Protease Fibrinolitik Dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah Dan Tempe Gembus
PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA
PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS
DIANA NUR AFIFAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Protease Fibrinolitik
dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
setiap bagian akhir Bab pada disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor,
Desember 2014
Diana Nur Afifah
NIM F261100071
RINGKASAN
DIANA NUR AFIFAH. Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi
Oncom Merah dan Tempe Gembus. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO,
DAHRUL SYAH, dan YANTI.
Penyakit kardiovaskuler seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, dan
stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Dasar
patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan bekuan
fibrin atau trombus yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka.
Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk
dari fibrinogen oleh trombin.
Enzim fibrinolitik dari mikroba pangan telah menarik perhatian untuk
diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Genus Bacillus dari pangan fermentasi
dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto,
pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK).
Beberapa genus Bacillus lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah
ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B.
amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina,
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea, Bacillus
sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea, dan Bacillus sp. KA38 dari
jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea.
Penelitian ini berhasil mengisolasi bakteri penghasil protease fibrinolitik
dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus. Empat puluh
tiga isolat menunjukkan aktivitas proteolitik pada media skim milk agar (SMA),
dan 38 diantaranya menunjukkan aktivitas fibrinolitik baik berdasarkan uji cakram
fibrin maupun zimogram dengan substrat fibrinogen. Dua isolat terbaik, yaitu
RO3 dari oncom merah dan 2.g dari tempe gembus, dipilih untuk diidentifikasi
menggunakan kit API 50 CHB dan analisis 16S rRNA. Hasil uji biokimia
menggunakan kit API 50 CHB khusus untuk Bacillus spp, menunjukkan bahwa
isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (99,9%) dan isolat 2.g sebagai
B. pumilus (99,7%). Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA telah
dilakukan dan isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (96%) dan isolat
2.g sebagai B. pumilus (97%). Urutan nukleotida telah didaftarkan di GenBank
dengan nomor akses AB968524 untuk isolat RO3 dan AB968523 untuk isolat 2.g.
Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan untuk
keberhasilan penerapan enzim dalam industri. Pemilihan media merupakan faktor
penting untuk produksi enzim. Bacillus licheniformis RO3 ditumbuhkan pada tiga
jenis media yang berbeda, yaitu Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + susu skim 1%
(b/v) (LBS), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) (LBO). Dalam media
LB, B. licheniformis RO3 mampu menghasilkan protease dengan aktivitas
tertinggi 0,024 U/ml atau 0,157 U/mg pada jam ke-36. Dalam media LBS,
aktivitas tertinggi 0,022 U/ml atau 0,152 U/mg tercapai pada jam ke-48. Hasil
terbaik ditunjukkan pada B. licheniformis RO3 yang ditumbuhkan pada media
LBO dengan aktivitas protease tertinggi 0,051 U/ml atau 0,283 U/mg setelah 48
jam fermentasi. Hasil ini menunjukkan bahwa tepung oncom merah dapat
digunakan sebagai media yang baik untuk produksi protease fibrinogenolitik.
Protease fibrinogenolitik kasar yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan
media produksi LBO memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC.
Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa fraksi protease yang memiliki
aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah
dimurnikan dari supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan
amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CMSephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl
Sepharose 6-FF. Kemurnian enzim meningkat 16 kali lipat dengan yield 25%
pada tahap akhir pemurnian. Enzim fibrinolitik murni stabil antara pH 5 hingga
pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Aktivitas fibrinolitik meningkat dengan adanya 5
mM MgCl2 dan 5 mM CaCl2 tetapi dihambat oleh 1 mM PMSF, 1 mM SDS, dan
1 mM EDTA. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g mampu menghidrolisis
substrat sintetik N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, substrat untuk subtilisin dan
kimotripsin, secara efisien. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni
dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin kelompok subtilisin.
Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus β.g dapat mendegradasi rantai α dan β
dari fibrinogen dengan cepat tetapi tidak dapat mendegradasi rantai .
Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g menghasilkan beberapa
protease ekstraseluler. Dari tiga fraksi protease ekstraseluler B. licheniformis RO3
yang dipisahkan menggunakan elektroforesis 2D dan identifikasi menggunakan
MALDI-TOF-MS, diperoleh satu fraksi dengan BM 48 kDa dan pI 4.80 yang
memiliki kemiripan dengan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13
dengan skor protein 27. Tiga fraksi dari B. pumilus 2.g yang dipisahkan
menggunakan SDS-PAGE dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS,
dengan BM masing-masing 23, 20, dan 15 kDa juga hanya memiliki kemiripan
dengan protein database dengan skor protein ≤ 74. Kemungkinan beberapa fraksi
protein tersebut adalah baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Kata kunci: protease fibrinolitik, oncom merah, tempe gembus, Bacillus
licheniformis, Bacillus pumilus
SUMMARY
DIANA NUR AFIFAH. Fibrinolytic protease from fermented food red oncom and
tempeh gembus microorganisms. Supervised by MAGGY T. SUHARTONO,
DAHRUL SYAH, and YANTI.
Cardiovascular diseases such as heart disease, high blood pressure, and
stroke are the leading cause of death in the world, including Indonesia. Basic
pathophysiology of myocardial infarction and stroke is the formation of fibrin clot
or thrombus attached to an injured blood vessel walls. Fibrin is the major protein
component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin.
Fibrinolytic enzyme from food microbes has attracted attention for
thrombolytic agent. The genus Bacillus from fermented food can produce a strong
fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from natto, a fermented soy food from
Japan that produce nattokinase (NK). The other Bacillus from various fermented
food are B. amyloliquefaciens DC-4 from douchi, fermented soy food from China,
Bacillus sp. CK from chungkookjang, soy sauce fermentation of Korea, Bacillus
sp. DJ-2 strains and DJ-4 from doenjang, Korea, and Bacillus sp. KA38 from
jeotgal, fermented salted fish from Korea.
This study was able to isolate bacteria producing fibrinolytic proteases from
Indonesian fermented food, red oncom and tempeh gembus. Forthy-three isolates
showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them
showed fibrinolytic activities both on fibrin plate and fibrinogen zymography.
Two isolates, i.e. RO3 from red oncom and 2.g from tempeh gembus, were
selected and identified using API CHB kit and 16S rRNA. The results of
biochemical tests using API 50 CHB kit specifically for Bacillus spp, revealed
that isolate RO3 was identified as B. licheniformis (99.9%) and isolate 2.g as B.
pumilus (99.7%). Molecular identification based on 16SrRNAs gene was
performed and isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis (96%) and isolate
2.g was confirmed as B. pumilus (97%). The nucleotide sequences were deposited
at GenBank with accession number AB968524 for isolate RO3 and AB968523 for
isolate 2.g.
The high cost of enzyme production is one of the barriers to successful
application of enzyme in the industry. Selection of media is a critical factor for the
enzyme production. Bacillus licheniformis RO3 was screened from red oncom, an
Indonesian fermented food. Three types of media were analyzed, i.e. Luria-bertani
broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder
(LBO). In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease with
activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg at 36 h fermentation. In LBS media, the
highest activity was 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 h fermentation. The best
result was shown when B. licheniformis RO3 was grown on LBO media with the
highest protease activity was 0.051 U/ml or 0.283 U/mg at 48 h. These results
indicate that red oncom flour can be used as a good media for fibrinogenolytic
protease production. Crude fibrinogenolytic protease enzyme from B.
licheniformis RO3 had an optimum pH and temperature at 8.0 and 60°C.
Bacillus pumilus 2.g secretes several proteases that have strong fibrinolytic
activities. A fibrinolytic enzyme with an apparent molecular weight of 20 kDa
was purified from the culture supernatant of B. pumilus 2.g by sequential
application of ammonium sulfate precipitation 80%, ion-exchange
chromatography by using CM-Sephadex C-50, and hydrophobic chromatography
by using Phenyl-Sepharose 6-FF. After Phenyl-Sepharose chromatography step,
the final purification fold was 16.0, and the yield was 25%. The partially purified
enzyme was stable between pH 5 and pH 9 and temperature of less than 60℃.
Fibrinolytic activity was increased by 5 mM MgCl2 and 5 mM CaCl2 but inhibited
by 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium dodecyl sulfate
(SDS), and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The partially purified
enzyme quickly degrades the α and β chains of fibrinogen but cannot degrade the
chain.
Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g secretes several extracellular
proteases. Three B. licheniformis RO3 extracellular protease fractions was
separated by 2D electrophoresis and identified by MALDI-TOF-MS. One
fraction with molecular weight of 48 kDa and pI 4.80 had similiarity to
bacillopeptidase F from B. licheniformis DSM 13 in protein score, that is 27. The
three fraction of B. pumilus 2.g was separated by MALDI-TOF-MS. Each fraction
of it has molecule weight of 23, 20 and 15 kDa and protein score ≤ 74 compared
protein database. The results showed that there are some new protein fraction
found in both extracellular fibrinolytic proteases produced by Bacillus
licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g.
