Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus) sebagai Antihiperglikemia
ENKAPSULASI NANOKITOSAN PADA EKSTRAK DAUN
TAPAK DARA (Catharanthus roseus) SEBAGAI
ANTIHIPERGLIKEMIA
NIA KURNIAWATI
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Enkapsulasi
Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus) sebagai
Antihiperglikemia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Nia Kurniawati
NIM C34100064
ABSTRAK
NIA KURNIAWATI, Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara
(Catharanthus roseus) sebagai Antihiperglikemia. Dibimbing oleh PIPIH
SUPTIJAH dan KUSTIARIYAH TARMAN.
Diabetes Mellitus merupakan suatu kelainan metabolik kronis yang
ditandai dengan kondisi dimana konsentrasi glukosa dalam darah lebih tinggi dari
normal (hiperglikemia). Optimalisasi pengobatan herbal dapat dilakukan dengan
proses enkapsulasi menggunakan nanokitosan. Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk menentukan dosis terbaik ekstrak daun tapak dara (Catharanthus roseus)
terenkapsulasi nanokitosan pada tikus hiperglikemia sesaat. Penelitian ini
dilakukan beberapa tahap, yaitu ekstraksi daun tapak dara, enkapsulasi
nanokitosan, uji fitokimia, analisis PSA, SEM, dan FTIR, serta uji toksisitas
dengan metode BSLT. Uji fitokimia menunjukkan esktrak daun tapak dara
mengandung flavonoid dan saponin. Ukuran partikel ekstrak, nanokitosan dan
ekstrak-nanokitosan berturut-turut yaitu 278,54; 273,36; 381,98 nm. Hasil analisis
SEM dan FTIR menunjukkan terjadinya penggabungan antara ekstrak dengan
nanokitosan. Perlakuan terbaik pada aktivitas antihiperglikemia yaitu dengan
dosis pemberian ekstrak-nanokitosan 20 mg/g BB yang menurunkan kadar
glukosa darah sebesar 68,9 mg/dL dari 140 mg/dL (tikus hiperglikemia) hingga
jam ke-3.
Kata kunci: antihiperglikemia, enkapsulasi, fitokimia, tapak dara, ukuran
partikel.
ABSTRACT
NIA KURNIAWATI, Nanochitosan Encapsulation on Perwinkle (Catharanthus
roseus) Leaf Extract as Antihyperglycemic. Supervised by PIPIH SUPTIJAH and
KUSTIARIYAH TARMAN.
Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disorder characterized by the
condition in which the concentration of glucose in the blood is higher than normal
(hyperglycemia). Optimization of herbal treatments can be done with
nanochitosan encapsulation. The purpose of this study was to determine the best
dose of leaf extract of perwinkle (Catharanthus roseus) encapsulated with
nanochitosan in hyperglycemic mice shortly. This research was conducted in
several stages, including extraction of perwinkle leaves, nanochitosan
encapsulation, phytochemical test, PSA, SEM, and FTIR analysis, as well as
toxicity test with BSLT method. Phytochemical test showed that perwinkle leaves
extracts contain flavonoids and saponins. Particle size of extract, nanochitosan
and extract-nanochitosan was 278.54;273.36;381.98 nm, respectively. SEM and
FTIR analyses indicated that the extracts were encapsulated by the nanochitosan.
The best treatment of antihyperglycemic activity was at a dose of 20 mg/g of
extract- nanochitosan which lowers blood glucose levels by 68.9 mg/dL from 140
mg dL in hyperglycemic mice up to 3 hours.
Keywords: antihyperglycemic,
phytochemical.
encapsulation,
particle
size,
perwinkle,
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ENKAPSULASI NANOKITOSAN PADA EKSTRAK DAUN
TAPAK DARA (Catharanthus roseus) SEBAGAI
ANTIHIPERGLIKEMIA
NIA KURNIAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan pada
Departemen Teknologi Hasil Perairan
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
: Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara
(Catharanthus roseus) sebagai Antihiperglikemia
Nama
: Nia Kurniawati
NIM
: C34100064
Program Studi : Teknologi Hasil Perairan
Disetujui oleh
Dr Dra Pipih Suptijah, MBA
Pembimbing I
Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, berkat rahmat serta
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus)
sebagai Antihiperglikemia”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
mendapatkan gelar sarjana di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penulisan skripsi ini, terutama kepada:
1
Dr Dra Pipih Suptijah, MBA dan Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi selaku
dosen pembimbing atas segala bimbingan dan pengarahan yang diberikan
kepada penulis.
2
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil
Perairan.
3
Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku dosen penguji dan Ketua Program
Studi Departemen Teknologi Hasil Perairan atas segala masukan yang
diberikan kepada penulis.
4
Dosen dan staff Tata Usaha Departemen Teknologi Hasil Perairan atas
segala bantuan kepada penulis selama mengenyam pendidikan S1.
5
Kedua orang tua, Bapak Odah Suryadi dan Ibu Elis Sulastri serta Winda
Wahyuni beserta keluarga tersayang yang telah memberikan dukungan
materil mau pun nonmateril.
6
Fanji Sanjaya, SHut yang telah memberikan dukungan, semangat, dan doa.
7
Fatmasari Nuarisma, Wahyu Mutia Rizki, Feky Pundi Utami, dan Annisa
Wulandari selaku teman seperjuangan dalam penelitian ini, atas suka duka
serta dukungannya selama ini.
8
Keluarga besar THP 47, THP 46, THP 48 dan THP 49 atas kebersamaan
dan dukungannya kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini memiliki banyak kekurangan. Penulis
mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk perbaikan skripsi
ini. Semoga tulisan ini bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya.
Bogor, Agustus 2014
Nia Kurniawati
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ............................................................................................... ii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ii
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
Latar Belakang ................................................................................................. 1
Perumusan Masalah .......................................................................................... 2
Tujuan Penelitian ............................................................................................. 2
Manfaat Penelitian............................................................................................ 2
Ruang Lingkup Penelitian ................................................................................ 2
METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3
Waktu dan Tempat ........................................................................................... 3
Bahan Penelitian............................................................................................... 3
Peralatan Penelitian .......................................................................................... 3
Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3
Preparasi Sampel dan Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) ......................... 4
Pembuatan Nanopartikel Kitosan .................................................................. 5
Karakterisasi Nanokitosan ............................................................................ 5
Uji Fitokimia ................................................................................................ 6
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ....................................... 6
Uji Aktivitas Antihiperglikemia pada Hewan Coba Tikus secara In Vivo ...... 7
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 7
Karakteristik Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi ..................................... 7
Ukuran Partikel ............................................................................................. 8
Morfologi Ekstrak Terenkapsulasi Nanokitosan ............................................ 9
Kelompok Gugus Fungsi ............................................................................ 10
Toksisitas Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi ....................................... 11
Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Daun Tapak Dara Terenkapsulasi
Nanokitosan pada Hewan Coba Tikus ............................................................ 12
Komponen Bioaktif Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) ............................. 16
KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 17
Kesimpulan .................................................................................................... 17
Saran .............................................................................................................. 17
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 17
LAMPIRAN ...................................................................................................... 21
RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 26
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji toksisitas nanokitosan, ekstrak daun tapak dara dan ekstrak
terenkapsulasi nanokitosan ............................................................................ 12
2 Hasil pengujian aktivitas antihiperglikemia ekstrak daun tapak dara
terenkapsulasi nanokitosan ............................................................................ 13
3 Hasil uji fitokimia ekstrak daun tapak dara .................................................... 16
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
Diagram alir penelitian .................................................................................... 4
Hasil SEM ekstrak terenkapsulasi nanokitosan ................................................ 9
Penyalutan obat di dalam nanopartikel kitosan................................................. 9
Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara ................................... 10
Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan ................................................................................................... 11
6 Kadar glukosa darah tikus dipuasakan dan setelah penambahan sukrosa. ....... 14
7 Aktivitas antihiperglikemia pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan ................................................................................................... 15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun tapak dara ...................................................... 22
2 Ekstrak daun tapak dara dan nanokitosan ........................................................ 22
3 Pengukuran kadar glukosa darah tikus percobaan ............................................ 22
4 Hasil analisis PSA esktrak, nanokitosan dan ekstrak-nanokitosan .................... 23
5 Hasil analisis probit LC50 dengan selang kepercayaan 95 SPSS v 22 ............... 24
6 Hasil aktivitas antihiperglikemia pada tikus dengan pemberian obat komersil . 25
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit degeneratif yang disebabkan
perubahan gaya hidup tidak sehat, lingkungan dan usia (Mistra 2004). Diabetes
Mellitus merupakan suatu kelainan metabolik kronis serius yang memiliki
dampak signifikan terhadap kesehatan. Penyakit diabetes mellitus ditandai dengan
kondisi dimana konsentrasi glukosa dalam darah lebih tinggi daripada normal
(hiperglikemia). Diabetes mellitus terjadi karena kelenjar pankreas tidak lagi
memproduksi insulin atau produksinya sangat sedikit sehingga tidak mampu
mencukupi kebutuhan tubuh (Mistra 2004). Penyakit DM sampai saat ini masih
belum ditemukan pengobatannya, akan tetapi dilakukan pencegahan dengan
mengatur pola makan dan gaya hidup sehat. Pengobatan terjangkau dan
berkualitas sebagai pencegah timbulnya penyakit diabetes mellitus atau
antihiperglikemia merupakan suatu upaya yang banyak dilakukan oleh peneliti.
Upaya untuk mengoptimalkan kerja senyawa aktif obat pada saat proses
pengobatan dapat dilakukan metode enkapsulasi. Enkapsulasi merupakan salah
satu cara penyalutan dalam mengendalikan laju pelepasan senyawa yang
disalutnya (Gufron 2013). Bahan yang dapat digunakan sebagai penyalut obat
salah satunya adalah kitosan. Kitosan memiliki struktur yang mirip selulosa dan
mampu membentuk gel yang berfungsi sebagai matriks dalam pengantar obat
(Gufron 2013). Modifikasi kitosan secara fisik mencakup perubahan ukuran
partikel atau butir kitosan menjadi lebih kecil untuk pemanfaatan yang lebih luas.
