdc Z. palmae). Expression of
pdc gene in pET21b not yet success done, so that need study more detail to hit
method that used in experiment.
Keyword: Cloning, Expression, pdc gene, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter
palmae
v
MOTTO
“Sesungguhnya, seseorang hanya akan meraih pengetahuan bila dalam dirinya
terdapat enam hal: kecerdasan, semangat, kesabaran, bekal, guru, dan proses
yang tiada henti”
“Setiap kegagalan adalah suatu pelajaran yang membawa seseorang untuk
mencoba suatu pendekatan baru yang tidak pernah dicoba sebelumnya”
“Berbahagialah manusia yang diberi berbagai masalah, karena dengan itu
manusia sadar akan kelemahannya dan bisa menjadi pandai karena pengertian”
Janganlah kamu bersikap lemah dan janganlah pula kamu bersedih hati, padahal
kamulah orang yang paling tinggi derajatnya, jika kamu orang-orang yang
beriman
(Q.S. Ali Imron: 139)
Aku mengagumi seorang mukmin. Bila memperoleh kebaikan dia memuji Allah
dan bersyukur. Bila ditimpa musibah dia memuji Allah dan bersabar
(H.R. Ahmad dan Abu Daud)
vi
PERSEMBAHAN
Karya ini aku persembahkan kepada
ibu dan bapak (alm)
tercinta,
yang senantiasa memberikan dukungan,
kasih sayang dan doanya.
Terima kasih.
vii
KATA PENGANTAR
Segala puja dan puji syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah
melimpahkan segala rahmat dah hidayah-Nya yang tak terhingga sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul: “Kloning
dan Ekspresi Gen pdc Penyandi Pyruvate Decarboxylase dari Zymobacter
palmae”. Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh
gelar kesarjanaan strata (S1) pada Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta.
Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang
berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif dengan
memanfaatkan metabolisme mikroorganisme. Terkait dengan hal tersebut, sekam
dan jerami sebagai limbah biomassa diketahui mengandung karbohidrat seperti
silosa, arabinosa, dan selulosa. Proses sakarifikasi terhadap karbohidrat dalam
biomassa mampu menghasilkan monosakarida yang melalui proses fermentasi
dengan memanfaatkan metabolisme mikroorganisme bakteri dapat menghasilkan
asetaldehida.
Kloning dan ekspresi gen pdc penyandi enzim PDC dari bakteri Z. palmae
diharapkan mampu menjadi teknologi alternatif dalam memproduksi asetaldehida
dengan memanfaatkan limbah biomassa dan metabolisme mikroorganisme.
Kloning gen pdc dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pGEM-T easy
dan Escherichia coli DH5α sebagai bakteri inang, sedangkan ekspresi gen pdc
viii
dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pET21b dan E. coli BL21
DE3pLys sebagai bakteri inang.
Dalam melakukan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis telah
mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang
sangat berguna dan bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh
karena itu pada kesempatan yang baik ini dengan besar hati penulis ingin
mengucapkan terima kasih yang setulus-tulusnya dan sebesar-besarnya kepada:
Sri Wahyuningsih dan (Alm) Agus Salim, selaku ibu dan bapak yang
selalu memberikan perhatian dan kasih sayang dengan tulus.
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah
memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi.
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta
yang telah memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi.
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D., selaku dosen pembimbing I yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai selesainya
penyusunan skripsi.
Budi Saksono, M.Sc., selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan
bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya penyusunan
skripsi.
ix
Dr. Okid Parama Astririn, M.S., selaku dosen penelaah I yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya
penyusunan skripsi.
Dr. Prabang Setyono, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya
penyusunan skripsi.
Valentino Arya Kusuma dan Pramudita Putri Kusuma, terima kasih atas
jalinan persaudaraan yang begitu hebat di antara kita serta Mariana Indrastuti,
terima kasih atas cinta, kasih sayang, perhatian, semangat, dan motivasi yang telah
diberikan dengan tulus selama ini.