Keywords: fibrinolytic protease, red oncom, tempeh gembus,
licheniformis, Bacillus pumilus
Bacillus
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA
PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS
DIANA NUR AFIFAH
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc
(Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian IPB)
Dr Harsi D. Kusumaningrum
(Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian IPB)
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD
(Kepala Rumah Sakit Hewan IPB)
Raymond R Tjandrawinata, PhD
(Scientist and Corporate Development Director at Dexa
Medica)
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
disertasi dengan judul “Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi
Oncom Merah dan Tempe Gembus” ini berhasil diselesaikan. Disertasi ini
merupakan salah satu syarat untuk mencapai gelar Doktor pada Program Studi
Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Sebagian hasil penelitian dalam disertasi ini telah diajukan sebagai artikel
ilmiah pada beberapa jurnal, yaitu 1) Proteolytic and fibrinolytic activities of
several microorganisms screened from red oncom and tempeh gembus,
Indonesian fermented soybean cakes, abstraknya telah dipresentasikan secara oral
pada 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and
Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel
lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of
Microbiology, 2) The use of red oncom powder as potential production media for
fibrinogenolytic protease derived from Bacillus licheniformis RO3, telah
dipresentasikan secara oral pada International Symposium on Food and AgroBiodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014 dan artikel lengkapnya
sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science
Elsevier, 3) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from
Bacillus pumilus 2.g isolated from tempeh gembus, an Indonesian fermented food,
telah dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF)
Vol 19(3): 213-219, (4) Studi proteomik protease fibrinolitik ekstraseluler dari
Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan
fermentasi indonesia.
Terima kasih kepada Ibu Prof Dr Maggy Thenawidjaja Suhartono, Bapak Dr
Ir Dahrul Syah, MScAgr, dan Ibu Yanti, PhD selaku pembimbing yang telah
banyak memberikan motivasi, arahan, dan bimbingan hingga terselesaikannya
disertasi ini. Terima kasih kepada Prof Jeong Hwan Kim selaku pembimbing
penelitian di Gyeongsang National University, Jinju, Korea. Terima kasih kepada
penguji pada ujian tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc dan Dr Harsi D.
Kusumaningrum, serta penguji pada ujian terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST,
PhD dan Raymond R Tjandrawinata, PhD. Terima kasih kepada DIKTI,
Kemendikbud, Republik Indonesia atas bantuan beasiswa BPPS tahun 2010-2014,
bantuan program Sandwich-like tahun 2013, dan bantuan penelitian melalui
program Hibah Bersaing atas nama Prof. dr. Muhammad Sulchan, M.Sc, DA
Nutr, SpGK. Terima kasih kepada Universitas Diponegoro yang telah
memberikan bantuan pendidikan dan bantuan penelitian melalui program Hibah
Doktor dana PNBP Undip 2014. Terima kasih kepada teman-teman IPN 2010,
2011, 2012, atas kebersamaannya. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada keluarga, kedua orang tua, mertua, suami, anak-anak, kakak, adek, dan
semua pihak yang telah membantu baik dalam pelaksanaan kuliah, penelitian,
hingga penyusunan disertasi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk
pengembangan ilmu dan pengetahuan di bidang Ilmu Pangan dan bidang terkait
lainnya.
Bogor,
Desember 2014
Diana Nur Afifah
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
1
2
3
4
5
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis Penelitian
Daftar Pustaka
1
1
2
3
3
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
6
6
Tahapan Penelitian
Penelitian Tahap I
Penelitian Tahap II
Penelitian Tahap III
Penelitian Tahap IV
6
6
6
7
7
4
4
PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL
MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND
TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results
Discussion
Conclusion
References
10
THE USE OF RED ONCOM POWDER AS POTENTIAL
PRODUCTION MEDIA FOR FIBRINOGENOLYTIC PROTEASE
DERIVED FROM Bacillus licheniformis RO3
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results and Discussion
Conclusion
References
21
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF
A FIBRINOLYTIC ENZYME FROM Bacillus pumilus 2.g
ISOLATED FROM TEMPEH GEMBUS, AN INDONESIAN
FERMENTED FOOD
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results and Discussion
References
31
10
10
11
13
17
18
18
21
21
22
24
29
29
31
31
32
34
39
6
7
8
STUDI PROTEOMIK PROTEASE FIBRINOLITIK
EKSTRASELULER DARI Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus
pumilus 2.g YANG DIISOLASI DARI PANGAN FERMENTASI
INDONESIA
42
Abstrak
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
Daftar Pustaka
42
42
43
45
49
49
PEMBAHASAN UMUM
Isolasi dan Identifikasi Mikroba dari Pangan Fermentasi Oncom Merah
dan Tempe Gembus yang dapat Memproduksi Protease Fibrinolitik
Pemanfaatan Tepung Oncom Merah sebagai Media Produksi Protease
Fibrinogenolitik Mikroba
Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Fibrinolitik
Studi Proteomik Enzim Protease Fibrinolitik
dari Mikroba Pangan Fermentasi
Daftar Pustaka
52
52
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
69
69
69
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
57
59
63
65
1
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit kardiovaskular yang meliputi infark miokardial akut, penyakit
jantung iskemik, penyakit jantung valvular, aritmia, tekanan darah tinggi, dan
stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Pada tahun
2008, sekitar 17,3 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular, atau 30%
dari semua penyebab kematian global. Dari jumlah ini, 7,3 juta disebabkan oleh
penyakit jantung koroner dan 6,2 juta disebabkan oleh stroke. Pada tahun 2030
diperkirakan jumlahnya akan meningkat hingga 23,6 juta orang (WHO 2011).
Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan
trombus atau bekuan fibrin yang melekat pada dinding pembuluh darah yang
terluka. Akumulasi fibrin dalam pembuluh darah dapat mengganggu aliran darah
dan merusak jaringan pada jantung, menyebabkan denyut jantung tidak teratur,
serangan jantung, dan kematian.
Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang
terbentuk dari fibrinogen oleh trombin (Voet & Voet 1990). Serat fibrin yang
tidak larut dapat dihidrolisis menjadi produk degradasi fibrin oleh plasmin, yang
dihasilkan dari plasminogen oleh aktivator plasminogen seperti aktivator
plasminogen jaringan, aktivator plasminogen vaskular, aktivator plasminogen
darah, urokinase, faktor Hageman, dan kompleks plasminogen-streptokinase
(Collen & Lijnen 1991).
Terapi trombolitik melalui suntikan maupun oral oleh agen trombolitik
untuk mendegradasi trombus dalam darah telah banyak diteliti dan dipraktekkan
(Goldhaber & Bounameaux 2001; Tough 2005). Berdasarkan mekanisme kerjanya,
agen trombolitik diklasifikasikan menjadi dua jenis. Pertama adalah aktivator
plasminogen, seperti aktivator plasminogen jaringan (t-PA) (Collen & Lijnen
2004) dan urokinase (Duffy 2002), yang mengaktifkan plasminogen menjadi
plasmin aktif untuk mendegradasi fibrin. Jenis lainnya adalah plasmin-like protein,
yang langsung mendegradasi fibrin dalam pembekuan darah, sehingga dapat
melarutkan trombus dengan cepat dan sempurna. Lumbrokinase dari cacing tanah
dan fibrolase dari bisa ular dikenal sebagai plasmin-like protein (Chen et al. 1991;
Mihara et al. 1991). Meskipun t-PA dan urokinase masih banyak digunakan
dalam terapi trombolitik, harganya yang mahal (100 mg t-PA adalah $2,750) dan
adanya efek samping yang tidak diinginkan, seperti risiko pendarahan dalam usus
ketika dikonsumsi secara oral (Peng et al. 2005), mendorong berbagai penelitian
untuk mencari sumber agen trombolitik yang lebih murah dan lebih aman.
Enzim fibrinolitik atau dikenal sebagai protease fibrinolitik dari mikroba
telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik.
Streptokinase dari Streptococcus hemolyticus dan stafilokinase dari
Staphylococcus sp. telah terbukti efektif dalam terapi trombolitik (Collen &
Lijnen 1994). Streptokinase tersedia dalam jumlah banyak dengan harga lebih
murah (1,5x106 unit streptokinase adalah $320), namun selama proses produksi
dan pemurnian mudah terkontaminasi oleh protein lain sehingga dapat
menimbulkan efek antigenik dan jika digunakan secara berulang dalam waktu
yang lama dapat menetralkan antibodi dan menimbulkan reaksi alergi (Turpie et
al. 2002; Banerjee et al. 2004).
2
Genus Bacillus dari pangan fermentasi ternyata juga dapat menghasilkan
enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi
kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Pemberian natto atau
enzimnya secara oral tidak hanya dapat mendegradasi trombus secara langsung
namun juga dapat meningkatkan pelepasan aktivator plasminogen endogen pada
hewan percobaan dan subjek manusia (Sumi et al. 1990). Beberapa genus Bacillus
lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu
menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens
DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina (Peng & Zhang 2002),
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea (Kim et
al. 1996), Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea (Choi et al.
