VALIDASI METODE DAN PENENTUAN CEMARAN MELAMIN DALAM SUSU FORMULA MENGGUNAKAN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY HITACHI D 7000.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

DAFTAR ISI

ABSTRAK ... i

KATA PENGANTAR ... ii

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL... viii

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... x

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah... 4

1.3 Batasan Masalah ... 4

1.4 Tujuan Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

2.1 Validasi Metode ... 6

2.1.1 Linearitas ... 7

2.1.2 Batas deteksi atau Limit of Detection (LOD) ... 8

2.1.3 Batas kuantitasi atau Limit of Quantitation (LOQ) ... 8

2.1.4 Presisi ... 9

2.1.5 Akurasi (Kecermatan) ... 10

2.1.6 Spesifitas ... 11

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

2.1.8 Ketahanan (Robustness) ... 11

2.1.9 Ketangguhan Metode (ruggedness) ... 12

2.1.10 Kesesuaian Sistem ... 12

2.2Melamin ... 13

2.2.1 Produksi dan Penguraian Melamin ... 15

2.2.2 Kontaminasi Melamin ... 16

2.2.3 Analisis Melamin ... 19

2.3Susu Formula ... 20

2.4High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ... 22

2.4.1 HPLC Fase Terbalik atau Reverse Phase HPLC (RP-HPLC) ... 23

2.4.2 Instrumentasi HPLC ... 26

2.5Trifluoroacetic Acid (TFA) ... 28

BAB III METODE PENELITIAN ... 30

3.1Lokasi Penelitian ... 30

3.2Alat dan Bahan ... 30

3.2.1 Alat ... 30

3.2.2 Bahan... 30

3.3Metode Penelitian ... 31

3.3.1 Preparasi ... 32

3.3.2 Penentuan Kondisi Analisis ... 35

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ... 39

4.1Penentuan Kondisi Analisis ... 39

4.1.1 Penentuan pH fase gerak TFA 0,1% ... 39

4.1.2 Penentuan komposisi fase gerak ... 40

4.1.3 Penentuan laju alir ... 41

4.2Validasi Metode ... 42

4.2.1 Penentuan linearitas ... 42

4.2.2 Batas deteksi atau limit of detection (LOD) ... 44

4.2.3 Batas kuantisasi atau limit of kuantitation (LOQ)... 45

4.2.4 Penentuan presisi (keterulangan) ... 45

4.2.5 Akurasi ... 46

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 49

5.1 Kesimpulan ... 49

5.2 Saran ... 49

DAFTAR PUSTAKA ... 50

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Susu mengandung berbagai protein, vitamin (A, B1, B2, B6, B12, C, D, E, dan K), mineral, karbohidrat dan lemak. Protein dalam susu mengandung semua jenis asam amino esensial yang sangat berperan dalam pertumbuhan tubuh (Fatima, 2011).

Pada tahun 2008, beberapa produk susu dan olahannya yang berasal dari Cina ditemukan telah terkontaminasi oleh senyawa melamin. Berdasarkan angka resmi yang disampaikan pemerintah Cina, skandal susu formula yang terkontaminasi melamin telah merenggut 6 nyawa dan membuat sekitar 294.000 anak lainnya sakit (FoodReview, 2008). Berdasarkan data dari BPOM tahun 2008, sebanyak 28 produk impor berbasis susu dan turunannya yang beredar di Indonesia mengandung melamin dengan kadar melamin berkisar antara 8,51 mg/kg sampai dengan 945,86 mg/kg (Suyanto dan Yulinar, 2008). Produk susu terkontaminasi melamin bukan hanya berasal dari Cina melainkan dari negara lain juga diduga mengandung sejumlah melamin.

Melamin merupakan senyawa organik polar yang bersifat basa. Kadar nitrogen dalam melamin relatif tinggi mencapai 66% (w/w). Apabila susu yang terkontaminasi melamin diuji menggunakan metode Kjehdahl, melamin akan teranalisis sebagai protein. Hal ini disebabkan pengujian kadar protein dalam makanan menggunakan metode tersebut ditentukan dari kandungan total nitrogen

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

yang dimiliki asam amino dan protein. Akibatnya berbagai molekul non protein seperti melamin dapat terdeteksi sebagai protein. Penambahan melamin pada susu yang dilakukan secara sengaja bertujuan untuk meningkatkan kadar protein secara simultan (Tyan et.al, 2009).

Melamin dapat terhidrolisis menjadi senyawa turunannya yaitu ammelin, ammelid, dan asam sianurat. Apabila dikonsumsi, melamin dan asam sianurat akan diserap oleh sistem pencernaan dan mengendap di ginjal membentuk kristal (Tyan et.al, 2009). Kristal yang terbentuk dapat menyebabkan gagal ginjal, batu ginjal (FoodReview, 2008), kerusakan kandung kemih dan alat reproduksi (Suyanto dan Yulinar, 2008).