Elvi Yetti, Lita Triratna, Dewi Fitriani, Puspita Suci Wulandari, Gunawan
Ari Wibowo, Fitria Kumala Arum, Sri Nurul Aini, Ifah Munifah, Dwi Setyo Rini,
dan Gintung Patantis terima kasih atas bimbingan, saran dan kritik selama proses
penelitian dan penyusunan skripsi di CBRG LIPI.
Dhimas Sagietha, Dhita Kurniawan, Tri Warseno, Eki Sulistyowati, Leny
Rahayuningsih, Maryati Rahayu, Susanti Wahyuningsih, Ari Rusmiyati, dan
Andriyani Puspitaningrum, terima kasih atas kebersamaan dalam perjalanan
mengarungi hidup di Cibinong.
Usman Setiawan, Topan Cahyono, Anugrah Adi Santoso, Rindyana
Arifatus Solikah, dan Galih Septia Amiati terima kasih atas persahabatan dan
kesabaran kalian dalam mendidik dan memberikan pemahaman tentang hidup,
serta Nina Astreani, terima kasih atas dukungan dan motivasi yang diberikan
selama menuntut ilmu di jurusan biologi.
x
Semua pihak yang telah membantu proses penelitian dan penyusunan
skripsi. Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam melakukan
penelitian dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu
masukan yang berupa saran dan kritik yang membangun dari para pembaca akan
sangat membantu. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi kita semua dan pihakpihak yang terkait.
Surakarta, Agustus 2008
Penyusun
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN ...................................................................... ii
HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... iii
ABSTRAK ................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................. v
HALAMAN MOTTO................................................................................... vi
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... vii
KATA PENGANTAR .................................................................................. viii
DAFTAR ISI ................................................................................................ xii
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xvi
DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xvii
BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1
A. Latar Belakang Masalah..................................................................... 1
B. Perumusan Masalah ........................................................................... 6
C. Tujuan Penelitian ............................................................................... 6
D. Manfaat Penelitian ............................................................................. 7
BAB II. LANDASAN TEORI ...................................................................... 8
A. Tinjauan Pustaka................................................................................ 8
B. Kerangka Pemikiran........................................................................... 24
BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................... 26
A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 26
B. Bahan dan Alat .................................................................................. 26
C. Cara Kerja.......................................................................................... 28
D. Analisis Data ..................................................................................... 45
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN............................... 46
A. Studi Bioinformatika.......................................................................... 46
xii
B. Desain Primer PCR ............................................................................ 47
C. Isolasi Genom .................................................................................... 49
D. Amplifikasi Gen pdc Zymobacter palmae dengan Metode PCR ......... 51
E. Kloning Gen pdc Zymobacter palmae ................................................ 55
F. Ekspresi Gen pdc Zymobacter palmae................................................ 62
BAB V. PENUTUP ...................................................................................... 67
A. Kesimpulan........................................................................................ 67
B. Saran.................................................................................................. 67
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 68
LAMPIRAN ................................................................................................. 72
RIWAYAT HIDUP PENULIS...................................................................... 77
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.Data Statistik Impor Asetaldehida .................................................... 3
Tabel 2.Sumber Mikroba Penghasil Gen pdc Penyandi PDC ......................... 46
Tabel 3.Komponen dan Konsentrasi Pereaksi PCR ....................................... 52
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Rumus Molekul Asetaldehida ...................................................... 11
Gambar 2. Kerangka Pemikiran Penelitian.................................................... 25