2005; Kim & Choi 2000), dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal, ikan asin fermentasi
dari Korea (Kim et al. 1997). Yoon et al. (2002) melakukan skrining secara
sistematis terhadap strain penghasil enzim fibrinolitik dari berbagai pangan
fermentasi komersial maupun buatan sendiri termasuk natto, chungkook-jang,
doen-jang, jeot-gal, dan tempe, pangan fermentasi dari Indonesia dan berhasil
mengisolasi Enterococcus faecalis yang mampu memproduksi enzim dengan
aktivitas fibrinolitik yang tinggi.
Berbagai temuan menarik tersebut menyiratkan bahwa dengan
mengonsumsi makanan fermentasi yang mengandung protein tinggi dapat
mencegah penyakit kardiovaskular. Mikroba penghasil enzim fibrinolitik yang
ditemukan pada pangan fermentasi selain Bacillus, diantaranya adalah Fusarium
sp. BLB dari tempe (Sugimoto et al. 2007) dan Rhizopus chinensis 12 dari arak
beras, Cina (Xiao-lan et al. 2005). Bahan pangan lain yang terbukti memiliki
aktivitas fibrinolitik diantaranya adalah jamur pangan. Sejumlah peneliti telah
melaporkan bahwa kandungan senyawa aktif dalam berbagai jamur pangan,
Cordyceps militaris (Kim et al. 2006; Choi et al. 2011), Schizophyllum commune
(Lu et al. 2010), Pleurotus eryngii (Cha et al. 2010), Volvariela volvaceae
(Sajuthi et al. 2010) yang diduga dapat mempengaruhi sirkulasi darah adalah
protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik.
Adanya manfaat biologis yang menjanjikan dari mengonsumsi makanan
sumber enzim fibrinolitik, terbuka kesempatan luas untuk mengeksplorasi sumber
enzim fibrinolitik baru dari pangan fermentasi khas Indonesia. Oncom merah dan
tempe gembus merupakan salah satu pangan fermentasi khas Indonesia yang
banyak ditemukan di daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah yang terbuat dari
fermentasi ampas kedelai. Hingga saat ini belum ada penelitian mengenai enzim
fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, baik penelitian isolasi
bakteri penghasil enzim fibrinolitiknya maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang
ada dalam oncom merah dan tempe gembus.
Perumusan masalah
Enzim fibrinolitik mikroba telah banyak ditemukan pada berbagai pangan
fermentasi, baik pada pangan fermentasi nabati maupun hewani yang memiliki
kadar protein tinggi. Penelitian mengenai enzim fibrinolitik mikroba pangan telah
banyak dilakukan di luar negeri terutama Jepang, Korea, dan Cina. Penelitian di
Indonesia mengenai enzim fibrinolitik mikroba masih terbatas padahal Indonesia
dikenal sebagai negara yang kaya akan pangan fermentasi.
3
Kacang-kacangan seperti kedelai dan hasil perikanan yang difermentasi
ternyata memiliki aktivitas fibrinolitik yang kuat. Pangan fermentasi kedelai yang
terkenal di Indonesia adalah tempe, oncom, dan tempe gembus. Berbeda dengan
tempe, oncom dan tempe gembus merupakan pangan fermentasi ampas kedelai.
Ampas kedelai atau lebih dikenal sebagai ampas tahu adalah limbah hasil
pembuatan tahu. Aktivitas fibrinolitik kuat dari mikroba yang diisolasi dari tempe
telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Namun penelitian mengenai enzim
fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, terutama mengenai
isolasi mikroba penghasil enzim fibrinolitik maupun ekstraksi enzim fibrinolitik
yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus belum pernah dilaporkan.
Dalam aplikasi khusus enzim pemecah fibrin, temuan mikroba fibrinolitik
lokal adalah tahap awal yang harus diikuti tahap berikutnya yaitu mencari media
produksi yang efektif dan efisien. Tingginya biaya produksi enzim merupakan
salah satu hambatan suksesnya aplikasi enzim di industri. Pemilihan media
produksi merupakan faktor kritis untuk fermentasi enzim fibrinolitik.
Karakteristik enzim fibrinolitik mikroba pangan yang sudah terbukti aman
dan efektivitasnya sebagai agen trombolitik perlu diketahui dengan baik.
Karakteristik ini dapat diketahui menggunakan analisis biokimia. Informasi
karakter enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi asal Indonesia sangat
diperlukan dalam aplikasi sebagai pangan fungsional maupun pengembangan
selanjutnya sebagai obat trombolitik yang aman.
Dari latar belakang yang telah dikemukakan, dirumuskan beberapa masalah
yang dikaji lebih lanjut dalam penelitian, yaitu: apakah di dalam oncom merah
dan tempe gembus ditemukan adanya mikroba penghasil protease yang bersifat
fibrinolitik, apakah tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media untuk
menumbuhkan mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinogenolitik,
bagaimanakah karakteristik dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh mikroba
terpilih setelah dilakukan pemurnian?
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian yang dilaksanakan adalah melakukan kajian
terhadap protease fibrinolitik mikroba dari oncom merah dan tempe gembus.
Tujuan khusus dari penelitian yang dilaksanakan adalah: (1) memilah dan
mengidentifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe
gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) memperoleh media
yang baik untuk produksi enzim dengan pemanfaatan tepung oncom merah, (3)
melakukan pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba
terpilih, (4) melakukan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba
pangan fermentasi.
Manfaat Penelitian
Penelitian yang dilaksanakan bermanfaat untuk memperoleh informasi
keberadaan mikroba penghasil enzim fibrinolitik pada pangan fermentasi berbasis
kedelai asal Indonesia, oncom merah dan tempe gembus, dan informasi karakter
dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan. Informasi ini berguna untuk
4
pengembangan pangan fungsional maupun pemanfaatan enzim sebagai obat
trombolitik.
Hipotesis Penelitian
1.
2.
3.
4.
Di dalam oncom merah dan tempe gembus terdapat mikroba penghasil
protease fibrinolitik.
Tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba
penghasil protease fibrinogenolitik.
Enzim yang dihasilkan memiliki karakteristik tertentu uang selanjutnya dapat
diaplikasikan dalam pengembangan pangan fungsional maupun dimanfaatkan
sebagai obat untuk terapi penyakit kardiovaskular.
Terdapat beberapa fraksi protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi
terpilih.
Daftar Pustaka
Banerjee A, Chisti Y, Banerjee UC. Streptokinase-a clinically useful thrombolytic
agent. Biotechnology Advances 22:287–307.
Cha WS, Park SS, Kim SJ, Choi D. 2010. Biochemical and enzymatic properties
of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state
conditions using corn cob. Bioresource Technology 101:6475–6481.
Chen HM, Guan AL, Markland FS. 1991. Immunological properties of the
fibrinolytic enzyme (fibrolase) from southern copperhead (Agkistrodon
contortrix contortrix) venom and its purification by immunoaffinity
chromatograph. Toxicon 29(6):683–694.
Choi D, Cha W, Park N, Kim H, Lee JH, Park JS, Park S. β011. Purification and
characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of
Korean Cordyceps militaris. Bioresource Technology 102:3279–3285.
Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim
SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase,
bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp.
DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79.
Collen D, Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical
perspective and personal account. J Thromb Haemost 2(4):541–546.
Collen D, Lijnen HR. 1994. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen
activator with therapeutic potential? Blood 84(3):680–686.
Collen D, Lijnen HR. 1991. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and
thrombosis. Blood 78:3114-3124.
Duffy MJ. 2002. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as
prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence studies.
Clin Chem 48(8): 1194–1197.
Goldhaber SZ, Bounameaux H. 2001. Thrombolytic therapy in pulmonary
embolism. Semin Vasc Med 1(2):213–220.
Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Hiep NT, Kim CS, Choi HS, Kim
MK, Chun HS et al. 2006. A fibrinolytic enzyme from the medicinal
mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology 44(6):622-631.
5
Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4
secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci
Biotechnol Biochem 64:1722–1725.
Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997.
Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from
Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4):
307–312.
Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic
enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from
Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62:2482-2488.
Lu CL, Chen S, Chen SN. 2010. Purification and Characterization of a Novel
Fibrinolytic Protease from Schizophyllum commune. Journal of Food and
Drug Analysis 18(2):69-76.
Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikedo R, Seiki M, Maruyama M.
1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus
rubellus. Jpn J Physiol 41(3): 461–472
Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of
source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl
Microbiol Biotechnol 69:126–132.
Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi
fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J
Appl Environ Biol 8:285-289.
Sajuthi D, Suparto I, Yanti, Praira W. 2010. Purifikasi dan pencirian enzim
protease fibrinolitik dari ekstrak jamur merang. Makara sains 14(2):145-150.
Sugimoto S, Fujii T, Morimiya T, Johdo O, Nakamura T. 2007. The fibrinolytic
activity of a novel protease derived from tempeh producing fungus,
Fusarium sp. BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184-2189.
Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the
fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta
Haematol. 84:139-143.
Turpie AG, Chin BS, Lip GY. 2002. Venous thromboembolism: treatment
strategies. British Medical Journal 325:948–950.
Tough J. 2005. Thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Nurs Stand
19(37):55–64.
Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Wiley. hlm 1087-1095.
WHO. 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010.
World Health Organization. Geneva.
Xiao-lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X. 2005. Purification and
characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12.
Appl Microbiol Biotechnol 67(2): 209–214.
Yoon SJ, Yu MA, Sim GS, Kwon ST, Hwang JK, Shin JK, Yeo IH, Pyun YR.
2002. creening and characterization of microorganisms with fibrinolytic
activity from fermented foods. J Microbiol Biotechnol 12(4): 649–656.
2 METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai November 2013
di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati,
IPB, Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST center IPB,
Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Universitas Katholik Atma Jaya
Jakarta, dan Laboratorium Mikrobiologi, Gyeongsang National University, Jinju,
Korea.
Tahapan Penelitian
Penelitian akan melalui tiga tahapan, yaitu (1) isolasi dan identifikasi
mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat
memproduksi protease fibrinolitik, (2) pemanfaatan tepung oncom merah sebagai
media produksi protease fibrinogenolitik mikroba, (3) pemurnian dan karakterisasi
enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) studi proteomik enzim protease
fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi.
Penelitian Tahap I
Penelitian tahap pertama adalah isolasi mikroba penghasil protease
fibrinolitik dengan menggunakan media SMA. Sampel yang digunakan adalah
oncom merah segar, oncom merah yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit,
tempe gembus segar, dan tempe gembus yang telah dipanaskan 80oC selama 15
menit. Mikroba yang mampu menghasilkan zona bening ditumbuhkan dalam
media Luria Bertani broth (LB) agar dapat memproduksi protease fibrinolitik.
Protease fibrinolitik yang dihasilkan diuji aktivitasnya secara kuantitatif
menggunakan cakram fibrin (Hwang et al. 2007) dan kualitatif dengan teknik
zimografi. Substrat yang digunakan untuk zimografi adalah fibrinogen. Mikroba
terpilih adalah yang mampu menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi
substrat yang ditandai dengan adanya garis bening pada gel. Pada tahap isolasi
diutamakan untuk mendapatkan mikroba yang aman dan dapat memproduksi
protease fibrinolitik dengan berat molekul yang relatif rendah.
Mikroba terpilih kemudian disimpan dalam gliserol sebagai stok bakteri
untuk pengujian selanjutnya. Mikroba yang diharapkan adalah Bacillus yang
aman dikonsumsi sehingga pemilihan isolat dilakukan dengan tahapan identifikasi
isolat sebagai berikut: pewarnaan Gram yang dilanjutkan dengan pewarnaan spora,
uji biokimiawi dengan kit API 50CHB dan APIWEBTM software, dan identifikasi
secara molekuler dengan analisis 16S-rRNA.
Penelitian Tahap II
Tujuan dari tahap ini adalah pemanfaatan tepung oncom merah sebagai
media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik. Mikroba yang
dipilih adalah B. licheniformis RO3 yang diisolasi dari oncom merah. Mikroba
ditumbuhkan dalam tiga media yang berbeda, yaitu media Luria Bertani broth
7
(LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v)
pada suhu 37oC dalam inkubator goyang. Optical density (OD620), aktivitas
protease (Bergmeyer & Grassl 1983), aktivitas fibrinogenolitik secara kualitatif
dengan zimografi, dan konsentrasi protein (Bradford 1976) diukur setiap 12 jam
sekali selama 72 jam.
Penelitian Tahap III
Penelitian tahap ketiga merupakan tahap pemurnian dan karakterisasi enzim
yang dihasilkan oleh mikroba terpilih. Mikroba yang dipilih adalah B. pumilus 2.g
yang diisolasi dari tempe gembus. Sebelum dilakukan pemurnian, pemilihan
media produksi dilakukan pada 4 media yang berbeda, yaitu Luria Bertani broth
(LB), tryptic soy broth (TSB), nutrient broth (NB), dan brain heart infusion (BHI).
Pemurnian enzim dilakukan dengan pengendapan amonium sulfat, kromatografi
penukar ion, dan kromatografi interaksi hidrofobik. Karakteristik yang diamati
adalah berat molekul, stabilitas pH, stabilitas suhu, pengaruh inhibitor dan
aktivator, spesifisitas substrat, dan degradasi fibrinogen.
Penelitian Tahap IV
Penelitian tahap keempat merupakan studi proteomik enzim protease
fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Mikroba yang dipilih adalah B.
licheniformis RO3 dengan media produksi ½ LB + tepung oncom merah 1%
(LBO) dan B. pumilus 2.g dengan media produksi NB. Studi proteomik diawali
dengan elektroforesis satu dimensi, kemudian elektroforesis dua dimensi dan
dilanjutkan identifikasi protein dengan Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF).
9
Tahap I
Isolasi dan identifikasi mikroba
dari pangan fermentasi oncom
merah dan tempe gembus yang
dapat memproduksi protease
fibrinolitik
Sampel
Tahap II
Pemanfaatan tepung
oncom merah sebagai
media produksi protease
fibrinogenolitik mikroba
Mikroba terpilih
B. licheniformis RO3
Isolasi pada media SMA
Fermentasi pada 3 media
yang berbeda
Isolat
Produksi pada media LB
Enzim
(supertnatan)
Uji aktivitas protease,
konfirmasi kemampuan
fibrinolitik dengan cakram
fibrin dan zimografi
Enzim
(supernatan)
Uji aktivitas protease,
aktivitas fibrinolitik dan
konsentrasi protein
Pengukuran
OD620
Kondisi pertumbuhan
terpilih
Identifikasi isolat:
Pewarnaan gram dan
spora
Uji biokimiawi dengan
API 50CHB
Analisis 16S-rRNA
Produksi enzim
Supernatan
Freezing dry
Dua mikroba
terpilih
Pelet (Enzim kasar)
Karakterisasi
biokimia enzim
Gambar 1 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap I dan II
9
Tahap III
Pemurnian dan
karakterisasi enzim
fibrinolitik mikroba
Mikroba terpilih
B. pumilus 2.g
Tahap IV
Studi proteomik protease dari
mikroba pangan fermentasi
Mikroba terpilih
B. licheniformis RO3
Mikroba terpilih
B.pumilus 2.g
Fermentasi pada 4
media yang berbeda
Produksi enzim
Produksi enzim
Kondisi pertumbuhan
terpilih
Supernatan
Enzim murni
Elektroforesis satu dimensi
(SDS-PAGE)
Elektroforesis satu dimensi
(SDS-PAGE)
Elektroforesis dua dimensi
(2D)
MALDI-TOF
MALDI-TOF
Identifikasi
Produksi enzim
supernatan
salting-out dengan
amonium sulfat
pelet
Identifikasi
dialisis dan freeze dry
Enzim kasar
Kromatografi penukar ion,
dialisis, freeze dry
Enzim semi murni
Kromatografi interaksi
hidrofobik, dialisis, freeze
Enzim murni
Karakterisasi
biokimia enzim
Gambar 2 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap III dan IV
10
3
PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL
MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND
TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES1
Abstract
This study was to isolate, screen, and identify microorganisms from
fermented food Red Oncom and Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic
proteases. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar,
while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on a fibrin plate and
a fibrinogen zymography. The isolates that showed activity in fibrin plate and
fibrinogen zymography with lower molecular weight and considered as safe were
chosen and identified as Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus by using API
CHB kit and 16S rRNA. The novel fibrinolytic microorganisms were referred to
as B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Red Oncom and Tempeh Gembus are
potential sources of microbial fibrinolytic protease. This is the first time that Red
Oncom and Tempeh Gembus as Indonesian fermented foods based on soybean
cake were shown having fibrinolytic microorganism. Microbial fibrinolytic
enzymes from these fermented foods can be used for functional food formulation
to prevent thrombosis and other related diseases.
Keywords: microbial fibrinolytic enzyme, red oncom, zymography,
B. licheniformis, B. pumilus
Introduction
Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world,
including in Indonesia (WHO 2011). Accumulation of fibrin in the blood vessels
usually results in thrombosis, leading to myocardial infarction and other
cardiovascular diseases (Peng et al. 2005). Fibrin is the major protein component
of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin. Insoluble fibrin
can be hydrolyzed to fibrin degradation products by plasmin, which is generated
from plasminogen by plasminogen activators such as tissue plasminogen activator,
vascular plasminogen activator, blood plasminogen activator, urokinase, Hageman
factor and plasminogen-streptokinase complex (Collen and Lijnen 2004).
Thrombolytic therapy by injection and oral thrombolytic agents to degrade
the thrombus in the blood have been widely studied and practiced (Tough 2005).
Based on its mechanism of action, thrombolytic agents are classified into two
types. The first is a plasminogen activator, such as tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase which activates plasminogen to plasmin and further
hydrolyses fibrin (Collen and Lijnen 2004). Other type for thrombolytic therapy is
using plasmin-like proteins, which directly degrade fibrin in the blood clotting,
thus dissolve the thrombus quickly and perfectly. Lumbrokinase of earthworms
and fibrolase of snake venom are known as plasmin-like protein (Mihara et al.
