Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina
Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
1
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Validasi Melamin
dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass
Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2013
Edwin Cahyadi
NIM G84062557
ABSTRAK
EDWIN CAHYADI. Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode
LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada
Artemia salina. Dibimbing oleh Prof Dr.drh Maria Bintang, MS dan Sri
Rachmawati, BSc, MSc.
Melamin adalah suatu senyawa organik yang berbentuk kristal putih dan
agak sulit terlarut dalam air. Metode validasi adalah suatu prosedur yang
digunakan untuk membuktikan hasil suatu metode analisis bersifat valid, akurat
dan tepat. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem,
linearitas, recovery (perolehan kembali), limit deteksi, dan limit kuantifikasi.
Metode analisis Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LCMS) dengan
standar melamin memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik dengan nilai
simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian sistem) dan rerata perolehan
kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%. Limit deteksi (LOD) dan limit
kuantifikasi (LOQ) didapatkan masing-masing yaitu 5 ppb dan 7 ppb, linearitas
dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r)
0,9367. Pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada
pada kisaran antara 0,02 ppm-0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm ) dan jika
menggunakan program microsoft excel diperoleh LC50 sebesar 0,036 ppm atau
0,036 µg/mL. Nilai LC50 tersebut menunjukkan bahwa melamin termasuk kriteria
yang tergolong toksik.
Kata kunci: Brine Shrimp Lethality Test, melamin, toksisitas, uji Validasi
ABSTRACT
EDWIN CAHYADI. Validation Test of Melamine in Milk Powder by LC-MS
method (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) and Artemia salina
toxicity test. Supervised by Prof. Dr.drh Maria Bintang, MS and Sri Rachmawati,
BSc, MSc.
Melamine is an organic compound in the form of white crystals and a bit
difficult to dissolve in water. Method validation is a procedure that is used to
prove the results of an analytical method is valid, accurate and precise. Parameter
validation methods include system suitability, linearity recovery, limit of detection
(LOD) and limit of quantification (LOQ). Liquid Chromatography-Mass
Spectrofotometry (LCMS) analysis method with a standard melamine has good
accuracy and precision with a relative standard deviation value of 1.18% (system
suitability test) and the mean recovery generated by 89.13 ± 9.47%. Limit of
detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) obtained respectively at 5 ppb
and 7 ppb, linearity with line equation y = 71,343,428 + 1371748x and correlation
coefficient (r) 0.9367. The result of BSLT get LC50 are in range 0.02-0.1 ppm
(0.02 ppm ≤ LC50 ≤ 0.1 ppm) and if using microsoft excel program LC50 obtained
at 0.036 ppm or 0.036 µg / mL. LC50 values showed that was toxic.
Keywords: Brine Shrimp Lethality Test, melamine, toxicity, test validation
2
Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
1
Judul Skripsi : Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
Nama
: Edwin Cahyadi
NRP
: G84062557
Disetujui oleh
Prof Dr.drh Maria Bintang, MS
Pembimbing I
Sri Rachmawati, BSc, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang maha kuasa atas rahmat
dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini hingga
selesai penulisan skripsi yang berjudul Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk
dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang telah dilaksanakan mulai bulan Juni sampai Desember 2012 yang bertempat
di laboratorium toksikologi Balai Besar Penelitian Veteriner.
Penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Prof Dr.drh
Maria Bintang, MS selaku dosen pembimbing saya di biokimia yang telah,
memeriksa draft skripsi saya di waktu kesibukan beliau dan juga memberikan
semangat kepada saya untuk secepatnya menyelesaikan penelitian ini, serta
kepada ibu Sri Rachmawati, BSc, MSc selaku pembimbing dari Laboratorium
Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), yang telah sabar
membimbing saya, menasehati saya dan mengarahkan saya dalam penulisan
penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh. Prima Mei
Widiyanti, Bapak Mihardja atas semua bantuannya selama saya penelitian di
Laboratorium Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET).
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kakak saya tercinta yaitu kak
Selvi Novianti dan mama Yeyen sebagai mama angkatku tersayang atas bantuan
dan perhatiannya dalam proses pengerjaan skripsi. Serta ucapan terima kasih
kepada seluruh pengajar dan murid di bimbel MAFIA CLUBS IPB yang selalu
memberikan motivasi untuk menyelesaikan penelitian dan skripsi ini. Semoga
karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Februari 2013
Edwin Cahyadi
3
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Kesesuaian Sistem
4
Linearitas
4
Recovery
5
Limit of Detection (LOD)
6
Limit of Quantitation (LOQ)
6
Toksisitas Melamin terhadap Larva udang
7
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL
1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem
2 Hasil Uji Recovery
3 Hasil Uji Limit of Quantitation (LOQ)
4 Data kesesuaian sistem
5 Data linearitas
6 Data pengamatan toksisitas
4
5
7
17
18
19
DAFTAR GAMBAR
1 Hubungan antara konsentrasi melamin dengan luas area
2 Luas Area Puncak 5 ppb
3 Hubungan antara persen kematian dengan konsentrasi
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Proses ekstraksi melamin
3 Diagram alur uji toksisitas
4 Data kesesuaian sistem
5 Hasil perhitungan data recovery
6 Data uji linearitas
7 Hasil pengamatan Toksisitas
14
15
16
17
18
19
20
1
PENDAHULUAN
Pada tahun 2008, kadar melamin dalam jumlah besar ditemukan pada
berbagai jenis pangan asal Cina, yaitu susu formula bayi, produk susu olahan cair,
bubuk (misal permen berbasis susu, produk kopi bubuk instant, biskuit, coklat,
dan minuman berbasis susu) serta berbagai produk bukan berbasis susu (amonium
bikarbonat, pakan hewan, ingredien pakan, tepung telur, telur mentah serta krimer
bukan susu)(Chen 2009).
Melamin adalah suatu senyawa organik dengan berat molekul 126.12,
berbentuk kristal putih dan agak sulit terlarut dalam air. Penambahan melamin
ditujukan untuk meningkatkan kadar nitrogen karena melamin memiliki
kandungan nitrogen yang tinggi (66%) sehingga pada saat susu diperiksa seolaholah susu mempunyai kandungan protein yang tinggi, karena secara umum
kandungan protein ditetapkan dengan cara menentukan kandungan nitrogennya.
FDA (Food and Drugs Administration) dari Amerika Serikat dan WHO
menetapkan Tolerable Daily Intake (TDI) yang dapat ditoleransi dalam 1 hari dari
melamin sebesar 0.2 mg per kg berat badan manusia. Toksisitas melamin
disebabkan oleh kandungan asam sianurat yang umumnya terdapat bersama-sama
melamin. Jika melamin di konsumsi secara berlebihan akan menyebabkan
komposisi antara formaldehid dengan fenol menjadi tidak seimbang maka dari itu
akan terjadi residu, yaitu monomer formaldehid atau fenol yang tidak bersenyawa
sempurna.
Analisis terhadap melamin dapat ditentukan melalui berbagai metode, salah
satunya adalah Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LC-MS)
(Turnipseed 2008). LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrofotometry)
adalah teknik analisis kimia yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik
dari Liquid Chromatography (LC) dengan kemampuan analisis massa dari Mass
Spectrometry (MS). Pemisahan senyawa terjadi pada sistem Liquid
Chromatography (LC) menggunakan fase gerak berupa cairan yang terikat secara
kimia pada penyangga halus (fase diam) dan berupa cairan (fase gerak) yang
dipaksa mengalir dengan laju terkendali memakai tekanan tinggi. Setelah terjadi
pemisahan, senyawa dalam larutan diubah menjadi gas dan dideteksi oleh detektor
spektrometri massa. Di Indonesia sendiri belum banyak industri maupun
laboratorium uji yang menggunakan metode LC-MS dalam menganalisis
melamin. Sehingga diperlukan kajian metode analisis melamin secara
laboratorium lebih lanjut.
Metode penentuan melamin dalam susu formula menggunakan LC-MS
harus divalidasi terlebih dahulu untuk menjamin keabsahan hasil analisis. Validasi
metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Metode yang tidak resmi
yang akan digunakan dalam pengujian harus di validasi sehingga dapat dibuktikan
metode tersebut dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah pada kondisi aktual
yang digunakan. Validasi bertujuan untuk menjamin bahwa metode analisis yang
digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal sehingga dapat
dipercaya. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem,
recovery (perolehan kembali), linearitas, limit deteksi, dan limit kuantifikasi
(Istiqlalah 2004).
2
Setelah melakukan uji validasi, penelitian ini juga melakukan uji toksisitas
melamin dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan
metode pengujian toksisitas suatu bahan dengan organisme uji berupa nauplius
(larva) Artemia salina Leach. Penelitian dengan menggunakan metode BSLT
memiliki beberapa keuntungan diantaranya cepat, mudah, dan biaya yang relatif
murah jika dibandingkan dengan metode lain. Oleh karena itu penelitian ini
bertujuan mendeteksi melamin yang valid dan menguji biotoksisitas melamin
dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) pada Artemia salina. Metode
uji validasi yang dilakukan valid untuk analisis melamin pada susu dan melamin
bersifat toksik terhadap larva udang yang diuji dengan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT).
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah susu bubuk yang telah tersedia di
BBALITVET, Bogor, asetonitril, asam formiat 2.5 %, amonium asetat, melamin,
susu bubuk, Artemia salina leach dan air laut.
Alat
Alat-alat yang digunakan yaitu LC-MS 2010 EV, Shimadzu Liquid
Chromatography Mass Spectrofotometry, pipet volumetrik, tabung vial, tabung
ependorf, sentrifus, aerator, vortex, labu takar, erlenmeyer, socorex 0-150 µL,
socorex 100-1000 µL, dan neraca kalibrasi.