Analisis terhadap melamin dapat ditentukan melalui bebagai metode antara lain menggunakan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), analisis IR, HPLC-UV, GC/MS, dan LC/MS/MS (Suyanto dan Yulinar, 2008), metode nano partikel emas (Lili et.al, 2009), dan metode diazotasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis (Wiadnya et.al, 2012). Akan tetapi, susu dan produk turunannya mengandung ratusan senyawa organik sehingga kehandalan metode analisa sangat diperlukan untuk dapat menganalisis kandungan melamin serta membedakannya dari senyawa lain dalam sampel.

Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS) telah mengesahkan Standar Pengujian penetapan kadar melamin dalam susu, produk susu dan susu formula dengan mengadopsi spesifikasi teknis standar ISO/TS 15495 menggunakan metode pengujian LC-MS/MS yang dikembangkan oleh ISO dan IDF (BSN, 2012). Penggunaan LC-MS/MS memiliki sensitifitas dan

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

selektivitas yang tinggi, namun biaya analisisnya sangat mahal (WHO, 2009). Selain itu pengujian dengan metode LC-MS/MS memerlukan banyak pereaksi dan hanya sedikit laboratorium di Indonesia yang memiliki alat tersebut. Sementara itu metode baku untuk analisis melamin belum ditetapkan di dalam Standar Nasional Indonesia. Sehingga sangat diperlukan adanya suatu metode yang handal, cepat, mudah, dan murah untuk menganalisis cemaran melamin dalam susu formula.

Metode analisis cemaran melamin dalam berbagai produk susu menggunakan HPLC telah dibakukan oleh pemerintah Cina. Saat ini telah dilakukan penelitian oleh Sun et.al (2010) untuk memperoleh metode penentuan cemaran melamin dalam produk susu cair menggunakan HPLC dengan fase gerak asetonitril. Sedangkan penggunaan HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak TFA (pH 2,4):metanol (90:10), panjang gelombang 240 nm, dan laju alir 0,3 mL/menit untuk menentukan melamin dalam susu formula telah dikembangkan dan divalidasi oleh Venkatasami dan Sowa Jr (2010) sehingga diperoleh metode yang cepat, valid, murah, dan simpel.

Di Indonesia sendiri belum banyak industri maupun laboratorium uji yang menggunakan metode HPLC fase terbalik dengan fase gerak metanol dalam menganalisis melamin. Sehingga diperlukan kajian metode analisis melamin secara laboratorium lebih lanjut (Nissa, 2011). Oleh sebab itu, untuk menjamin keabsahan hasil analisis maka metode penentuan melamin dalam susu formula menggunakan HPLC harus divalidasi terlebih dahulu. Dengan demikian penelitian ini bertujuan untuk menguji validitas (keabsahan) metode pengujian melamin

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 sehingga diperoleh metode yang valid.

1.2Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut, diperoleh rumusan masalah sebagai berikut:

1. Bagaimana kondisi analisis yang digunakan dalam penentuan cemaran melamin menggunakan HPLC Hitachi D-7000?

2. Bagaimana validitas metode penentuan cemaran melamin dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 terhadap beberapa parameter validasi yaitu linearitas, batas deteksi atau limit of detection (LOD), batas kuantisasi atau limit of quantitation (LOQ), presisi, dan akurasi?

1.3Batasan Masalah

Batasan masalah dalam penelitian ini yaitu:

1. Parameter validasi yang diuji meliputi linearitas, LOD, LOQ, presisi (repetabilitas), dan akurasi (perolehan kembali).

2. Sampel yang digunakan dalam penelitian merupakan produk susu formula bayi usia 0-6 bulan.

1.4Tujuan Penelitian

Adapun penelitian ini bertujuan sebagai berikut:

1. Memperoleh kondisi analisis terbaik untuk menentukan cemaran melamin menggunakan HPLC Hitachi D-7000.

2. Memperoleh metode analisis yang valid untuk menentukan kadar cemaran melamin dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 dengan

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

mempertimbangan lima parameter validasi yaitu linearitas, LOD, LOQ, presisi, dan akurasi.

1.5Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi industri makanan diantaranya untuk mendapatkan metode analisis melamin dalam produk pangan berbasis susu yang peka, lebih murah, mudah, dan simpel. Selain itu, dapat mempermudah pemerintah dalam melakukan pengawasan terhadap produk pangan berbasis susu terutama susu formula yang beredar di Indonesia sehingga mampu menjamin keamanan pangan.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi Penelitian

Penelitian validasi metode dan penentuan cemaran melamin dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 dilaksanakan di Laboratorium Kimia Instrumen dan Laboratorium Riset Jurusan Pendidikan Kimia, Universitas Pendidikan Indonesia yang berlokasi di jalan Dr. Setiabudi No. 22 Bandung.