1991). Although t-PA and urokinase are still widely used in thrombolytic therapy,
its price and the side effects possibility of undesirable such as the risk of bleeding
in the gut when taken orally (Peng et al. β005), prevent it’s normal utilization.
1
Abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4 th Annual International Symposium on
Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013,
sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of
Microbiology
11
This encourages study to find the source of thrombolytic agent that is cheaper and
safer.
Fibrinolytic enzyme originated from microbes has attracted the attention of
many researchers to be applied as a thrombolytic agent. Streptokinase from
Streptococcus hemolyticus and Staphylokinase from Staphylococcus sp. are
potential alternative plasminogen activator and had proven effective in
thrombolytic therapy (Banarjee et al. 2004). However, Streptokinase is available
in large quantities at high prices and during the production and purification is
easily contaminated by other proteins that can cause antigenic effect. Furthermore,
repeated use for a long time can induce allergies (Banerjee et al. 2004).
Recently, many fibrinolytic enzymes have been identified from traditional
fermented foods such as Japanese Natto (Fujita et al. 1993), Chinese Douchi
(Peng and Zhang 2002), Korean Doen-jang (Choi et al. 2005), Korean
Cheonggukjang (Jeong et al. 2007) and Korean Meju (Jo et al. 2011a). These
interesting reports imply some fermented foods contain enzymes that can
potentially prevent cardiovascular diseases. This fact opens opportunities to
explore new sources of fibrinolytic enzyme from typical Indonesian fermented
food. Red Oncom and Tempeh Gembus are two of the typical Indonesian
fermented foods made from fermented soy pulp. Until now there has been no
research on the fibrinolytic enzyme from Red Oncom and Tempeh Gembus, either
isolation of bacteria producing enzymes or extraction of fibrinolytic enzyme
present in Red Oncom and Tempeh Gembus. The purpose of this study was to
isolate, screen, and identify microbes from fermented food Red Oncom and
Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic proteases.
Materials and Methods
Materials
Red oncom was obtained from the traditional markets in Bogor, West Java,
whereas Tempeh Gembus was obtained from the traditional markets in Semarang,
Central Java. Growth media including skim milk agar (SMA) was purchased from
Difco. Luria-Bertani broth (LB) was made from yeast extract and tryptone were
purchased from Oxoid. Fibrinogen from bovine plasma was purchased from
Sigma. API 50CHB kit was purchased from bioMerieux.
Isolation of Proteolytic Bacterial Strain
Heat pretreatment at 80oC for 15 min was applied to some of the samples to
avoid possible pathogen contamination. One-tenth gram of the sample was
suspended in sterile physiological saline (0.85% NaCl). The suspension was
plated on sterile skim milk agar (SMA), and then incubated at 37oC for 48 h. A
clear zone of skim milk hydrolysis gave an indication of protease producing
organisms. At the end of incubation period, the protease colonies were picked,
purified and sent for further fibrinolytic screening.
Fibrinolytic protease production
A loop of selected microorganisms was cultivated in 25 mL LB broth and
incubated at 37oC in a shaking incubator (120 rpm) for 48 h. At the end of
12
incubation, the fermentation broth was centrifuged at 6000 g at 4oC for 15 min.
The clear supernatant was collected as source of enzyme.
Analysis of protease activity and protein determination
Protease activity was measured according to the Bergmeyer method
(Bergmeyer et al. 1λ83) with casein (1%) as the substrate. As much as 50 l
enzyme filtrate was mixed with 250 l substrate and incubated at 37oC for 10 min.
Trichloroacetic acid (TCA) 0.1 M was added and incubated at 37oC for 10 min,
and centrifuged at 4000 g for 10 min. The supernatant was mixed with Na2CO3
0.4 M, followed by addition of Folin Ciocalteau reagent (1:2) and incubated
further at 37°C for 20 min. The reaction products were measured at
578 nm.
Substrate solution without enzyme was used as control. One unit (U) of enzyme
activity was defined as enzyme which produces 1 mol of tyrosine per min.
Protein concentration was analysed by Bradford’s method (1λ76) using
reagents consisted of 100 mg Coomassie brilliant blue (CBB) G-250 in 50 ml
ethanol 95% and 100 ml phosphate acid 85% in 1 liter. Bovine serum albumin
was used as the protein standard. Triplicate experiments were conducted for each
measurement.
Screening of Fibrinolytic Bacterial Strain
Fibrinolytic bacterial strain was screened by fibrin plate and fibrinogen
zymography (Hwang et al. 2007). 0.2% fibrinogen solution in 50 mM sodium
phosphate buffer (pH 8) was mixed with 2% agarose solution along with 0.02 ml
of a thrombin solution (100 NIH units). The solution was applied to a petri dish
and left for 1 h at room temperature to form a fibrin clot layer. Twenty l of the
enzymes was dropped onto a fibrin plate and incubated at 37oC for 5 h. The
activity of fibrinolytic enzyme was estimated by measuring the dimensions of the
clear zone on the fibrin plate. Fibrinogen zymography was carried out in 12%
polyacrylamide gels containing 0.1% fibrinogen. The enzymes were diluted in 5x
sample buffer, which consisted of 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 2%
SDS, and 0.1% bromophenol blue. Electrophoresis was carried out at 70 V and 50
A for 4 h until the bromophenol blue reached the bottom of the gel. After
electrophoresis, the gel was soaked in 2.5% Triton X-100, for 1 hour at room
temperature for enzyme renaturation. The gel was washed with distilled water to
remove Triton X-100, and then incubated with 50 mM phosphate buffer (pH 8) at
37oC for 12 hours. The gel was stained with Coomassie blue for 1 h and then
destained. The clear bands, correspond to the areas where fibrinogen was digested.
Identification of microorganisms
Identification of microorganisms followed three steps. First is microbiology
analysis i.e. Gram staining, spore staining, and morphological examination.
Second is biochemical tests with API 50CHB kit for Bacillus spp. followed by
identification using Apiweb™ software. Third is molecular identification for the
best fibrinolytic bacterial strain. The selected microorganisms were enriched, and
its 16SrRNAs were analyzed in order to identify the microorganisms at the
species level. Amplification of 16SrRNA was performed with universal primers,
63Fμ 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ and 1387Rμ 5’-GGG CGG
WGT GTA CAA GGC-3’, using a 2720 thermal cycler (Applied Biosystems).
13
PCR products was isolated from the agarose gel and sequenced with a BidDye
Terminator v3.1 cycle sequencing chemistry, genetic analyzer 3730XL (Applied
Biosystems). A sequence similarity search was performed using BLAST in the
NCBI database.
Results
Proteolytic activity of several microorganisms
Isolation of microbes from Red oncom and Tempeh Gembus revealed 43
isolates, 30 isolates from Red Oncom and 13 isolates from Tempeh Gembus that
produce protease enzyme characterized by their ability to produce clear zones on
the SMA plate. Figure 1 showed the clearing zone observed from the best
proteolytic microorganism when grown in SMA. Isolates tested were: RO3 and
2.g.
RO3
2.g
Figure 1 Proteolytic activity of several microorganisms
Fibrinolytic and fibrinogenolytic activity of several microorganisms
Fibrinolytic activity on the fibrin plate showed that 40 isolates were able to
produce a clear zone. The activity of fibrinolytic enzyme was estimated by
measuring the dimensions of the clear zone on the fibrin plate (Table 1).
Table 1 Fibrinolytic activities on fibrin plate
Isolate
Fibrinolytic
Isolate
Fibrinolytic
activities (cm)
activities (cm)
RO1
0.90±0.10
RO16
0.47±0.15
RO2
0.87±0.15
RO17
0.37±0.12
RO3
1.00±0.10
RO18
0.33±0.06
RO4
None
RO19
0.30±0.00
RO5
1.23±0.25
ROa
0.50±0.00
RO6
0.97±0.12
ROb
0.37±0.12
RO7
1.23±0.15
ROc
0.33±0.06
RO8
1.13±0.32
ROd
0.50±0.10
RO9
0.67±0.15
ROe
0.30±0.00
RO10
0.47±0.15
ROf
0.30±0.00
RO11
1.35±0.35
ROg
0.80±0.14
RO12
None
ROh
0.30±0.00
RO13
None
ROi
0.33±0.14
RO14
0.87±0.21
ROj
0.35±0.07
RO15
1.17±0.06
ROk
0.35±0.07
Isolate
1.g
2.g
3.g
4.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
d.g
e.g
f.g
---
Fibrinolytic
activities (cm)
0.90±0.00
1.45±0.07
0.90±0.14
1.00±0.00
0.70±0.14
1.00±0.00
0.45±0.07
0.50±0.00
0.50±0.00
0.35±0.07
0.30±0.00
0.30±0.00
0.35±0.07
---
kDa
M
1
kDa
M
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
3.g
4.g
14
15
16
17
18
19
a
b
c
d
d.g
e.g
f.g
260
140
100
70
50
40
35
25
15
10
e
f
g
h
i
j
k
1.g
2.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
260
140
100
70
50
40
35
25
15
10
Figure 2 Fibrinolytic activity analyzed by zymography
M, Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); 1-19 refer to enzymes from isolates RO1-19; a-k refer to enzyme
from isolates ROa-k (Red Oncom); 1.g-7.g and a.g-f.g refer to enzyme from isolates 1.g-7.g and a.g-f.g (Tempeh Gembus)
15
Table 2 Fibrinolytic fractions with various molecular weight
MW
kDa
Isolate
RO1
RO2
RO3
RO4
RO5
RO6
RO7
RO8
RO9
RO10
RO11
RO12
RO13
RO14
RO15
RO16
RO17
RO18
RO19
ROa
ROb
ROc
ROd
ROe
ROf
ROg
ROh
ROi
ROj
ROk
1.g
2.g
3.g
4.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
d.g
e.g
f.g
15-25
30-50
60-80
100-140
>160
�
PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS
DIANA NUR AFIFAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Protease Fibrinolitik
dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
setiap bagian akhir Bab pada disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor,
Desember 2014
Diana Nur Afifah
NIM F261100071
RINGKASAN
DIANA NUR AFIFAH. Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi
Oncom Merah dan Tempe Gembus. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO,
DAHRUL SYAH, dan YANTI.
