Isolasi Bakteri Penghasil Lipase Termofilik Kloning Dan Ekspresi Gen Penyandi Lipase.

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL LIPASE TERMOFILIK
KLONING DAN EKSPRESI GEN PENYANDI LIPASE

ALBERT SEMBIRING

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi Bakteri Penghasil
Lipase Termofilik Kloning dan Ekspresi Gen Penyandi Lipase adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Oktober 2015
Albert Sembiring
NIM P051130071

RINGKASAN
ALBERT SEMBIRING. Isolasi Bakteri Penghasil Lipase Termofilik Kloning dan
Ekspresi Gen Penyandi Lipase. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan
NISA RACHMANIA MUBARIK.
Bakteri termofil merupakan kelompok bakteri yang dapat tumbuh optimal
pada suhu 70-80oC. Enzim lipase yang berasal dari bakteri ini memiliki ketahanan
terhadap denaturan kimia seperti detergen, agen chaotropic (urea, guanidinium
chloride), pelarut organik dan pH ekstrem, sehingga cukup menjanjikan hasil yang
maksimal untuk digunakan dalam proses industri. Lipase (triacyl glycerol
acylhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan kelompok enzim kelas hidrolase yang
mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan ester pada rantai panjang asam lemak
(trigliserida) menjadi gliserol dan asam lemak bebas pada permukaan air dengan
minyak. Selain itu lipase mendapat perhatian khusus karena keunikannya yaitu pada
kondisi yang sedikit air (micro-aqueous) mampu mengkatalisis reaksi esterifikasi,
trans-esterifikasi, aminolisis dan asidolisis. Tujuan penelitian ini ialah melakukan
isolasi bakteri termofilik penghasil lipase; identifikasi dari isolat terpilih; kloning

dan ekspresi gen lipase dari isolat terpilih yang berasal dari sumber air panas geiser
di Cisolok, Sukabumi, Jawa Barat yang suhunya dapat mencapai 95oC.
Bakteri termofil yang diisolasi dari sumber air panas geiser, Sukabumi, Jawa
Barat, Indonesia yang memiliki pH 8 dan suhu mencapai 95oC menggunakan
metode pengenceran bertingkat yang disebar pada media padat Luria Bertani
Rhodamine B. Bakteri termofil ini memiliki kemampuan menghasilkan lipase
secara ekstraseluler yang ditunjukkan dengan terjadinya pendaran orange bila
diamati di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 350 nm. Isolat yang
diperoleh diukur kemampuannya dalam menghasilkan lipase dengan metode titrasi.
Isolat bakteri termofilik S4-01 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 3.91 U menit-1
yang dipilih untuk dilakukan uji selanjutnya. Identifikasi bakteri dilakukan secara
molekuler dengan metode 16S rRNA, hasil sekuensing parsial gen 16S rRNA
menunjukkan isolat ini berkerabat paling dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens.
Gen lipase yang berasal dari isolat S4-01 diisolasi dengan primer BamyKpnI-F dan
BamyNotI-R yang didesain berdasarkan gen yang diambil dari genebank
ncbi.nih.nlm.gov. Hasil isolasi menunjukkan gen lipase memiliki panjang 645 pb
dan telah berhasil dikloning ke dalam vektor p-GEMT-Easy pada E. coli TOP10
dengan metode heat shock. Untuk ekspresi gen lipase dilakukan pada vektor
ekspresi pET15-by dalam inang E. coli BL21(DE3) pLyss. Produksi lipase
rekombinan dilakukan dengan induksi 0.5 mM IPTG pada nilai 0.5-0.6 OD600nm.

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan metode 4-para nitrofenil palmitat
(pNPP) dan pH optimum menggunakan metode 4-para nitrofenil oktanoat (pNPC).
Hasil uji menunjukkan lipase rekombinan ini memiliki suhu dan pH optimum pada
40oC dan pH 8. Pengujian terhadap pelarut organik dengan metode pNPP
menunjukkan bahwa lipase rekombinan toleran terhadap n-heksan dan substrat
nitrofenil ester dilakukan dengan metode pNPP dan pNPC yang menunjukkan
lipase rekombinan lebih suka terhadap substrat C6 (heksanoat) dan C14 (miristat).
Kata kunci: Bakteri termofil, Bacillus amyloliquefaciens, Gen lipase, Kloning,
Ekspresi.

SUMMARY
ALBERT SEMBIRING. Isolation of A Lipolytic Thermophilic Bacterium Cloning
and Expressing Lipase Gene. Supervised by ANTONIUS SUWANTO and NISA
RACHMANIA MUBARIK
The optimum temperature for thermophile bacteria range between 70oC to
80oC. Most lipase from these bacteria are tolerant to detergent, chaotropic agent,
organic solvent, and extreme pH therefore give a guarantee for industrial
application. Lipase (triacyl glycerol acylhydrolase EC 3.1.1.3) is hydrolase enzyme
that able to catalyze the hydrolysis of ester bonds in long chain fatty acids
(triglycerides) into glycerol and free fatty acid over an oil-water interface. In

addition lipases can catalyze acidolysis, aminolysis, trans-esterification, and
esterification in micro-aqueous condition, which is very unique. The objectives of
this research were to isolate lipase producing thermophilic bacteria, clone and
express the lipase gene from selected isolate.
A thermophilic bacteria were spread on solidified Luria Bertani (LB)
containing Rhodamine B with serial dilution 10-1-10-5 from a hot spring Geyser
(95oC, pH 8), located in Sukabumi, West Java, Indonesia. The thermophilic bacteria
showed extracellular lipase acitivity as identified orange fluorescent halo under UV
light while they were grown on the Rhodamine B agar plate. Isolate producing
lipase was determined by titrimetric method. S4-01 demonstrated the highest lipase
activity 3.91 U ml-1 among other isolates and selected for the next test. Bacterial
identification uses 16S rRNA as marka moleculer. Based on partial sequencing of
16S rRNA gene, S4-01 was related to Bacillus amyloliquefaciens. Lipase gene from
S4-01 isolate, was isolated by a pair of oligonucleotide primers with restriction
enzyme were designed and named as BamyKpnI-F and BamyNotI-R, the reference
gene was taken from genebank ncbi.nih.nlm.gov. The lipase gene of S4-01 645 bp
long, was successfully isolated and cloned with heat shock methode into p-GEMTEasy vector on E. coli TOP10. For lipase expression was induced with 0.5 mM
isopropyl-β-ɒ-thiogalactopyranoside (IPTG) on E. coli BL21(DE3) pLyss when
OD600nm attained 0.5-0.6.
The effect temperature was investigated by evaluating lipase activity

towards 4-paranitrophenyl palmitate (pNPP) methode and the optimum pH was
determined by monitoring lipase activity towards 4-paranitrophenyl octanoate
(pNPC). The test showed that the optimum temperature and pH were at 40oC and
8 respectively. The enzyme was determined with pNPP methode in some organic
solvent and showed only tolerant to n-hexane. Substrate specificity assay was tested
with pNPP and pNPC methode, indicated that S4-01 lipase showed preference to
hexanoate (C6) or myristate (C14).
Keywords: Thermophilic bacteria, Bacillus amyloliquefaciens, Lipase gene,
Cloning, Expression.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL LIPASE TERMOFILIK