Prosedur Analisis Data
Pembuatan Fase Gerak
Sebanyak 7.6 g sampel amonium asetat (NH4CH3COO) di timbang dan di
masukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL. Kemudian ditambahkan aquades hingga
batas dan larutan tersebut di sonikasi terlebih dahulu selama 10 menit.
Preparasi Standar
Persiapan Standar Baku Melamin
Labu ukur 10 mL di siapkan dan di bilas dengan metanol. Melamin di
timbang dengan neraca analitik mettler BSIAR untuk 1000 ppm sekitar 10.4120
mg. Lalu dilarutkan dengan metanol sampai 10 ml sedikit demi sedikit dengan
sepatu timbang, lalu di vorteks sampai larut.
Ekstraksi Melamin
Sampel susu sebanyak 2,0 ± 0.1 dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50
mL. Kemudian di tambahkan 14 mL asam format 2.5 % dalam air. Lalu Tabung
ditutup, dam di kocok-kocok selama 15-30 detik, kemudian di kocok lagi dengan
menggunakan vortex mixer selama 30 menit. Setelah itu, sampel di sentrifugasi
pada 4000 rpm selama 10 menit di suhu ruang. Supernatan di pindahkan sebanyak
1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung sentrifius. Lalu di sentrifugasi lagi pada 13000
3
rpm selama 30 menit. Kemudian di ambil semua supernatan dan di pindahkan ke
dalam tabung ependorf. Setelah itu, di encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL
ekstrak + 950 µL asetonitril) lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifugasi lagi
pada 5900 rpm selama 30 menit. Supernatan di pindahkan ke autosampler vial 2
mL siap untuk di suntikan ke alat LC-MS.
Uji Validasi
Uji Kesesuaian Sistem
Larutan baku melamin dengan konsentrasi 0,5 ppm disuntikkan sebanyak
10 µL dan diukur puncak area. Pengerjaan diulangi sampai tujuh kali
pengulangan, dan luas puncak yang diperoleh, dihitung simpangan baku
relatifnya.
Uji Linearitas
Pada uji linearitas dibuat larutan yang terdiri dari lima konsentrasi yang
berbeda. Pembuatan larutannya yaitu sebanyak 10 µL, 20 µL, 40 µL, 100 µL, 200
µL larutan baku melamin 50 ppm diencerkan menjadi 2 ml pelarut asetonitril
untuk mendapatkan konsentrasi 0.25, 0.5, 1, 2,5 dan 5 ppm. Larutan siap di injek
ke dalam alat LC-MS. Selanjutnya hasil peak area dari masing-masing konsentrasi
di plot terhadap konsentrasi ( konsentrasi versus luas area).
Uji Perolehan Kembali (Recovery)
Sampel di buat dengan konsentrasi akhir yang di injek ke alat 0.5 ppm.
Sebanyak 2 gram sampel susu bubuk diekstrak dengan 14 ml asam format
kemudian di tambahkan 280 µL standar baku melamin (1000 ppm) lalu dikocok
selama 30 menit. Sampel disentrifius pada 4000 rpm selama 10 menit di ruangan
temperatur. Pindahkan supernatan sebanyak 1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung
sentrifius. Lalu di sentrifius lagi pada 13000 rpm selama 30 menit. Lalu diambil
semua supernatan dan di pindahkan ke dalam tabung ependorf. Di pipet 50 µL
ekstrak + 950 µL asetonitril lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifius lagi pada
5900 rpm selama 30 menit. Lalu sampel siap untuk di analisis, di suntikan ke alat
LC-MS.
Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Perhitungan batas deteksi diperoleh melalui konsentrasi terendah analit
terdeteksi yang dapat terdeteksi dan batas kuantitasi di hitung dari limit deteksi +
10 x standar deviasi dari 9x pengulangan dari injeksi konsentrasi limit deteksi.
Uji Toksistas
Uji toksisitas melamin dengan BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test)
Sebanyak ± 20 mg telur A. salina dimasukkan ke dalam wadah penetasan
yang berisi air laut buat dan diberi penyinaran serta aerator. Setelah 24 jam telur
4
yang sudah menetas menjadi larva (nauplii) dipindahkan ke wadah lain, naupili
tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji.
Sebanyak 30 ekor larva A. salina dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10
mL uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) yang berisi air laut dan dibuat
konsentrasi ekstrak melamin 0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm.
Untuk setiap konsentrasi dilakukan 2 kali pengulangan. Larutan diaduk sampai
homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel melamin.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva udang
yang mati dengan bantuan lampu bohlam dan kaca pembesar. Grafik dibuat
dengan menghubungkan konsentrasi dan persen kematian larva. Nilai LC50
diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu persen kematian
sampai memotong sumbu grafik, perpotongan garis di tarik ke garis konsentrasi
zat yang menyebabkan kematian larva 50%.
Hasil
Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum suatu sistem analisis
digunakan dengan tujuan untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir.
Uji kesesuaian sistem harus dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa
sistem analisis beroperasi secara benar. Menurut farmakope Amerika, suatu
sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dari salah satu uji
berikut, yakni resolusi, presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor
kapasitas (Reynilda 2008). Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 1 .
Tabel 1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem
Luas Puncak
Waktu
Rata‐rata
(Area)
Retensi
(menit)
1,388
1,388
1,387
1,384
1,385
1,382
1,385
1272325
1280330
1310298
1294215
1306307
1308049
1308663
1297169,57
Simpangan
Baku (SB)
Simpangan
Baku Relatif
(SBR)
15361,5456
1,18
Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon
yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas biasanya
dinyatakan sebagai variasi sekitar kemiringan (slope) dari garis regresi yang
diperhitungkan sesuai dengan rumus matematika. Kelinearan suatu metode harus
diuji untuk membuktikan adanya hubungan linear antara konsentrasi analit dengan
respon instrumen. (Hartutik 2007). Kurva kalibrasi melamin dapat dilihat pada
gambar 1.
5
Gambar 1 Hubungan antara Konsentrasi Melamin dengan Luas Area.
Recovery
Perolehan kembali (recovery) menunjukkan derajat kedekatan hasil
analisis terhadap kadar zat yang sebenarnya. Akurasi merupakan ukuran ketepatan
metode analisis dan biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali.
Perolehan kembali ditetapkan dengan cara menambah analit dalam jumlah tertentu
ke dalam tempat yang mengandung analit yang sama dan ditentukan harga persen
perolehan kembali. Untuk analisis, harga persen perolehan kembali antara 80-120
%. Makin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya, maka
akurasinya semakin tinggi (Istiqlalah 2004). Hasi uji recovery dapat di lihat pada
Tabel 2.
Tabel 2 Hasil Uji Recovery
Konsentrasi yang di
tambahkan
0.5 µg/g
0.5 µg/g
0.5 µg/g
Ulangan
1
2
3
Luas
Puncak
(Area)
1272325
1308663
1389934
Kosentrasi yang
ditemukan
0.41
0.43
0.49
rata-rata
%
Recovery
82
86.8
98.6
89.13
6
Limit of Detection (LOD)
Limit of Detection (LOD) adalah suatu metode analisis yang menunjukkan
nilai parameter uji batas, yaitu konsentrasi analit terendah yang dapat di deteksi,
tetapi tidak dikuantitasi pada kondisi percobaan yang dilakukan. Batas ambang
deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel. Batas deteksi adalah
batas kadar terkecil yang masih dapat dideteksi oleh alat dan menghasilkan respon
yang bermakna. cara yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi yaitu
berdasarkan evaluasi visual. Dapat digunakan untuk metode analisis non
instrumental dan instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan
analisis terhadap zat uji yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar
terendah yang dapat dideteksi dengan baik (Reynilda 2008).
Gambar 2 Luas Area pada 5 ppb.
Limit of Quantification (LOQ)
Batas ambang kuantitasi (Limit of Quantitation) adalah konsentrasi analit
terkecil yang dapat dikuantitasi secara cermat dan seksama. Batas kuantitasi
metode perlu ditentukan kalau metode tersebut digunakan untuk menganalisis
sampel yang mengandung analit berkadar rendah. Cara yang dapat digunakan
untuk menentukan batas kuantitasi, yaitu berdasarkan evaluasi visual. Dapat
digunakan untuk metode analisis non instrumental dan instrumental. Batas
kuantitasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap zat uji yang diketahui
konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan
secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima. dari suatu
metode analisis adalah nilai parameter penentuan kuantitatif senyawa yang
terdapat dalam konsentrasi rendah dalam matriks. Batas ambang kuntitasi adalah
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan. Batas
ambang kuantitasi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel (Hartutik
2007).
7
Tabel 3 Hasil Uji LOQ (Limit of Quantification)
Luas Puncak
Ulangan
Konsentrasi
(Area)
1
5 ppb
157399
2
5 ppb
158803
3
5 ppb
169705
4
5 ppb
157505
5
5 ppb
161493
6
5 ppb
148119
7
5 ppb
158641
8
5 ppb
156962
9
5 ppb
148790
rata-rata
157490,7778
RSD ( Relatif Standar
Deviasi)
6442,7471
LOQ = LOD + (10 x SDV) x LOD
luas area
= 5 + 10.6442.7 x 5
157490
= 7 ppb
Toksisitas Melamin pada Larva Udang
Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan metode pengujian
toksisitas suatu bahan dengan Artemia salina Leach. Metode ini cukup praktis,
cepat, mudah, murah dan cukup akurat. Pemeriksaan toksisitas diperlukan untk
mengetahui konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan sehingga dapat
diketahui jumlah penggunaan konsentrasi yang tepat. Tingkat konsentrasi yang
dapat menyebabkan keracunan ditentukan dengan letal konsentrasi 50 (LC50). Lc50
adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50 % kematian dalam
suatu populasi. Lc50 dapat digunakan untuk menentukan toksisitas dari suatu zat.