Pemanfaatan modifikasi fisik menghasilkan ukuran nanopartikel (Wahyono 2010)
Nanopartikel memiliki sifat sangat spesifik dan luas permukaan yang
berlipat ganda, biasanya dapat meningkatkan peluang terjadinya reaksi kimia yang
lebih banyak. Suatu zat dapat diserap langsung pada aliran darah tempat zat
tersebut dibutuhkan sehingga lebih efektif dibandingkan dipecah selama sistem
pencernaan berlangsung (Winarno dan Fernandez 2010). Faktor-faktor yang
mempengaruhi kerja zat diantaranya adalah dosis dan pemasukan yang berulang
(Dewi dan Tyas 2009). Penerapan nanoteknologi pada kitosan yaitu dalam
pembentukan nanopartikel memungkinkan kitosan untuk menjadi penghantar
senyawa fungsional atau obat menjadi lebih efektif.
Aplikasi nanokitosan sebagai penyalut obat dapat dimanfaatkan untuk
pencegahan penyakit DM dengan pengobatan tradisional menggunakan tanaman
herbal. Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman daripada
penggunaan obat modern karena obat tradisional memiliki efek samping relatif
sedikit daripada obat modern. Pengetahuan empiris tentang tanaman berkhasiat
obat berdasar pada pengalaman dan keterampilan yang secara turun temurun telah
diwariskan dari generasi ke genarasi (Sari 2006). Jenis tanaman yang dapat
digunakan sebagai obat tradisional adalah tapak dara (Catharanthus roseus).
Bagian-bagian tanaman ini seperti akar, batang, daun dan bunga mengandung
senyawa aktif seperti alkaloid. Alkaloid yang memiliki fungsi menurunkan kadar
gula darah, antara lain leurosine, catharanthine, lochnerine, tetrahydroalstonine,
vindoline, dan vindolinine (Dewi dan Tyas 2009).
2
Pemanfaatan daun tapak dara (C. roseus) dan modifikasinya dengan
metode penyalutan enkapsulasi menggunakan nanokitosan perlu dilakukan untuk
mengetahui efektifitas metode enkapsulasi nanokitosan dalam aplikasinya sebagai
antihiperglikemia pada ekstrak daun tapak dara (C. roseus). Hipotesis penelitian
ini adalah penggunaan nanokitosan sebagai bahan penyalut pada ekstrak daun
tapak dara (C. roseus) dapat mengefisienkan pencapaian target pengobatan
sebagai antihiperglikemia terhadap tikus hiperglikemia sesaat.
Perumusan Masalah
Permasalahan yang sering terjadi dalam pengobatan penyakit degeneratif
adalah penggunaan obat yang dapat menimbulkan efek samping pada kesehatan.
Metode pengobatan tradisional menggunakan tanaman herbal merupakan salah
satu cara untuk mengurangi efek samping penggunaan obat modern. Penelitian
menggunakan metode penyalutan obat secara enkapsulasi oleh nanokitosan pada
ekstrak daun tapak dara yang belum pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian ini
diharapkan dapat meningkatkan efektifitas pengobatan menggunakan tanaman
herbal tersalut nanokitosan sebagai antihiperglikemia.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah menganalisis kitosan sebagai
bahan penyalut obat dalam bentuk nanopartikel dan aplikasinya dalam metode
enkapsulasi dengan nanokitosan pada model pengobatan antihiperglikemia dari
tanaman tradisional. Tujuan khusus penelitian ini adalah menentukan efektifitas
metode enkapsulasi nanokitosan sebagai bahan penyalut ekstrak daun tapak dara
(C. roseus) untuk antihiperglikemia dan menentukan dosis terbaik ekstrak daun
tapak dara (C. roseus) terenkapsulasi nanokitosan pada tikus hiperglikemia sesaat.
Manfaat Penelitian
1
2
3
4
Manfaat dari penelitian ini meliputi:
Menerapkan teknologi enkapsulasi nanokitosan sebagai penyalut obat dalam
upaya meningkatkan efektivitas pada pengobatan
Sebagai alternatif pengobatan secara herbal pada penderita diabetes mellitus
Sebagai sediaan obat baru tanaman herbal tapak dara (C. roseus)
terenkapsulasi nanokitosan dalam bentuk puyer
Memperkaya khasanah informasi bagi dunia farmasi akan efektivitas
nanokitosan menyalut senyawa aktif tanaman herbal tapak dara (C. roseus)
sebagai model antihiperglikemia.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah pengambilan contoh, pembuatan
nanokitosan, ekstraksi daun tapak dara (C. roseus), proses enkapsulasi, analisis
3
karakteristik nanokitosan dan ekstrak yang terenkapsulasi nanokitosan, serta
analisis aktivitas antihiperglikemik ekstrak terenkapsulasi secara in vivo.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanan dari bulan November 2013 hingga Maret 2014.
Preparasi sampel dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.
Analisis PSA dan FTIR dilakukan di Laboratorium Analisis Bahan, Departemen
Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pengujian aktivitas
antihiperglikemia dilakukan di Laboratorium Unit Pengelola Hewan Lab, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Uji toksisitas dan fitokimia
dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, LPPM, Institut Pertanian
Bogor. Analisis SEM dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian dan
Pengembangan Geologi Kelautan (P3GL), Bandung dan di Laboratorium
Pengujian Hasil Hutan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan (P3HH),
Bogor.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar tapak dara
(C. roseus) dengan ukuran panjang daun 5-7 cm dan lebar 2-3 cm, didapatkan dari
kebun Biofarmaka, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Bahan pembuatan nanokitosan yang digunakan yaitu
kitosan serbuk, asam asetat 1%, tween 80, TPP 0,1%, akuades, serta bahan untuk
pengujian in vivo yaitu sukrosa 80% dan tikus jantan galur Sprague Dawley.
Peralatan Penelitian
Alat yang digunakan meliputi beaker glass, gelas ukur, botol jar, botol
film, botol pial, kaca arloji, batang pengaduk, sudip, pipet tetes, saringan,
magnetic stirrer dan spray dryer. Alat untuk analisis atau pengujian yang
digunakan antara lain Mikroskop Elektron Payaran (JSM-5310 LV, JEOL Ltd),
Particle Size Analyzer (Delsa TM Nano, Cordouan), Fourier Transform Infrared
(Tipe MB3000, ABB Group), glukosa meter (Easy Touch ®GCU meter), dan
kamera (GT-8000, Samsung).
Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian ini terbagi menjadi dua tahap. Tahap pertama yaitu
penelitian pendahuluan terdiri dari preparasi sampel dan ekstraksi daun tapak dara
(C. roseus), pembuatan nanokitosan, pembuatan puyer ekstrak daun tapak dara
terenkapsulasi nanokitosan dan pengujian karakteristik sampel meliputi pengujian
4
fitokimia ekstrak daun tapak dara (C. roseus), pengujian ukuran partikel dengan
analisis Particle Size Analyzer (PSA), Scanning Electron Microscopy (SEM), dan
analisis Fourier Transform InfraRed (FTIR), serta pengujian toksisitas dengan
metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Tahap kedua yaitu penelitian utama
yaitu uji aktivitas antihiperglikemia dengan analisis in vivo menggunakan hewan
coba tikus jantan putih galur Sprague Dawley. Diagram alir prosedur penelitian
dapat dilihat pada Gambar 1.
3 g kitosan
Pelarutan dengan Asam Asetat 1%
Homogenisasi 2000 rpm, 2 jam
Penambahan Tween 0,1%,
20 µl
16 g daun TD
Homogenisasi 2000 rpm, 30 menit
Penambahan TPP 0,1%, 200 ml
Analisis PSA, BSLT
Ekstaksi dengan aquades 3 L
suhu sampai titik didih air
Nanokitosan
Penambahan ekstrak daun
tapak dara 1000 ml
Homogenisasi, 2000 rpm, 30 menit
Spray Drying
Ekstrak daun TD terenkapsulasi
Analisis
Karakteristik:
PSA, SEM,
FTIR, dan
BSLT serta
pengujian
In vivo
Keterangan :
= Input/output
= Proses
Gambar 1 Diagram alir penelitian
Preparasi Sampel dan Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) (Modifikasi
Haryanto 2012)
Tanaman tapak dara (C. roseus) didapatkan dari kebun Biofarmaka
Cikabayan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor. Daun tapak dara segar dibersihkan dengan air mengalir untuk
menghilangkan kotoran yang menempel. Daun yang telah dibersihkan kemudian
5
ditiriskan. Daun tapak dara sebanyak 16 gram diekstraksi dengan pelarut air.
Pelarut air yang digunakan sebanyak 3 L. Ekstrak air yang diperoleh dilakukan
penyaringan dan didapatkan hasil ekstrak sebanyak 1 L, selanjutnya dilakukan
enkapsulasi dengan nanokitosan. Analisis karakteristik yang akan dilakukan
meliputi uji fitokimia, PSA, dan BSLT.
Pembuatan Nanopartikel Kitosan (Xu dan Du 2003)
Kitosan dibuat dengan konsentrasi 3% menggunakan metode gelasi ionik.
Sebanyak 3 gram kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 1% dengan
pengadukan magnetik pada suhu kamar. Pemotongan ikatan gel lunak dilakukan
dengan menggunakan magnetic stirrer selama 2 jam dengan kecepatan 2000 rpm.
Kemudian penambahan larutan Tween 80 0,1% sebanyak 20 uL yang bertujuan
dapat memisahkan antara gel satu dengan gel lainnya, selanjutnya di stirrer
selama 30 menit. Setelah itu, dilakukan penambahan 200 mL tripoliphospat 0,1%
dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit, bertujuan
agar ukuran partikel yang dihasilkan tetap stabil. Proses enkapsulasi diawali
dengan larutan nanokitosan ditambahkan 1000 mL ekstrak daun tapak dara dan
dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer selama 45 menit, selanjutnya
larutan campuran tersebut dikeringkan dengan pengeringan semprot (spray
drying).
Karakterisasi Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Pengujian yang dillakukan untuk ektrak terenkapsulasi nanokitosan pada
penelitian ini yaitu menentukan morfologi sampel dengan pengujian Scanning
Electron Microscopy (SEM), analisis pengukuran partikel sampel dengan
pengujian Particle Size Analyzer (PSA), dan analisis gugus fungsi sampel yang
dihasilkan dengan pengujian Fourier Transform Infrared (FTIR).
Pengujian PSA (Particle Size Analyzer) (Burgess et al. 2004)
Uji ukuran partikel dilakukan menggunakan pengujian PSA (Particle Size
Analyzer). Sampel larutan diambil dengan pipet kemudian dimasukkan ke dalam
tabung dengan tinggi maksimum 15 mm. Hasil pengujian akan muncul pada layar
komputer.
Pengujian SEM (Scanning Electron Microscopy) (Fujita et al. 1971)
Serbuk ekstrak terenkapsulasi nanokitosan diletakkan pada potongan
kuningan (stub) berdiameter 1 cm dengan menggunakan selotip dua sisi.
Kemudian serbuk tersebut dibuat menjadi konduktif dengan cara elektrik
menggunakan sinar dari platina lapis tipis (coating) selama 30 detik pada tekanan
dibawah 2 Pa dan tegangan elektron 10 kV dengan perbesaran 500x, 2500x, dan
5000x.
Pengujian FTIR (Fourier Transform Infrared) (Holme dan Peck 1993)
Sebanyak 2 mg serbuk ektrak terenkapsulasi nanokitosan dicampurkan
dengan 100 mg KBr untuk dibuat pellet dengan pencetak vakum. Pelet tersebut
dikenai sinar infra merah pada jangkauan bilangan gelombang 400-4000 cm-1.
Latar belakang penyerapan dihilangkan dengan cara pelet KBr dijadikan satu pada
setiap pengukuran.
6
Uji Fitokimia (Harbone 1987)
Pengujian komponen aktif terkandung dalam ekstrak ini dilakukan secara
kualitatif dengan metode uji fitokimia yang meliputi uji alkaloid, flavonoid,
saponin, steroid, fenol hidrokuinon, dan tanin.
1 Alkaloid
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan 4 tetes asam sulfat 2 N kemudian
diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer,
dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer
terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner,
dan endapan merah dengan pereaksi Dragendorff.
2 Flavonoid
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan serbuk magnesium 0,10 mg dan 0,40
mL amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume
yang sama), serta 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Warna merah,
kuning atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya
flavonoid.
3 Saponin
Saponin dideteksi dengan uji busa pada 1 mL ekstrak dalam air panas.
Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang setelah penambahan satu tetes
HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
4 Steroid
Sebanyak 1 mL ekstrak dilarutkan dalam 2 mL kloroform, 10 tetes anhidra
asetat, dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan berwarna merah yang terbentuk
untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru atau hijau menunjukkan reaksi
positif.
5 Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan dengan 20 mL etanol 70%. Larutan
yang dihasilkan diambil satu mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%.
Warna hijau atau hijau biru yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa fenol
dalam bahan.
6 Tanin
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan ke dalam 100 mL air panas
kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 mL filtrat
ditambahkan FeCl3 1%. Hasil positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman.
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)
Persiapan larva Artemia salina dilakukan dengan menetaskan telur larva
selama 48 jam sebelum dilakukan uji. Penetasan dilakukan dengan cara
merendam telur tersebut dalam air laut di dalam wadah yang diberi suplai oksigen
dari aerator dan diberi penerangan dengan lampu TL 20 Watt.
Pelaksanaan uji dilakukan dengan memasukkan larva ke dalam sumur uji
dengan tujuh kelompok perlakuan yang berisi larutan 50; 100; 500; dan 1000 ppm
dari ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi nanokitosan dengan pelarut air laut.
Masing-masing sumur uji berisi 10 ekor larva dan volume akhir setiap sumur
sebesar 2 mL. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan
selama 24 jam, selanjutnya dihitung jumlah larva yang mati. Nilai LC50 diperoleh
dengan cara menghitung menggunakan rumus y = a + bx. Nilai a dan b diperoleh
7
dengan perhitungan menggunakan rumus regresi linier berdasarkan data dari titik
konsentrasi yang digunakan. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi
larutan yang menyebabkan kematian terhadap 50% larva.
Uji Aktivitas Antihiperglikemia pada Hewan Coba Tikus secara In Vivo
(modifikasi Nugroho 2006)
Uji in vivo dilakukan dengan menggunakan tikus putih jantan sehat galur
Sprague Dawley, berumur 5 minggu dengan bobot 130-150 gram. Tikus dibagi
menjadi 2 kelompok utama yaitu pemberian larutan gula dan tidak diberikan
larutan gula (kontrol negatif/normal). Kelompok yang diberikan larutan gula
dibagi lagi menjadi 2 kelompok perlakuan yaitu pemberian larutan gula dan obat
komersil dan pemberian larutan gula dan ekstrak daun tapak dara terankapsulasi
nanokitosan. Pelakuan pemberian ekstrak tapak dara terenkapsulasi nanokitosan
dibedakan kembali berdasarkan dosis pemberian yaitu 5;10:15: dan 20 mg/g BB
tikus. Tikus diadaptasikan terlebih dahulu selama 8 hari untuk menyeragamkan
cara hidup dan makanannya.
Tikus pada masing-masing kelompok dipuasakan selama 18 jam, setelah
dipuasakan diambil darah pada masing-masing kelompok dan diukur kadar
glukosa darah puasanya. Tikus perlakukan selanjutnya dicekok sukrosa 80%
sebanyak 2 mL, kadar glukosa darah kembali diukur setelah satu jam pemberian
larutan sukrosa, sedangkan untuk kelompok kontrol negatif tikus diberikan pakan
untuk selanjutnya diperiksa kadar glukosa darah 2 jam setelah makan. Pelakuan
perlakuan dengan obat komersil selanjutnya diberikan obat komersil dan
perlakuan lainnya diberikan dosis ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan sesuai dengan dosis yaitu 5:10:15: dan 20 mg/ g bb tikus masingmasing sebanyak 2 mL pada setiap perlakuan. Kadar glukosa darah pada masingmasing kelompok perlakuan pemberian sukrosa selanjutnya diukur setelah 1, 2, 3,
4, dan 5 jam perlakuan pemberian dosis obat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Kulit udang atau cangkang kepiting dan rajungan merupakan penghasil
kitin dan kitosan. Bahan baku yang digunakan untuk mengolahnya tersedia dalam
jumlah yang cukup melimpah terutama kulit udang dan cangkang kepiting serta
rajungan. Kitosan merupakan modifikasi polimer karbohidrat alami yang diproses
melalui N-deasetilasi parsial kitin. Kitosan mempunyai kegunaan salah satunya
sebagai sarana penghantar obat dan gen serta biomaterial untuk imobilisasi.
Kitosan merupakan biopolimer alami menarik disebabkan adanya gugus amino
reaktif dan grup fungsional hidroksil. Kitosan memiliki karakteristik
biokompatibilitas yang diinginkan serta kemampuannya untuk meningkatkan
permeabilitas membran sehingga kitosan paling menjanjikan karena memiliki
kemampuan membentuk membran (Irianto dan Muljanah 2011). Modifikasi
kitosan secara fisik mencakup perubahan ukuran partikel atau butir kitosan
menjadi lebih kecil untuk pemanfaatan yang lebih luas. Pemanfaatan modifikasi
fisik menghasilkan ukuran nanopartikel (Wahyono 2010).
8
Nanopartikel memiliki sifat yang sangat spesifik, dengan luas permukaan
yang berlipat ganda dapat meningkatkan terjadinya reaksi kimia lebih banyak.
Suatu zat dapat diserap langsung pada aliran darah tempat zat tersebut dibutuhkan,
proses ini lebih efektif dibandingkan dipecah selama sistem pencernaan
berlangsung. Nanopartikel bersifat bioavailability yaitu ukurannya yang sangat
kecil lebih leluasa memasuki bagian-bagian tubuh sehingga nanopartikel akan
lebih mudah diserap oleh sel-sel secara individu (Winarno dan Fernandez 2010).
Metode paling umum dalam pembuatan nanopartikel yaitu dengan metode
gelasi ionik salah satunya menggunakan magnetic stirrer. Metode gelasi ionik
yaitu mencampurkan polimer kitosan dengan polianion sodium tripolifosfat yang
menghasilkan interaksi antara muatan positif pada gugus amino kitosan dengan
muatan tripolifosfat. Tripolifosfat dianggap sebagai zat pengikat silang yang
paling baik (Mohanraj dan Chen 2006).
Ukuran Partikel
Penggunaan nanopartikel dalam proses penyalutan dapat meningkatkan
absorsi zat-zat aktif. Proses nanoenkapsulasi berarti bahwa berbagai zat nutrisi
dapat diserap langsung pada aliran darah dimana nutrisi tersebut dibutuhkan, hal
ini akan jauh lebih efektif dibandingkan dipecah selama pemrosesan atau pun
pemecahan dengan enzim dalam sistem pencernaan. Mekanisme baru dapat
dikembangakan dengan nanoteknologi dalam masalah penyampaian obat.
Landasan yang digunakan pada drug delivery system adalah merangsang
efektivitas dari obat, melalui penentuan target dan sel-sel khusus yang spesifik,
percepatan waktu delivery, dan pencegahan enzim pencernaan dalam memecah
obat yang sedang dikonsumsi (Winarno dan Fernandez 2010).
Perhitungan partikel secara modern umumnya menggunakan analisis
gambar atau beberapa jenis perhitungan partikel seperti analisis Particle Size
Analyzer (PSA). Hasil rata-rata distribusi ukuran partikel dengan metode gelasi
ionik diperoleh ukuran nanokitosan yaitu 273,36 nm. Ekstrak daun tapak dara
memiliki ukuran partikel 278,54 nm sedangkan ekstrak-nanokitosan memiliki
ukuran 381,98 nm. Menurut Mohanraj dan Chen (2006) nanopartikel
didefinisikan sebagai partikel yang berbentuk padat dengan ukuran 10-1000 nm.
Partikel dengan ukuran lebih kecil dari 300 nm dapat menembus dengan sangat
mudah dan masuk kedalam sel-sel individu. Nanoteknologi dapat didefinisikan
sebagai kegiatan yang meliputi design, produksi, dan pemanfaatan struktur,
peralatan sistem dan material dengan cara pengendalian ukuran dan bentuk
material pada skala atom dan molekul dengan ukuran material kurang dari 300 nm
(Winarno dan Fernandez 2010).
Hasil yang didapatkan tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Gufron
(2013), hasil analisis PSA ukuran nanokitosan yang diperoleh yaitu 259,22 nm
dan kitosan-metformin yaitu 351,46 nm. Ukuran kitosan tersebut menjadi lebih
besar setelah proses enkapsulasi dan menunjukkan proses enkapsulasi berhasil
dilihat dari morfologi pada hasil SEM serta gugus fungsi pada FTIR yang
menunjukan terdapat 2 gugus fungsi spesifik kitosan dan senyawa obat. Menurut
Rachmania (2011), pengecilan ukuran dengan magnetic stirrer dengan kecepatan
tinggi akan menyamaratakan energi yang diterima oleh partikel hampir diseluruh
bagian sisi larutan sehingga ukuran partikel semakin homogen untuk waktu
tertentu. Perbedaan waktu proses sizing, aktivitas bahan emulsifier serta bahan
9
stabilizer dapat mempengaruhi variasi ukuran partikel hingga ukuran partikel
yang dihasilkan tidak homogen tetapi ukurannya cukup memenuhi standar
nanopartikel.