KLONING DAN EKSPRESI GEN PENYANDI LIPASE

ALBERT SEMBIRING

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, M.Si

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini berhasil diselesaikan. Tesis ini disusun

dalam rangka memenuhi persyaratan memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada: Prof. Dr. Ir.
Antonius Suwanto, M.Sc dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku komisi
pembimbing yang telah memberikan arahan dan masukan dalam penyusunan karya
ini. Ucapan terima kasih berturut-turut diasampaikan kepada; Prof. Dr. Ir.
Suharsono, selaku ketua program studi Bioteknologi; PT. Wilmar Benih Indonesia,
Cikarang yang telah memberikan fasilitas selama mengerjakan penelitian; Esti
Puspitasari Griselda Herman Natadiputri dan Andreas Adhi Satya Putra, selaku staf
R&D PT. Wilmar Benih Indonesia, Cikarang; dan seluruh staf laboratorium
Bioteknologi PT. Wilmar Benih Indonesia, Cikarang; Dirjen Pendidikan Tinggi
(DIKTI) Indonesia yang telah memberikan dana melalui beasiswa Pendidikan
Pasca Sarjana Dalam Negeri (BPPDN) 2013; Rekan-rekan Bioteknologi (BTK)
2013, khususnya Tira Siti Nur Afiah, Siti Nabila, Jekmal Malau, Retno Tri Astuti,
Arif Setiawan dan Natalia Lusianingsih Sumanto yang telah memberikan bantuan,
dukungan dan motivasi selama perkuliahan dan penelitian berlangsung; Kedua
orang tua, saudara-saudara, dan Nina Septania Damanik yang telah memberi
dukungan dan doa kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2015
Albert Sembiring

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

v

DAFTAR GAMBAR

v

DAFTAR LAMPIRAN

v

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian

Manfaat Penelitian

1
1
2
2
3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Termofilik
Struktur, Peranan, dan Mekanisme Lipase
Vektor

3
3
4
6

3 METODE
Waktu dan Tempat Peneitian

Bahan
Alat
Isolasi Bakteri Termofil Penghasil Lipase
Produksi Enzim Ekstrak Kasar Lipase
Pengukuran Aktivitas Enzim Ekstrak Kasar Lipase
Identifikasi Bakteri
Isolasi Gen Lipase
Kloning Gen Lipase
Ekspresi Gen Lipase pada E. coli BL21 (DE3) pLyss
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar Lipase

7
7
7
7
7
8
8
8
9

9
9
10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri dan Pengukuran Aktivitas Lipase Termofilik
Identifikasi Bakteri
Isolasi, Kloning, dan Analisis Sekuen Gen Penyandi Lipase
Ekspresi Lipase Rekombinan
Karakterisasi Lipase Rekombinan
Pembahasan

11
11
11
12
14
16
18

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

22
22
22

DAFTAR PUSTAKA

23

LAMPIRAN

27

RIWAYAT HIDUP

31

DAFTAR TABEL
1 Pengukuran aktivitas enzim lipase

11

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Skema pelipatan α/β hidrolase
Mekanisme katalitik lipase
Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA isolat S4-01
Konstruksi pohon filogenetik isolat S4-01 berdasarkan gen 16S rRNA
Hasil elektroforesis amplifikasi gen lipase isolat S4-01
Hasil konstruksi pGEM-Lip
Hasil PCR koloni seleksi bakteri transforman pGEM-Lip
Konstruksi pohon filogenetik gen lipase isolat S4-01 berdasarkan urutan
asam amino
Prediksi triad katalitik lipase Ser110Asp166His189
Hasil pemotongan pGEM-Lip menggunakan KpnI dan NotI
Hasil konstruksi pET15by-Lip
Hasil PCR koloni seleksi bakteri transforman pET15by-Lip
Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase rekombinan
Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase rekombinan
Pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas lipase rekombinan
Pengaruh substrat p-nitrofenil ester terhadap aktivitas lipase rekombinan

4
6
12
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Sekuen nukleotida parsial gen 16S rRNA bakteri isolat S4-01
Sekuen nukleotida gen lipase bakteri isolat S4-01
Prediksi asam amino menggunakan software expasy
Kurva standar p-nitrofenil oktanoat (pNPC)
Kurva standar p-nitrofenil palmitat (pNPP)
Pengukuran aktivitas lipase terhadap suhu
Pengukuran aktivitas lipase terhadap pH
Pengukuran aktivitas lipase terhadap pelarut organik
Pengukuran aktivitas lipase terhadap substrat p-nitrofenil ester

27
27
28
28
28
29
29
29
30

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikrob berserta enzimnya seperti amilase, protease, dan lipase memiliki
peranan penting dalam proses industri. Lipase dari mikrob mendapat perhatian
khusus untuk dimanfaatkan dalam industri detergen, food additives, kesehatan,
bioremediasi dan bahan bakar ramah lingkungan (biodiesel) (Sangeetha et al. 2011)
karena memiliki kemampuan stabil terhadap pH dan temperatur yang ekstrem,
pelarut organik, substrat yang luas, serta selektivitas yang tinggi sebagai chemo,
regio dan enantio (Verma et al. 2012; Gupta et al. 2004) sebab proses industri
umumnya memerlukan temperatur tinggi yang memberikan keuntungan berupa
menurunkan viskositas dan kontaminasi, meningkatkan koefisien difusi, kelarutan
dan bioavaibility senyawa organik (Niehaus et al. 1999).
Bakteri memiliki relung (niche) hidup yang lebih luas karena dapat tumbuh
subur pada lingkungan ekstrem dibandingkan dengan mikrob lainnya (kapang,
khamir) sehingga dapat menjadi alternatif yang sangat menarik untuk dieksplor
lebih jauh dalam aplikasinya di industri. Ekstremofil merupakan kelompok bakteri
yang tumbuh subur pada lingkungan ekstrem dalam parameter fisiologi yang
meliputi tekanan, radiasi, temperatur, parameter geokimia (kekeringan, salinitas,
pH) atau bahkan secara biologis (keterbatasan nutrisi, predator dan kepadatan
populasi) (Rothschild dan Mancinelli 2001;Martinez et al. 2010). Bakteri termofil
merupakan kelompok bakteri yang dapat tumbuh optimal pada suhu 70-80oC dan
hipertermofil pada suhu 85-100oC atau lebih (Niehaus et al. 1999), lingkungan
eksotis ini biasanya terdapat pada berbagai macam geotermal dan daerah vulkanik
seperti deep-sea geothermal vents, fumarol, dan geiser (Walsh 2014). Kemampuan
bakteri tersebut untuk bertahan dalam kondisi seperti ini kemungkinan besar karena
hasil perkembangan novel biokimia dan metabolisme seluler yang termasuk enzim
di dalamnya (Kiran et al. 2014). Enzim lipase yang berasal dari bakteri ini memiliki
ketahanan terhadap denaturan kimia seperti detergen, agen chaotropic (urea,
guanidinium chloride), pelarut organik dan pH ekstrem (Martinez et al. 2010),
sehingga cukup menjanjikan hasil yang maksimal untuk digunakan dalam proses
industri.
Lipase (triacyl glycerol acylhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan kelompok
enzim kelas hidrolase yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan ester pada rantai
panjang asam lemak (trigliserida) menjadi gliserol dan asam lemak bebas pada
permukaan air dengan minyak (Helen et al. 2010). Selain itu lipase mendapat
perhatian khusus karena keunikannya yaitu pada kondisi yang sedikit air (microaqueous) mampu mengkatalisis reaksi esterifikasi, trans-esterifikasi, aminolisis dan
asidolisis (Joseph et al. 2008). Keunikan yang dimiliki lipase ini menjadikannya
teratas sebagai biokatalis dengan potensi yang telah terbukti berkontribusi dalam
menghasilkan milyaran dolar dalam pemanfaatan bioindustri teknologi lipid dan
telah digunakan juga dalam metabolisme lipid secara in situ dan berbagai peranan
dalam aplikasi di industri secara ex situ (Jaeger dan Eggert 2002).
Proses industri yang dikatalisis oleh lipase memiliki beberapa keuntungan
yaitu lebih ramah lingkungan dibandingkan dengan penggunaan bahan kimia,
menghasilkan produk dengan kualitas tinggi, kemudahan dalam pengembalian dan