3.2Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu neraca analitik dengan ketelitian 4 desimal, labu ukur 10 mL, 25 mL, dan 50 mL, gelas ukur 10 mL, 100 mL, dan 500 mL, gelas kimia 20 mL, 50 mL, 100, mL dan 250 mL, botol semprot 250 mL, sentrifuse, tabung sentrifuse, pipet volum 1 mL, 2 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, dan 7 mL, ball pipet, pH meter, corong tangkai pendek, mikropipet, batang pengaduk, spatula, tabung reaksi, botol vial, pipet tetes, pipet ukur 0,1 mL, ultrasonic vibrator, penyaringan vakum, membran nitrat selulosa, membran PTFE, syrink 10 µ L, dan instrumen HPLC Hitachi D-7000 menggunakan kolom C18 dengan spesifikasi L-7300, detektor UV L-7400 dan pompa L-7100.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan diantaranya sampel susu formula, melamin murni (≥ 99%), metanol grade for HPLC, asam trifloroasetat (TFA), asam trikloroasetat (TCA), NaOH dan aquabides, dan kertas saring Whatman.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

3.3Metode Penelitian

Penelitian validasi metode penentuan cemaran melamin dalam susu formula yang dilakukan mengacu pada prosedur penelitian sebelumnya, yakni metode analisis yang telah dikembangkan dan diuji validitasnya oleh Venkatasami dan Sowa Jr (2010). Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan meliputi tahap preparasi, penentuan kondisi analisis dan validasi metode. Adapun parameter validasi yang diuji diantaranya linearitas, batas deteksi (LOD), batas kuantisasi (LOQ), presisi, dan akurasi. Bagan alir tahapan penelitian secara keseluruhan ditampilkan pada gambar 3.1 berikut:

Melamin

Larutan standar melamin

Sampel + standar melamin

Data linearitas Data LOD Data LOQ Data presisi Data akurasi

-dilakukan validasi

penentuan presisi dan akurasi

-penentuan kondisi analisis: pH

0,1% TFA, komposisi fase gerak, dan laju alir

-dilakukan validasi penentuan

linearitas, LOD, dan LOQ

Kesimpulan

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

3.3.1 Preparasi

a. Preparasi fase gerak 1. Fase gerak 0,1% TFA

Satu liter aquabides dimasukkan ke dalam gelas ukur. Ditambahkan 1 mL TFA. Fase gerak dihomogenkan menggunakan ultrasonic vibrator dan di-adjust pHnya. Kemudian fase gerak tersebut disaring secara vakum menggunakan membran nitrat selulosa. Filtrat dimasukkan ke dalam botol fase gerak (PET Radiopharmaceutical Sciences, 2007).

2. Fase gerak metanol

Sebanyak 500 mL metanol dimasukkan dalam gelas ukur. Fase gerak disaring menggunakan membran PTFE. Fase gerak yang telah disaring dihomogenkan selama 15 menit, lalu dimasukkan ke dalam botol fase gerak.

b. Preparasi larutan stok melamin 1. Pelarut

Pelarut merupakan larutan metanol 50% (v/v) yang dibuat dengan mencampurkan sejumlah volume yang sama metanol dan air.

2. Larutan stok melamin 500 ppm

Sebanyak 25 mg melamin dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, ditambah metanol 50% sehingga konsentrasinya menjadi 500 ppm. Larutan tersebut dihomogenkan selama 30 menit.

3. Larutan stok melamin intermediet

Sebanyak 10 mL larutan stok melamin 500 ppm diencerkan dengan metanol 50% sehingga volumenya menjadi 50 mL dan konsentrasinya 100 ppm.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

4. Larutan kerja melamin

Larutan kerja diperoleh dari pengenceran larutan stok melamin intermediet ke dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh rentang konsentrasi deret standar melamin.

c. Penambahan TCA 5%

Sebanyak 0,1 gram sampel susu formula dilarutkan dalam 10 mL metanol 50%. Lalu dilakukan penambahan larutan TCA 5% dengan variasi volume 1 mL, 1,5 mL, 2 mL, dan 2,5 mL. Larutan dihomogenkan selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Diamati pengedapan kasein susu dan tingkat kekeruhan supernatan.