Hasil kuva toksisita melamin dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3 Hubungan antara Persen kematian (%) dengan konsentrasi (ppm)
8
Pembahasan
Validasi suatu metode analisis yang dilakukan untuk menjamin bahwa
metode analisis bersifat akurat, spesifik, dan tahan pada kisaran analit yang akan
dianalisis. Selain itu, agar proses pemeriksaan suatu produk mencapai hasil sesuai
dengan spesifikasi yang telah ditentukan sebelumnya. Hal tersebut dilakukan
untuk mengidentifikasi validasi yang perlu dilakukan sebagai bukti pengendalian
terhadap aspek kritis dari kegiatan yang dikerjakan, sehingga metode analisis
yang telah divalidasi dapat digunakan secara rutin dan menghasilkan data yang
dapat diandalkan kebenarannya. Menurut International Conference on
Harmonisation (ICH 1994), parameter validasi yang diuji meliputi uji kesesuaian
sistem, linearitas, recovery, limit deteksi dan limit kuantitasi (Ibrahim 2001).
Pengujian pertama yang dilakukan yaitu uji kesesuaian sistem yang perlu
dilakukan sebelum suatu sistem analisis digunakan dengan tujuan untuk
memastikan keefektifan sistem operasional akhir. Uji kesesuaian sistem harus
dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa sistem analisis beroperasi secara
benar. Menurut farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi
persyaratan presisi dari salah satu uji berikut, yakni resolusi, presisi, faktor
asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor kapasitas (Reynilda 2008).
Pengujian ini didasarkan pada suatu konsep bahwa elektronik, peralatan, zat
uji, dan kondisi operasional analisis membentuk satu sistem analitik tunggal yang
dapat diuji fungsinya secara keseluruhan. Hasil uji kesesuaian sistem yang dapat
dilihat pada Tabel 1 menunjukkan bahwa Nilai SBR (Simpangan Baku Relatif)
hasil pengukuran adalah 1.18 % dan memenuhi kriteria penerimaan parameter
ketelitian menurut ICH (1994) dan ASEAN (1996), yaitu SBR harus lebih kecil
atau sama dengan 2.0%. Metode ini berdasarkan nilai SBR yang diperoleh
termasuk teliti, artinya setiap hasil analisis yang dilakukan secara berulang
memiliki nilai yang tidak jauh berbeda.
Pengujian berikutnya yaitu lineritas. Linearitas merupakan kemampuan
suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional
dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode
adalah ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara
konsentrasi standar melamin dan luas puncak yang merekomendasikan minimal
lima deret konsentrasi larutan standar harus digunakan untuk mengevaluasi
linearitas (ICH 1994). Koefisien korelasi, kemiringan (slope), dan intersep-y harus
dilaporkan (Iatiqlalah 2004). Kurva standar yang diperoleh dari Tabel 3 memiliki
persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r) 0,9367
(Gambar 1). Nilai r yang diperoleh mendekati satu sehingga dapat dikatakan
bahwa kurva memiliki kelinearan yang tinggi, artinya dengan meningkatnya
konsentrasi melamin maka luas puncak juga akan mengalami kenaikan yang
linear. Menurut ICH (1994), nilai r yang dihasilkan telah memenuhi persyaratan,
yaitu harus lebih dari 0.90.
Ketepatan dapat dilihat berdasarkan nilai recovery standar yang
ditambahkan ke dalam contoh dengan menggunakan metode penambahan standar.
Persen perolehan kembali tidak harus 100%, tetapi perolehan kembali analit
menggunakan internal standar harus konsisten dan presisi. Penentuan perolehan
kembali diperoleh dari membandingkan hasil analisis dari 3 konsentrasi sampel
(rendah, medium, tinggi). Respon analit harus dapat diidentifikasi dengan kriteria
9
akurasi 80–120% (ICH 1994). Data hasil uji ketepatan dapat dilihat pada Tabel 3
dan perhitungannya berada pada lampiran 4. Rerata hasil recovery melamin yang
ditambahkan untuk tiga konsentrasi berada di antara kisaran tersebut, yaitu 89,13
± 9,47%. Hal ini menunjukkan bahwa metode ini tepat untuk menganalisis
melamin karena memenuhi persyaratan ICH.
Limit of Detection (LOD) didefinisikan sebagai sebagai konsentrasi analit
terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara nyata dari sinyal
blanko dan sinyal latar belakang (Ibrahim 2001). Sedangkan menurut Reynilda
(2008), LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas
deteksi sangat penting dalam analisis untuk menentukan jumlah kontaminan yang
ada di bawah atau di atas batas yang diperbolehkan. Batas deteksi merupakan
kriteria dalam pemilihan metode tersebut (Ibrahim 2001). Limit of Quantitation
(LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terkecil yang dapat dikuantisasi
secara cermat dan seksama (Ibrahim 2001). Seperti halnya batas deteksi, batas
kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linear. Semakin
kecil nilai LOD dan LOQ menunjukkan semakin sensitifnya suatu metode pada
penelitian ini, nilai LOD diperoleh dari pengamatan secara visual, kurva
kosentrasi 5 ppb melamin masih memberikan kromatogram yang baik (Lampiran
5) dan LOQ dianalisis secara statistik melalui luas puncak kurva dengan 9 kali
ulangan injeksi konsentrasi limit deteksi 5 ppb di tambah dengan hasil 10 kali
Standar Deviasi (SD) dengan . Sensitivitas metode ini terlihat dari perolehan nilai
LOD = 5 ppb dan LOQ = 7 ppb.
Larva udang A. Salina yang digunakan untuk uji toksisitas diperoleh dari
hasil penetasan menggunakan air laut dengan bantuan aerator untuk menjaga
kecukupan kadar oksigen yang terlarut. Gelembung udara dari aerator berfungsi
sebagai pengaduk telur sehingga telur tidak mengendap di dasar wadah.
Penggunaan aerator tersebut dikarenakan telur akan sulit menetas jika oksigen
dalam air kurang. Selain itu dilakukan penyinaran selama proses penetasan yang
berfungsi untuk menjaga kondisi air. Umur larva udang yang digunakan adalah 24
jam setelah menetas. Kondisi membran sel larva udang A. Salina pada umur
tersebut masih lunak sehingga memudahkan senyawa asing dalam air masuk ke
dalam tubuh larva udang A. Salina dan akan menyebabkan kematian. Kematian
dari larva udang A. Salina yang disebabkan oleh senyawa asing dalam air tersebut
yang menjadi dasar untuk pengujian toksisitas (Moon 1992).
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas
yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik
dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan karena mudah, cepat, murah dan
cukup reproducible.
Menurut Meyer (1982), senyawa bahan alam dapat dikatakan sangat toksik
bila nilai LC50 < 30 µg/mL, dan toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/mL. LC50 (Lethal
Concentration 50) merupakan konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya
kematian pada 50% hewan percobaan yaitu larva Artemia salina Leach. Hasil
pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada pada
kisaran 0,02 - 0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm) yang dapat di lihat pada
Gambar 3, sehingga dapat dikatakan standar melamin itu termasuk sangat toksik
karena ukuran dari hewan uji coba terlalu kecil. Hasil pengamatan uji toksisitas
larva udang terhadap melamin dapat dilihat pada Tabel 6.
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Metode analisis LCMS dengan standar melamin memiliki ketelitian dan
ketepatan yang baik dengan nilai simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian
sistem) dan rerata perolehan kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%.
Limit deteksi dan limit kuantifikasi metode adalah 5 ppb dan 7 ppb, linearitas
dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748 x dan koefisien korelasi (r)
0,9367. Melamin tergolong toksik dengan nilai LC50 sebesar 0,036 ppm atau 0,036
µg/mL. Metode analisis LC-MS yang telah dilakukan memiliki hasil yang valid.
Saran
Perlu dilakukan uji keterulangan dan uji toksisitas melamin in vivo pada
hewan coba seperti mencit. Selain itu juga, diperlukan pengujian analisis sampel
susu formula yang sesuai dengan standar baku pemerintah.
DAFTAR PUSTAKA
Andersen WC, Turnipseed SB, Karbiwnyk CM, Clark, SB, Madson MR, Gieseker
CM, Miller RA, Rummel NG, Reimschuessel R. 2008. Determination and
Confirmation of Melamine Residues in Catfish, Trout, Tilapia, Salmon and
Shrimp by LC-MS-MS. J. Ag. Food Chem 56: 4340.
Briggle T V, Allen L M, Duncan R C. 1981. High performance liquid
chromatographic determination of cyanuric acid in human urine and pool
water. J Assoc Off Anal Chem 64, 1222-1226.
Carbas P, Meloni M, Spaneedda L. 1990. High-performane liquid
chromatographic separation of cyromazine and its metabolite melamine. J
Chromatography 505(2), 413-416.
Chen J S. 2009. A worldwide food safety concern in 2008. melaminecontaminated infant formula in China caused urinary tract stone in 290000
children in China. Chinese Medical Journal 122(3), 243-244.
Chozin AS, Sutarno, Ruslan K. 1996. Uji Brine shrimp dan analisis kandungan
kimia fraksi ekstrak etanol 95 % dan suren Toona Sureni (BL) Merr.
Prosiding Simposium Penelitian bahan obat alami, Perhipba Balittro, Bogor
: 537-577.
Davidson M B, Thakkar S, Hix J. 2004. Pathophysiology, clinical consequences,
and treatment of tumor lysis syndrome. Am J Med 116, 546-554.