2
penggunaan kembali lipase, memungkinkan dalam penggunaan proses yang
berkelanjutan (Hamid et al. 2003). Sebuah ciri khas utama dari lipase ialah memiliki
interfacial activation, walaupun setelah diidentifikasi terdapat beberapa lipase yang
tidak melakukan interfacial activation. Sisi aktif dari lipase mengandung sebuah
sisi katalitik triad yang terdiri dari Ser-His-Asp/Glu. Sebuah penutup menutupi sisi
aktif ini sehingga membuat pelarut dan substrat tidak dapat mencapainya. Penutup
ini terbuka pada saat ada proses interfacial activation yang membuat substrat lipid
dapat berikatan dengan sisi aktif (Zheng et al. 2010).
Secara khusus penggunaan enzim ini dilakukan untuk memproduksi
biodiesel melalui proses transesterifikasi. Lipase mengkatalisis transesterifikasi
antara lipid dengan rantai pendek alkohol yang menghasilkan ester dan gliserol
(Sangeetha et al. 2011). Produksi biodiesel memerlukan lingkungan yang sedikit
air sebab keberadaan air akan menghambat proses transesterifikasi sebaliknya
menginduksi hidrolisis minyak, keuntungan lipase dalam menghasilkan biodiesel
ialah reaksi dapat berjalan dalam kondisi mild (dingin), menggunakan energi yang
lebih sedikit dan mudah mengembalikan gliserol dari biodiesel (Bajaj et al. 2010).
Dengan demikian enzim lipase termofilik merupakan pilihan yang potensial
untuk meningkatkan proses industri. Namun terdapat kendala lain bahwa lipase
yang dihasilkan oleh bakteri termofil umumnya dalam jumlah yang sedikit,
sehingga diperlukan cara untuk meningkatkan produksi enzim sampai pada level
tertinggi dengan melakukan kloning dan ekspresi gen lipase termofilik ke dalam
berbagai host mesofilik yang sesuai. Beberapa penelitian telah berhasil
melakukannya seperti pada Geobacillus thermoleovorans (Fattah dan Gaballa
2008), Geobacillus sp. (Tayyab et al. 2010), Geobacillus stearothermophillus
(Apituley 2012), Bacillus subtilis (Emtenani et al. 2013), Bacillus
amyloliquefaciens (Cai et al. 2014). Dari penelitian ini diharapkan mendapat isolat
rekombinan yang potensial dalam penggunaan enzim lipase di bidang industri.
Perumusan Masalah
Sampai saat ini ketergantungan akan minyak bumi untuk digunakan sebagai
bahan bakar masih sangat tinggi, sementara itu cadangan minyak bumi semakin
menipis dan bersifat tidak dapat diperbarui selain itu hasil pembakarannya
menyebabkan polusi udara dan pemanasan bumi, oleh karena itu diperlukan
produksi energi terbarukan, seperti biodiesel, dengan menggunakan enzim lipase
yang ramah lingkungan dan bersifat biodegradable dibandingkan penggunaan
bahan kimia.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini ialah melakukan isolasi bakteri termofilik penghasil
lipase; identifikasi dari isolat terpilih; kloning dan ekspresi gen lipase dari isolat
terpilih yang berasal dari sumber air panas geiser di Cisolok, Sukabumi, Jawa Barat
yang suhunya dapat mencapai 95oC.

Manfaat Penelitian
Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini antara lain isolat bakteri
rekombinan penghasil lipase dapat dimanfaatkan secara khusus untuk produksi
biodiesel, serta sebagai sumber informasi yang berkaitan dengan gen penyandi
lipase yang berasal dari bakteri termofil.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Termofilik
Termofilik adalah kelompok organisme yang dapat tumbuh subur pada suhu
yang tinggi. Kelompok organisme yang dapat tumbuh optimal pada suhu di atas
45oC disebut dengan termofilik sedangkan organisme yang tumbuh optimal lebih
dari 80oC disebut hipertermofilik (Madigan et al. 2011). Daerah dengan suhu yang
demikian tinggi biasa dijumpai pada berbagai macam habitat panas bumi seperti
geothermal vents, sumber mata air panas, fumarol, kawah gunung berapi dan geiser
(Walsh 2014). Hasil studi terhadap spesies yang tersebar di alam terhadap tingkatan
suhu serta pengujian pada berbagai habitat sumber air panas dengan suhu yang
berbeda-beda menyimpulkan bahwa prokariot dapat tumbuh subur pada suhu yang
jauh lebih tinggi dibandingkan dengan eukariot sehingga disebut dengan bakteri
termofil dan hipertermofil. Bakteri termofil dari kelompok bakteri fototropik terdiri
atas sianobakter, bakteri hijau dan ungu, kelompok eubakteria yaitu Bacillus,
Clostridium, Thiobacillus, Thermus, Actinomycetes dan genus lainnya. Kelompok
arkea berasal dari genus Pyrococcus, Thermococcus, Thermoplasma, Sulfolobus
dan Metanogen (Madigan et al. 2011; Rothschild dan Macinelli 2001).
Bakteri termofil dan hipertermofil menjadi sangat menarik tidak hanya
untuk alasan biologi semata tetapi karena menawarkan beberapa keuntungan dalam
proses industri sebab banyak proses industri yang dapat berjalan lebih efisien pada
suhu tinggi. Keuntungan yang ditawarkan tidak terlepas dari mekanisme bakteri ini
untuk dapat bertahan pada kondisi suhu lingkungan yang ekstrem. Mekanisme
tersebut meliputi perkembangan lipid pada membran sel dan kestabilan protein
(Zeikus 1979; Kumar dan Nussinov 2001).
Pemahaman struktur dan fungsi membran secara biologis telah menjadi fokus
yang menarik dalam mempelajari perbedaan komponen lipid pada organisme
temofilik. Lipid pada membran organisme ini mempunyai rantai hidrokarbon yang
lebih jenuh (tidak bercabang) dibandingkan dengan mesofilik (Zeikus 1979). Hal
ini membuat fluiditas membran berfungsi dengan baik sehingga bakteri termofil
mampu tumbuh pada suhu yang lebih tinggi. Pada arkaea membrannya memiliki
rantai isoprenoid yang berfungsi pada rentang suhu 0-100oC dan tidak memerlukan
regulasi adaptasi lipid terhadap perubahan lingkungan (Marieke et al. 1994).
Sementara itu membran bakteri terdiri dari lipid dengan ikatan ester yang dapat
digunakan baik pada suhu yang rendah atau tinggi karena mampu meregulasi
mekanisme fase permeabilitas rendah dan kristal cair sehingga toleran terhadap
suhu tinggi, mekanisme regulasi komposisi lipid ini memungkinkan mereka untuk
hidup pada kondisi rentang suhu yang lebih luas (Mansilla et al. 2004). Hal ini
dipertegas dengan penelitian sebelumnya bahwa baik mesofil dan termofil mampu

4
mengubah komponen spesifik asam lemak mereka agar tetap memiliki viskositas
membran yang stabil sebagai respon terhadap perubahan suhu yang disebut dengan
homeoviscous adaptation (Sinensky 1974).
Mekanisme yang tidak kalah pentingnya ialah kemampuan protein dan
enzim untuk dapat bertahan pada kondisi yang demikian esktrem. Hasil beberapa
studi menunjukkan bahwa terdapat sedikit perbedaan urutan asam amino pada
enzim, yang mengkatalisis reaksi yang sama pada bakteri mesofil. Hal ini
menjelaskan bahwa pergantian residu asam amino penting pada lokasi tertentu
mampu membuat pelipatan enzim menjadi tahan panas (Madigan et al. 2011). Hasil
penelitian menjelaskan bahwa terdapat beberapa mekanisme yang bekontribusi
dalam enzim termostabil yaitu terdapatnya interaksi van der walls, inti enzim
bersifat lebih hidrofobik, susunan tambahan ikatan hidrogen, peningkatan struktur
sekunder (Berezovsky dan Shakhnovich 2005), pengepakan atom yang lebih
kompak, peningkatan residu prolin pada daerah loop, konten heliks, area
permukaan yang bersifat polar dan pembentukan jembatan garam yang lebih baik
(Nussinov dan Kumar 2001). Hal ini menunjukkan bahwa interaksi dari berbagai
mekanisme tersebut terdapat pada struktur protein termostabil.
Struktur, Peranan, dan Mekanisme Lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases E.C. 3.1.1.3) merupakan enzim yang
tersebar luas di alam dan diproduksi oleh beberapa tanaman, hewan dan
mikroorganisme yang memiliki potensi cukup besar secara fisiologis dan industri
(Gupta et al. 2004). Lipase mengkatalisis reaksi hidrolisis trigliserida menjadi asam
lemak bebas dan gliserol yang menunjukkan aktivitas yang rendah terhadap substrat
yang larut dalam air (Sharma et al. 2001). Dalam kondisi yang sedikit air lipase
memiliki kemampuan yang unik karena dapat mengkatalisis reaksi esterifikasi,
alkoholisis dan asidolisis (Joseph et al. 2008), di samping lipolitik, lipase juga
mempunyai aktivitas esterolitik yang membuatnya memiliki jenis substrat yang
beragam, walaupun demikian sebagai katalis, lipase tetap memiliki selektifitas
kespesifikan kemo, regio dan enantio yang tinggi (Pandey et al. 1999).
Lipase merupakan serin hidrolase yang mengkatalisis reaksi bila terjadi
lipid-water interface. Triad katalitik lipase tersusun dari Ser-Asp/Glu-His yang
terdapat pada daerah di sekeliling sisi aktif serin, bentuk struktur tiga dimensinya
menunjukkan karakteristik pelipatan α/β hidrolase, serin residu biasanya terdapat
pada daerah lestari pentapeptida Gli-Xaa-Ser-Xaa-Gli (Arpigny dan Jaeger 1999).

Gambar 1 Skema pelipatan α/β hidrolase (Rahman et al. 2006).

5
Enzim lipolitik menjadi pusat perhatian karena potensinya dalam
pengaplikasian di bidang industri bioteknologi lipid. Saat ini enzim lipase yang
digunakan dalam industri detergen, lipid dan biodiesel sebagian besar berasal dari
mikroba terutama fungi dan bakteri (Gupta et al. 2004) karena biasanya lebih tahan
panas dibandingkan dari tanaman dan hewan. Bakteri penghasil lipase termostabil
ekstraseluler memiliki nilai komersial yang penting karena proses produksinya
mudah disamping kelebihannya toleran terhadap pelarut organik dan memiliki
aktivitas yang lebih besar pada suhu tinggi (Schmidt-Dannert et al. 1996). Proses
produksi yang berjalan pada suhu tinggi memberikan keuntungan seperti
mempercepat proses difusi, meningkatkan kelarutan lipid dan substrat hidrofobik
lainnya serta mengurangi resiko kontaminasi (Becker et al. 1997). Lipase memiliki
ciri khas yang dikenal dengan istilah interfacial activation yaitu suatu mekanisme
yang mana sisi aktif lipase akan terbuka ketika berinteraksi dengan substrat yang
memiliki kelarutan rendah terhadap air (Zhang et al. 2010).
Dengan berbagai fitur tersebut lipase sering digunakan pada berbagai jenis
industri yaitu
a. Industri makanan; terutama dalam produksi produk susu seperti keju,
modifikasi lemak dan minyak (misalnya perusahaan mentega, margarin,
minyak goreng baru), produksi makanan bayi dan lipid berstruktur unik
(mentega, coklat yang sehat, pengganti susu manusia, lemak berkalori rendah
atau tinggi, asam lemak tidak jenuh). Lipase juga digunakan sebagai emulsifier
pada perkembangan produk roti dan pasta serta sebagai bahan tambahan dalam
makanan hewan (Houde et al. 2004; Aloulou et al. 2007)
b. Detergen dan agen pembersih; karena sebagai bahan tambahan, lipase aktif dan
stabil pada suhu tinggi serta pH alkali, selain itu juga berperan dalam produksi
sabun, pembersih piring, larutan pembersih yang cepat kering dan kontak lensa
(Pandey et al. 1999; Hasan et al. 2006)
c. Bahan kimia berkualitas tinggi; dalam industri farmasi produksi enansiomer
murni melalui resolusi campuran rasemat (misalnya molekul kiral seperti
prostaglandin, sefalosporin, obat antiinflamasi nonsteroid, hidantoin dan
penisilin) (Jaeger dan Eggert 2002). Molekul kiral biasanya juga digunakan
sebagai herbisida dalam industri agrokimia. Lipase digunakan juga untuk
memproduksi aroma parfum, selain itu juga digunakan dalam produk perawatan
kulit sebagai pelembut dan pelembab dalam industri kosmetik dan parfum
(Casas-Godoy et al. 2012).
d. Industri kesehatan; lipase sebagai aplikasi alternatif dimanfaatkan untuk alat
diagnostik, karena keberadaan dan jumlah mereka dapat mengindikasikan
sebuah penyakit atau infeksi serta sebagai obat baru berfungsi mengobati
masalah pencernaan dan kadar kolesterol yang tinggi (Hasan et al. 2006).
e. Industri kertas dan bubur kertas: mengontrol penghilangan trigliserida dan lilin,
disamping meningkatkan keputihan dan mengurangi polusi dalam air limbah
(Casas-Godoy et al. 2012).
f. Proses bioremediasi; membantu degradasi air limbah yang kaya akan minyak,
sampah organik dan berbagai sampah industri lainnya (Hasan et al. 2006).
g. Industri energi; produksi pelumas, dan sebuah biokerosin dari sumber
terbarukan minyak hewani atau nabati lewat proses transesterifikasi. Lipase
juga digunakan untuk produksi bahan tambahan agar mengurangi viskositas
biodiesel (Jaeger dan Eggert 2002).

6
Mekanisme katalisis lipase terhadap substrat diawali dengan terjadinya
pembentukan oxyanion hole. Selama proses katalisis dihasilkan sebuah tetrahedral
intermediet yang distabilkan oleh ikatan hidrogen bersama dua asam amino yang
membentuk oxyanion hole, ikatan hidrogen ini terbentuk dari kelompok amida pada
enzim dan gugus karbonil oksigen pada substrat. Menurut Bezborodov dan
Zagustina (2014) jenis oxyanion hole yang terbentuk berperan penting terhadap
kespesifikan substrat lipase.
Katalisis dimulai dengan asilasi, tahap ini melibatkan transfer proton antara
residu aspartat, histidin dan serin pada triad katalitik sehingga hidroksil serin
diaktifkan. Proses ini meyebabkan nukleofil bersifat lebih reaktif yang membuat
gugus hidroksil serin menyerang gugus karbonil substrat. Tetrahedral intermediet
pertama yang terbentuk dengan muatan negatif pada oksigen dari gugus karboksil
distabilkan oleh oxyanion hole dengan distribusi muatan dan mengembalikan energi
tetrahedral melalui pembentukan minimal dua ikatan hidrogen (Bornscheuer 2002).
Selanjutnya komponen alkohol (R-OH) dilepaskan dari bagian intermediet
sedangkan bagian asam pada substrat tetap berikatan secara kovalen dengan residu
serin dalam enzim asetil intermediet (Casas-Godoy et al. 2012), tahapan deasetilasi
terjadi ketika nukleofil yang menyerang enzim menghasilkan produk dan terjadi
regenerasi enzim.

Gambar 2. Mekanisme katalitik lipase (Casas-Godoy et. al. 2012).

Vektor
Pengertian vektor dalam biologi molekuler mengacu pada molekul DNA
yang dapat melakukan replikasi dan membawa gen klon atau fragmen DNA.
Fragmen DNA tidak memiliki situs awal untuk memulai replikasi DNA sehingga
untuk dapat melakukan perbanyakan di dalam sel harus ditempatkan ke dalam
vektor yang memiliki situs awal replikasi (Weaver 2012). Umumnya vektor terdiri
dari dua jenis yaitu vektor kloning dan ekspresi. Vektor kloning digunakan untuk
menyimpan dan memperbanyak fragmen DNA sedangkan vektor ekspresi untuk
mengekspresikan gen target.
Fitur yang dibutuhkan dalam sebuah vektor yaitu: memiliki situs awal
replikasi DNA, penanda seleksi untuk membedakan sel yang tidak membawa dan
membawa vektor rekombinan, situs restriksi yang unik, ukuran yang sesuai,

7
penanda untuk gen yang tersisipi (misal gen lacZ), menghasilkan salinan vektor
dalam jumlah besar (Sambrook et al. 2001; Howe 2007). Vektor umum yang
digunakan dalam teknik biologi molekuler ialah plasmid. Perbedaan utama antara
plasmid untuk kloning dengan plasmid ekspresi ialah keberadaan promoter. Contoh
plasmid kloning ialah pGEMT-Easy yang menggunakan prinsip TA kloning
sedangkan contoh plasmid ekspresi yang banyak digunakan ialah pET. Sistem
ekspresi pET sering digunakan karena menyediakan enam kemungkinan kombinasi
vektor dengan inang untuk dapat mengatur ekspresi gen target secara optimal.
Sistem ini dibutuhkan karena setiap ekspresi protein target membutuhkan kondisi
yang berbeda-beda (Studier et al. 1990).

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2014-Mei 2015 di
Laboratorium Bioteknologi PT. Wilmar Benih Indonesia, Cikarang, Bekasi.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu media tumbuh
bakteri Luria Bertani (LB) yang mengandung natrium klorida, ekstrak khamir,
tripton, Rhodamine B, substrat p-nitrophenil ester (C2-C18), olive oil/minyak zaitun
(SIGMA), Escherichia coli TOP10 (Invitrogen), ampisilin, kanamisin, plasmid
pGEM-T Easy (Promega), pET15by, Isopropil β-D Tiogalatosida (IPTG), X-gal,
Agarosa, Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega), QiAquick PCR
purification kit (Qiagen), marka molekuler 100 pb DNA ladder (Vivantis), 1000 pb
DNA ladder (Promega) PCR Go Taq Green Master Mix (Promega), enzim T4 ligase
(New England Biolabs).
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah botol falkon steril, mesin
PCR BIORAD Thermal Cycler C1000, sentrifus (sorval biofuge primo R), neraca
analitik, spektrofotometer (BIORAD), mikropipet, shaker, sequencer (AB Applied
Biosystems Hitachi 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis BIORAD,
software Geneious R7.
Isolasi Bakteri Termofil Penghasil Lipase
Sampel diperoleh dengan mengambil sedimen dan air hasil semburan geiser
(95o, pH 8) dengan botol falkon steril, lalu dimasukkan ke dalam cool box,
kemudian dibawa ke laboratorium. Isolasi bakteri penghasil lipase dilakukan
dengan menginokulasikan 1 ml air dan sedimen ke dalam media Basal Salt
Solution (BSM) (0.8 g L-1 K2HPO4; 0.6 g L-1 KH2PO4; 1 g L-1 (NH4)2SO4; 0.2 g
L-1 MgSO4·7H2O; 0.05 g L-1 CaC2·2H2O; 3 g L-1 NaCl dan 0.001 g L-1 FeCl3) yang
diberi 0.01% ekstrak khamir, kultur diinkubasi selama 48 jam pada inkubator

8
bergoyang dengan kecepatan agitasi 200 rpm 50oC. Setelah itu dilakukan
pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 dan disebar ke atas media agar-agar Luria
Bertani (LB) yang mengandung 1% natrium klorida, 1% tripton, 0.5% ekstrak
khamir, 1.5% agar-agar bakto 1% Rhodamine B, 1% minyak zaitun (Kouker dan
Jaeger 1987), Polivinil alkohol 2% (PVA)/minyak zaitun (3:1) dalam 500 ml, lalu
diinkubasi pada suhu 50oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh diamati di bawah
lampu UV dengan panjang gelombang 350 nm, jika dihasilkan pendaran berwarna
jingga mengindikasikan bahwa koloni mampu menghasilkan lipase.
Produksi Enzim Ekstrak Kasar Lipase
Proses produksi enzim ekstrak kasar diawali dengan pembuatan starter
(inokulum) dengan menginokulasikan bakteri sebanyak 1 lup ke dalam 10 ml media
LB cair (1% tripton, 1% natrium klorida, 0.5% ekstrak khamir) dan diinkubasi
menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan agitas 200 rpm pada suhu
50oC selama 24 jam, setelah itu diinokulasikan starter sebanyak 2% ke dalam 50 ml
media produksi yang mengandung (1% tripton, 1% natrium klorida, 0.5% ekstrak
khamir, 1% minyak zaitun), kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan
kecepatan agitasi 200 rpm pada suhu 50oC selama 24 jam. Hasil kultur selama 24
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm (jenis rotor 7591) selama 15
menit pada suhu 4oC lalu supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar
dipindahkan ke dalam tabung falkon untuk digunakan pada pengukuran aktivitas
enzim ekstrak kasar.
Pengukuran Aktivitas Enzim Ekstrak Kasar Lipase
Aktivitas enzim ekstrak kasar diukur menggunakan metode (Xu et al. 2002)
yang dimodifikasi dengan membuat 4 ml campuran PVA dan minyak zaitun (3:1),
kemudian ditambahkan 2 ml 0.1 M bufer natrium fosfat pH 7, 2.5 ml akuades, 0.5
ml 0.1 M CaCl2, 1 ml enzim ekstrak kasar, lalu diinkubasi selama 15 menit pada
inkubator bergoyang dengan kecepatan agitasi 200 rpm pada suhu 50oC. Setelah itu
reaksi dihentikan dengan menambahkan 10 ml etanol absolut 96%. Lalu campuran
ditetesi dengan 4 tetes fenolftalein dan dititrasi dengan 0.05 M NaOH. Setiap
pengukuran dilakukan dengan 4 kali pengulangan. Satu unit aktivitas lipase
didefinisikan dengan jumlah enzim yang menghasilkan 1 µmol asam lemak per
menit pada kondisi pengkuran aktivitas.
Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan dengan mengisolasi DNA genom bakteri
menggunakan wizard genomic DNA purification kit Promega. Amplifikasi 16S
rRNA dilakukan dengan 10 µl reaksi PCR yang mengandung 1 µl DNA genom, 5
µl GoTaq Green Master Mix (Promega), 1 µl primer 63F 1 µl 1387R (Marchesi et
al. 1998) dan 1 µl ddH2O. Kondisi PCR yang digunakan ialah pre denaturasi 95oC
3 menit, denaturasi 95oC 30 detik, penempelan 55oC 30 detik dan pemanjangan
72oC 1 menit yang dilakukan sebanyak 30 siklus pada mesin Thermocylcer
BIORAD. Hasil PCR diimigrasikan ke dalam gel agarosa 1% pada kondisi 100 volt
40 menit. Setelah itu dilakukan pewarnaan gel dengan merendam pada larutan
ethidium bromida (EtBr) selama 15 menit, dilakukan penghilangan warna dengan

9
merendam pada akuades selama 15 menit. Gel kemudian divisualisasikan pada UV
transluminator BIORAD. Hasil PCR kemudian dipurifikasi dengan metode EXOSAP untuk kemudian dilakukan sekuensing dengan mesin Applied Biosystems
Hitachi 3130 Genetic Analyzer. Hasil sekuensing dinalisis menggunakan software
Geneious R7, kemudian dibandingkan dengan sekuen 16S rRNA data genebank
dengan menggunakan software BLASTn (Basic Local Alignmet Search Tools for
nucleotide).
Isolasi Gen Lipase
Untuk memperoleh gen lipase maka didesain primer forward dan reverse
menggunakan sekuen open reading frame (ORF) gen lipase atau full genome yang
diambil dari genebank. Desain primer dibuat dengan melihat daerah yang conserve
dengan software Geneious. Kondisi PCR yang digunakan yaitu pradenaturasi 95oC
selama 3 menit dan dilanjutkan dengan denaturasi 95oC 1 menit, penempelan 55oC
30 detik dan pemanjangan 72oC 1.5 menit serta setelah pemanjangan 72oC 5 menit.
Hasil PCR diimigrasikan ke dalam gel agarosa 1% pada kondisi 100 volt selama 40
menit. Setelah itu dilihat di bawah sinar UV transluminator yang nantinya akan
menghasilkan satu pita. Selanjutnya pita yang diinginkan dipotong lalu dipurifikasi
dari gel agarosa dengan QIAquick PCR Purification Gel Kit.
Kloning Gen Lipase
Gen hasil purifikasi diligasikan ke dalam plasmid pGEM-T Easy (Promega)
menggunakan enzim T4 ligase (New England Biolabs), pada suhu 4oC selama 16
jam dan ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli TOP10 (Novagen, USA)
dengan metode (Sambrook et al. 2001). Hasil transformasi diseleksi dengan
ditumbuhkan pada media agar-agar Luria Bertani yang mengandung ampisilin
(100µg/ml) 0.1 mM IPTG, 80 µg/ml X-Gal yang diinkubasi selama semalam pada
suhu 37oC. Koloni transforman yang membawa gen lipase yang diinginkan akan
berwarna putih, selanjutnya koloni transforman diverifikasi dengan melakukan
PCR koloni menggunakan primer M13F dan M13R. Hasil PCR diimigrasikan ke
dalam gel agarosa 1% dengan kondisi 100 volt 40 menit, kemudian dilakukan
pewarnaan dengan Ethidium Bromida (EtBr) dan penghilangan warna masingmasing 15 menit lalu dilihat di bawah UV transluminator. Hasil PCR kemudian
disekuensing, dibandingkan dengan data sekuen gen lipase pada genebank dengan
tools BLASTn (Basic Local Alignment Search Tools for nucleotide). Setelah itu
prediksi asam amino dan sisi aktif gen lipase dilakukan menggunakan perangkat
lunak http://web.expasy.org/translate/ dan http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu,
konstruksi pohon filogenetik berdasarkan asam amino menggunakan MEGA 6.06.
Ekspresi Gen Lipase pada E. coli BL21(DE3) pLyss
Plasmid pET15-by digunakan untuk ekspresi gen pada E. coli BL21(DE3)
pLyss. Untuk itu didesain primer dengan menambahkan situs restriksi KpnI/NotI
pada primer sebelumnya. Kemudian gen lipase yang telah terligasi pada plasmid
pGEM-T Easy dipotong dengan menggunakan enzim restriksi KpnI/NotI. Fragmen
yang diperoleh diligasikan ke dalam vektor ekspresi pET15-by dengan enzim T4
ligase, plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli

10
TOP10, dan disebar ke dalam media agar-agar Luria Bertani yang mengandung
ampisilin 100 µg/ml. Selanjutnya untuk verifikasi transforman dilakukan PCR
koloni menggunakan primer yang didesain sebelumnya dan primer T7 promoter
dan terminal, pemotongan plasmid menggunakan KpnI/NotI serta sekuensing
menggunakan primer T7. Plasmid yang telah diverifikasi ditransformasikan ke
dalam E.coli BL21(DE3) pLyss, kemudian produksi enzim dilakukan dengan
menumbuhkan starter (inokulan awal) pada 10 mL media LB cair yang
mengandung ampisilin 100 µg/ml dan kloramfenikol 35 µg/ml pada inkubator
bergoyang kecepatan agitasi 200 rpm pada suhu 37oC selama semalam, lalu
diinokulasikan 2% inokulum ke dalam media produksi, dan ditambahkan 0.5 mM
IPTG ketika nilai absorbansi 0.5-0.6 pada OD600, inkubasi kultur bakteri dilanjutkan
selama semalam. Kultur bakteri dipanen dengan disentrifugasi 8000 rpm (jenis
rotor 7591) 4oC selama 10 menit, pelet yang diperoleh dilarutkan menggunakan
bufer 0.1 M Tris-HCl sebanyak 10% dari media produksi. Setelah itu sel dipecah
dengan alat sonikator selama 10 menit, supernatan diperoleh dengan melakukan
sentrifugasi 13000 rpm (jenis rotor 7591) 15 menit 4oC, selanjutnya enzim ekstrak
kasar dikarakterisasi.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar Lipase
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan pengujian pada suhu 20-90oC,
untuk pH optimum pH 5 - pH 11, substrat spesifik dengan subtrat rantai pendek
hingga panjang (C2-C18) dan pelarut organik metanol, etanol, 2-propanol, 1-butanol,
n-heksan.
Pengujian suhu optimun dilakukan dengan metode 4-para nitrofenil palmitat
(pNPP) (Joseph et al. 2012), dengan mencampurkan substrat 30 mg para
nitropalmitat ke dalam 10 ml isoproponal, setelah itu diambil 1 ml campuran
substrat dilarutkan dengan 0.1 M bufer fosfat pH 8 yang mengandung 0.04 g gum
arabic, dan 0.92 g sodium deoxycholate, hasil campuran disimpan selalu dalam
keadaan dingin. Setelah itu 25 µl enzim ekstrak kasar ditambahkan 600 µl
campuran substrat, lalu diinkubasi pada masing-masing suhu selama 15 menit
menggunakan heating cooling dry block, reaksi dihentikan dengan penambahan
500 µl etanol 96%, lalu disentrifugasi 16200 × � selama 3 menit dan diukur
absorbansi pada panjang gelombang 405 nm. Penentuan pH optimum dilakukan
dengan metode 4-para nitorofenil oktanoat (pNPC) (Natadiputri et al. 2015) pada
suhu optimum. Penentuan pH optimum lipase dilakukan pada berbagai pH dengan
menginkubasi campuran reaksi 950 µl, 40µl etanol 96% dan 10 µl enzim pada bufer
0.1 M natrium asetat (pH 5-6), 0.1 M bufer fosfat (pH 6-8), 0.1 M tris-HCl (pH 810), dan 0.1 M KCl-NaOH (10-11) selama 5 menit, kemudian diukur absorbansi
pada panjang gelombang 405 nm menggunakan spektrofotometer (BIORAD).
Pengujian substrat spesifik dilakukan menggunakan substrat p-nitrofenil
dengan panjang rantai karbon C2-C18 (pNp-asetat, pNP-butirat, pNP-heksanoat,
pNP-Okatanoat, pNP-dekanoat, pNP-dodekanoat) dilarutkan dengan 10 ml
asetonitril sedangkan (pNP-miristat, pNP-palmitat, pNP-stearat) dilarutkan dalam
10 ml isopropanol. Pengujian substrat C2-C12 (pNp-asetat, pNP-butirat, pNPheksanoat, pNP-Okatanoat, pNP-dekanoat, pNP-dodekanoat) dilakukan dengan
metode pNPC, sedangkan C12-C18 sedangkan (pNP-miristat, pNP-palmitat, pNPstearat) dengan metode pNPP (Ranlym et al. 2013). Selanjutnya dilakukan

11
pengujian stabilitas lipase pada berbagai pelarut organik (metanol, 2-isopropanol,
etanol, 1-butanol, n-heksan) pada suhu optimum. Enzim ekstrak kasar sebanyak 300
µl dicampurkan dengan 100 µl pelarut, lalu diinkubasi pada inkubator bergoyang
dengan kecepatan agitasi 200 rpm 30 menit dan disentrifugasi 16200 × � 2 menit,
setelah itu pengukuran aktivitas dilakukan dengan metode pNPP seperti yang telah
dijelaskan sebelumnya (Kim et al. 2012)

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri dan Pengukuran Aktivitas Lipase Termofilik
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa air dan sedimen yang
diambil dari sumber air panas geiser Cisolok Sukabumi Jawa Barat yang memiliki
pH 8 dan suhu mencapai 95oC. Hasil isolasi diperoleh lima isolat bakteri yang
mampu menghasilkan enzim lipase ditandai dengan adanya koloni berwarna merah
muda pada media Rhodamine B dan berpendar bila diamati di bawah sinar
ultraviolet (UV), pendaran ini terjadi karena hidrolisis substrat berupa minyak
zaitun oleh lipase menjadi asam lemak monogliserida atau digliserida yang
berikatan dengan pewarna Rhodamine B yang kemudian tereksitasi bila diamati
pada panjang gelombang 350 nm (Kouker dan Jaeger 1987; Mackenzie et al. 1967).
Kelima isolat diseleksi berdasarkan kemampuannya menghasilkan enzim
lipase ekstraseluler melalui uji titrasi untuk mengukur aktivitas lipase (Tabel 1).
Berdasarkan uji titrasi maka diperoleh aktivitas lipase ekstrak kasar tertinggi dari
bakteri S4-01 sebesar 3.91 U mL-1. Aktivitas lipase ditunjukkan oleh adanya
perubahan warna dari yang tidak berwarna menjadi merah muda dengan
penambahan indikator fenolftalein. Perubahan ini terjadi akibat adanya perubahan
pH pada larutan reaksi. Warna merah muda terjadi saat tidak ada lagi NaOH yang
dapat berikatan dengan asam lemak sehingga pH larutan menjadi basa, sebab asam
lemak memiliki pH yang bersifat asam lemah.
Tabel 1 Pengukuran aktivitas enzim lipase
Sampel
A1-01
S3-01
S3-04
S4-01
A4-01

Aktivitas U mL-1
2.83
1.58
3.75
3.91
2.41
Identifikasi Bakteri

Bakteri S4-01 yang memiliki kemampuan penghasil lipase terbesar dipilih
untuk diisolasi genomnya. Identifikasi dilakukan dengan mengamplifikasi gen
penyandi 16S rDNA menggunakan primer 63F dan 1387R pada mesin Polymerase
Chain Reaction (PCR) (Marchesi et al. 1998). Pita berukuran sekitar 1300 pasang
basa berhasil diperoleh (Gambar 3). Hasil produk PCR tersebut disekuensing lalu

12
dibandingkan dengan melakukan BLAST terhadap data 16S rRNA yang terdapat
pada GenBank. Hubungan kekerabatan antara isolat S4-01 dengan Bacillus
amyloliquefaciens strain D15 ditunjukkan dengan pohon filogenetik (Gambar 4).

Gambar 3 Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA isolat S4-01
(M= Penanda vc 100 pb).
S4 01
100
82

Bacillus amyloliquefaciens strain D15 16S
Bacillus subtilis strain J-18
Bacillus methylotrophicus strain VD18S15

100

Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus alcalophilus strain DSM 485
Acientobacter calcoaceticus
Pseudomonas mendocina

0.02

Gambar 4 Konstruksi pohon filogenetik isolat S4-01 berdasarkan gen 16S rRNA.
Isolasi, Kloning, dan Analisis Sekuen Gen Penyandi Lipase
Hasil identifikasi bakteri dengan pembandingan gen 16S rRNA
menunjukkan bahwa isolat bakteri memiliki kemiripan dengan Bacillus
amyloliquefaciens, yang kemudian diisolasi gen lipasenya menggunakan primer
Bamy-lipF dan Bamy-lipR yang telah didesain dengan perangkat lunak Geneious
R7. Hasil amplifikasi PCR menunjukkan ukuran pita sebesar 645 pb yang
merupakan open reading frame dengan menyandikan 214 asam amino (Gambar 5).

Gambar 5 Hasil elektroforesis amplifikasi gen lipase isolat S4-01
(M= Penanda vc 100 pb).
Hasil PCR ini dimurnikan dari gel elektroforesis kemudian diligasikan ke
dalam vektor pGEMT-Easy dengan DNA T4 ligase (NEB) (Gambar 6) setelah itu
ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10. Seleksi biru putih digunakan untuk

13
mendapatkan bakteri transforman dan diverifikasi dengan PCR koloni
menggunakan primer M13 forward dan M13 reverse yang menghasilkan pita
dengan ukuran sekitar 845 pb (Gambar 7).

Gambar 6 Hasil konstruksi pGEM-Lip.

Gambar 7 Hasil PCR koloni seleksi bakteri transforman pGEM-Lip
(M= Penanda vc 100 pb; K(-)= Kontrol negatif).
Hasil plasmid rekombinan yang telah disekuensing lalu dikonstruksi pohon
filogenetiknya berdasarkan prediksi asam amino. Pohon filogenetik menunjukkan
bahwa sekuen asam amino isolat S4-01 lebih dekat terhadap B. methylotropicus
dibandingkan dengan B. amyloliquefaciens (Gambar 8). Berdasarkan prediksi

14
urutan asam amino maka prediksi situs katalik triad lipase terletak pada posisi asam
amino Ser110Asp166His189, residu serin pada daerah lestari pentapeptida berada pada
Ala-His-Ser110-Met-Gly, sedangkan nukleofil dan oxyanion hole berada pada
Asp166 dan His189 (Gambar 9).

Gambar 8 Konstruksi pohon filogenetik gen lipase isolat S4-01
berdasarkan urutan asam amino.

Gambar 9 Prediksi triad katalitik lipase Ser110Asp166His189.
Ekspresi Lipase Rekombinan
Hasil kloning gen lipase pada p-GEMT Easy dipotong dengan enzim KpnI
dan NotI yang menghasilkan dua pita berukuran 3015 untuk plasmid p-GEMT Easy
dan 645 gen lipase (Gambar 10) yang kemudian diligasikan ke dalam vektor pET15by (Gambar 11). Vektor pET15by rekombinan yang telah ditransformasi ke
dalam E. coli TOP10 diverifikasi koloni dengan primer T7 promoter dan T7
terminal yang menghasilkan pita sekitar 845 pb (Gambar 12). Produksi lipase

15
relombinan dilakukan dalam E. coli BL21(DE3) pLyss pada media cair LB yang
induksi oleh isopropyl-β-ɒ-thiogalaktopiranosida (IPTG).

Gambar 10 Hasil pemotongan pGEM-Lip menggunakan KpnI dan NotI
(M= Penanda vc 100 pb; P= plasmid).

Gambar 11 Hasil konstruksi pET15by-Lip.

16

Gambar 12 Hasil PCR koloni seleksi bakteri transforman pET15by-Lip
(M= Penanda vc 100 pb; K(-)= Kontrol negatif).
Karakterisasi Lipase Rekombinan
Lipase rekombinan yang diekspresikan pada E.coli BL21 (DE3) pLyss
selanjutnya diuji untuk mencari suhu, pH optimum serta ketahanan terhadap
pelarut, dan kespesifikan substrat sintesis. Berdasarkan hasil uji efek temperatur
terhadap aktivitas lipase diperoleh bahwa temperatur optimum berada pada 40oC
(Gambar 13). Aktivitas enzim akan terus meningkat hingga suhu optimum dan akan
rusak perlahan bila melewati titik tersebut.

Gambar 13 Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase rekombinan.
Penentuan pH optimum lipase S4-01 dilakukan dengan metode pNPC pada
rentang pH 5-11. Hasil uji menunjukkan lipase bekerja optimum pada pH 8
(Gambar 14). Aktivitas enzim terhadap pH dipengaruhi oleh gugus ion pada sisi
katalitik enzim dan muatan pada struktur tiga dimensi protein (Bisswanger 2008).
Dengan demikian, pada umumnya enzim akan mengalami denaturasi pada pH yang
ekstrem. Biasanya sisi aktif enzim disusun oleh asam amino polar yang mudah
mengalami ionisasi sehingga aktivitas katalitiknya tergantung pada pH.

17

Gambar 14 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase rekombinan
(Konsentrasi bufer yang digunakan 0.1M).
Hasil pengujian lipase S4-01 terhadap beberapa pelarut organik
memperlihatkan bahwa lipase ini tidak hanya stabil tetapi juga meningkatkan
sedikit aktivitas bila dilarutkan dalam n-heksan (Gambar 15). Menurut Ogino dan
Ishikawa (2001) terkadang penggantian molekul air yang berikatan pada enzim
dengan pelarut organik dapat menstabilkan struktur tiga dimensi enzim tersebut.

Gambar 15 Pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas lipase rekombinan
(Konsentrasi pelarut yang digunakan 96%).
Lipase memiliki kespesifikan terhadap jenis substrat yang berbeda-beda.
Pengujian kespesifikan substrat dilakukan terhadap p-nitrofenil ester pada panjang
rantai karbon yang bervariasi. Hasil penelitian menunjukkan jenis substrat yang
memiliki aktivitas tertinggi terdapat pada substrat dengan panjang rantai karbon C6
(heksanoat) dan C14 (miristat) secara berturut-turut (Gambar 16).

18

Gambar 16 Pengaruh substrat p-nitrofenil ester terhadap aktivitas lipase
rekombinan (Konsentrasi substrat yang digunakan 30 mM).

Pembahasan
Isolat bakteri S4-01 yang diperoleh menunjukkan kemampuan menghasilkan
lipase secara kualitatif dengan melihat terbentuknya pendaran orange bila diamati
di bawah sinar UV. Pendaran ini terjadi karena hidrolisis substrat berupa minyak
zaitun oleh lipase menjadi asam lemak monogliserida atau digliserida yang
berikatan dengan pewarna Rhodamine B yang kemudian tereksitasi bila diamati
pada panjang gelombang 350 nm (Kouker dan Jaeger 1987). Aktivitas enzim
biasanya memiliki korelasi yang positif dengan besarnya pendaran pada sinar UV.
Uji titrasi menunjukkan aktivitas lipase ekstrak kasar isolat S4-01 sebesar
3.91 U mL-1. Aktivitas lipase ditunjukkan oleh terjadinya perubahan warna dari
yang tidak berwarna menjadi merah muda dengan penambahan indikator
fenolftalein. Perubahan ini terjadi akibat adanya perubahan pH pada larutan reaksi.
Warna merah muda terjadi saat tidak ada lagi NaOH yang dapat berikatan dengan
asam lemak sehingga pH larutan menja