Gambar 3. Hasil Isolasi Genom Z. palmae .................................................... 50
Gambar 4. Hasil Amplifikasi gen pdc Z. palmae ........................................... 54
Gambar 5. Circle Map pGEM-T easy............................................................ 56
Gambar 6. Hasil Transformasi Rekombinan pdc Z. palmae ........................... 58
Gambar 7. Hasil Isolasi Plasmid Rekombinan pGEM-T easy + pdc .............. 61
Gambar 8. Circle Map Plasmid pET21b........................................................ 63
Gambar 9. Hasil Digesti plasmid pET21b ..................................................... 64
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Sekuen Nukleotida Gen pdc Z. palmae...................................... 72
Lampiran 2. Hasil Uji In Silico Fast PCR ...................................................... 73
Lampiran 3. Hasil Sekuensing Gen pdc Z. palmae ........................................ 74
Lampiran 4. Daftar Riwayat Hidup Penulis ................................................... 77
xvi
DAFTAR SINGKATAN
Singkatan
Kepanjangan
µl
µm
Atm
BLAST
BPPT
BPS
BUMN
CBRG
DNA
GRAS
HCl
IPTG
kb
LB
LIPI
mPa
mRNA
MYE
NaCl
NCBI
OD
PCR
PDC
SDS
TAE
TBE
TE
ThDP
TI
X-gal
mikroliter
mikrometer
Atmosfer
Basic Local Allignment Search Tool
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi
Biro Pusat Statistik
Badan Usaha Milik Negara
Carbohydrate and Bioengineering Research Group
Deoxyribo Nucleic Acid
Generally Recognized As Safe
Hidroklorida
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
Kilo basepairs
Luria Bertani
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
mili pascal
messenger ribonucleotide
Maltose Yeast Extract
Natrium Klorida
National Center for Biotechnology Information
Optical Density
Polymerase Chain Reaction
Pyruvate Decarboxylase
Sodium Dodesil Sulfat
Tris Asetat EDTA
Tris Borat EDTA
Tris EDTA
Thiamin Diphosphate
Teknik Informasi
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
xvii
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh:
Agitya Putra Kusuma
M0404018
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2008
i
PENGESAHAN
SKRIPSI
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Oleh:
Agitya Putra Kusuma
NIM M0404018
Telah dipertahankan di depan Tim Penguji
pada tanggal 28 Juli 2008
dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Surakarta,
Agustus 2008
Penguji I
Penguji II
Dr. Okid Parama Astirin, MS
NIP. 131 569270
Dr. Prabang Setyono, M.Si
NIP. 132 240 171
Penguji III
Penguji IV
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D
NIP. 131 472 192
Budi Saksono, M.Sc
NIP. 320 006 024
Mengesahkan
Dekan FMIPA
Ketua Jurusan Biologi
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D
NIP.131 649 948
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si
NIP. 130 676 864
ii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri
dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar
kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat
yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu
dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar
kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.
Surakarta,
Agustus 2008
Agitya Putra Kusuma
NIM M0404018
iii
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE
DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Agitya Putra Kusuma
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sebelas Maret, Surakarta
ABSTRAK
Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang
berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif.
Asetaldehida berperan penting dalam sintesis asam asetat, anhidrid asam asetat,
butanol, etil asetat dan piridin. Kebutuhan asetaldehida terus mengalami
peningkatan setiap tahun, sehingga memerlukan teknologi produksi yang efektif,
efisien dan ramah lingkungan. Rekayasa genetika dengan penerapan teknologi
DNA rekombinan diharapkan dapat dikembangkan sebagai teknologi alternatif
produksi asetaldehida dengan memanfaatkan metabolisme bakteri dan limbah
biomassa pertanian. Untuk mengembangkan teknologi tersebut, pada penelitian
ini telah dilakukan kloning dan ekspresi gen pdc penyandi pyruvate decarboxylase
dari Zymobacter palmae.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk (1) mengisolasi gen pdc dari
genom bakteri Z. palmae, (2) mendapatkan klon gen pdc pada vektor plasmid
pGEM-T easy, (3) menguji ekspresi gen pdc pada vektor plasmid pET21b.
Penelitian ini dimulai dengan studi bioinformatika yang bertujuan untuk mencari
sekuen gen pdc pada GenBank NCBI dan mendesain pasangan primer PCR
dengan memanfaatkan beberapa perangkat lunak seperti Genamics Expression,
BioEdit, FastPCR dan DNA Calculator Online.
Gen pdc didapatkan dengan metode PCR menggunakan genom Z. palmae
digunakan sebagai DNA cetakannya. Kloning dilakukan dengan membuat DNA
rekombinan antara gen pdc dan plasmid pGEM-T easy yang ditransformasikan ke
dalam E. coli DH5α untuk selanjutnya dilakukan konfirmasi tingkat keberhasilan
dengan isolasi plasmid. Uji ekspresi gen pdc dilakukan dengan menggunakan
plasmid pET21b dan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 DE3pLys.