Debesis, E. et al., 1982. Submitting HPLC methodes to the compendia and
regulatory agencies. Pharm.Tech., September. p. 120
Ehling S Tefera S, Ho I P 2007. High-performance liquid chromatographic
method for the simultaneous detection of the adulteration of cereal flours
with melamine and related triazine by-products ammeline, ammelide, and
cyanuric acid. Food Addit Contam 24, 1319-1325.
11
Filigenzi M S, Tor E R, Poppenga R H. 2007. The determination of melamine in
muscle tissue by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid
Commun Mass Spectrom 21, 4027-4032.
Hartutik ES. 2007. Validasi metode penerapan kadar vitamin B12
(sianokobalamin) pada produk bubur bayi secara mikrobiologi [laporan PL].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Heller, DN, Nochetto, C. 2003. Simultaneous Determination and Confirmation of
Melamine and Cyanuric Acid in Animal Feed by Zwitterionic HILIC
Chromatography and Tandem Mass Spectrometry, in press, Rapid Commun.
Mass Spectrom.
Iatiqlalah A. 2004. Validasi metode analisis penetapan kadar pirazinamida secara
KCKT [Laporan PL]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Ibrahim S. 2001. Penggunaan Statistika dalam Validasi Metode Analitik dan
Penerapannya. Dalam Prosiding temu ilmiah nasional bidang Farmasi. VI –
15.
International Conference on Harmonisation [ICH]. 1994. Validation of Analytical
Procedures: Definitions and Terminology. WWW ICH. [terhubung berkala].
http://www.ich.org [9 Jan 2006].
Jutzik, Cook A M, Hutter R. 1982. The degradative pathway of the s-triazine
melamine. The steps to ring cleavage. Biochemistry Journal 208(3), 679684.
Meyer BN et al. 1982. Brine Shrimps: A Comvenient General Booasaay for active
Plant Constituent. Planta Med 45:31-34.
Moon CK, Park KS. 1992. Drug and chemical toxicology. Drug Chem. Toxicol.
15 (1):81-91.
Patel K, Jones K. 2007. Analytical method for the quantitative determination of
cyanuric acid as the degradation product of sodium dichloroisocyanurate in
urine by liquid chromatography mass spectrometry. J Chromatogr B 853,
360-363.
Pujiati I, Ningsih S, Palupi S. 2002. Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia
salina leach. Dari fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat, dan air ekstrak
etanol rimpang temumangga. (Prosiding Seminar Nasional Tumbeuhan
Obat Indonesia ). Universitas Surabaya. Surabaya :109-115.
Reynilda J. 2008. Validasi metode analisis penetapan kadar clindamycin dalam
librodan kapsul secara HPLC [Laporan PL]. Surabaya: Fakultas Farmasi,
Universitas Surabaya.
Sancho J V, Ibanez M, Grimalt S. 2010. Residue determination of cyromazine and
its metabolite melamine in chard samples by ion-pair liquid chromatography
coupled to electrospray tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta 530,
237-243. 94 MIAO AND FAN ET AL.
Smoker M, Krynitsky A J 2008. LIB_Interim Method for Determination of
Melamine and Cyanuric Acid Residues In Foods using LC_MS_MS:
Version 1.0. Laboratory Information Bulletin No. 4422, October 2008.
accessed at http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html.
12
Turnipseed S, Casey C, Nochetto C. 2008. Determination of Melamine and
Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS. Laboratory
Information Bulletin No. 4421, Volume 24, October 2008. accessed at
http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html.
Vail T, Jones P R, Sparkman O D. 2007. Rapid and unambiguous identification of
melamine in contaminated pet food based on mass spectrometry with four
degrees of confirmation. J Anal Toxicol 31, 304-312.
World Health Organization (WHO). 2008. Expert meeting to review toxicological
aspects of melamine and cyanuric acid, Ottawa, Canada, 1-4 December 8,
Overall
conclusion
and
recommands.
(Accesed
at
http://www.who.int/foodsafety/fs_management/conclusions_recommendatio
n.pdf).
Yokley R A, Mayer L C, Rezaaiyan R. 2000. Analytical method for the
determination of cyromazine and melamine residues in soil using LC-UV
and GCMSD. J Agric Food Chem 48, 3352-3358.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian
Pembuatan fase gerak
Persiapan standar baku melamin
Ekstraksi melamin
Uji validasi
Toksisitas melamin dengan Artemia salina
15
Lampiran 2 Proses Ekstraksi Melamin
EKSTRAKSI MELAMIN
2.0 ± 0.1 gram sampel
Masukkan ke tube 50 mL
14 mL asam format 2.5 % dalam air
Tabung di tutup
Vortex mixer 30 menit
Sentrifus pada 5000 rpm selama 10 menit, suhu ruang
Pindahkan 1.4 mL supernatan dalam 1.5 mL tube
Sentrifus 5900 rpm selama 30 menit
Pindahkan semua supernatan ke dalam 1.5 mL tube
Encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL ekstrak + 950 µL asetonitril)
Vortex selama 30 menit
Lalu sentrifus 13.000 rpm selama 30 menit, pindah ke autosampler vial 2
mL (hindari pengendapan)
16
Lampiran 3 Diagram alur uji toksisitas
Pembuatan Larutan Sampel
Sampel melamin
0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm
Penyiapan Larutan Sampel (500 ppm)
50 µL Sampel melamin
Labu ukur 100 mL lalu
ditera dengan air laut
500 ppm (50 µL /100 mL)
Penyemaian benur udang
Di beri ± 30 mg telur
udang/500 mL
Disemaikan dalam labu kocok
t = 24 jam, di bawah sinar
lampu + aerator
Uji toksisitas larva udang
Di siapkan botol 10 mL sebanyak 14 yang berisi air laut buatan
Di buat 5 konsentrasi 0, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2
ppm lalu di masukkan ke dalam botol yang telah disediakan
Tiap konsentrasi akan dimasukkan 30 ekor larva udang
Larva udang di inkubasi selama 24 jam di bawah sinar lampu
17
Lampiran 4 Data kesesuaian sistem
Tabel 4 Data Perhitungan Kesesuaian Sistem
X
x-
(x-
1272325
-24844,5
617249180,3
1280330
-16839,5
283568760,3
1310298
13128,5
172357512,3
1294215
-2954,5
8729070,25
1306307
9137,5
83493906,25
1308049
10879,5
118363520,3
1308663
11493,5
132100542,5
18
Lampiran 5 Hasil Perhitungan Data Recovery
1. Y = 1272325
Y = a + bx
1272325 = 713428,3641 + 1371748.019 x
x = 1272325 - 713428,3641
1371748.019
x = 0.41
x = 0.41 x 100 %
0.5
= 82 %
2. Y = 1308663
Y = a + bx
1308663 = 713428,3641 + 1371748.019 x
x = 1308663 - 713428,3641
1371748.019
x = 0.43
x = 0.43 x 100 %
0.5
= 86.8 %
3. Y = 1389934
Y = a + bx
1389934 = 713428,3641 + 1371748.019 x
X = 1389934 - 713428,3641
1371748.019
X = 0.49
X = 0.49 x 100 %
0.5
= 98.6 %
Rata-rata hasil recovery = 82 + 86.8 + 98.6
3
= 89.13
19
Lampiran 6 Data Uji linearitas
Tabel 5 Data hasil uji linearitas
Konsentrasi (ppm)
Luas Puncak (A)
X
Y
0,25
0,5
1,0
667303
1117542
2118253
2,5
5336263
5,0
7016450
a = 713428,3641
b = 1371748,019
r = 0,9367
Berdasarkan data di atas di peroleh persamaan garis sebagai berikut :
Y = a + bx
71343428 + 1371748 x
r = 0,9367
20
Lampiran 7 Hasil Pengamatan toksisitas
Tabel 6 Hasil Pengamatan Uji Toksisitas Larva Udang terhadap Melamin
Rata‐rata
Larva Udang
Larva Udang
persen
akhir
Rata‐rata
awal
(hidup)
Larva mati kematian (%)
(hidup)
1
2
1
2
78.3
2 ppm
30 30
6 7
23,5
69,95
1 ppm
30 30
8 11 20.5
63,3
0.5 ppm
30 30
11 12 18,5
54,95
0.1 ppm
30 30
13 14 16,5
0.02 ppm
30 30
15 10 12,5
48,3
Contoh Perhitungan
Contoh konsentrasi 2 ppm
Ulangan 1 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 6 = 24 (Larva yang mati)
Ulangan 2 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 7 = 23 (Larva yang mati)
Rata-rata larva yang mati 24 + 23 = 23,5
2
Konsentrasi
(ppm)
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tangerang pada taggal 7 April 1988 dari ayah
Tjahyadi (alm) dan ibu Lilis (alm). Penulis adalah anak kedua dari dua
bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Mardi Yuana Serang dan pada
tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB)
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan tahun 2007 diterima di
Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti Dewan
Perwakilan Mahasiswa (DPM) di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam pada tahun ajaran 2007/2008, Master of Dicipline di Masa Perkenalan
Fakultas (MPF) dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) pada tahun ajaran
2007/2008 dan 2008/2009. Penulis pernah mengikuti dan menang menjadi 15
usaha terbaik dalam Program Mahasiswa Wirausaha IPB di tahun 2009 untuk
bidang usaha pendidikan di daerah kampus IPB. Bulan Juli-Agustus 2009 penulis
melaksanakan Praktik Lapangan Kerja di Balai Perkebunan Bioteknologi
Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor dengan judul Isolasi Fragmen Gen
penyandi Aminosiklopropana karboksilat sintase yang diberi Stimulan Etefon.