d. Preparasi sampel

Sebanyak 0,1 gram sampel susu formula dimasukkan dalam labu ukur 10 mL. Kemudian ke dalam sampel tersebut ditambahkan 2 mL larutan TCA 5%, diencerkan dengan metanol 50%. Larutan tersebut dihomogenkan selama 30 menit. Sampel didinginkan pada suhu ruang, lalu ditambahkan metanol 50% hingga tanda batas. Dikocok dengan hati-hati. Larutan sampel disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang belum jernih disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman, selanjutnya menggunakan membran PTFE. Sementara supernatan jernih secara langsung difiltrasi menggunakan membran PTFE. Minimal sebanyak 3 mL filtrat dimasukkan dalam vial yang akan dianalisis menggunakan HPLC. Hal ini dilakukan untuk mengurangi faktor penyerapan sampel melamin oleh filter. Bagan alir preparasi sampel dapat dilihat pada gambar 3.2 berikut ini:

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

Gambar 3.2 Bagan alir preparasi sampel susu formula e. Penentuan kadar cemaran melamin dalam sampel

Kadar cemaran melamin dalam sampel dihitung dengan rumus:

Keterangan:

X : Konsentrasi melamin dalam sampel hasil integrasi kurva (ppm) Vs : Volume akhir sebelum injeksi (mL)

B : Massa sampel (g)

0,1 gram sampel

- dilarutkan dengan metanol 50% dalam labu ukur 10 mL

- ditambah 2 mL TCA 5% - didinginkan pada suhu ruang

- ditambah metanol 50% hingga tanda batas (10000 ppm)

- disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama30 menit

supernatan residu

Supernatan jernih

Supernatan belum jernih

- disaring dengan membran PTFE 0,2 µm disaring dengan kertas saring Whatman No.1

Filtrat siap uji (minimal 3 mL)

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

3.3.2 Penentuan Kondisi Analisis

Dalam penelitian ini digunakan HPLC Hitachi D-7000 fase terbalik, kolom C18 (5 µm), panjang kolom 12,5 cm, suhu kolom 26°C, dan fase gerak 0,1% TFA/metanol. Volume injeksi sebanyak 10 µ L dan dideteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 240 nm.

a. Penentuan pH

Larutan stok melamin 500 ppm disuntikkan sebanyak 10 µ L ke dalam HPLC dengan 2 variasi pH fase gerak 0,1% TFA yaitu 2,4 dan 2,8.

Komposisi fase gerak yang digunakan 0,1% TFA:metanol (90:10), laju alir 1 mL/menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 240 nm. Kemudian diamati waktu retensi (RT), luas puncak, dan bentuk puncak kromatogram melamin. b. Penentuan komposisi fase gerak

Larutan stok melamin 500 ppm disuntikkan sebanyak 10 µ L ke dalam HPLC dengan berbagai variasi komposisi fase gerak 0,1% TFA:metanol yaitu 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, dan 50:50.

Laju alir yang digunakan 1 mL/menit, pH fase gerak 2,8 dan dideteksi pada panjang gelombang 240 nm. Kemudian diamati waktu retensi (RT), luas puncak, dan bentuk puncak kromatogram melamin.

c. Penentuan laju alir

Larutan stok melamin 500 ppm disuntikkan sebanyak 10 µ L ke dalam HPLC dengan 2 variasi laju alir yaitu 1 mL/menit dan 0,75 ml/menit.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

Komposisi fase gerak yang digunakan 0,1% TFA:metanol (50:50), pH fase gerak 2,8 dan dideteksi pada panjang gelombang 240 nm. Kemudian diamati waktu retensi (RT), luas puncak, dan bentuk puncak kromatogram melamin.

3.3.3Validasi Metode

a. Penentuan linearitas

Linearitas diperoleh dari pengukuran larutan deret standar yang telah dibuat sehingga diperoleh kurva kalibrasi dan persamaan regresinya. Penentuan linearitas dilakukan dengan cara membuat 7 konsentrasi larutan deret standar 1, 10, 20, 40, 50, 60, 70 ppm. Persamaan linearitas yang digunakan ialah y = a + bx dengan a ialah titik potong dan b ialah kemiringan. Berdasarkan persamaan tersebut ditentukan nilai koefisien korelasinya (r).

b. Penentuan batas deteksi (LOD)

Batas deteksi ditentukan secara statistik dari hasil pengukuran linearitas berdasarkan persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi.

LOD = Keterangan :

Sy/x = simpangan baku (SD)

Sl = kemiringan (b pada persamaan garis y = a + bx) c. Batas kuantisasi (LOQ)

Batas kuantitasi ditentukan secara statistik dari hasil pengukuran linearitas berdasarkan persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

Keterangan :

Sy/x = simpangan baku (SD)

Sl = kemiringan (b pada persamaan garis y = a + bx) d. Penentuan presisi

Uji presisi dilakukan dengan cara pengulangan (repeatability). Sebanyak 0,25 gram sampel susu formula dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan 4 mL larutan standar melamin 250 ppm. Perlakuan selanjutnya sama seperti preparasi sampel. Larutan tersebut diinjekkan sebanyak 6 kali ulangan pada hari yang sama sehingga diperoleh data yang akan dinyatakan nilai presisinya sebagai simpangan baku (SD) dan simpangan baku relatif (% RSD) yang dirumuskan sebagai berikut:

Keterangan :

: nilai masing-masing pengukuran

: rata-rata pengukuran n : banyaknya data n – 1 : derajat kebebasan e. Penentuan akurasi

Akurasi diperoleh dari uji persen perolehan kembali (recovery) berdasarkan metode standar adisi. Sampel susu formula diadisi dengan larutan standar melamin 40 ppm dan 70 ppm.