Morfologi Ekstrak Terenkapsulasi Nanokitosan
Morfologi ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi nanokitosan dapat
dibedakan secara visual dengan menggunakan analisis SEM (Scanning Electron
Microscopy). Analisis SEM memiliki fungsi untuk mengidentifikasi morfologi
permukaan, bentuk dan ukuran sampel yang ditampilkan dalam sebuah gambar.
Foto SEM didapatkan dengan cara menghitung perbandingan jumlah partikel
berukuran nano terhadap seluruh partikel baik berukuran nano maupun mikro
dalam satu foto SEM tersebut (Wahyono 2010). Hasil analisis SEM dapat dilihat
pada Gambar 2.
c
c
a
b
c
Gambar 2 Hasil SEM ekstrak terenkapsulasi nanokitosan (a) pembesaran 2500x,
(b) pembesaran 5000,dan (c) nanokitosan (Rachmania 2011)
Hasil karakterisasi SEM pada pembesaran 2500-5000x memperlihatkan
morfologi permukaan dan bentuk ekstrak terenkapsulasi nanokitosan (Gambar 2a
dan 2b). Enkapsulasi merupakan salah satu cara penyalutan dalam mengendalikan
laju pelepasan senyawa yang disalutnya (Gufron 2013). Ukuran partikel
nanokitosan yang bervariasi tetapi masih dalam ukuran nanopartikel. Ekstrak
tersalut nanokitosan melalui kondisi enkapsulasi yaitu menempel dipermukaan
kitosan (teradsopsi) (Gambar 2a dan 2b). Menurut Tiyaboonchai (2003) Ekstrak
dapat tersalut nanokitosan melalui 2 kondisi enkapsulasi yaitu masuk kedalam
matriks nanokitosan (terjebak) dan menempel dipermukaan kitosan (teradsopsi).
Gambar 3 Penyalutan obat di dalam nanopartikel kitosan (Tiyaboonchai 2003)
Ukuran partikel yang tidak seragam karena bahan yang tersalutnya juga
tidak seragam tetapi masih dalam ukuran nanopartikel, pensalut menempel di
permukaan nanokitosan sehingga dikatakan bahwa proses enkapsulasi berjalan
dengan baik. Ekstrak mempunyai variasi ukuran partikel kurang homogen, sesuai
dengan hasil PSA rata-rata yaitu ukuran ekstrak lebih besar daripada rata-rata
ukuran nanokitosan hingga menyebabkan ekstrak tersalut pada permukaan
10
nanokitosan. Rachmania (2011) menyatakan bahwa nanopartikel kitosan yang
diperoleh dengan menggunakan magnetic stirrer menghasilkan penyebaran energi
cenderung merata sehingga dalam waktu tertentu distribusi ukuran partikel dapat
lebih homogen serta memiliki morfologi berbentuk bulat (Gambar 2c). Wahyono
(2010) menyatakan bahwa nanopartikel kitosan kosong memiliki bentuk yang
keriput dan kempes, sedangkan nanokitosan terisi ketoprofen memiliki bentuk
bulat utuh.
Kelompok Gugus Fungsi
Analisis Fourier Transform Infrared (FTIR) adalah salah satu analisis
yang digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa. Analisis FTIR pada
ekstrak kasar dari tanaman dapat memberikan informasi tentang distribusi
kelompok-kelompok fungsional dan memberikan dasar untuk membandingkan
perbedaan komposisi antara isolat. FTIR merupakan analisis yang paling baik
untuk mengidentifikasi jenis ikatan kimia. Panjang gelombang tertentu merupakan
karakteristik dari ikatan kimia molekul yang dapat dilihat pada energi yang
diserap spektrum inframerah. Bilangan gelombang yang digunakan untuk
senyawa organik maupun senyawa polimer yaitu 400-4000 cm-1 (Shalini dan
Prema 2012). Analisis data FTIR dilakukan menggunakan software IR Pal V2.0. A
Tabledriven Infrared Application. Hasil analisis Fourier Transform Infrared
(FTIR) pada ekstrak daun tapak dara dan ektrak tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan disajikan pada Gambar 4 dan Gambar 5.
Gambar 4 Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara
Kurva transmitan hasil FTIR menunjukkan profil kimiawi berupa pola
spektrum. Pada ekstrak daun tapak dara, spektrum inframerah menunjukkan
puncak serapan kuat pada bilangan-bilangan gelombang berikut adalah gugus
fungsi hidroksil (-OH) pada 3425 cm-1, gugus metil (C-H) pada 2939 cm-1, asam
karboksilat (C-O) pada 1404 cm-1, gugus metil lainnya (CH3) pada bilangan
gelombang 1265-1257 cm-1, dan alkil halida (C-Br) pada 594 cm-1. Hasil pola
spektrum ini sesuai dengan penelitian Shalini dan Perma (2012) yang menyatakan
bahwa pada daun C. roseus, spektrum yang menunjukkan penyerapan kuat ada
pada 3394, 2929, 2864, 1622, 1069, dan 596 cm-1 yang menunjukkan kelompok
11
gugus fungsi alkohol (-OH), asam karboksilat (C-O), alkana (C-H), alkena, amina,
aromatik, amina alifatik, ester dan alkil halida (C-Br).
Gambar 5 Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan
Pada kurva transmitan hasil ekstrak terenkapsulasi nanokitosan
menunjukkan puncak serapan kuat pada bilangan gelombang 3418 cm-1 gugus
fungsi hidroksil (-OH), 2932 cm-1 gugus metil (C-H), 1643 cm-1 (NH), 1566 cm-1
(C=C), 1412 cm-1 (C-C), 1257 cm-1 (C-O), 617 cm-1 metil (C-H) dan 586 cm-1 alkil
halida (C-Br). Spektum inframerah pada ekstrak terenkapsulasi nanokitosan
menunjukkan gabungan gugus fungsi spesifik pada nanokitosan yaitu (NH) dan
gugus fungsi ekstrak yang lebih dominan menunjukan gugus fungsi yang sama
pada ekstrak daun tapak dara (Gambar 4). Penelitian Gufron (2013) menyatakan
bahwa nanokitosan memiliki gugus fungsi spesifik yaitu gugus fungsi amina (NH)
pada bilangan gelombang 1643 cm-1 dan gugus fungsi hidroksil (-OH) pada
bilangan gelombang 3410 cm-1. Perubahan frekuensi serapan untuk gugus fungsi
tertentu dipengaruhi oleh substituen tertentu yang berubah yang disebabkan oleh
adanya reaksi tertentu sehingga kekuatan ikatan akan berubah. Serapan gugus
fungsi yang mengalami perubahan menunjukan bahwa terdapat air atau (-OH)
yang mungkin terserap sehingga mempengaruhi ikatan antara molekul yang
menyebabkan perbedaan daerah serapan gugus fungsi spesifik pada sampel uji
(Pebrian et al. 2012).
Toksisitas Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Salah satu metode awal yang sering digunakan untuk pengujian toksisitas
senyawa aktif terutama yang berasal dari tanaman adalah Brine Shrimp Lethality
Test (BSLT). Metode ini bertujuan untuk melihat tingkat mortalitas larva udang
yang disebabkan oleh ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dari pengujian toksisitas
dihitung sebagai nilai LC50 (Lethal Concentration) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis
12
atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang
sejumlah 50% setelah masa inkubasi selama 24 jam (Lisdawati et al. 2006). Hasil
uji toksisitas menunjukkan beban konsentrasi dalam media dapat membunuh larva
udang ditunjukan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil uji toksisitas nanokitosan, ekstrak daun tapak dara dan ekstrak
terenkapsulasi nanokitosan
Sampel (ppm)
Ekstrak
Nanokitosan
Ekstrak-nanokitosan
Mortalitas (%)
50
100
3,33
3,33
3,33
13,33
10
23,33
500
23,33
53,33
63,33
1000
63,33
63,33
83,33
LC50
(ppm)
842,50
683,64
464,13
Kategori
Toksik rendah
Toksik rendah
Toksik rendah
Pengujian dilakukan pada ekstrak, nanokitosan, dan ekstrak terenkapsulasi
nanokitosan dengan konsentrasi yaitu 50, 100, 500, dan 1000 ppm. Hasil uji
toksisitas pada Tabel 3 menunjukkan LC50 pada ekstrak daun tapak dara yaitu
842,50 ppm dan pada nanokitosan diperoleh LC50 sebesar 683,64. Ekstrak yang
telah melalui proses enkapsulasi dengan nanokitosan memiliki nilai LC50 yaitu
464,13 ppm. Berdasarkan McLaughlin et al. (1998), senyawa dengan nilai
toksisitas LC50 ≤ 30 ppm dinyatakan sangat toksik, LC50 antara 31-200 ppm
dinyatakan toksik, LC50 antara 201-1000 ppm dinyatakan toksik rendah, dan nilai
LC50 >1000 ppm dinyatakan tidak toksik. Hal ini menunjukkan bahwa toksisitas
ekstrak terenkapsulasi nanokitosan termasuk rendah yaitu dengan nilai LC50 yaitu
464,13 ppm. Winarno dan Fernandez (2010) menyatakan bahwa semakin tinggi
daya reaktivitas dan bioavailability yang bersifat positif dari nanomaterial
kemungkinan juga dapat berakibat meningkatnya daya toksisitas yang lebih besar
dari nanomaterial dibandingkan dengan materi yang sama tetapi dengan ukuran
besar.
Tamat et al. (2007) memaparkan bahwa apabila ekstrak tersebut termasuk
golongan tidak toksik maka kemungkinan dapat dikembangkan penggunaannya
untuk tujuan yang luas, diantaranya sebagai makanan suplemen atau bahan baku
kosmetik, sedangkan apabila ekstrak tersebut termasuk golongan toksik maka
kemungkinan penggunaannya dapat dikembangkan untuk bahan baku obat. Suatu
ekstrak menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam pengujian toksisitas, apabila
ekstrak tersebut memiliki nilai LC50
TAPAK DARA (Catharanthus roseus) SEBAGAI
ANTIHIPERGLIKEMIA
NIA KURNIAWATI
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Enkapsulasi
Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus) sebagai
Antihiperglikemia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Nia Kurniawati
NIM C34100064
ABSTRAK
NIA KURNIAWATI, Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara
(Catharanthus roseus) sebagai Antihiperglikemia. Dibimbing oleh PIPIH
SUPTIJAH dan KUSTIARIYAH TARMAN.
Diabetes Mellitus merupakan suatu kelainan metabolik kronis yang
ditandai dengan kondisi dimana konsentrasi glukosa dalam darah lebih tinggi dari
normal (hiperglikemia). Optimalisasi pengobatan herbal dapat dilakukan dengan
proses enkapsulasi menggunakan nanokitosan. Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk menentukan dosis terbaik ekstrak daun tapak dara (Catharanthus roseus)
terenkapsulasi nanokitosan pada tikus hiperglikemia sesaat. Penelitian ini
dilakukan beberapa tahap, yaitu ekstraksi daun tapak dara, enkapsulasi
nanokitosan, uji fitokimia, analisis PSA, SEM, dan FTIR, serta uji toksisitas
dengan metode BSLT. Uji fitokimia menunjukkan esktrak daun tapak dara
mengandung flavonoid dan saponin. Ukuran partikel ekstrak, nanokitosan dan
ekstrak-nanokitosan berturut-turut yaitu 278,54; 273,36; 381,98 nm. Hasil analisis
SEM dan FTIR menunjukkan terjadinya penggabungan antara ekstrak dengan
nanokitosan. Perlakuan terbaik pada aktivitas antihiperglikemia yaitu dengan
dosis pemberian ekstrak-nanokitosan 20 mg/g BB yang menurunkan kadar
glukosa darah sebesar 68,9 mg/dL dari 140 mg/dL (tikus hiperglikemia) hingga
jam ke-3.
Kata kunci: antihiperglikemia, enkapsulasi, fitokimia, tapak dara, ukuran
partikel.
ABSTRACT
NIA KURNIAWATI, Nanochitosan Encapsulation on Perwinkle (Catharanthus
roseus) Leaf Extract as Antihyperglycemic. Supervised by PIPIH SUPTIJAH and
KUSTIARIYAH TARMAN.
Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disorder characterized by the
condition in which the concentration of glucose in the blood is higher than normal
(hyperglycemia). Optimization of herbal treatments can be done with
nanochitosan encapsulation. The purpose of this study was to determine the best
dose of leaf extract of perwinkle (Catharanthus roseus) encapsulated with
nanochitosan in hyperglycemic mice shortly. This research was conducted in
several stages, including extraction of perwinkle leaves, nanochitosan
encapsulation, phytochemical test, PSA, SEM, and FTIR analysis, as well as
toxicity test with BSLT method. Phytochemical test showed that perwinkle leaves
extracts contain flavonoids and saponins. Particle size of extract, nanochitosan
and extract-nanochitosan was 278.54;273.36;381.98 nm, respectively. SEM and
FTIR analyses indicated that the extracts were encapsulated by the nanochitosan.
The best treatment of antihyperglycemic activity was at a dose of 20 mg/g of
extract- nanochitosan which lowers blood glucose levels by 68.9 mg/dL from 140
mg dL in hyperglycemic mice up to 3 hours.
Keywords: antihyperglycemic,
phytochemical.
encapsulation,
particle
size,
perwinkle,
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ENKAPSULASI NANOKITOSAN PADA EKSTRAK DAUN
TAPAK DARA (Catharanthus roseus) SEBAGAI
ANTIHIPERGLIKEMIA
NIA KURNIAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan pada
Departemen Teknologi Hasil Perairan
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
: Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara
(Catharanthus roseus) sebagai Antihiperglikemia
Nama
: Nia Kurniawati
NIM
: C34100064
Program Studi : Teknologi Hasil Perairan
Disetujui oleh
Dr Dra Pipih Suptijah, MBA
Pembimbing I
Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, berkat rahmat serta
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Enkapsulasi Nanokitosan pada Ekstrak Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus)
sebagai Antihiperglikemia”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk
mendapatkan gelar sarjana di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penulisan skripsi ini, terutama kepada:
1
Dr Dra Pipih Suptijah, MBA dan Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi selaku
dosen pembimbing atas segala bimbingan dan pengarahan yang diberikan
kepada penulis.
2
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil
Perairan.
3
Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku dosen penguji dan Ketua Program
Studi Departemen Teknologi Hasil Perairan atas segala masukan yang
diberikan kepada penulis.
4
Dosen dan staff Tata Usaha Departemen Teknologi Hasil Perairan atas
segala bantuan kepada penulis selama mengenyam pendidikan S1.
5
Kedua orang tua, Bapak Odah Suryadi dan Ibu Elis Sulastri serta Winda
Wahyuni beserta keluarga tersayang yang telah memberikan dukungan
materil mau pun nonmateril.
6
Fanji Sanjaya, SHut yang telah memberikan dukungan, semangat, dan doa.
7
Fatmasari Nuarisma, Wahyu Mutia Rizki, Feky Pundi Utami, dan Annisa
Wulandari selaku teman seperjuangan dalam penelitian ini, atas suka duka
serta dukungannya selama ini.
8
Keluarga besar THP 47, THP 46, THP 48 dan THP 49 atas kebersamaan
dan dukungannya kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini memiliki banyak kekurangan. Penulis
mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk perbaikan skripsi
ini. Semoga tulisan ini bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya.
Bogor, Agustus 2014
Nia Kurniawati
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ............................................................................................... ii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ii
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
Latar Belakang ................................................................................................. 1
Perumusan Masalah .......................................................................................... 2
Tujuan Penelitian ............................................................................................. 2
Manfaat Penelitian............................................................................................ 2
Ruang Lingkup Penelitian ................................................................................ 2
METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3
Waktu dan Tempat ........................................................................................... 3
Bahan Penelitian............................................................................................... 3
Peralatan Penelitian .......................................................................................... 3
Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3
Preparasi Sampel dan Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) ......................... 4
Pembuatan Nanopartikel Kitosan .................................................................. 5
Karakterisasi Nanokitosan ............................................................................ 5
Uji Fitokimia ................................................................................................ 6
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ....................................... 6
Uji Aktivitas Antihiperglikemia pada Hewan Coba Tikus secara In Vivo ...... 7
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 7
Karakteristik Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi ..................................... 7
Ukuran Partikel ............................................................................................. 8
Morfologi Ekstrak Terenkapsulasi Nanokitosan ............................................ 9
Kelompok Gugus Fungsi ............................................................................ 10
Toksisitas Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi ....................................... 11
Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Daun Tapak Dara Terenkapsulasi
Nanokitosan pada Hewan Coba Tikus ............................................................ 12
Komponen Bioaktif Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) ............................. 16
KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 17
Kesimpulan .................................................................................................... 17
Saran .............................................................................................................. 17
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 17
LAMPIRAN ...................................................................................................... 21
RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 26
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji toksisitas nanokitosan, ekstrak daun tapak dara dan ekstrak
terenkapsulasi nanokitosan ............................................................................ 12
2 Hasil pengujian aktivitas antihiperglikemia ekstrak daun tapak dara
terenkapsulasi nanokitosan ............................................................................ 13
3 Hasil uji fitokimia ekstrak daun tapak dara .................................................... 16
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
Diagram alir penelitian .................................................................................... 4
Hasil SEM ekstrak terenkapsulasi nanokitosan ................................................ 9
Penyalutan obat di dalam nanopartikel kitosan................................................. 9
Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara ................................... 10
Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan ................................................................................................... 11
6 Kadar glukosa darah tikus dipuasakan dan setelah penambahan sukrosa. ....... 14
7 Aktivitas antihiperglikemia pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan ................................................................................................... 15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun tapak dara ...................................................... 22
2 Ekstrak daun tapak dara dan nanokitosan ........................................................ 22
3 Pengukuran kadar glukosa darah tikus percobaan ............................................ 22
4 Hasil analisis PSA esktrak, nanokitosan dan ekstrak-nanokitosan .................... 23
5 Hasil analisis probit LC50 dengan selang kepercayaan 95 SPSS v 22 ............... 24
6 Hasil aktivitas antihiperglikemia pada tikus dengan pemberian obat komersil . 25
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit degeneratif yang disebabkan
perubahan gaya hidup tidak sehat, lingkungan dan usia (Mistra 2004). Diabetes
Mellitus merupakan suatu kelainan metabolik kronis serius yang memiliki
dampak signifikan terhadap kesehatan. Penyakit diabetes mellitus ditandai dengan
kondisi dimana konsentrasi glukosa dalam darah lebih tinggi daripada normal
(hiperglikemia). Diabetes mellitus terjadi karena kelenjar pankreas tidak lagi
memproduksi insulin atau produksinya sangat sedikit sehingga tidak mampu
mencukupi kebutuhan tubuh (Mistra 2004). Penyakit DM sampai saat ini masih
belum ditemukan pengobatannya, akan tetapi dilakukan pencegahan dengan
mengatur pola makan dan gaya hidup sehat. Pengobatan terjangkau dan
berkualitas sebagai pencegah timbulnya penyakit diabetes mellitus atau
antihiperglikemia merupakan suatu upaya yang banyak dilakukan oleh peneliti.
Upaya untuk mengoptimalkan kerja senyawa aktif obat pada saat proses
pengobatan dapat dilakukan metode enkapsulasi. Enkapsulasi merupakan salah
satu cara penyalutan dalam mengendalikan laju pelepasan senyawa yang
disalutnya (Gufron 2013). Bahan yang dapat digunakan sebagai penyalut obat
salah satunya adalah kitosan. Kitosan memiliki struktur yang mirip selulosa dan
mampu membentuk gel yang berfungsi sebagai matriks dalam pengantar obat
(Gufron 2013). Modifikasi kitosan secara fisik mencakup perubahan ukuran
partikel atau butir kitosan menjadi lebih kecil untuk pemanfaatan yang lebih luas.
Pemanfaatan modifikasi fisik menghasilkan ukuran nanopartikel (Wahyono 2010)
Nanopartikel memiliki sifat sangat spesifik dan luas permukaan yang
berlipat ganda, biasanya dapat meningkatkan peluang terjadinya reaksi kimia yang
lebih banyak. Suatu zat dapat diserap langsung pada aliran darah tempat zat
tersebut dibutuhkan sehingga lebih efektif dibandingkan dipecah selama sistem
pencernaan berlangsung (Winarno dan Fernandez 2010). Faktor-faktor yang
mempengaruhi kerja zat diantaranya adalah dosis dan pemasukan yang berulang
(Dewi dan Tyas 2009). Penerapan nanoteknologi pada kitosan yaitu dalam
pembentukan nanopartikel memungkinkan kitosan untuk menjadi penghantar
senyawa fungsional atau obat menjadi lebih efektif.
Aplikasi nanokitosan sebagai penyalut obat dapat dimanfaatkan untuk
pencegahan penyakit DM dengan pengobatan tradisional menggunakan tanaman
herbal. Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman daripada
penggunaan obat modern karena obat tradisional memiliki efek samping relatif
sedikit daripada obat modern. Pengetahuan empiris tentang tanaman berkhasiat
obat berdasar pada pengalaman dan keterampilan yang secara turun temurun telah
diwariskan dari generasi ke genarasi (Sari 2006). Jenis tanaman yang dapat
digunakan sebagai obat tradisional adalah tapak dara (Catharanthus roseus).
Bagian-bagian tanaman ini seperti akar, batang, daun dan bunga mengandung
senyawa aktif seperti alkaloid. Alkaloid yang memiliki fungsi menurunkan kadar
gula darah, antara lain leurosine, catharanthine, lochnerine, tetrahydroalstonine,
vindoline, dan vindolinine (Dewi dan Tyas 2009).
2
Pemanfaatan daun tapak dara (C. roseus) dan modifikasinya dengan
metode penyalutan enkapsulasi menggunakan nanokitosan perlu dilakukan untuk
mengetahui efektifitas metode enkapsulasi nanokitosan dalam aplikasinya sebagai
antihiperglikemia pada ekstrak daun tapak dara (C. roseus). Hipotesis penelitian
ini adalah penggunaan nanokitosan sebagai bahan penyalut pada ekstrak daun
tapak dara (C. roseus) dapat mengefisienkan pencapaian target pengobatan
sebagai antihiperglikemia terhadap tikus hiperglikemia sesaat.
Perumusan Masalah
Permasalahan yang sering terjadi dalam pengobatan penyakit degeneratif
adalah penggunaan obat yang dapat menimbulkan efek samping pada kesehatan.
Metode pengobatan tradisional menggunakan tanaman herbal merupakan salah
satu cara untuk mengurangi efek samping penggunaan obat modern. Penelitian
menggunakan metode penyalutan obat secara enkapsulasi oleh nanokitosan pada
ekstrak daun tapak dara yang belum pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian ini
diharapkan dapat meningkatkan efektifitas pengobatan menggunakan tanaman
herbal tersalut nanokitosan sebagai antihiperglikemia.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah menganalisis kitosan sebagai
bahan penyalut obat dalam bentuk nanopartikel dan aplikasinya dalam metode
enkapsulasi dengan nanokitosan pada model pengobatan antihiperglikemia dari
tanaman tradisional. Tujuan khusus penelitian ini adalah menentukan efektifitas
metode enkapsulasi nanokitosan sebagai bahan penyalut ekstrak daun tapak dara
(C. roseus) untuk antihiperglikemia dan menentukan dosis terbaik ekstrak daun
tapak dara (C. roseus) terenkapsulasi nanokitosan pada tikus hiperglikemia sesaat.
Manfaat Penelitian
1
2
3
4
Manfaat dari penelitian ini meliputi:
Menerapkan teknologi enkapsulasi nanokitosan sebagai penyalut obat dalam
upaya meningkatkan efektivitas pada pengobatan
Sebagai alternatif pengobatan secara herbal pada penderita diabetes mellitus
Sebagai sediaan obat baru tanaman herbal tapak dara (C. roseus)
terenkapsulasi nanokitosan dalam bentuk puyer
Memperkaya khasanah informasi bagi dunia farmasi akan efektivitas
nanokitosan menyalut senyawa aktif tanaman herbal tapak dara (C. roseus)
sebagai model antihiperglikemia.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah pengambilan contoh, pembuatan
nanokitosan, ekstraksi daun tapak dara (C. roseus), proses enkapsulasi, analisis
3
karakteristik nanokitosan dan ekstrak yang terenkapsulasi nanokitosan, serta
analisis aktivitas antihiperglikemik ekstrak terenkapsulasi secara in vivo.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanan dari bulan November 2013 hingga Maret 2014.
Preparasi sampel dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.
Analisis PSA dan FTIR dilakukan di Laboratorium Analisis Bahan, Departemen
Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pengujian aktivitas
antihiperglikemia dilakukan di Laboratorium Unit Pengelola Hewan Lab, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Uji toksisitas dan fitokimia
dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, LPPM, Institut Pertanian
Bogor. Analisis SEM dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian dan
Pengembangan Geologi Kelautan (P3GL), Bandung dan di Laboratorium
Pengujian Hasil Hutan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan (P3HH),
Bogor.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar tapak dara
(C. roseus) dengan ukuran panjang daun 5-7 cm dan lebar 2-3 cm, didapatkan dari
kebun Biofarmaka, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Bahan pembuatan nanokitosan yang digunakan yaitu
kitosan serbuk, asam asetat 1%, tween 80, TPP 0,1%, akuades, serta bahan untuk
pengujian in vivo yaitu sukrosa 80% dan tikus jantan galur Sprague Dawley.
Peralatan Penelitian
Alat yang digunakan meliputi beaker glass, gelas ukur, botol jar, botol
film, botol pial, kaca arloji, batang pengaduk, sudip, pipet tetes, saringan,
magnetic stirrer dan spray dryer. Alat untuk analisis atau pengujian yang
digunakan antara lain Mikroskop Elektron Payaran (JSM-5310 LV, JEOL Ltd),
Particle Size Analyzer (Delsa TM Nano, Cordouan), Fourier Transform Infrared
(Tipe MB3000, ABB Group), glukosa meter (Easy Touch ®GCU meter), dan
kamera (GT-8000, Samsung).
Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian ini terbagi menjadi dua tahap. Tahap pertama yaitu
penelitian pendahuluan terdiri dari preparasi sampel dan ekstraksi daun tapak dara
(C. roseus), pembuatan nanokitosan, pembuatan puyer ekstrak daun tapak dara
terenkapsulasi nanokitosan dan pengujian karakteristik sampel meliputi pengujian
4
fitokimia ekstrak daun tapak dara (C. roseus), pengujian ukuran partikel dengan
analisis Particle Size Analyzer (PSA), Scanning Electron Microscopy (SEM), dan
analisis Fourier Transform InfraRed (FTIR), serta pengujian toksisitas dengan
metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Tahap kedua yaitu penelitian utama
yaitu uji aktivitas antihiperglikemia dengan analisis in vivo menggunakan hewan
coba tikus jantan putih galur Sprague Dawley. Diagram alir prosedur penelitian
dapat dilihat pada Gambar 1.
3 g kitosan
Pelarutan dengan Asam Asetat 1%
Homogenisasi 2000 rpm, 2 jam
Penambahan Tween 0,1%,
20 µl
16 g daun TD
Homogenisasi 2000 rpm, 30 menit
Penambahan TPP 0,1%, 200 ml
Analisis PSA, BSLT
Ekstaksi dengan aquades 3 L
suhu sampai titik didih air
Nanokitosan
Penambahan ekstrak daun
tapak dara 1000 ml
Homogenisasi, 2000 rpm, 30 menit
Spray Drying
Ekstrak daun TD terenkapsulasi
Analisis
Karakteristik:
PSA, SEM,
FTIR, dan
BSLT serta
pengujian
In vivo
Keterangan :
= Input/output
= Proses
Gambar 1 Diagram alir penelitian
Preparasi Sampel dan Ekstrak Daun Tapak Dara (C. roseus) (Modifikasi
Haryanto 2012)
Tanaman tapak dara (C. roseus) didapatkan dari kebun Biofarmaka
Cikabayan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor. Daun tapak dara segar dibersihkan dengan air mengalir untuk
menghilangkan kotoran yang menempel. Daun yang telah dibersihkan kemudian
5
ditiriskan. Daun tapak dara sebanyak 16 gram diekstraksi dengan pelarut air.
Pelarut air yang digunakan sebanyak 3 L. Ekstrak air yang diperoleh dilakukan
penyaringan dan didapatkan hasil ekstrak sebanyak 1 L, selanjutnya dilakukan
enkapsulasi dengan nanokitosan. Analisis karakteristik yang akan dilakukan
meliputi uji fitokimia, PSA, dan BSLT.
Pembuatan Nanopartikel Kitosan (Xu dan Du 2003)
Kitosan dibuat dengan konsentrasi 3% menggunakan metode gelasi ionik.
Sebanyak 3 gram kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 1% dengan
pengadukan magnetik pada suhu kamar. Pemotongan ikatan gel lunak dilakukan
dengan menggunakan magnetic stirrer selama 2 jam dengan kecepatan 2000 rpm.
Kemudian penambahan larutan Tween 80 0,1% sebanyak 20 uL yang bertujuan
dapat memisahkan antara gel satu dengan gel lainnya, selanjutnya di stirrer
selama 30 menit. Setelah itu, dilakukan penambahan 200 mL tripoliphospat 0,1%
dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit, bertujuan
agar ukuran partikel yang dihasilkan tetap stabil. Proses enkapsulasi diawali
dengan larutan nanokitosan ditambahkan 1000 mL ekstrak daun tapak dara dan
dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer selama 45 menit, selanjutnya
larutan campuran tersebut dikeringkan dengan pengeringan semprot (spray
drying).
Karakterisasi Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Pengujian yang dillakukan untuk ektrak terenkapsulasi nanokitosan pada
penelitian ini yaitu menentukan morfologi sampel dengan pengujian Scanning
Electron Microscopy (SEM), analisis pengukuran partikel sampel dengan
pengujian Particle Size Analyzer (PSA), dan analisis gugus fungsi sampel yang
dihasilkan dengan pengujian Fourier Transform Infrared (FTIR).
Pengujian PSA (Particle Size Analyzer) (Burgess et al. 2004)
Uji ukuran partikel dilakukan menggunakan pengujian PSA (Particle Size
Analyzer). Sampel larutan diambil dengan pipet kemudian dimasukkan ke dalam
tabung dengan tinggi maksimum 15 mm. Hasil pengujian akan muncul pada layar
komputer.
Pengujian SEM (Scanning Electron Microscopy) (Fujita et al. 1971)
Serbuk ekstrak terenkapsulasi nanokitosan diletakkan pada potongan
kuningan (stub) berdiameter 1 cm dengan menggunakan selotip dua sisi.
Kemudian serbuk tersebut dibuat menjadi konduktif dengan cara elektrik
menggunakan sinar dari platina lapis tipis (coating) selama 30 detik pada tekanan
dibawah 2 Pa dan tegangan elektron 10 kV dengan perbesaran 500x, 2500x, dan
5000x.
Pengujian FTIR (Fourier Transform Infrared) (Holme dan Peck 1993)
Sebanyak 2 mg serbuk ektrak terenkapsulasi nanokitosan dicampurkan
dengan 100 mg KBr untuk dibuat pellet dengan pencetak vakum. Pelet tersebut
dikenai sinar infra merah pada jangkauan bilangan gelombang 400-4000 cm-1.
Latar belakang penyerapan dihilangkan dengan cara pelet KBr dijadikan satu pada
setiap pengukuran.
6
Uji Fitokimia (Harbone 1987)
Pengujian komponen aktif terkandung dalam ekstrak ini dilakukan secara
kualitatif dengan metode uji fitokimia yang meliputi uji alkaloid, flavonoid,
saponin, steroid, fenol hidrokuinon, dan tanin.
1 Alkaloid
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan 4 tetes asam sulfat 2 N kemudian
diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer,
dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer
terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner,
dan endapan merah dengan pereaksi Dragendorff.
2 Flavonoid
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan serbuk magnesium 0,10 mg dan 0,40
mL amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume
yang sama), serta 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Warna merah,
kuning atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya
flavonoid.
3 Saponin
Saponin dideteksi dengan uji busa pada 1 mL ekstrak dalam air panas.
Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang setelah penambahan satu tetes
HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
4 Steroid
Sebanyak 1 mL ekstrak dilarutkan dalam 2 mL kloroform, 10 tetes anhidra
asetat, dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan berwarna merah yang terbentuk
untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru atau hijau menunjukkan reaksi
positif.
5 Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan dengan 20 mL etanol 70%. Larutan
yang dihasilkan diambil satu mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%.
Warna hijau atau hijau biru yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa fenol
dalam bahan.
6 Tanin
Sebanyak 1 mL ekstrak ditambahkan ke dalam 100 mL air panas
kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 mL filtrat
ditambahkan FeCl3 1%. Hasil positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman.
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)
Persiapan larva Artemia salina dilakukan dengan menetaskan telur larva
selama 48 jam sebelum dilakukan uji. Penetasan dilakukan dengan cara
merendam telur tersebut dalam air laut di dalam wadah yang diberi suplai oksigen
dari aerator dan diberi penerangan dengan lampu TL 20 Watt.
Pelaksanaan uji dilakukan dengan memasukkan larva ke dalam sumur uji
dengan tujuh kelompok perlakuan yang berisi larutan 50; 100; 500; dan 1000 ppm
dari ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi nanokitosan dengan pelarut air laut.
Masing-masing sumur uji berisi 10 ekor larva dan volume akhir setiap sumur
sebesar 2 mL. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan
selama 24 jam, selanjutnya dihitung jumlah larva yang mati. Nilai LC50 diperoleh
dengan cara menghitung menggunakan rumus y = a + bx. Nilai a dan b diperoleh
7
dengan perhitungan menggunakan rumus regresi linier berdasarkan data dari titik
konsentrasi yang digunakan. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi
larutan yang menyebabkan kematian terhadap 50% larva.
Uji Aktivitas Antihiperglikemia pada Hewan Coba Tikus secara In Vivo
(modifikasi Nugroho 2006)
Uji in vivo dilakukan dengan menggunakan tikus putih jantan sehat galur
Sprague Dawley, berumur 5 minggu dengan bobot 130-150 gram. Tikus dibagi
menjadi 2 kelompok utama yaitu pemberian larutan gula dan tidak diberikan
larutan gula (kontrol negatif/normal). Kelompok yang diberikan larutan gula
dibagi lagi menjadi 2 kelompok perlakuan yaitu pemberian larutan gula dan obat
komersil dan pemberian larutan gula dan ekstrak daun tapak dara terankapsulasi
nanokitosan. Pelakuan pemberian ekstrak tapak dara terenkapsulasi nanokitosan
dibedakan kembali berdasarkan dosis pemberian yaitu 5;10:15: dan 20 mg/g BB
tikus. Tikus diadaptasikan terlebih dahulu selama 8 hari untuk menyeragamkan
cara hidup dan makanannya.
Tikus pada masing-masing kelompok dipuasakan selama 18 jam, setelah
dipuasakan diambil darah pada masing-masing kelompok dan diukur kadar
glukosa darah puasanya. Tikus perlakukan selanjutnya dicekok sukrosa 80%
sebanyak 2 mL, kadar glukosa darah kembali diukur setelah satu jam pemberian
larutan sukrosa, sedangkan untuk kelompok kontrol negatif tikus diberikan pakan
untuk selanjutnya diperiksa kadar glukosa darah 2 jam setelah makan. Pelakuan
perlakuan dengan obat komersil selanjutnya diberikan obat komersil dan
perlakuan lainnya diberikan dosis ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan sesuai dengan dosis yaitu 5:10:15: dan 20 mg/ g bb tikus masingmasing sebanyak 2 mL pada setiap perlakuan. Kadar glukosa darah pada masingmasing kelompok perlakuan pemberian sukrosa selanjutnya diukur setelah 1, 2, 3,
4, dan 5 jam perlakuan pemberian dosis obat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Kulit udang atau cangkang kepiting dan rajungan merupakan penghasil
kitin dan kitosan. Bahan baku yang digunakan untuk mengolahnya tersedia dalam
jumlah yang cukup melimpah terutama kulit udang dan cangkang kepiting serta
rajungan. Kitosan merupakan modifikasi polimer karbohidrat alami yang diproses
melalui N-deasetilasi parsial kitin. Kitosan mempunyai kegunaan salah satunya
sebagai sarana penghantar obat dan gen serta biomaterial untuk imobilisasi.
Kitosan merupakan biopolimer alami menarik disebabkan adanya gugus amino
reaktif dan grup fungsional hidroksil. Kitosan memiliki karakteristik
biokompatibilitas yang diinginkan serta kemampuannya untuk meningkatkan
permeabilitas membran sehingga kitosan paling menjanjikan karena memiliki
kemampuan membentuk membran (Irianto dan Muljanah 2011). Modifikasi
kitosan secara fisik mencakup perubahan ukuran partikel atau butir kitosan
menjadi lebih kecil untuk pemanfaatan yang lebih luas. Pemanfaatan modifikasi
fisik menghasilkan ukuran nanopartikel (Wahyono 2010).
8
Nanopartikel memiliki sifat yang sangat spesifik, dengan luas permukaan
yang berlipat ganda dapat meningkatkan terjadinya reaksi kimia lebih banyak.
Suatu zat dapat diserap langsung pada aliran darah tempat zat tersebut dibutuhkan,
proses ini lebih efektif dibandingkan dipecah selama sistem pencernaan
berlangsung. Nanopartikel bersifat bioavailability yaitu ukurannya yang sangat
kecil lebih leluasa memasuki bagian-bagian tubuh sehingga nanopartikel akan
lebih mudah diserap oleh sel-sel secara individu (Winarno dan Fernandez 2010).
Metode paling umum dalam pembuatan nanopartikel yaitu dengan metode
gelasi ionik salah satunya menggunakan magnetic stirrer. Metode gelasi ionik
yaitu mencampurkan polimer kitosan dengan polianion sodium tripolifosfat yang
menghasilkan interaksi antara muatan positif pada gugus amino kitosan dengan
muatan tripolifosfat. Tripolifosfat dianggap sebagai zat pengikat silang yang
paling baik (Mohanraj dan Chen 2006).
Ukuran Partikel
Penggunaan nanopartikel dalam proses penyalutan dapat meningkatkan
absorsi zat-zat aktif. Proses nanoenkapsulasi berarti bahwa berbagai zat nutrisi
dapat diserap langsung pada aliran darah dimana nutrisi tersebut dibutuhkan, hal
ini akan jauh lebih efektif dibandingkan dipecah selama pemrosesan atau pun
pemecahan dengan enzim dalam sistem pencernaan. Mekanisme baru dapat
dikembangakan dengan nanoteknologi dalam masalah penyampaian obat.
Landasan yang digunakan pada drug delivery system adalah merangsang
efektivitas dari obat, melalui penentuan target dan sel-sel khusus yang spesifik,
percepatan waktu delivery, dan pencegahan enzim pencernaan dalam memecah
obat yang sedang dikonsumsi (Winarno dan Fernandez 2010).
Perhitungan partikel secara modern umumnya menggunakan analisis
gambar atau beberapa jenis perhitungan partikel seperti analisis Particle Size
Analyzer (PSA). Hasil rata-rata distribusi ukuran partikel dengan metode gelasi
ionik diperoleh ukuran nanokitosan yaitu 273,36 nm. Ekstrak daun tapak dara
memiliki ukuran partikel 278,54 nm sedangkan ekstrak-nanokitosan memiliki
ukuran 381,98 nm. Menurut Mohanraj dan Chen (2006) nanopartikel
didefinisikan sebagai partikel yang berbentuk padat dengan ukuran 10-1000 nm.
Partikel dengan ukuran lebih kecil dari 300 nm dapat menembus dengan sangat
mudah dan masuk kedalam sel-sel individu. Nanoteknologi dapat didefinisikan
sebagai kegiatan yang meliputi design, produksi, dan pemanfaatan struktur,
peralatan sistem dan material dengan cara pengendalian ukuran dan bentuk
material pada skala atom dan molekul dengan ukuran material kurang dari 300 nm
(Winarno dan Fernandez 2010).
Hasil yang didapatkan tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Gufron
(2013), hasil analisis PSA ukuran nanokitosan yang diperoleh yaitu 259,22 nm
dan kitosan-metformin yaitu 351,46 nm. Ukuran kitosan tersebut menjadi lebih
besar setelah proses enkapsulasi dan menunjukkan proses enkapsulasi berhasil
dilihat dari morfologi pada hasil SEM serta gugus fungsi pada FTIR yang
menunjukan terdapat 2 gugus fungsi spesifik kitosan dan senyawa obat. Menurut
Rachmania (2011), pengecilan ukuran dengan magnetic stirrer dengan kecepatan
tinggi akan menyamaratakan energi yang diterima oleh partikel hampir diseluruh
bagian sisi larutan sehingga ukuran partikel semakin homogen untuk waktu
tertentu. Perbedaan waktu proses sizing, aktivitas bahan emulsifier serta bahan
9
stabilizer dapat mempengaruhi variasi ukuran partikel hingga ukuran partikel
yang dihasilkan tidak homogen tetapi ukurannya cukup memenuhi standar
nanopartikel.