Hasil dari penelitian ini adalah DNA rekombinan antara gen pdc hasil
amplifikasi dengan metode PCR dan pGEM-T easy telah berhasil diklon ke dalam
E. coli DH5α. Analisis restriksi dengan NdeI dan BamHI terhadap plasmid
rekombinan pGEM-T easy + pdc menghasilkan dua pita yang masing-masing
berukuran ± 3018 bp (identik dengan ukuran pGEM-T easy) dan ± 1671 bp
(identik dengan ukuran pdc Z. palmae). Uji ekspresi gen pdc pada pET21b
melalui E. coli BL21 DE3pLys belum berhasil dilakukan, sehingga memerlukan
kajian lebih mendalam mengenai metode yang digunakan dalam penelitian
tersebut.
Kata Kunci : Kloning, Ekspresi, Gen pdc, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter
palmae.
iv
CLONING AND EXPRESSION pdc GENE ENCODING PYRUVATE
DECARBOXYLASE FROM Zymobacter palmae
Agitya Putra Kusuma
Biology Department, Mathematics and Natural Sciences Faculty,
Sebelas Maret University, Surakarta
ABSTRACT
The pdc gene is encode of Pyruvate Decarboxylase (PDC) enzyme that
play a part in production process acetaldehyde according to homofermentatif.
Acetaldehyde play important role in synthesis acetic acid, anhidrid acetic acid,
butanol, etil acetic and pyridine. The requirement of acetaldehyde always increase
in every year, so that need effective production technology, efficient and friendly
environment. Genetics engineering with adjustment of DNA recombinant
technology supposed can be developed as production alternative technology of
acetaldehyde with make use bacteria metabolism and waste biomassa agriculture.
To develop of this technology, in this experiment have been done cloning and
expression of pdc gene from Zymobacter palmae.
The aims of this experiment were (1) to isolate pdc gene from genom Z.
palmae, (2) to get positive clon of pdc gene in vector plasmid pGEM-T easy pass
E. coli DH5α, (3) to examine expression of pdc gene in vector plasmid pET21b
pass E. coli BL21 DE3pLys. This experiment was begun with bioinformatical
studies in order to seek sequence pdc gene in GenBank NCBI and design a pair of
PCR primers using several softwares such as Genamics Expression, BioEdit,
FastPCR and DNA Calculator Online.
The results showed that pdc gene from Z. palmae has succesfully cloned
into pGEM-T easy. Restriction analysis with NdeI and BamHI towards plasmid
recombinant pGEM-T easy + pdc are produce two bands which else have a size
about 3018 bp (pGEM-T easy) and about 1671 bp (pdc Z. palmae). Expression of
pdc gene in pET21b not yet success done, so that need study more detail to hit
method that used in experiment.
Keyword: Cloning, Expression, pdc gene, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter
palmae
v
MOTTO
“Sesungguhnya, seseorang hanya akan meraih pengetahuan bila dalam dirinya
terdapat enam hal: kecerdasan, semangat, kesabaran, bekal, guru, dan proses
yang tiada henti”
“Setiap kegagalan adalah suatu pelajaran yang membawa seseorang untuk
mencoba suatu pendekatan baru yang tidak pernah dicoba sebelumnya”
“Berbahagialah manusia yang diberi berbagai masalah, karena dengan itu
manusia sadar akan kelemahannya dan bisa menjadi pandai karena pengertian”
Janganlah kamu bersikap lemah dan janganlah pula kamu bersedih hati, padahal
kamulah orang yang paling tinggi derajatnya, jika kamu orang-orang yang
beriman
(Q.S. Ali Imron: 139)
Aku mengagumi seorang mukmin. Bila memperoleh kebaikan dia memuji Allah
dan bersyukur. Bila ditimpa musibah dia memuji Allah dan bersabar
(H.R. Ahmad dan Abu Daud)
vi
PERSEMBAHAN
Karya ini aku persembahkan kepada
ibu dan bapak (alm)
tercinta,
yang senantiasa memberikan dukungan,
kasih sayang dan doanya.
Terima kasih.
vii
KATA PENGANTAR
Segala puja dan puji syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah
melimpahkan segala rahmat dah hidayah-Nya yang tak terhingga sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul: “Kloning
dan Ekspresi Gen pdc Penyandi Pyruvate Decarboxylase dari Zymobacter
palmae”. Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh
gelar kesarjanaan strata (S1) pada Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta.
Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang
berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif dengan
memanfaatkan metabolisme mikroorganisme. Terkait dengan hal tersebut, sekam
dan jerami sebagai limbah biomassa diketahui mengandung karbohidrat seperti
silosa, arabinosa, dan selulosa. Proses sakarifikasi terhadap karbohidrat dalam
biomassa mampu menghasilkan monosakarida yang melalui proses fermentasi
dengan memanfaatkan metabolisme mikroorganisme bakteri dapat menghasilkan
asetaldehida.
Kloning dan ekspresi gen pdc penyandi enzim PDC dari bakteri Z. palmae
diharapkan mampu menjadi teknologi alternatif dalam memproduksi asetaldehida
dengan memanfaatkan limbah biomassa dan metabolisme mikroorganisme.
Kloning gen pdc dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pGEM-T easy
dan Escherichia coli DH5α sebagai bakteri inang, sedangkan ekspresi gen pdc
viii
dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pET21b dan E. coli BL21
DE3pLys sebagai bakteri inang.
Dalam melakukan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis telah
mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang
sangat berguna dan bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh
karena itu pada kesempatan yang baik ini dengan besar hati penulis ingin
mengucapkan terima kasih yang setulus-tulusnya dan sebesar-besarnya kepada:
Sri Wahyuningsih dan (Alm) Agus Salim, selaku ibu dan bapak yang
selalu memberikan perhatian dan kasih sayang dengan tulus.
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah
memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi.
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta
yang telah memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi.
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D., selaku dosen pembimbing I yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai selesainya
penyusunan skripsi.
Budi Saksono, M.Sc., selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan
bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya penyusunan
skripsi.
ix
Dr. Okid Parama Astririn, M.S., selaku dosen penelaah I yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya
penyusunan skripsi.
Dr. Prabang Setyono, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya
penyusunan skripsi.
Valentino Arya Kusuma dan Pramudita Putri Kusuma, terima kasih atas
jalinan persaudaraan yang begitu hebat di antara kita serta Mariana Indrastuti,
terima kasih atas cinta, kasih sayang, perhatian, semangat, dan motivasi yang telah
diberikan dengan tulus selama ini.
Elvi Yetti, Lita Triratna, Dewi Fitriani, Puspita Suci Wulandari, Gunawan
Ari Wibowo, Fitria Kumala Arum, Sri Nurul Aini, Ifah Munifah, Dwi Setyo Rini,
dan Gintung Patantis terima kasih atas bimbingan, saran dan kritik selama proses
penelitian dan penyusunan skripsi di CBRG LIPI.
Dhimas Sagietha, Dhita Kurniawan, Tri Warseno, Eki Sulistyowati, Leny
Rahayuningsih, Maryati Rahayu, Susanti Wahyuningsih, Ari Rusmiyati, dan
Andriyani Puspitaningrum, terima kasih atas kebersamaan dalam perjalanan
mengarungi hidup di Cibinong.
Usman Setiawan, Topan Cahyono, Anugrah Adi Santoso, Rindyana
Arifatus Solikah, dan Galih Septia Amiati terima kasih atas persahabatan dan
kesabaran kalian dalam mendidik dan memberikan pemahaman tentang hidup,
serta Nina Astreani, terima kasih atas dukungan dan motivasi yang diberikan
selama menuntut ilmu di jurusan biologi.
x
Semua pihak yang telah membantu proses penelitian dan penyusunan
skripsi. Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam melakukan
penelitian dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu
masukan yang berupa saran dan kritik yang membangun dari para pembaca akan
sangat membantu. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi kita semua dan pihakpihak yang terkait.
Surakarta, Agustus 2008
Penyusun
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN ...................................................................... ii
HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... iii
ABSTRAK ................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................. v
HALAMAN MOTTO................................................................................... vi
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... vii
KATA PENGANTAR .................................................................................. viii
DAFTAR ISI ................................................................................................ xii
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xvi
DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xvii
BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1
A. Latar Belakang Masalah..................................................................... 1
B. Perumusan Masalah ........................................................................... 6
C. Tujuan Penelitian ............................................................................... 6
D. Manfaat Penelitian ............................................................................. 7
BAB II. LANDASAN TEORI ...................................................................... 8
A. Tinjauan Pustaka................................................................................ 8
B. Kerangka Pemikiran........................................................................... 24
BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................... 26
A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 26
B. Bahan dan Alat .................................................................................. 26
C. Cara Kerja.......................................................................................... 28
D. Analisis Data ..................................................................................... 45
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN............................... 46
A. Studi Bioinformatika.......................................................................... 46
xii
B. Desain Primer PCR ............................................................................ 47
C. Isolasi Genom .................................................................................... 49
D. Amplifikasi Gen pdc Zymobacter palmae dengan Metode PCR ......... 51
E. Kloning Gen pdc Zymobacter palmae ................................................ 55
F. Ekspresi Gen pdc Zymobacter palmae................................................ 62
BAB V. PENUTUP ...................................................................................... 67
A. Kesimpulan........................................................................................ 67
B. Saran.................................................................................................. 67
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 68
LAMPIRAN ................................................................................................. 72
RIWAYAT HIDUP PENULIS...................................................................... 77
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.Data Statistik Impor Asetaldehida .................................................... 3
Tabel 2.Sumber Mikroba Penghasil Gen pdc Penyandi PDC ......................... 46
Tabel 3.Komponen dan Konsentrasi Pereaksi PCR ....................................... 52
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Rumus Molekul Asetaldehida ...................................................... 11
Gambar 2. Kerangka Pemikiran Penelitian.................................................... 25
Gambar 3. Hasil Isolasi Genom Z. palmae .................................................... 50
Gambar 4. Hasil Amplifikasi gen pdc Z. palmae ........................................... 54
Gambar 5. Circle Map pGEM-T easy............................................................ 56
Gambar 6. Hasil Transformasi Rekombinan pdc Z. palmae ........................... 58
Gambar 7. Hasil Isolasi Plasmid Rekombinan pGEM-T easy + pdc .............. 61
Gambar 8. Circle Map Plasmid pET21b........................................................ 63
Gambar 9. Hasil Digesti plasmid pET21b ..................................................... 64
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Sekuen Nukleotida Gen pdc Z. palmae...................................... 72
Lampiran 2. Hasil Uji In Silico Fast PCR ...................................................... 73
Lampiran 3. Hasil Sekuensing Gen pdc Z. palmae ........................................ 74
Lampiran 4. Daftar Riwayat Hidup Penulis ................................................... 77
xvi
DAFTAR SINGKATAN
Singkatan
Kepanjangan
µl
µm
Atm
BLAST
BPPT
BPS
BUMN
CBRG
DNA
GRAS
HCl
IPTG
kb
LB
LIPI
mPa
mRNA
MYE
NaCl
NCBI
OD
PCR
PDC
SDS
TAE
TBE
TE
ThDP
TI
X-gal
mikroliter
mikrometer
Atmosfer
Basic Local Allignment Search Tool
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi
Biro Pusat Statistik
Badan Usaha Milik Negara
Carbohydrate and Bioengineering Research Group
Deoxyribo Nucleic Acid
Generally Recognized As Safe
Hidroklorida
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
Kilo basepairs
Luria Bertani
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
mili pascal
messenger ribonucleotide
Maltose Yeast Extract
Natrium Klorida
National Center for Biotechnology Information
Optical Density
Polymerase Chain Reaction
Pyruvate Decarboxylase
Sodium Dodesil Sulfat
Tris Asetat EDTA
Tris Borat EDTA
Tris EDTA
Thiamin Diphosphate
Teknik Informasi
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
xvii