SD =

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

Sebanyak 0,25 gram sampel susu formula dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan 4 mL larutan standar melamin 250 ppm. Perlakuan selanjutnya sama seperti preparasi sampel. Percobaan diulangi untuk penambahan 7 mL larutan standar yang sama. Pengukuran diulangi sebanyak 3 kali. Nilai akurasi dinyatakan sebagai % perolehan kembali dan dihitung menggunakan rumus:

% Perolehan kembali = x 100%

Keterangan:

CF : konsentrasi total sampel dari pengukuran CA : konsentrasi sampel sebenarnya

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1Kesimpulan

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa kondisi analisis cemaran melamin dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 diperoleh pada

komposisi fase gerak 0,1% TFA (pH 2,8):metanol (50:50), laju alir 0,75 mL/menit, kolom C 18, volume injeksi 10 µL dan panjang gelombang 240 nm.

Berdasarkan hasil uji lima parameter validasi diperoleh linearitas (r) 0,9999, batas deteksi 0,76 ppm, batas kuantisasi 0,25 ppm, presisi berdasarkan uji repetabilitas dengan RSD sebesar 1,31%, dan akurasi berdasarkan uji perolehan kembali sebesar 100,7-119,8% dengan batas keberterimaan 80-120%. Semua parameter tersebut telah memenuhi persyaratan validasi metode analisis sehingga metode analisis menggunakan HPLC Hitachi D-7000 layak digunakan untuk menentukan cemaran melamin dalam susu formula.

5.2Saran

Agar diperoleh metode analisis cemaran melamin dalam susu formula yang lebih baik perlu dilakukan optimasi variasi konsentrasi fase gerak TFA untuk menghasilkan pemisahan melamin dengan matriks sampel yang lebih baik, dilakukan uji validasi terhadap parameter lain yaitu uji sensitifitas, kisaran, ruggedness, robustness, dan kesesuaian sistem agar semua parameter validasi terpenuhi, dan dilakukan uji antar laboratorium sehingga metode ini dapat digunakan secara rutin.

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

DAFTAR PUSTAKA

AOAC. (2002). Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals

BPOM RI. (2011). Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor Hk.03.1.52.08.11.07235 Tahun 2011 Tentang Pengawasan Formula Bayi Dan Formula Bayi Untuk Keperluan Medis Khusus. Jakarta: BPOM RI

BSN. (2011). CCMAS CODEX Menetapkan Metode Uji Penetapan Kadar Melamin Dalam Produk Susu, Susu Formula. [Online]. Tersedia: http://www.bsn.go.id/ news_detail.php.htm[4Februari 2012]

Buckle, K.A., dkk. (2009). Ilmu Pangan. Jakarta: UI-Press

CAC. (2010). Report of the Fourth Session of the Codex Committee on Contaminants in Foods. Geneva: CAC

CAC. (2011). Report of the Fifth Session of the Codex Committee on Contaminants in Foods. Geneva: CAC

CDER. (1994). Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods. Chan, C.C., dkk. (2004). Analytical Method Validation and Instrument

Performance Verification. Canada: John Wiley & Sons

CODEX STAN 72. (1981). Standard for Infant Formula and Formulas for Special Medical Purposes Intended For Infants

EFSA. (2010). “Scientific Opinion on Melamin in Food and Feed”. EFSA

Journal. 8, (4), 1573

Egayanti, Y. (2007). Komponen Fungsional Tambahan Susu Formula Bayi. “Info POM”. 8,(6). Jakarta : BPOM RI

EMEA. (2006). Validation Of Analytical Procedures: Methodology. London Fatima, I., Wasim, M. dan Rehman, S. (2011). “Dietary Exposure to Essential and

Toxic Element from Fresh, Pasteurisedand Powder Milk Samples from Pakistan”. Journal of Pakistan. 48, (4). 315-322

FDA. (2001). Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation.