Morfologi Ekstrak Terenkapsulasi Nanokitosan
Morfologi ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi nanokitosan dapat
dibedakan secara visual dengan menggunakan analisis SEM (Scanning Electron
Microscopy). Analisis SEM memiliki fungsi untuk mengidentifikasi morfologi
permukaan, bentuk dan ukuran sampel yang ditampilkan dalam sebuah gambar.
Foto SEM didapatkan dengan cara menghitung perbandingan jumlah partikel
berukuran nano terhadap seluruh partikel baik berukuran nano maupun mikro
dalam satu foto SEM tersebut (Wahyono 2010). Hasil analisis SEM dapat dilihat
pada Gambar 2.
c
c
a
b
c
Gambar 2 Hasil SEM ekstrak terenkapsulasi nanokitosan (a) pembesaran 2500x,
(b) pembesaran 5000,dan (c) nanokitosan (Rachmania 2011)
Hasil karakterisasi SEM pada pembesaran 2500-5000x memperlihatkan
morfologi permukaan dan bentuk ekstrak terenkapsulasi nanokitosan (Gambar 2a
dan 2b). Enkapsulasi merupakan salah satu cara penyalutan dalam mengendalikan
laju pelepasan senyawa yang disalutnya (Gufron 2013). Ukuran partikel
nanokitosan yang bervariasi tetapi masih dalam ukuran nanopartikel. Ekstrak
tersalut nanokitosan melalui kondisi enkapsulasi yaitu menempel dipermukaan
kitosan (teradsopsi) (Gambar 2a dan 2b). Menurut Tiyaboonchai (2003) Ekstrak
dapat tersalut nanokitosan melalui 2 kondisi enkapsulasi yaitu masuk kedalam
matriks nanokitosan (terjebak) dan menempel dipermukaan kitosan (teradsopsi).
Gambar 3 Penyalutan obat di dalam nanopartikel kitosan (Tiyaboonchai 2003)
Ukuran partikel yang tidak seragam karena bahan yang tersalutnya juga
tidak seragam tetapi masih dalam ukuran nanopartikel, pensalut menempel di
permukaan nanokitosan sehingga dikatakan bahwa proses enkapsulasi berjalan
dengan baik. Ekstrak mempunyai variasi ukuran partikel kurang homogen, sesuai
dengan hasil PSA rata-rata yaitu ukuran ekstrak lebih besar daripada rata-rata
ukuran nanokitosan hingga menyebabkan ekstrak tersalut pada permukaan
10
nanokitosan. Rachmania (2011) menyatakan bahwa nanopartikel kitosan yang
diperoleh dengan menggunakan magnetic stirrer menghasilkan penyebaran energi
cenderung merata sehingga dalam waktu tertentu distribusi ukuran partikel dapat
lebih homogen serta memiliki morfologi berbentuk bulat (Gambar 2c). Wahyono
(2010) menyatakan bahwa nanopartikel kitosan kosong memiliki bentuk yang
keriput dan kempes, sedangkan nanokitosan terisi ketoprofen memiliki bentuk
bulat utuh.
Kelompok Gugus Fungsi
Analisis Fourier Transform Infrared (FTIR) adalah salah satu analisis
yang digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa. Analisis FTIR pada
ekstrak kasar dari tanaman dapat memberikan informasi tentang distribusi
kelompok-kelompok fungsional dan memberikan dasar untuk membandingkan
perbedaan komposisi antara isolat. FTIR merupakan analisis yang paling baik
untuk mengidentifikasi jenis ikatan kimia. Panjang gelombang tertentu merupakan
karakteristik dari ikatan kimia molekul yang dapat dilihat pada energi yang
diserap spektrum inframerah. Bilangan gelombang yang digunakan untuk
senyawa organik maupun senyawa polimer yaitu 400-4000 cm-1 (Shalini dan
Prema 2012). Analisis data FTIR dilakukan menggunakan software IR Pal V2.0. A
Tabledriven Infrared Application. Hasil analisis Fourier Transform Infrared
(FTIR) pada ekstrak daun tapak dara dan ektrak tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan disajikan pada Gambar 4 dan Gambar 5.
Gambar 4 Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara
Kurva transmitan hasil FTIR menunjukkan profil kimiawi berupa pola
spektrum. Pada ekstrak daun tapak dara, spektrum inframerah menunjukkan
puncak serapan kuat pada bilangan-bilangan gelombang berikut adalah gugus
fungsi hidroksil (-OH) pada 3425 cm-1, gugus metil (C-H) pada 2939 cm-1, asam
karboksilat (C-O) pada 1404 cm-1, gugus metil lainnya (CH3) pada bilangan
gelombang 1265-1257 cm-1, dan alkil halida (C-Br) pada 594 cm-1. Hasil pola
spektrum ini sesuai dengan penelitian Shalini dan Perma (2012) yang menyatakan
bahwa pada daun C. roseus, spektrum yang menunjukkan penyerapan kuat ada
pada 3394, 2929, 2864, 1622, 1069, dan 596 cm-1 yang menunjukkan kelompok
11
gugus fungsi alkohol (-OH), asam karboksilat (C-O), alkana (C-H), alkena, amina,
aromatik, amina alifatik, ester dan alkil halida (C-Br).
Gambar 5 Spektrum hasil uji FTIR pada ekstrak daun tapak dara terenkapsulasi
nanokitosan
Pada kurva transmitan hasil ekstrak terenkapsulasi nanokitosan
menunjukkan puncak serapan kuat pada bilangan gelombang 3418 cm-1 gugus
fungsi hidroksil (-OH), 2932 cm-1 gugus metil (C-H), 1643 cm-1 (NH), 1566 cm-1
(C=C), 1412 cm-1 (C-C), 1257 cm-1 (C-O), 617 cm-1 metil (C-H) dan 586 cm-1 alkil
halida (C-Br). Spektum inframerah pada ekstrak terenkapsulasi nanokitosan
menunjukkan gabungan gugus fungsi spesifik pada nanokitosan yaitu (NH) dan
gugus fungsi ekstrak yang lebih dominan menunjukan gugus fungsi yang sama
pada ekstrak daun tapak dara (Gambar 4). Penelitian Gufron (2013) menyatakan
bahwa nanokitosan memiliki gugus fungsi spesifik yaitu gugus fungsi amina (NH)
pada bilangan gelombang 1643 cm-1 dan gugus fungsi hidroksil (-OH) pada
bilangan gelombang 3410 cm-1. Perubahan frekuensi serapan untuk gugus fungsi
tertentu dipengaruhi oleh substituen tertentu yang berubah yang disebabkan oleh
adanya reaksi tertentu sehingga kekuatan ikatan akan berubah. Serapan gugus
fungsi yang mengalami perubahan menunjukan bahwa terdapat air atau (-OH)
yang mungkin terserap sehingga mempengaruhi ikatan antara molekul yang
menyebabkan perbedaan daerah serapan gugus fungsi spesifik pada sampel uji
(Pebrian et al. 2012).
Toksisitas Nanokitosan dan Ekstrak Terenkapsulasi
Salah satu metode awal yang sering digunakan untuk pengujian toksisitas
senyawa aktif terutama yang berasal dari tanaman adalah Brine Shrimp Lethality
Test (BSLT). Metode ini bertujuan untuk melihat tingkat mortalitas larva udang
yang disebabkan oleh ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dari pengujian toksisitas
dihitung sebagai nilai LC50 (Lethal Concentration) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis
12
atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang
sejumlah 50% setelah masa inkubasi selama 24 jam (Lisdawati et al. 2006). Hasil
uji toksisitas menunjukkan beban konsentrasi dalam media dapat membunuh larva
udang ditunjukan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil uji toksisitas nanokitosan, ekstrak daun tapak dara dan ekstrak
terenkapsulasi nanokitosan
Sampel (ppm)
Ekstrak
Nanokitosan
Ekstrak-nanokitosan
Mortalitas (%)
50
100
3,33
3,33
3,33
13,33
10
23,33
500
23,33
53,33
63,33
1000
63,33
63,33
83,33
LC50
(ppm)
842,50
683,64
464,13
Kategori
Toksik rendah
Toksik rendah
Toksik rendah
Pengujian dilakukan pada ekstrak, nanokitosan, dan ekstrak terenkapsulasi
nanokitosan dengan konsentrasi yaitu 50, 100, 500, dan 1000 ppm. Hasil uji
toksisitas pada Tabel 3 menunjukkan LC50 pada ekstrak daun tapak dara yaitu
842,50 ppm dan pada nanokitosan diperoleh LC50 sebesar 683,64. Ekstrak yang
telah melalui proses enkapsulasi dengan nanokitosan memiliki nilai LC50 yaitu
464,13 ppm. Berdasarkan McLaughlin et al. (1998), senyawa dengan nilai
toksisitas LC50 ≤ 30 ppm dinyatakan sangat toksik, LC50 antara 31-200 ppm
dinyatakan toksik, LC50 antara 201-1000 ppm dinyatakan toksik rendah, dan nilai
LC50 >1000 ppm dinyatakan tidak toksik. Hal ini menunjukkan bahwa toksisitas
ekstrak terenkapsulasi nanokitosan termasuk rendah yaitu dengan nilai LC50 yaitu
464,13 ppm. Winarno dan Fernandez (2010) menyatakan bahwa semakin tinggi
daya reaktivitas dan bioavailability yang bersifat positif dari nanomaterial
kemungkinan juga dapat berakibat meningkatnya daya toksisitas yang lebih besar
dari nanomaterial dibandingkan dengan materi yang sama tetapi dengan ukuran
besar.
Tamat et al. (2007) memaparkan bahwa apabila ekstrak tersebut termasuk
golongan tidak toksik maka kemungkinan dapat dikembangkan penggunaannya
untuk tujuan yang luas, diantaranya sebagai makanan suplemen atau bahan baku
kosmetik, sedangkan apabila ekstrak tersebut termasuk golongan toksik maka
kemungkinan penggunaannya dapat dikembangkan untuk bahan baku obat. Suatu
ekstrak menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam pengujian toksisitas, apabila
ekstrak tersebut memiliki nilai LC50