Penyakit kardiovaskuler seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, dan
stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Dasar
patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan bekuan
fibrin atau trombus yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka.
Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk
dari fibrinogen oleh trombin.
Enzim fibrinolitik dari mikroba pangan telah menarik perhatian untuk
diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Genus Bacillus dari pangan fermentasi
dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto,
pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK).
Beberapa genus Bacillus lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah
ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B.
amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina,
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea, Bacillus
sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea, dan Bacillus sp. KA38 dari
jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea.
Penelitian ini berhasil mengisolasi bakteri penghasil protease fibrinolitik
dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus. Empat puluh
tiga isolat menunjukkan aktivitas proteolitik pada media skim milk agar (SMA),
dan 38 diantaranya menunjukkan aktivitas fibrinolitik baik berdasarkan uji cakram
fibrin maupun zimogram dengan substrat fibrinogen. Dua isolat terbaik, yaitu
RO3 dari oncom merah dan 2.g dari tempe gembus, dipilih untuk diidentifikasi
menggunakan kit API 50 CHB dan analisis 16S rRNA. Hasil uji biokimia
menggunakan kit API 50 CHB khusus untuk Bacillus spp, menunjukkan bahwa
isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (99,9%) dan isolat 2.g sebagai
B. pumilus (99,7%). Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA telah
dilakukan dan isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (96%) dan isolat
2.g sebagai B. pumilus (97%). Urutan nukleotida telah didaftarkan di GenBank
dengan nomor akses AB968524 untuk isolat RO3 dan AB968523 untuk isolat 2.g.
Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan untuk
keberhasilan penerapan enzim dalam industri. Pemilihan media merupakan faktor
penting untuk produksi enzim. Bacillus licheniformis RO3 ditumbuhkan pada tiga
jenis media yang berbeda, yaitu Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + susu skim 1%
(b/v) (LBS), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) (LBO). Dalam media
LB, B. licheniformis RO3 mampu menghasilkan protease dengan aktivitas
tertinggi 0,024 U/ml atau 0,157 U/mg pada jam ke-36. Dalam media LBS,
aktivitas tertinggi 0,022 U/ml atau 0,152 U/mg tercapai pada jam ke-48. Hasil
terbaik ditunjukkan pada B. licheniformis RO3 yang ditumbuhkan pada media
LBO dengan aktivitas protease tertinggi 0,051 U/ml atau 0,283 U/mg setelah 48
jam fermentasi. Hasil ini menunjukkan bahwa tepung oncom merah dapat
digunakan sebagai media yang baik untuk produksi protease fibrinogenolitik.
Protease fibrinogenolitik kasar yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan
media produksi LBO memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC.
Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa fraksi protease yang memiliki
aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah
dimurnikan dari supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan
amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CMSephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl
Sepharose 6-FF. Kemurnian enzim meningkat 16 kali lipat dengan yield 25%
pada tahap akhir pemurnian. Enzim fibrinolitik murni stabil antara pH 5 hingga
pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Aktivitas fibrinolitik meningkat dengan adanya 5
mM MgCl2 dan 5 mM CaCl2 tetapi dihambat oleh 1 mM PMSF, 1 mM SDS, dan
1 mM EDTA. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g mampu menghidrolisis
substrat sintetik N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, substrat untuk subtilisin dan
kimotripsin, secara efisien. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni
dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin kelompok subtilisin.
Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus β.g dapat mendegradasi rantai α dan β
dari fibrinogen dengan cepat tetapi tidak dapat mendegradasi rantai .
Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g menghasilkan beberapa
protease ekstraseluler. Dari tiga fraksi protease ekstraseluler B. licheniformis RO3
yang dipisahkan menggunakan elektroforesis 2D dan identifikasi menggunakan
MALDI-TOF-MS, diperoleh satu fraksi dengan BM 48 kDa dan pI 4.80 yang
memiliki kemiripan dengan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13
dengan skor protein 27. Tiga fraksi dari B. pumilus 2.g yang dipisahkan
menggunakan SDS-PAGE dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS,
dengan BM masing-masing 23, 20, dan 15 kDa juga hanya memiliki kemiripan
dengan protein database dengan skor protein ≤ 74. Kemungkinan beberapa fraksi
protein tersebut adalah baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Kata kunci: protease fibrinolitik, oncom merah, tempe gembus, Bacillus
licheniformis, Bacillus pumilus
SUMMARY
DIANA NUR AFIFAH. Fibrinolytic protease from fermented food red oncom and
tempeh gembus microorganisms. Supervised by MAGGY T. SUHARTONO,
DAHRUL SYAH, and YANTI.
Cardiovascular diseases such as heart disease, high blood pressure, and
stroke are the leading cause of death in the world, including Indonesia. Basic
pathophysiology of myocardial infarction and stroke is the formation of fibrin clot
or thrombus attached to an injured blood vessel walls. Fibrin is the major protein
component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin.
Fibrinolytic enzyme from food microbes has attracted attention for
thrombolytic agent. The genus Bacillus from fermented food can produce a strong
fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from natto, a fermented soy food from
Japan that produce nattokinase (NK). The other Bacillus from various fermented
food are B. amyloliquefaciens DC-4 from douchi, fermented soy food from China,
Bacillus sp. CK from chungkookjang, soy sauce fermentation of Korea, Bacillus
sp. DJ-2 strains and DJ-4 from doenjang, Korea, and Bacillus sp. KA38 from
jeotgal, fermented salted fish from Korea.
This study was able to isolate bacteria producing fibrinolytic proteases from
Indonesian fermented food, red oncom and tempeh gembus. Forthy-three isolates
showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them
showed fibrinolytic activities both on fibrin plate and fibrinogen zymography.
Two isolates, i.e. RO3 from red oncom and 2.g from tempeh gembus, were
selected and identified using API CHB kit and 16S rRNA. The results of
biochemical tests using API 50 CHB kit specifically for Bacillus spp, revealed
that isolate RO3 was identified as B. licheniformis (99.9%) and isolate 2.g as B.
pumilus (99.7%). Molecular identification based on 16SrRNAs gene was
performed and isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis (96%) and isolate
2.g was confirmed as B. pumilus (97%). The nucleotide sequences were deposited
at GenBank with accession number AB968524 for isolate RO3 and AB968523 for
isolate 2.g.
The high cost of enzyme production is one of the barriers to successful
application of enzyme in the industry. Selection of media is a critical factor for the
enzyme production. Bacillus licheniformis RO3 was screened from red oncom, an
Indonesian fermented food. Three types of media were analyzed, i.e. Luria-bertani
broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder
(LBO). In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease with
activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg at 36 h fermentation. In LBS media, the
highest activity was 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 h fermentation. The best
result was shown when B. licheniformis RO3 was grown on LBO media with the
highest protease activity was 0.051 U/ml or 0.283 U/mg at 48 h. These results
indicate that red oncom flour can be used as a good media for fibrinogenolytic
protease production. Crude fibrinogenolytic protease enzyme from B.
licheniformis RO3 had an optimum pH and temperature at 8.0 and 60°C.
Bacillus pumilus 2.g secretes several proteases that have strong fibrinolytic
activities. A fibrinolytic enzyme with an apparent molecular weight of 20 kDa
was purified from the culture supernatant of B. pumilus 2.g by sequential
application of ammonium sulfate precipitation 80%, ion-exchange
chromatography by using CM-Sephadex C-50, and hydrophobic chromatography
by using Phenyl-Sepharose 6-FF. After Phenyl-Sepharose chromatography step,
the final purification fold was 16.0, and the yield was 25%. The partially purified
enzyme was stable between pH 5 and pH 9 and temperature of less than 60℃.
Fibrinolytic activity was increased by 5 mM MgCl2 and 5 mM CaCl2 but inhibited
by 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium dodecyl sulfate
(SDS), and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The partially purified
enzyme quickly degrades the α and β chains of fibrinogen but cannot degrade the
chain.
Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g secretes several extracellular
proteases. Three B. licheniformis RO3 extracellular protease fractions was
separated by 2D electrophoresis and identified by MALDI-TOF-MS. One
fraction with molecular weight of 48 kDa and pI 4.80 had similiarity to
bacillopeptidase F from B. licheniformis DSM 13 in protein score, that is 27. The
three fraction of B. pumilus 2.g was separated by MALDI-TOF-MS. Each fraction
of it has molecule weight of 23, 20 and 15 kDa and protein score ≤ 74 compared
protein database. The results showed that there are some new protein fraction
found in both extracellular fibrinolytic proteases produced by Bacillus
licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g.
Keywords: fibrinolytic protease, red oncom, tempeh gembus,
licheniformis, Bacillus pumilus
Bacillus
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA
PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS
DIANA NUR AFIFAH
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc
(Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian IPB)
Dr Harsi D. Kusumaningrum
(Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian IPB)
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD
(Kepala Rumah Sakit Hewan IPB)
Raymond R Tjandrawinata, PhD
(Scientist and Corporate Development Director at Dexa
Medica)
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
disertasi dengan judul “Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi
Oncom Merah dan Tempe Gembus” ini berhasil diselesaikan. Disertasi ini
merupakan salah satu syarat untuk mencapai gelar Doktor pada Program Studi
Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Sebagian hasil penelitian dalam disertasi ini telah diajukan sebagai artikel
ilmiah pada beberapa jurnal, yaitu 1) Proteolytic and fibrinolytic activities of
several microorganisms screened from red oncom and tempeh gembus,
Indonesian fermented soybean cakes, abstraknya telah dipresentasikan secara oral
pada 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and
Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel
lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of
Microbiology, 2) The use of red oncom powder as potential production media for
fibrinogenolytic protease derived from Bacillus licheniformis RO3, telah
dipresentasikan secara oral pada International Symposium on Food and AgroBiodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014 dan artikel lengkapnya
sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science
Elsevier, 3) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from
Bacillus pumilus 2.g isolated from tempeh gembus, an Indonesian fermented food,
telah dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF)
Vol 19(3): 213-219, (4) Studi proteomik protease fibrinolitik ekstraseluler dari
Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan
fermentasi indonesia.
Terima kasih kepada Ibu Prof Dr Maggy Thenawidjaja Suhartono, Bapak Dr
Ir Dahrul Syah, MScAgr, dan Ibu Yanti, PhD selaku pembimbing yang telah
banyak memberikan motivasi, arahan, dan bimbingan hingga terselesaikannya
disertasi ini. Terima kasih kepada Prof Jeong Hwan Kim selaku pembimbing
penelitian di Gyeongsang National University, Jinju, Korea. Terima kasih kepada
penguji pada ujian tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc dan Dr Harsi D.
Kusumaningrum, serta penguji pada ujian terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST,
PhD dan Raymond R Tjandrawinata, PhD. Terima kasih kepada DIKTI,
Kemendikbud, Republik Indonesia atas bantuan beasiswa BPPS tahun 2010-2014,
bantuan program Sandwich-like tahun 2013, dan bantuan penelitian melalui
program Hibah Bersaing atas nama Prof. dr. Muhammad Sulchan, M.Sc, DA
Nutr, SpGK. Terima kasih kepada Universitas Diponegoro yang telah
memberikan bantuan pendidikan dan bantuan penelitian melalui program Hibah
Doktor dana PNBP Undip 2014. Terima kasih kepada teman-teman IPN 2010,
2011, 2012, atas kebersamaannya. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada keluarga, kedua orang tua, mertua, suami, anak-anak, kakak, adek, dan
semua pihak yang telah membantu baik dalam pelaksanaan kuliah, penelitian,
hingga penyusunan disertasi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk
pengembangan ilmu dan pengetahuan di bidang Ilmu Pangan dan bidang terkait
lainnya.
Bogor,
Desember 2014
Diana Nur Afifah
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
1
2
3
4
5
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis Penelitian
Daftar Pustaka
1
1
2
3
3
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
6
6
Tahapan Penelitian
Penelitian Tahap I
Penelitian Tahap II
Penelitian Tahap III
Penelitian Tahap IV
6
6
6
7
7
4
4
PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL
MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND
TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results
Discussion
Conclusion
References
10
THE USE OF RED ONCOM POWDER AS POTENTIAL
PRODUCTION MEDIA FOR FIBRINOGENOLYTIC PROTEASE
DERIVED FROM Bacillus licheniformis RO3
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results and Discussion
Conclusion
References
21
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF
A FIBRINOLYTIC ENZYME FROM Bacillus pumilus 2.g
ISOLATED FROM TEMPEH GEMBUS, AN INDONESIAN
FERMENTED FOOD
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results and Discussion
References
31
10
10
11
13
17
18
18
21
21
22
24
29
29
31
31
32
34
39
6
7
8
STUDI PROTEOMIK PROTEASE FIBRINOLITIK
EKSTRASELULER DARI Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus
pumilus 2.g YANG DIISOLASI DARI PANGAN FERMENTASI
INDONESIA
42
Abstrak
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
Daftar Pustaka
42
42
43
45
49
49
PEMBAHASAN UMUM
Isolasi dan Identifikasi Mikroba dari Pangan Fermentasi Oncom Merah
dan Tempe Gembus yang dapat Memproduksi Protease Fibrinolitik
Pemanfaatan Tepung Oncom Merah sebagai Media Produksi Protease
Fibrinogenolitik Mikroba
Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Fibrinolitik
Studi Proteomik Enzim Protease Fibrinolitik
dari Mikroba Pangan Fermentasi
Daftar Pustaka
52
52
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
69
69
69
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
57
59
63
65
1
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit kardiovaskular yang meliputi infark miokardial akut, penyakit
jantung iskemik, penyakit jantung valvular, aritmia, tekanan darah tinggi, dan
stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Pada tahun
2008, sekitar 17,3 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular, atau 30%
dari semua penyebab kematian global. Dari jumlah ini, 7,3 juta disebabkan oleh
penyakit jantung koroner dan 6,2 juta disebabkan oleh stroke. Pada tahun 2030
diperkirakan jumlahnya akan meningkat hingga 23,6 juta orang (WHO 2011).
Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan
trombus atau bekuan fibrin yang melekat pada dinding pembuluh darah yang
terluka. Akumulasi fibrin dalam pembuluh darah dapat mengganggu aliran darah
dan merusak jaringan pada jantung, menyebabkan denyut jantung tidak teratur,
serangan jantung, dan kematian.
Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang
terbentuk dari fibrinogen oleh trombin (Voet & Voet 1990). Serat fibrin yang
tidak larut dapat dihidrolisis menjadi produk degradasi fibrin oleh plasmin, yang
dihasilkan dari plasminogen oleh aktivator plasminogen seperti aktivator
plasminogen jaringan, aktivator plasminogen vaskular, aktivator plasminogen
darah, urokinase, faktor Hageman, dan kompleks plasminogen-streptokinase
(Collen & Lijnen 1991).
Terapi trombolitik melalui suntikan maupun oral oleh agen trombolitik
untuk mendegradasi trombus dalam darah telah banyak diteliti dan dipraktekkan
(Goldhaber & Bounameaux 2001; Tough 2005). Berdasarkan mekanisme kerjanya,
agen trombolitik diklasifikasikan menjadi dua jenis. Pertama adalah aktivator
plasminogen, seperti aktivator plasminogen jaringan (t-PA) (Collen & Lijnen
2004) dan urokinase (Duffy 2002), yang mengaktifkan plasminogen menjadi
plasmin aktif untuk mendegradasi fibrin. Jenis lainnya adalah plasmin-like protein,
yang langsung mendegradasi fibrin dalam pembekuan darah, sehingga dapat
melarutkan trombus dengan cepat dan sempurna. Lumbrokinase dari cacing tanah
dan fibrolase dari bisa ular dikenal sebagai plasmin-like protein (Chen et al. 1991;
Mihara et al. 1991). Meskipun t-PA dan urokinase masih banyak digunakan
dalam terapi trombolitik, harganya yang mahal (100 mg t-PA adalah $2,750) dan
adanya efek samping yang tidak diinginkan, seperti risiko pendarahan dalam usus
ketika dikonsumsi secara oral (Peng et al. 2005), mendorong berbagai penelitian
untuk mencari sumber agen trombolitik yang lebih murah dan lebih aman.
Enzim fibrinolitik atau dikenal sebagai protease fibrinolitik dari mikroba
telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik.
Streptokinase dari Streptococcus hemolyticus dan stafilokinase dari
Staphylococcus sp. telah terbukti efektif dalam terapi trombolitik (Collen &
Lijnen 1994). Streptokinase tersedia dalam jumlah banyak dengan harga lebih
murah (1,5x106 unit streptokinase adalah $320), namun selama proses produksi
dan pemurnian mudah terkontaminasi oleh protein lain sehingga dapat
menimbulkan efek antigenik dan jika digunakan secara berulang dalam waktu
yang lama dapat menetralkan antibodi dan menimbulkan reaksi alergi (Turpie et
al. 2002; Banerjee et al. 2004).