FoodReview. (2008). Screening Cepat dan Konfirmasi Residu Melamin. Referensi Industri dan Pusat Teknologi Pangan Indonesia. [Online]. Tersedia: http://www.foodreview.biz/login/preview.php?view&id=55664[14Februari 2012]

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

Harahap, Y., Mansur, U. dan Sinandang, T. (2006). “Analisis Glimepirida dalam Plasma Tikus”. Majalah Ilmu Kefarmasian. 3, (1), 22 - 37

Harmita. (2004). “Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya”. Majalah Ilmu Kefarmasian. I, (3). Jakarta: Departemen

Farmasi FMIPA-UI

Harvey, D. (2000). Modern Analitycal Chemistry. USA: The McGraw-Hill Companies

Huber, L. (2010). Validation of Analytical Methods. Jerman: Agilent Technologie Ibrahim, S. (2004). “Berbagai Pendekatan pada Penaksiran Batas Deteksi dan

Batas Kuantisasi Suatu Metode Analisis Instrumen”. Jurnal Acta Pharmaceutica Indonesia. 29 (4), 153-159

ICH. (1996). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) Lili et.al. (2009). “Visual Detection of Melamine in Raw Milk Using Gold

Nanoparticles as Colorimetric Probe”. Journal of food Chemistry. 122, 895 –

900

Miller, J.C. dan Miller, J.N. (1991). Statistika untuk Kimia Analitik. Bandung: ITB.

NFA. (2009). Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed. Sweden: NFA

Nissa, C. (2011). Kajian Cemaran Melamin dalam Produk Pangan dan Pengawasannya di Indonesia. Tesis. Program Master IPB: tidak diterbitkan PET Radiophamaceutical Sciences. (2007). [18F]FMPEP-d2 for Injection:

Standard Operating Procedures

Rohman, A. (2009). Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu SIELC Technologies. (2009). “The Do’s and Don’ts of Method Development in

Mixed-Mode Chromatography”. Newsletter. (Agustus 2009)

SigmaAldrich. (2002). “Eliminate TFA and Improve Sensitivity of Peptide

Analyses by LC/MS”. Application Note. USA: Sigma-Aldrich Co

SigmaAldrich. (2007). “Trifluoroacetic Acid”. Application Note. USA: Sigma-Aldrich Co

SNI ISO/IEC 17025. (2008). Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi. Jakarta: BSN

SNI 7541.2. (2009). Metode Pengujian dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Bagian 2 : Residu golongan tetrasiklin dalam daging, telur, susu, dan olahannya. Jakarta: BSN

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

SNI 7577. (2010). Metode Pengujian Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) pada Susu, Susu Bubuk, Susu Formula. Jakarta: BSN

Sun, H., dkk. (2010). ”A sensitive and validated method for determination of melamine residuemin liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction”. Journal of Food Control. 21, 686–691

Suyanto dan Yulinar. (2008). Melamin dalam Produk Pangan. “Info POM”. 9, (6). Jakarta: BPOM RI

Thermo Electron Corporation (TEC). (2004). HPLC Analysis of Biomolecules Technical Guide. USA: TEC

Tyan, Y.C., dkk. (2009). “Melamine Contamination”. Journal of Anal Bioanal Chem. 395, 729–735

UNODC. (2009). Guidance for the Validation of Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit Drugs in Seized Materials and Biological Specimens. New York: United Nations Publication Venkatasami, G. dan Sowa Jr, J.R. (2010). “A rapid, acetonitrile-free, HPLC

method for determination of melamine in infrant formula”. Journal of Analitica Chimica Acta. 665, 227–230

Vydac. (1998). “What is 0,1% TFA?”. Application Note. USA: The Nest Group

Wiadnya, I., Supriyanto, G. dan Handoko. (2012). “Pengembangan Metode Analisis Melamin dalam Produk Susu Berbasis Reaksi Diazotasi dengan

Senyawa Pengkoupling β-Naftol”. Jurnal Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. 15, (1), 32 – 37

WHO. (2004). Joint WHO/FAO Workshop on Enterobacter sakazakii and other Microorganisms in Powdered Infant Formula. Geneva: WHO

WHO. (2008). Melamine and Cyanuric acid: Toxicity, Preliminary Risk Assessment and Guidance on Levels in Food

WHO. (2008). Questions and Answers on Melamine. [Online]. Tersedia: http://www.who.int/csr/media/faq/QAmelamine/en/index.html[30September 2012]

WHO. (2009). Background Paper on Methods for the Analysis of Melamine and Related Compounds in Foods and Animal Feeds. Geneva: WHO

WHO. (2009). Background Paper on the Chemistry of Melamine Alone and in Combination with Related Compounds. Geneva: WHO

WHO. (2009). Toxicological and Health Aspects on Melamine and Cyanuric Acid. Geneva: WHO

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

Keterangan :

Sy/x = simpangan baku (SD)

Sl = kemiringan (b pada persamaan garis y = a + bx) d. Penentuan presisi

Uji presisi dilakukan dengan cara pengulangan (repeatability). Sebanyak 0,25 gram sampel susu formula dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan 4 mL larutan standar melamin 250 ppm. Perlakuan selanjutnya sama seperti preparasi sampel. Larutan tersebut diinjekkan sebanyak 6 kali ulangan pada hari yang sama sehingga diperoleh data yang akan dinyatakan nilai presisinya sebagai simpangan baku (SD) dan simpangan baku relatif (% RSD) yang dirumuskan sebagai berikut:

Keterangan :

: nilai masing-masing pengukuran : rata-rata pengukuran

n : banyaknya data n – 1 : derajat kebebasan e. Penentuan akurasi

Akurasi diperoleh dari uji persen perolehan kembali (recovery) berdasarkan metode standar adisi. Sampel susu formula diadisi dengan larutan standar melamin 40 ppm dan 70 ppm.

SD =

38

Sebanyak 0,25 gram sampel susu formula dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan 4 mL larutan standar melamin 250 ppm. Perlakuan selanjutnya sama seperti preparasi sampel. Percobaan diulangi untuk penambahan 7 mL larutan standar yang sama. Pengukuran diulangi sebanyak 3 kali. Nilai akurasi dinyatakan sebagai % perolehan kembali dan dihitung menggunakan rumus:

% Perolehan kembali = x 100%

Keterangan:

CF : konsentrasi total sampel dari pengukuran

CA : konsentrasi sampel sebenarnya

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1Kesimpulan

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa kondisi analisis cemaran melamin dalam susu formula menggunakan HPLC Hitachi D-7000 diperoleh pada

komposisi fase gerak 0,1% TFA (pH 2,8):metanol (50:50), laju alir 0,75 mL/menit, kolom C 18, volume injeksi 10 µL dan panjang gelombang 240 nm.

Berdasarkan hasil uji lima parameter validasi diperoleh linearitas (r) 0,9999, batas deteksi 0,76 ppm, batas kuantisasi 0,25 ppm, presisi berdasarkan uji repetabilitas dengan RSD sebesar 1,31%, dan akurasi berdasarkan uji perolehan kembali sebesar 100,7-119,8% dengan batas keberterimaan 80-120%. Semua parameter tersebut telah memenuhi persyaratan validasi metode analisis sehingga metode analisis menggunakan HPLC Hitachi D-7000 layak digunakan untuk menentukan cemaran melamin dalam susu formula.

5.2Saran

Agar diperoleh metode analisis cemaran melamin dalam susu formula yang lebih baik perlu dilakukan optimasi variasi konsentrasi fase gerak TFA untuk menghasilkan pemisahan melamin dengan matriks sampel yang lebih baik, dilakukan uji validasi terhadap parameter lain yaitu uji sensitifitas, kisaran, ruggedness, robustness, dan kesesuaian sistem agar semua parameter validasi terpenuhi, dan dilakukan uji antar laboratorium sehingga metode ini dapat digunakan secara rutin.

50

DAFTAR PUSTAKA

AOAC. (2002). Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals

BPOM RI. (2011). Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor Hk.03.1.52.08.11.07235 Tahun 2011 Tentang Pengawasan Formula Bayi Dan Formula Bayi Untuk Keperluan Medis Khusus. Jakarta: BPOM RI

BSN. (2011). CCMAS CODEX Menetapkan Metode Uji Penetapan Kadar Melamin Dalam Produk Susu, Susu Formula. [Online]. Tersedia: http://www.bsn.go.id/ news_detail.php.htm[4Februari 2012]

Buckle, K.A., dkk. (2009). Ilmu Pangan. Jakarta: UI-Press

CAC. (2010). Report of the Fourth Session of the Codex Committee on Contaminants in Foods. Geneva: CAC

CAC. (2011). Report of the Fifth Session of the Codex Committee on Contaminants in Foods. Geneva: CAC

CDER. (1994). Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods. Chan, C.C., dkk. (2004). Analytical Method Validation and Instrument

Performance Verification. Canada: John Wiley & Sons

CODEX STAN 72. (1981). Standard for Infant Formula and Formulas for Special Medical Purposes Intended For Infants

EFSA. (2010). “Scientific Opinion on Melamin in Food and Feed”. EFSA Journal. 8, (4), 1573

Egayanti, Y. (2007). Komponen Fungsional Tambahan Susu Formula Bayi. “Info POM”. 8,(6). Jakarta : BPOM RI

EMEA. (2006). Validation Of Analytical Procedures: Methodology. London Fatima, I., Wasim, M. dan Rehman, S. (2011). “Dietary Exposure to Essential and

Toxic Element from Fresh, Pasteurisedand Powder Milk Samples from Pakistan”. Journal of Pakistan. 48, (4). 315-322

FDA. (2001). Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation.

FoodReview. (2008). Screening Cepat dan Konfirmasi Residu Melamin. Referensi Industri dan Pusat Teknologi Pangan Indonesia. [Online]. Tersedia: http://www.foodreview.biz/login/preview.php?view&id=55664[14Februari 2012]

Dian Novita Zebua, 2013

Validasi Metode Dan Penentuan Cemaran Melamin Dalam Susu Formula Menggunakan High Performance Liquid Chromatography Hitachi D 7000

|

Harahap, Y., Mansur, U. dan Sinandang, T. (2006). “Analisis Glimepirida dalam Plasma Tikus”. Majalah Ilmu Kefarmasian. 3, (1), 22 - 37

Harmita. (2004). “Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya”. Majalah Ilmu Kefarmasian. I, (3). Jakarta: Departemen Farmasi FMIPA-UI

Harvey, D. (2000). Modern Analitycal Chemistry. USA: The McGraw-Hill Companies

Huber, L. (2010). Validation of Analytical Methods. Jerman: Agilent Technologie Ibrahim, S. (2004). “Berbagai Pendekatan pada Penaksiran Batas Deteksi dan

Batas Kuantisasi Suatu Metode Analisis Instrumen”. Jurnal Acta Pharmaceutica Indonesia. 29 (4), 153-159

ICH. (1996). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) Lili et.al. (2009). “Visual Detection of Melamine in Raw Milk Using Gold

Nanoparticles as Colorimetric Probe”. Journal of food Chemistry. 122, 895 – 900

Miller, J.C. dan Miller, J.N. (1991). Statistika untuk Kimia Analitik. Bandung: ITB.

NFA. (2009). Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed. Sweden: NFA

Nissa, C. (2011). Kajian Cemaran Melamin dalam Produk Pangan dan Pengawasannya di Indonesia. Tesis. Program Master IPB: tidak diterbitkan PET Radiophamaceutical Sciences. (2007). [18F]FMPEP-d2 for Injection:

Standard Operating Procedures

Rohman, A. (2009). Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu SIELC Technologies. (2009). “The Do’s and Don’ts of Method Development in

Mixed-Mode Chromatography”. Newsletter. (Agustus 2009)

SigmaAldrich. (2002). “Eliminate TFA and Improve Sensitivity of Peptide Analyses by LC/MS”. Application Note. USA: Sigma-Aldrich Co

SigmaAldrich. (2007). “Trifluoroacetic Acid”. Application Note. USA: Sigma-Aldrich Co

SNI ISO/IEC 17025. (2008). Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi. Jakarta: BSN

SNI 7541.2. (2009). Metode Pengujian dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Bagian 2 : Residu golongan tetrasiklin dalam daging, telur, susu, dan olahannya. Jakarta: BSN

52

SNI 7577. (2010). Metode Pengujian Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) pada Susu, Susu Bubuk, Susu Formula. Jakarta: BSN

Sun, H., dkk. (2010). ”A sensitive and validated method for determination of melamine residuemin liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction”. Journal of Food Control. 21, 686–691

Suyanto dan Yulinar. (2008). Melamin dalam Produk Pangan. “Info POM”. 9, (6). Jakarta: BPOM RI

Thermo Electron Corporation (TEC). (2004). HPLC Analysis of Biomolecules Technical Guide. USA: TEC

Tyan, Y.C., dkk. (2009). “Melamine Contamination”. Journal of Anal Bioanal Chem. 395, 729–735

UNODC. (2009). Guidance for the Validation of Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit Drugs in Seized Materials and Biological Specimens. New York: United Nations Publication Venkatasami, G. dan Sowa Jr, J.R. (2010). “A rapid, acetonitrile-free, HPLC

method for determination of melamine in infrant formula”. Journal of Analitica Chimica Acta. 665, 227–230

Vydac. (1998). “What is 0,1% TFA?”. Application Note. USA: The Nest Group Wiadnya, I., Supriyanto, G. dan Handoko. (2012). “Pengembangan Metode

Analisis Melamin dalam Produk Susu Berbasis Reaksi Diazotasi dengan Senyawa Pengkoupling β-Naftol”. Jurnal Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 15, (1), 32 – 37

WHO. (2004). Joint WHO/FAO Workshop on Enterobacter sakazakii and other Microorganisms in Powdered Infant Formula. Geneva: WHO

WHO. (2008). Melamine and Cyanuric acid: Toxicity, Preliminary Risk Assessment and Guidance on Levels in Food

WHO. (2008). Questions and Answers on Melamine. [Online]. Tersedia: http://www.who.int/csr/media/faq/QAmelamine/en/index.html[30September 2012]

WHO. (2009). Background Paper on Methods for the Analysis of Melamine and Related Compounds in Foods and Animal Feeds. Geneva: WHO

WHO. (2009). Background Paper on the Chemistry of Melamine Alone and in Combination with Related Compounds. Geneva: WHO

WHO. (2009). Toxicological and Health Aspects on Melamine and Cyanuric Acid. Geneva: WHO