Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005
USU Repository ©2006
IV. METODE PENELITIAN Pengambilan Contoh
Contoh diambil dari berbagai habitat. Untuk bakteri tanah, contoh diambil di permukaan tanah, rizosfer, atau lumpur perairan. Untuk bakteri pada tumbuhan diambil di lubang
tampungan air di pohon atau dalam tumbuhan pemakan serangga Nephentes sp.. Sampai saat ini telah diperoleh isolat bakteri kitinase dari tanah pertanian, tanah lumpur, dan lubang
tampungan air di pohon. Pengambilan contoh tanah, tumbuhan, dan air seperti dari hutan Taman Nasional Gunung Leuser TNGL Tangkahan Langkat dan Taman Nasional Batang
Gadis Madina telah dilakukan. Pekerjaan isolasi sampai saat ini tetap masih dilakukan
Penapisan Bakteri Penghasil Kitinase
Bakteri kitinolitik biasa dijejak dengan pembentukan zona bening pada medium kitin atau dengan melihat kemampuan hidrolisis pada subtrat fluorogenik analog kitin Cotrell et al.
1999. Dalam penelitian ini mikroba kitinolitik ditapis dengan menggunakan medium mengandung kitin. Mikroba diisolasi dari contoh dengan menggunakan medium garam
koloidal kitin disesuaikan dengan kondis lingkungan kadar garam dan pH dari mana isolat berasa. Pembentukan halo di sekitar koloni sebagai hasil degradasi kitin dievaluasi. Nilai
aktivitas hidrolisis secara kualitatif diperoleh dengan membagi diameter zona hidrolisis di sekitar koloni dengan besarnya diameter koloni isolat pada hari ke-4 96 jam setelah inkubasi
Widhyastuti and Dewi, 2001. Aktivitas enzim kasar kultur bebas sel ditentukan dengan menggunakan substrat koloidal kitin. Aktivitas khitinase dihitung berdasarkan selisih antara
kadar N-asetil glukosamin GlcNAc yang dibebaskan pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak diperlakukan kontrol. GlcNAc yang dihasilkan
dianalisis secara kolorimetri dengan metode Reissig 1955 dalam Jeaniaux 1966. Penampakan Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Penghasil Kitinase
Karakterisasi sifat morfoJogi mencakup bentuk dan warna koloni, motilitas, bentuk sel, dan sifat gram. Motilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat sulfide indole
motility SIM. Pewarnaan Gram dengan menggunakan kristal violet dan safranin digunakan untuk menentukan sifat gram. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat dengan medium
Simmons Citrate agar, uji gelatin dengan medium nutrien gelatin, dan uji katalase dengan 10
Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005
USU Repository ©2006
menggunakan larutan 3 H
2
O
2
Cappuccino and Sherman, 1983.
Pengukuran Aktivitas Kitinase Kasar
Kitinase kasar diperoleh dari kultur 96 jam Pleban et al., 1997. Kitinase kasar dari masing-masing Isolat dan substrat kitin 1 koloidal kitin bv dalam 50 mM buffer fosfat,
pH 6,8 dicampur dengan volume yang sama dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan memanaskan campuran dalam air mendidih selama 15 menit dan
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Aktivitas khitinase dihitung berdasarkan selisih antara kadar N-asetil glukosamin GlcNAc yang dibebaskan
pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak diperlakukan kontrol. GlcNAc yang dihasilkan dianalisis secara kolorimetri dengan metode
Reissig 1955 dalam Jeaniaux 1966. Satu unit aktivitas kitinase didefenisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan sebanyak 1 mol GlcNAcjam pada kondisi tertentu Singh
et al., 1999.
Uji Penghambatan Pertumbuhan Beberapa Jamur Patogen Tanaman
Hifa jamur Fusarium semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum yang ditumbuhkan dalam media nutrien broth yang ditambah dengan 3 potato dextrose agar
diambil seukuran 0.5x0.5 em, kemudian dikulturkan dalam media garam kitin. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar 28°C selama 2 hari. Setelah jamur terlihat tumbuh kira-kira 0.5
cm dari hifa-terluar digores lurus bakteri kitinolitik dari hasil isolasi. Pengamatan dilakukan dengan melihat ada tidaknya zona hambat pertumbuhan setelah diinkubasi selama 2 hari.
Ekstraksi DNA
DNA genom total dari bakteri terkulturkan akan diekstraksi sebagai yang digambarkan oleh Sambrook et al. 1989.
11
Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005
USU Repository ©2006
Melihat Keragaman Genetik Bakteri Penghasil Kitinase Melalui Gen 168 rRNA
Amplifikasi gen 16S-rRNA dilakukan dengan primer 63f dan 1387r Marchesi et al., 1998 menggunakan Ready- To-GO PCR Beads Pharmacia-Biotech, Uppsala, Sweden. DNA
yang teramplifikasi akan diklon pada pGEM-T dan ditransfer dalam E. coli DH5 g
menggunakan metode yang digambarkan oleh Sambrook et al. 1989. Analisis Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang
dilakukan oleh Desiliyarni et al. 1999 dengan elekroforesis minigel. Hubungan kekerabatan antar isolat dianalisis dengan program komputer Treecon Van de Peer and De Wachter 1994.
Isolat dengan pola pita yang berbeda digunakan untuk analisis selanjutnya.
Hambatan Dalam Pekerjaan
Sangat terlambatnya pencairan dana penelitian menyebabkan berubahnya beberapa rencana pekerjaan dalam hal metode dan waktu pelaksanaan. Dana penelitian baru diterima
peneliti tanggal 13 September 2005, sedang laporan kemajuan harus diserahkan ke LP USU paling lambat tanggal 20 September 2005. Namun demikian perubahan rencana pekerjaan dan
jadwal tidak merubah keseluruhan ini dari penelitian ini. Diharapkan sekali untuk tahun-tahun berikutnya dana penelitian dapat diterima peneliti secepat mungkin.
Seberapa pekerjaan dalam metode yang berubah mencakup tidak digunakannya substrat p-nitrophenyl-N-acetyl- -D-glucosamine pNP-GlcNAc dan p-nitrophenyl- -D-
N,N,N-triacetylchitotriose [pNP-GlcNAc
3
seperti yang dilakukan Folders et al. 2001 untuk mengukur aktivitas eksokitinase dan endokitinase. Dalam tahap pengerjaan Saat ini
dilakukan uji penghambatan pertumbuhan terhadap jamur patogen tanaman seperti Fusarium semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum yang merupakan jamur-jamur
penyebab penyakit. Pekerjaan analisis genom yang dijadwalkan tengah JuliAgustus terpaksa ditunda dan dijadwal ulang, karena pekerjaan ini melibatkan institusi lain yaitu RCMD,
Fakultas MIPA, IPS. Pekerjaan identifikasi dan uji aktivitas kitinase tetap dilakukan pada isolat-isolat yang baru didapat.
12
Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005
USU Repository ©2006
V. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Kitinolitik