2
Genus Bacillus dari pangan fermentasi ternyata juga dapat menghasilkan
enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi
kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Pemberian natto atau
enzimnya secara oral tidak hanya dapat mendegradasi trombus secara langsung
namun juga dapat meningkatkan pelepasan aktivator plasminogen endogen pada
hewan percobaan dan subjek manusia (Sumi et al. 1990). Beberapa genus Bacillus
lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu
menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens
DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina (Peng & Zhang 2002),
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea (Kim et
al. 1996), Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea (Choi et al.
2005; Kim & Choi 2000), dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal, ikan asin fermentasi
dari Korea (Kim et al. 1997). Yoon et al. (2002) melakukan skrining secara
sistematis terhadap strain penghasil enzim fibrinolitik dari berbagai pangan
fermentasi komersial maupun buatan sendiri termasuk natto, chungkook-jang,
doen-jang, jeot-gal, dan tempe, pangan fermentasi dari Indonesia dan berhasil
mengisolasi Enterococcus faecalis yang mampu memproduksi enzim dengan
aktivitas fibrinolitik yang tinggi.
Berbagai temuan menarik tersebut menyiratkan bahwa dengan
mengonsumsi makanan fermentasi yang mengandung protein tinggi dapat
mencegah penyakit kardiovaskular. Mikroba penghasil enzim fibrinolitik yang
ditemukan pada pangan fermentasi selain Bacillus, diantaranya adalah Fusarium
sp. BLB dari tempe (Sugimoto et al. 2007) dan Rhizopus chinensis 12 dari arak
beras, Cina (Xiao-lan et al. 2005). Bahan pangan lain yang terbukti memiliki
aktivitas fibrinolitik diantaranya adalah jamur pangan. Sejumlah peneliti telah
melaporkan bahwa kandungan senyawa aktif dalam berbagai jamur pangan,
Cordyceps militaris (Kim et al. 2006; Choi et al. 2011), Schizophyllum commune
(Lu et al. 2010), Pleurotus eryngii (Cha et al. 2010), Volvariela volvaceae
(Sajuthi et al. 2010) yang diduga dapat mempengaruhi sirkulasi darah adalah
protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik.
Adanya manfaat biologis yang menjanjikan dari mengonsumsi makanan
sumber enzim fibrinolitik, terbuka kesempatan luas untuk mengeksplorasi sumber
enzim fibrinolitik baru dari pangan fermentasi khas Indonesia. Oncom merah dan
tempe gembus merupakan salah satu pangan fermentasi khas Indonesia yang
banyak ditemukan di daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah yang terbuat dari
fermentasi ampas kedelai. Hingga saat ini belum ada penelitian mengenai enzim
fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, baik penelitian isolasi
bakteri penghasil enzim fibrinolitiknya maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang
ada dalam oncom merah dan tempe gembus.
Perumusan masalah
Enzim fibrinolitik mikroba telah banyak ditemukan pada berbagai pangan
fermentasi, baik pada pangan fermentasi nabati maupun hewani yang memiliki
kadar protein tinggi. Penelitian mengenai enzim fibrinolitik mikroba pangan telah
banyak dilakukan di luar negeri terutama Jepang, Korea, dan Cina. Penelitian di
Indonesia mengenai enzim fibrinolitik mikroba masih terbatas padahal Indonesia
dikenal sebagai negara yang kaya akan pangan fermentasi.
3
Kacang-kacangan seperti kedelai dan hasil perikanan yang difermentasi
ternyata memiliki aktivitas fibrinolitik yang kuat. Pangan fermentasi kedelai yang
terkenal di Indonesia adalah tempe, oncom, dan tempe gembus. Berbeda dengan
tempe, oncom dan tempe gembus merupakan pangan fermentasi ampas kedelai.
Ampas kedelai atau lebih dikenal sebagai ampas tahu adalah limbah hasil
pembuatan tahu. Aktivitas fibrinolitik kuat dari mikroba yang diisolasi dari tempe
telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Namun penelitian mengenai enzim
fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, terutama mengenai
isolasi mikroba penghasil enzim fibrinolitik maupun ekstraksi enzim fibrinolitik
yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus belum pernah dilaporkan.
Dalam aplikasi khusus enzim pemecah fibrin, temuan mikroba fibrinolitik
lokal adalah tahap awal yang harus diikuti tahap berikutnya yaitu mencari media
produksi yang efektif dan efisien. Tingginya biaya produksi enzim merupakan
salah satu hambatan suksesnya aplikasi enzim di industri. Pemilihan media
produksi merupakan faktor kritis untuk fermentasi enzim fibrinolitik.
Karakteristik enzim fibrinolitik mikroba pangan yang sudah terbukti aman
dan efektivitasnya sebagai agen trombolitik perlu diketahui dengan baik.
Karakteristik ini dapat diketahui menggunakan analisis biokimia. Informasi
karakter enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi asal Indonesia sangat
diperlukan dalam aplikasi sebagai pangan fungsional maupun pengembangan
selanjutnya sebagai obat trombolitik yang aman.
Dari latar belakang yang telah dikemukakan, dirumuskan beberapa masalah
yang dikaji lebih lanjut dalam penelitian, yaitu: apakah di dalam oncom merah
dan tempe gembus ditemukan adanya mikroba penghasil protease yang bersifat
fibrinolitik, apakah tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media untuk
menumbuhkan mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinogenolitik,
bagaimanakah karakteristik dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh mikroba
terpilih setelah dilakukan pemurnian?
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian yang dilaksanakan adalah melakukan kajian
terhadap protease fibrinolitik mikroba dari oncom merah dan tempe gembus.
Tujuan khusus dari penelitian yang dilaksanakan adalah: (1) memilah dan
mengidentifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe
gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) memperoleh media
yang baik untuk produksi enzim dengan pemanfaatan tepung oncom merah, (3)
melakukan pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba
terpilih, (4) melakukan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba
pangan fermentasi.
Manfaat Penelitian
Penelitian yang dilaksanakan bermanfaat untuk memperoleh informasi
keberadaan mikroba penghasil enzim fibrinolitik pada pangan fermentasi berbasis
kedelai asal Indonesia, oncom merah dan tempe gembus, dan informasi karakter
dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan. Informasi ini berguna untuk
4
pengembangan pangan fungsional maupun pemanfaatan enzim sebagai obat
trombolitik.
Hipotesis Penelitian
1.
2.
3.
4.
Di dalam oncom merah dan tempe gembus terdapat mikroba penghasil
protease fibrinolitik.
Tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba
penghasil protease fibrinogenolitik.
Enzim yang dihasilkan memiliki karakteristik tertentu uang selanjutnya dapat
diaplikasikan dalam pengembangan pangan fungsional maupun dimanfaatkan
sebagai obat untuk terapi penyakit kardiovaskular.
Terdapat beberapa fraksi protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi
terpilih.
Daftar Pustaka
Banerjee A, Chisti Y, Banerjee UC. Streptokinase-a clinically useful thrombolytic
agent. Biotechnology Advances 22:287–307.
Cha WS, Park SS, Kim SJ, Choi D. 2010. Biochemical and enzymatic properties
of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state
conditions using corn cob. Bioresource Technology 101:6475–6481.
Chen HM, Guan AL, Markland FS. 1991. Immunological properties of the
fibrinolytic enzyme (fibrolase) from southern copperhead (Agkistrodon
contortrix contortrix) venom and its purification by immunoaffinity
chromatograph. Toxicon 29(6):683–694.
Choi D, Cha W, Park N, Kim H, Lee JH, Park JS, Park S. β011. Purification and
characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of
Korean Cordyceps militaris. Bioresource Technology 102:3279–3285.
Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim
SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase,
bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp.
DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79.
Collen D, Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical
perspective and personal account. J Thromb Haemost 2(4):541–546.
Collen D, Lijnen HR. 1994. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen
activator with therapeutic potential? Blood 84(3):680–686.
Collen D, Lijnen HR. 1991. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and
thrombosis. Blood 78:3114-3124.
Duffy MJ. 2002. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as
prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence studies.
Clin Chem 48(8): 1194–1197.
Goldhaber SZ, Bounameaux H. 2001. Thrombolytic therapy in pulmonary
embolism. Semin Vasc Med 1(2):213–220.
Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Hiep NT, Kim CS, Choi HS, Kim
MK, Chun HS et al. 2006. A fibrinolytic enzyme from the medicinal
mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology 44(6):622-631.
5
Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4
secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci
Biotechnol Biochem 64:1722–1725.
Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997.
Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from
Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4):
307–312.
Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic
enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from
Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62:2482-2488.
Lu CL, Chen S, Chen SN. 2010. Purification and Characterization of a Novel
Fibrinolytic Protease from Schizophyllum commune. Journal of Food and
Drug Analysis 18(2):69-76.
Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikedo R, Seiki M, Maruyama M.
1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus
rubellus. Jpn J Physiol 41(3): 461–472
Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of
source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl