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
1
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Validasi Melamin
dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass
Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2013
Edwin Cahyadi
NIM G84062557
ABSTRAK
EDWIN CAHYADI. Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode
LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada
Artemia salina. Dibimbing oleh Prof Dr.drh Maria Bintang, MS dan Sri
Rachmawati, BSc, MSc.
Melamin adalah suatu senyawa organik yang berbentuk kristal putih dan
agak sulit terlarut dalam air. Metode validasi adalah suatu prosedur yang
digunakan untuk membuktikan hasil suatu metode analisis bersifat valid, akurat
dan tepat. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem,
linearitas, recovery (perolehan kembali), limit deteksi, dan limit kuantifikasi.
Metode analisis Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LCMS) dengan
standar melamin memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik dengan nilai
simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian sistem) dan rerata perolehan
kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%. Limit deteksi (LOD) dan limit
kuantifikasi (LOQ) didapatkan masing-masing yaitu 5 ppb dan 7 ppb, linearitas
dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r)
0,9367. Pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada
pada kisaran antara 0,02 ppm-0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm ) dan jika
menggunakan program microsoft excel diperoleh LC50 sebesar 0,036 ppm atau
0,036 µg/mL. Nilai LC50 tersebut menunjukkan bahwa melamin termasuk kriteria
yang tergolong toksik.
Kata kunci: Brine Shrimp Lethality Test, melamin, toksisitas, uji Validasi
ABSTRACT
EDWIN CAHYADI. Validation Test of Melamine in Milk Powder by LC-MS
method (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) and Artemia salina
toxicity test. Supervised by Prof. Dr.drh Maria Bintang, MS and Sri Rachmawati,
BSc, MSc.
Melamine is an organic compound in the form of white crystals and a bit
difficult to dissolve in water. Method validation is a procedure that is used to
prove the results of an analytical method is valid, accurate and precise. Parameter
validation methods include system suitability, linearity recovery, limit of detection
(LOD) and limit of quantification (LOQ). Liquid Chromatography-Mass
Spectrofotometry (LCMS) analysis method with a standard melamine has good
accuracy and precision with a relative standard deviation value of 1.18% (system
suitability test) and the mean recovery generated by 89.13 ± 9.47%. Limit of
detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) obtained respectively at 5 ppb
and 7 ppb, linearity with line equation y = 71,343,428 + 1371748x and correlation
coefficient (r) 0.9367. The result of BSLT get LC50 are in range 0.02-0.1 ppm
(0.02 ppm ≤ LC50 ≤ 0.1 ppm) and if using microsoft excel program LC50 obtained
at 0.036 ppm or 0.036 µg / mL. LC50 values showed that was toxic.
Keywords: Brine Shrimp Lethality Test, melamine, toxicity, test validation
2
Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
1
Judul Skripsi : Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS
(Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina
Nama
: Edwin Cahyadi
NRP
: G84062557
Disetujui oleh
Prof Dr.drh Maria Bintang, MS
Pembimbing I
Sri Rachmawati, BSc, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang maha kuasa atas rahmat
dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini hingga
selesai penulisan skripsi yang berjudul Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk
dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji
Toksisitas pada Artemia salina. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang telah dilaksanakan mulai bulan Juni sampai Desember 2012 yang bertempat
di laboratorium toksikologi Balai Besar Penelitian Veteriner.
Penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Prof Dr.drh
Maria Bintang, MS selaku dosen pembimbing saya di biokimia yang telah,
memeriksa draft skripsi saya di waktu kesibukan beliau dan juga memberikan
semangat kepada saya untuk secepatnya menyelesaikan penelitian ini, serta
kepada ibu Sri Rachmawati, BSc, MSc selaku pembimbing dari Laboratorium
Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), yang telah sabar
membimbing saya, menasehati saya dan mengarahkan saya dalam penulisan
penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh. Prima Mei
Widiyanti, Bapak Mihardja atas semua bantuannya selama saya penelitian di
Laboratorium Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET).
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kakak saya tercinta yaitu kak
Selvi Novianti dan mama Yeyen sebagai mama angkatku tersayang atas bantuan
dan perhatiannya dalam proses pengerjaan skripsi. Serta ucapan terima kasih
kepada seluruh pengajar dan murid di bimbel MAFIA CLUBS IPB yang selalu
memberikan motivasi untuk menyelesaikan penelitian dan skripsi ini. Semoga
karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Februari 2013
Edwin Cahyadi
3
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Kesesuaian Sistem
4
Linearitas
4
Recovery
5
Limit of Detection (LOD)
6
Limit of Quantitation (LOQ)
6
Toksisitas Melamin terhadap Larva udang
7
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL
1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem
2 Hasil Uji Recovery
3 Hasil Uji Limit of Quantitation (LOQ)
4 Data kesesuaian sistem
5 Data linearitas
6 Data pengamatan toksisitas
4
5
7
17
18
19
DAFTAR GAMBAR
1 Hubungan antara konsentrasi melamin dengan luas area
2 Luas Area Puncak 5 ppb
3 Hubungan antara persen kematian dengan konsentrasi
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Proses ekstraksi melamin
3 Diagram alur uji toksisitas
4 Data kesesuaian sistem
5 Hasil perhitungan data recovery
6 Data uji linearitas
7 Hasil pengamatan Toksisitas
14
15
16
17
18
19
20
1
PENDAHULUAN
Pada tahun 2008, kadar melamin dalam jumlah besar ditemukan pada
berbagai jenis pangan asal Cina, yaitu susu formula bayi, produk susu olahan cair,
bubuk (misal permen berbasis susu, produk kopi bubuk instant, biskuit, coklat,
dan minuman berbasis susu) serta berbagai produk bukan berbasis susu (amonium
bikarbonat, pakan hewan, ingredien pakan, tepung telur, telur mentah serta krimer
bukan susu)(Chen 2009).
Melamin adalah suatu senyawa organik dengan berat molekul 126.12,
berbentuk kristal putih dan agak sulit terlarut dalam air. Penambahan melamin
ditujukan untuk meningkatkan kadar nitrogen karena melamin memiliki
kandungan nitrogen yang tinggi (66%) sehingga pada saat susu diperiksa seolaholah susu mempunyai kandungan protein yang tinggi, karena secara umum
kandungan protein ditetapkan dengan cara menentukan kandungan nitrogennya.
FDA (Food and Drugs Administration) dari Amerika Serikat dan WHO
menetapkan Tolerable Daily Intake (TDI) yang dapat ditoleransi dalam 1 hari dari
melamin sebesar 0.2 mg per kg berat badan manusia. Toksisitas melamin
disebabkan oleh kandungan asam sianurat yang umumnya terdapat bersama-sama
melamin. Jika melamin di konsumsi secara berlebihan akan menyebabkan
komposisi antara formaldehid dengan fenol menjadi tidak seimbang maka dari itu
akan terjadi residu, yaitu monomer formaldehid atau fenol yang tidak bersenyawa
sempurna.
Analisis terhadap melamin dapat ditentukan melalui berbagai metode, salah
satunya adalah Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LC-MS)
(Turnipseed 2008). LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrofotometry)
adalah teknik analisis kimia yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik
dari Liquid Chromatography (LC) dengan kemampuan analisis massa dari Mass
Spectrometry (MS). Pemisahan senyawa terjadi pada sistem Liquid
Chromatography (LC) menggunakan fase gerak berupa cairan yang terikat secara
kimia pada penyangga halus (fase diam) dan berupa cairan (fase gerak) yang
dipaksa mengalir dengan laju terkendali memakai tekanan tinggi. Setelah terjadi
pemisahan, senyawa dalam larutan diubah menjadi gas dan dideteksi oleh detektor
spektrometri massa. Di Indonesia sendiri belum banyak industri maupun
laboratorium uji yang menggunakan metode LC-MS dalam menganalisis
melamin. Sehingga diperlukan kajian metode analisis melamin secara
laboratorium lebih lanjut.
Metode penentuan melamin dalam susu formula menggunakan LC-MS
harus divalidasi terlebih dahulu untuk menjamin keabsahan hasil analisis. Validasi
metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Metode yang tidak resmi
yang akan digunakan dalam pengujian harus di validasi sehingga dapat dibuktikan
metode tersebut dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah pada kondisi aktual
yang digunakan. Validasi bertujuan untuk menjamin bahwa metode analisis yang
digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal sehingga dapat
dipercaya. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem,
recovery (perolehan kembali), linearitas, limit deteksi, dan limit kuantifikasi
(Istiqlalah 2004).
2
Setelah melakukan uji validasi, penelitian ini juga melakukan uji toksisitas
melamin dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan
metode pengujian toksisitas suatu bahan dengan organisme uji berupa nauplius
(larva) Artemia salina Leach. Penelitian dengan menggunakan metode BSLT
memiliki beberapa keuntungan diantaranya cepat, mudah, dan biaya yang relatif
murah jika dibandingkan dengan metode lain. Oleh karena itu penelitian ini
bertujuan mendeteksi melamin yang valid dan menguji biotoksisitas melamin
dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) pada Artemia salina. Metode
uji validasi yang dilakukan valid untuk analisis melamin pada susu dan melamin
bersifat toksik terhadap larva udang yang diuji dengan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT).
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah susu bubuk yang telah tersedia di
BBALITVET, Bogor, asetonitril, asam formiat 2.5 %, amonium asetat, melamin,
susu bubuk, Artemia salina leach dan air laut.
Alat
Alat-alat yang digunakan yaitu LC-MS 2010 EV, Shimadzu Liquid
Chromatography Mass Spectrofotometry, pipet volumetrik, tabung vial, tabung
ependorf, sentrifus, aerator, vortex, labu takar, erlenmeyer, socorex 0-150 µL,
socorex 100-1000 µL, dan neraca kalibrasi.
Prosedur Analisis Data
Pembuatan Fase Gerak
Sebanyak 7.6 g sampel amonium asetat (NH4CH3COO) di timbang dan di
masukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL. Kemudian ditambahkan aquades hingga
batas dan larutan tersebut di sonikasi terlebih dahulu selama 10 menit.
Preparasi Standar
Persiapan Standar Baku Melamin
Labu ukur 10 mL di siapkan dan di bilas dengan metanol. Melamin di
timbang dengan neraca analitik mettler BSIAR untuk 1000 ppm sekitar 10.4120
mg. Lalu dilarutkan dengan metanol sampai 10 ml sedikit demi sedikit dengan
sepatu timbang, lalu di vorteks sampai larut.
Ekstraksi Melamin
Sampel susu sebanyak 2,0 ± 0.1 dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50
mL. Kemudian di tambahkan 14 mL asam format 2.5 % dalam air. Lalu Tabung
ditutup, dam di kocok-kocok selama 15-30 detik, kemudian di kocok lagi dengan
menggunakan vortex mixer selama 30 menit. Setelah itu, sampel di sentrifugasi
pada 4000 rpm selama 10 menit di suhu ruang. Supernatan di pindahkan sebanyak
1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung sentrifius. Lalu di sentrifugasi lagi pada 13000
3
rpm selama 30 menit. Kemudian di ambil semua supernatan dan di pindahkan ke
dalam tabung ependorf. Setelah itu, di encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL
ekstrak + 950 µL asetonitril) lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifugasi lagi
pada 5900 rpm selama 30 menit. Supernatan di pindahkan ke autosampler vial 2
mL siap untuk di suntikan ke alat LC-MS.
Uji Validasi
Uji Kesesuaian Sistem
Larutan baku melamin dengan konsentrasi 0,5 ppm disuntikkan sebanyak
10 µL dan diukur puncak area. Pengerjaan diulangi sampai tujuh kali
pengulangan, dan luas puncak yang diperoleh, dihitung simpangan baku
relatifnya.
Uji Linearitas
Pada uji linearitas dibuat larutan yang terdiri dari lima konsentrasi yang
berbeda. Pembuatan larutannya yaitu sebanyak 10 µL, 20 µL, 40 µL, 100 µL, 200
µL larutan baku melamin 50 ppm diencerkan menjadi 2 ml pelarut asetonitril
untuk mendapatkan konsentrasi 0.25, 0.5, 1, 2,5 dan 5 ppm. Larutan siap di injek
ke dalam alat LC-MS. Selanjutnya hasil peak area dari masing-masing konsentrasi
di plot terhadap konsentrasi ( konsentrasi versus luas area).
Uji Perolehan Kembali (Recovery)
Sampel di buat dengan konsentrasi akhir yang di injek ke alat 0.5 ppm.
Sebanyak 2 gram sampel susu bubuk diekstrak dengan 14 ml asam format
kemudian di tambahkan 280 µL standar baku melamin (1000 ppm) lalu dikocok
selama 30 menit. Sampel disentrifius pada 4000 rpm selama 10 menit di ruangan
temperatur. Pindahkan supernatan sebanyak 1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung
sentrifius. Lalu di sentrifius lagi pada 13000 rpm selama 30 menit. Lalu diambil
semua supernatan dan di pindahkan ke dalam tabung ependorf. Di pipet 50 µL
ekstrak + 950 µL asetonitril lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifius lagi pada
5900 rpm selama 30 menit. Lalu sampel siap untuk di analisis, di suntikan ke alat
LC-MS.
Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Perhitungan batas deteksi diperoleh melalui konsentrasi terendah analit
terdeteksi yang dapat terdeteksi dan batas kuantitasi di hitung dari limit deteksi +
10 x standar deviasi dari 9x pengulangan dari injeksi konsentrasi limit deteksi.
Uji Toksistas
Uji toksisitas melamin dengan BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test)
Sebanyak ± 20 mg telur A. salina dimasukkan ke dalam wadah penetasan
yang berisi air laut buat dan diberi penyinaran serta aerator. Setelah 24 jam telur
4
yang sudah menetas menjadi larva (nauplii) dipindahkan ke wadah lain, naupili
tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji.
Sebanyak 30 ekor larva A. salina dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10
mL uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) yang berisi air laut dan dibuat
konsentrasi ekstrak melamin 0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm.
Untuk setiap konsentrasi dilakukan 2 kali pengulangan. Larutan diaduk sampai
homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel melamin.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva udang
yang mati dengan bantuan lampu bohlam dan kaca pembesar. Grafik dibuat
dengan menghubungkan konsentrasi dan persen kematian larva. Nilai LC50
diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu persen kematian
sampai memotong sumbu grafik, perpotongan garis di tarik ke garis konsentrasi
zat yang menyebabkan kematian larva 50%.
Hasil
Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum suatu sistem analisis
digunakan dengan tujuan untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir.
Uji kesesuaian sistem harus dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa
sistem analisis beroperasi secara benar. Menurut farmakope Amerika, suatu
sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dari salah satu uji
berikut, yakni resolusi, presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor
kapasitas (Reynilda 2008). Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 1 .
Tabel 1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem
Luas Puncak
Waktu
Rata‐rata
(Area)
Retensi
(menit)
1,388
1,388
1,387
1,384
1,385
1,382
1,385
1272325
1280330
1310298
1294215
1306307
1308049
1308663
1297169,57
Simpangan
Baku (SB)
Simpangan
Baku Relatif
(SBR)
15361,5456
1,18
Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon
yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas biasanya
dinyatakan sebagai variasi sekitar kemiringan (slope) dari garis regresi yang
diperhitungkan sesuai dengan rumus matematika. Kelinearan suatu metode harus
diuji untuk membuktikan adanya hubungan linear antara konsentrasi analit dengan
respon instrumen. (Hartutik 2007). Kurva kalibrasi melamin dapat dilihat pada
gambar 1.
5
Gambar 1 Hubungan antara Konsentrasi Melamin dengan Luas Area.
Recovery
Perolehan kembali (recovery) menunjukkan derajat kedekatan hasil
analisis terhadap kadar zat yang sebenarnya. Akurasi merupakan ukuran ketepatan
metode analisis dan biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali.
Perolehan kembali ditetapkan dengan cara menambah analit dalam jumlah tertentu
ke dalam tempat yang mengandung analit yang sama dan ditentukan harga persen
perolehan kembali. Untuk analisis, harga persen perolehan kembali antara 80-120
%. Makin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya, maka
akurasinya semakin tinggi (Istiqlalah 2004). Hasi uji recovery dapat di lihat pada
Tabel 2.
Tabel 2 Hasil Uji Recovery
Konsentrasi yang di
tambahkan
0.5 µg/g
0.5 µg/g
0.5 µg/g
Ulangan
1
2
3
Luas
Puncak
(Area)
1272325
1308663
1389934
Kosentrasi yang
ditemukan
0.41
0.43
0.49
rata-rata
%
Recovery
82
86.8
98.6
89.13
6
Limit of Detection (LOD)
Limit of Detection (LOD) adalah suatu metode analisis yang menunjukkan
nilai parameter uji batas, yaitu konsentrasi analit terendah yang dapat di deteksi,
tetapi tidak dikuantitasi pada kondisi percobaan yang dilakukan. Batas ambang
deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel. Batas deteksi adalah
batas kadar terkecil yang masih dapat dideteksi oleh alat dan menghasilkan respon
yang bermakna. cara yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi yaitu
berdasarkan evaluasi visual. Dapat digunakan untuk metode analisis non
instrumental dan instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan
analisis terhadap zat uji yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar
terendah yang dapat dideteksi dengan baik (Reynilda 2008).
Gambar 2 Luas Area pada 5 ppb.
Limit of Quantification (LOQ)
Batas ambang kuantitasi (Limit of Quantitation) adalah konsentrasi analit
terkecil yang dapat dikuantitasi secara cermat dan seksama. Batas kuantitasi
metode perlu ditentukan kalau metode tersebut digunakan untuk menganalisis
sampel yang mengandung analit berkadar rendah. Cara yang dapat digunakan
untuk menentukan batas kuantitasi, yaitu berdasarkan evaluasi visual. Dapat
digunakan untuk metode analisis non instrumental dan instrumental. Batas
kuantitasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap zat uji yang diketahui
konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan
secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima. dari suatu
metode analisis adalah nilai parameter penentuan kuantitatif senyawa yang
terdapat dalam konsentrasi rendah dalam matriks. Batas ambang kuntitasi adalah
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan. Batas
ambang kuantitasi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel (Hartutik
2007).
7
Tabel 3 Hasil Uji LOQ (Limit of Quantification)
Luas Puncak
Ulangan
Konsentrasi
(Area)
1
5 ppb
157399
2
5 ppb
158803
3
5 ppb
169705
4
5 ppb
157505
5
5 ppb
161493
6
5 ppb
148119
7
5 ppb
158641
8
5 ppb
156962
9
5 ppb
148790
rata-rata
157490,7778
RSD ( Relatif Standar
Deviasi)
6442,7471
LOQ = LOD + (10 x SDV) x LOD
luas area
= 5 + 10.6442.7 x 5
157490
= 7 ppb
Toksisitas Melamin pada Larva Udang
Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan metode pengujian
toksisitas suatu bahan dengan Artemia salina Leach. Metode ini cukup praktis,
cepat, mudah, murah dan cukup akurat. Pemeriksaan toksisitas diperlukan untk
mengetahui konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan sehingga dapat
diketahui jumlah penggunaan konsentrasi yang tepat. Tingkat konsentrasi yang
dapat menyebabkan keracunan ditentukan dengan letal konsentrasi 50 (LC50). Lc50
adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50 % kematian dalam
suatu populasi. Lc50 dapat digunakan untuk menentukan toksisitas dari suatu zat.
Hasil kuva toksisita melamin dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3 Hubungan antara Persen kematian (%) dengan konsentrasi (ppm)
8
Pembahasan
Validasi suatu metode analisis yang dilakukan untuk menjamin bahwa
metode analisis bersifat akurat, spesifik, dan tahan pada kisaran analit yang akan
dianalisis. Selain itu, agar proses pemeriksaan suatu produk mencapai hasil sesuai
dengan spesifikasi yang telah ditentukan sebelumnya. Hal tersebut dilakukan
untuk mengidentifikasi validasi yang perlu dilakukan sebagai bukti pengendalian
terhadap aspek kritis dari kegiatan yang dikerjakan, sehingga metode analisis
yang telah divalidasi dapat digunakan secara rutin dan menghasilkan data yang
dapat diandalkan kebenarannya. Menurut International Conference on
Harmonisation (ICH 1994), parameter validasi yang diuji meliputi uji kesesuaian
sistem, linearitas, recovery, limit deteksi dan limit kuantitasi (Ibrahim 2001).
Pengujian pertama yang dilakukan yaitu uji kesesuaian sistem yang perlu
dilakukan sebelum suatu sistem analisis digunakan dengan tujuan untuk
memastikan keefektifan sistem operasional akhir. Uji kesesuaian sistem harus
dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa sistem analisis beroperasi secara
benar. Menurut farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi
persyaratan presisi dari salah satu uji berikut, yakni resolusi, presisi, faktor
asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor kapasitas (Reynilda 2008).
Pengujian ini didasarkan pada suatu konsep bahwa elektronik, peralatan, zat
uji, dan kondisi operasional analisis membentuk satu sistem analitik tunggal yang
dapat diuji fungsinya secara keseluruhan. Hasil uji kesesuaian sistem yang dapat
dilihat pada Tabel 1 menunjukkan bahwa Nilai SBR (Simpangan Baku Relatif)
hasil pengukuran adalah 1.18 % dan memenuhi kriteria penerimaan parameter
ketelitian menurut ICH (1994) dan ASEAN (1996), yaitu SBR harus lebih kecil
atau sama dengan 2.0%. Metode ini berdasarkan nilai SBR yang diperoleh
termasuk teliti, artinya setiap hasil analisis yang dilakukan secara berulang
memiliki nilai yang tidak jauh berbeda.
Pengujian berikutnya yaitu lineritas. Linearitas merupakan kemampuan
suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional
dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode
adalah ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara
konsentrasi standar melamin dan luas puncak yang merekomendasikan minimal
lima deret konsentrasi larutan standar harus digunakan untuk mengevaluasi
linearitas (ICH 1994). Koefisien korelasi, kemiringan (slope), dan intersep-y harus
dilaporkan (Iatiqlalah 2004). Kurva standar yang diperoleh dari Tabel 3 memiliki
persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r) 0,9367
(Gambar 1). Nilai r yang diperoleh mendekati satu sehingga dapat dikatakan
bahwa kurva memiliki kelinearan yang tinggi, artinya dengan meningkatnya
konsentrasi melamin maka luas puncak juga akan mengalami kenaikan yang
linear. Menurut ICH (1994), nilai r yang dihasilkan telah memenuhi persyaratan,
yaitu harus lebih dari 0.90.
Ketepatan dapat dilihat berdasarkan nilai recovery standar yang
ditambahkan ke dalam contoh dengan menggunakan metode penambahan standar.
Persen perolehan kembali tidak harus 100%, tetapi perolehan kembali analit
menggunakan internal standar harus konsisten dan presisi. Penentuan perolehan
kembali diperoleh dari membandingkan hasil analisis dari 3 konsentrasi sampel
(rendah, medium, tinggi). Respon analit harus dapat diidentifikasi dengan kriteria
9
akurasi 80–120% (ICH 1994). Data hasil uji ketepatan dapat dilihat pada Tabel 3
dan perhitungannya berada pada lampiran 4. Rerata hasil recovery melamin yang
ditambahkan untuk tiga konsentrasi berada di antara kisaran tersebut, yaitu 89,13
± 9,47%. Hal ini menunjukkan bahwa metode ini tepat untuk menganalisis
melamin karena memenuhi persyaratan ICH.
Limit of Detection (LOD) didefinisikan sebagai sebagai konsentrasi analit
terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara nyata dari sinyal
blanko dan sinyal latar belakang (Ibrahim 2001). Sedangkan menurut Reynilda
(2008), LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas
deteksi sangat penting dalam analisis untuk menentukan jumlah kontaminan yang
ada di bawah atau di atas batas yang diperbolehkan. Batas deteksi merupakan
kriteria dalam pemilihan metode tersebut (Ibrahim 2001). Limit of Quantitation
(LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terkecil yang dapat dikuantisasi
secara cermat dan seksama (Ibrahim 2001). Seperti halnya batas deteksi, batas
kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linear. Semakin
kecil nilai LOD dan LOQ menunjukkan semakin sensitifnya suatu metode pada
penelitian ini, nilai LOD diperoleh dari pengamatan secara visual, kurva
kosentrasi 5 ppb melamin masih memberikan kromatogram yang baik (Lampiran
5) dan LOQ dianalisis secara statistik melalui luas puncak kurva dengan 9 kali
ulangan injeksi konsentrasi limit deteksi 5 ppb di tambah dengan hasil 10 kali
Standar Deviasi (SD) dengan . Sensitivitas metode ini terlihat dari perolehan nilai
LOD = 5 ppb dan LOQ = 7 ppb.
Larva udang A. Salina yang digunakan untuk uji toksisitas diperoleh dari
hasil penetasan menggunakan air laut dengan bantuan aerator untuk menjaga
kecukupan kadar oksigen yang terlarut. Gelembung udara dari aerator berfungsi
sebagai pengaduk telur sehingga telur tidak mengendap di dasar wadah.
Penggunaan aerator tersebut dikarenakan telur akan sulit menetas jika oksigen
dalam air kurang. Selain itu dilakukan penyinaran selama proses penetasan yang
berfungsi untuk menjaga kondisi air. Umur larva udang yang digunakan adalah 24
jam setelah menetas. Kondisi membran sel larva udang A. Salina pada umur
tersebut masih lunak sehingga memudahkan senyawa asing dalam air masuk ke
dalam tubuh larva udang A. Salina dan akan menyebabkan kematian. Kematian
dari larva udang A. Salina yang disebabkan oleh senyawa asing dalam air tersebut
yang menjadi dasar untuk pengujian toksisitas (Moon 1992).
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas
yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik
dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan karena mudah, cepat, murah dan
cukup reproducible.
Menurut Meyer (1982), senyawa bahan alam dapat dikatakan sangat toksik
bila nilai LC50 < 30 µg/mL, dan toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/mL. LC50 (Lethal
Concentration 50) merupakan konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya
kematian pada 50% hewan percobaan yaitu larva Artemia salina Leach. Hasil
pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada pada
kisaran 0,02 - 0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm) yang dapat di lihat pada
Gambar 3, sehingga dapat dikatakan standar melamin itu termasuk sangat toksik
karena ukuran dari hewan uji coba terlalu kecil. Hasil pengamatan uji toksisitas
larva udang terhadap melamin dapat dilihat pada Tabel 6.
10
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Metode analisis LCMS dengan standar melamin memiliki ketelitian dan
ketepatan yang baik dengan nilai simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian
sistem) dan rerata perolehan kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%.
Limit deteksi dan limit kuantifikasi metode adalah 5 ppb dan 7 ppb, linearitas
dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748 x dan koefisien korelasi (r)
0,9367. Melamin tergolong toksik dengan nilai LC50 sebesar 0,036 ppm atau 0,036
µg/mL. Metode analisis LC-MS yang telah dilakukan memiliki hasil yang valid.
Saran
Perlu dilakukan uji keterulangan dan uji toksisitas melamin in vivo pada
hewan coba seperti mencit. Selain itu juga, diperlukan pengujian analisis sampel
susu formula yang sesuai dengan standar baku pemerintah.
DAFTAR PUSTAKA
Andersen WC, Turnipseed SB, Karbiwnyk CM, Clark, SB, Madson MR, Gieseker
CM, Miller RA, Rummel NG, Reimschuessel R. 2008. Determination and
Confirmation of Melamine Residues in Catfish, Trout, Tilapia, Salmon and
Shrimp by LC-MS-MS. J. Ag. Food Chem 56: 4340.
Briggle T V, Allen L M, Duncan R C. 1981. High performance liquid
chromatographic determination of cyanuric acid in human urine and pool
water. J Assoc Off Anal Chem 64, 1222-1226.
Carbas P, Meloni M, Spaneedda L. 1990. High-performane liquid
chromatographic separation of cyromazine and its metabolite melamine. J
Chromatography 505(2), 413-416.
Chen J S. 2009. A worldwide food safety concern in 2008. melaminecontaminated infant formula in China caused urinary tract stone in 290000
children in China. Chinese Medical Journal 122(3), 243-244.
Chozin AS, Sutarno, Ruslan K. 1996. Uji Brine shrimp dan analisis kandungan
kimia fraksi ekstrak etanol 95 % dan suren Toona Sureni (BL) Merr.
Prosiding Simposium Penelitian bahan obat alami, Perhipba Balittro, Bogor
: 537-577.
Davidson M B, Thakkar S, Hix J. 2004. Pathophysiology, clinical consequences,
and treatment of tumor lysis syndrome. Am J Med 116, 546-554.
Debesis, E. et al., 1982. Submitting HPLC methodes to the compendia and
regulatory agencies. Pharm.Tech., September. p. 120
Ehling S Tefera S, Ho I P 2007. High-performance liquid chromatographic
method for the simultaneous detection of the adulteration of cereal flours
with melamine and related triazine by-products ammeline, ammelide, and
cyanuric acid. Food Addit Contam 24, 1319-1325.
11
Filigenzi M S, Tor E R, Poppenga R H. 2007. The determination of melamine in
muscle tissue by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid
Commun Mass Spectrom 21, 4027-4032.
Hartutik ES. 2007. Validasi metode penerapan kadar vitamin B12
(sianokobalamin) pada produk bubur bayi secara mikrobiologi [laporan PL].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Heller, DN, Nochetto, C. 2003. Simultaneous Determination and Confirmation of
Melamine and Cyanuric Acid in Animal Feed by Zwitterionic HILIC
Chromatography and Tandem Mass Spectrometry, in press, Rapid Commun.
Mass Spectrom.
Iatiqlalah A. 2004. Validasi metode analisis penetapan kadar pirazinamida secara
KCKT [Laporan PL]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Ibrahim S. 2001. Penggunaan Statistika dalam Validasi Metode Analitik dan
Penerapannya. Dalam Prosiding temu ilmiah nasional bidang Farmasi. VI –
15.
International Conference on Harmonisation [ICH]. 1994. Validation of Analytical
Procedures: Definitions and Terminology. WWW ICH. [terhubung berkala].
http://www.ich.org [9 Jan 2006].
Jutzik, Cook A M, Hutter R. 1982. The degradative pathway of the s-triazine
melamine. The steps to ring cleavage. Biochemistry Journal 208(3), 679684.
Meyer BN et al. 1982. Brine Shrimps: A Comvenient General Booasaay for active
Plant Constituent. Planta Med 45:31-34.
Moon CK, Park KS. 1992. Drug and chemical toxicology. Drug Chem. Toxicol.
15 (1):81-91.
Patel K, Jones K. 2007. Analytical method for the quantitative determination of
cyanuric acid as the degradation product of sodium dichloroisocyanurate in
urine by liquid chromatography mass spectrometry. J Chromatogr B 853,
360-363.
Pujiati I, Ningsih S, Palupi S. 2002. Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia
salina leach. Dari fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat, dan air ekstrak
etanol rimpang temumangga. (Prosiding Seminar Nasional Tumbeuhan
Obat Indonesia ). Universitas Surabaya. Surabaya :109-115.
Reynilda J. 2008. Validasi metode analisis penetapan kadar clindamycin dalam
librodan kapsul secara HPLC [Laporan PL]. Surabaya: Fakultas Farmasi,
Universitas Surabaya.
Sancho J V, Ibanez M, Grimalt S. 2010. Residue determination of cyromazine and
its metabolite melamine in chard samples by ion-pair liquid chromatography
coupled to electrospray tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta 530,
237-243. 94 MIAO AND FAN ET AL.
Smoker M, Krynitsky A J 2008. LIB_Interim Method for Determination of
Melamine and Cyanuric Acid Residues In Foods using LC_MS_MS:
Version 1.0. Laboratory Information Bulletin No. 4422, October 2008.
accessed at http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html.
12
Turnipseed S, Casey C, Nochetto C. 2008. Determination of Melamine and
Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS. Laboratory
Information Bulletin No. 4421, Volume 24, October 2008. accessed at
http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html.
Vail T, Jones P R, Sparkman O D. 2007. Rapid and unambiguous identification of
melamine in contaminated pet food based on mass spectrometry with four
degrees of confirmation. J Anal Toxicol 31, 304-312.
World Health Organization (WHO). 2008. Expert meeting to review toxicological
aspects of melamine and cyanuric acid, Ottawa, Canada, 1-4 December 8,
Overall
conclusion
and
recommands.
(Accesed
at
http://www.who.int/foodsafety/fs_management/conclusions_recommendatio
n.pdf).
Yokley R A, Mayer L C, Rezaaiyan R. 2000. Analytical method for the
determination of cyromazine and melamine residues in soil using LC-UV
and GCMSD. J Agric Food Chem 48, 3352-3358.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian
Pembuatan fase gerak
Persiapan standar baku melamin
Ekstraksi melamin
Uji validasi
Toksisitas melamin dengan Artemia salina
15
Lampiran 2 Proses Ekstraksi Melamin
EKSTRAKSI MELAMIN
2.0 ± 0.1 gram sampel
Masukkan ke tube 50 mL
14 mL asam format 2.5 % dalam air
Tabung di tutup
Vortex mixer 30 menit
Sentrifus pada 5000 rpm selama 10 menit, suhu ruang
Pindahkan 1.4 mL supernatan dalam 1.5 mL tube
Sentrifus 5900 rpm selama 30 menit
Pindahkan semua supernatan ke dalam 1.5 mL tube
Encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL ekstrak + 950 µL asetonitril)
Vortex selama 30 menit
Lalu sentrifus 13.000 rpm selama 30 menit, pindah ke autosampler vial 2
mL (hindari pengendapan)
16
Lampiran 3 Diagram alur uji toksisitas
Pembuatan Larutan Sampel
Sampel melamin
0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm
Penyiapan Larutan Sampel (500 ppm)
50 µL Sampel melamin
Labu ukur 100 mL lalu
ditera dengan air laut
500 ppm (50 µL /100 mL)
Penyemaian benur udang
Di beri ± 30 mg telur
udang/500 mL
Disemaikan dalam labu kocok
t = 24 jam, di bawah sinar
lampu + aerator
Uji toksisitas larva udang
Di siapkan botol 10 mL sebanyak 14 yang berisi air laut buatan
Di buat 5 konsentrasi 0, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2
ppm lalu di masukkan ke dalam botol yang telah disediakan
Tiap konsentrasi akan dimasukkan 30 ekor larva udang
Larva udang di inkubasi selama 24 jam di bawah sinar lampu
17
Lampiran 4 Data kesesuaian sistem
Tabel 4 Data Perhitungan Kesesuaian Sistem
X
x-
(x-
1272325
-24844,5
617249180,3
1280330
-16839,5
283568760,3
1310298
13128,5
172357512,3
1294215
-2954,5
8729070,25
1306307
9137,5
83493906,25
1308049
10879,5
118363520,3
1308663
11493,5
132100542,5
18
Lampiran 5 Hasil Perhitungan Data Recovery
1. Y = 1272325
Y = a + bx
1272325 = 713428,3641 + 1371748.019 x
x = 1272325 - 713428,3641
1371748.019
x = 0.41
x = 0.41 x 100 %
0.5
= 82 %
2. Y = 1308663
Y = a + bx
1308663 = 713428,3641 + 1371748.019 x
x = 1308663 - 713428,3641
1371748.019
x = 0.43
x = 0.43 x 100 %
0.5
= 86.8 %
3. Y = 1389934
Y = a + bx
1389934 = 713428,3641 + 1371748.019 x
X = 1389934 - 713428,3641
1371748.019
X = 0.49
X = 0.49 x 100 %
0.5
= 98.6 %
Rata-rata hasil recovery = 82 + 86.8 + 98.6
3
= 89.13
19
Lampiran 6 Data Uji linearitas
Tabel 5 Data hasil uji linearitas
Konsentrasi (ppm)
Luas Puncak (A)
X
Y
0,25
0,5
1,0
667303
1117542
2118253
2,5
5336263
5,0
7016450
a = 713428,3641
b = 1371748,019
r = 0,9367
Berdasarkan data di atas di peroleh persamaan garis sebagai berikut :
Y = a + bx
71343428 + 1371748 x
r = 0,9367
20
Lampiran 7 Hasil Pengamatan toksisitas
Tabel 6 Hasil Pengamatan Uji Toksisitas Larva Udang terhadap Melamin
Rata‐rata
Larva Udang
Larva Udang
persen
akhir
Rata‐rata
awal
(hidup)
Larva mati kematian (%)
(hidup)
1
2
1
2
78.3
2 ppm
30 30
6 7
23,5
69,95
1 ppm
30 30
8 11 20.5
63,3
0.5 ppm
30 30
11 12 18,5
54,95
0.1 ppm
30 30
13 14 16,5
0.02 ppm
30 30
15 10 12,5
48,3
Contoh Perhitungan
Contoh konsentrasi 2 ppm
Ulangan 1 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 6 = 24 (Larva yang mati)
Ulangan 2 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 7 = 23 (Larva yang mati)
Rata-rata larva yang mati 24 + 23 = 23,5
2
Konsentrasi
(ppm)
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tangerang pada taggal 7 April 1988 dari ayah
Tjahyadi (alm) dan ibu Lilis (alm). Penulis adalah anak kedua dari dua
bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Mardi Yuana Serang dan pada
tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB)
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan tahun 2007 diterima di
Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti Dewan
Perwakilan Mahasiswa (DPM) di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam pada tahun ajaran 2007/2008, Master of Dicipline di Masa Perkenalan
Fakultas (MPF) dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) pada tahun ajaran
2007/2008 dan 2008/2009. Penulis pernah mengikuti dan menang menjadi 15
usaha terbaik dalam Program Mahasiswa Wirausaha IPB di tahun 2009 untuk
bidang usaha pendidikan di daerah kampus IPB. Bulan Juli-Agustus 2009 penulis
melaksanakan Praktik Lapangan Kerja di Balai Perkebunan Bioteknologi
Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor dengan judul Isolasi Fragmen Gen
penyandi Aminosiklopropana karboksilat sintase yang diberi Stimulan Etefon.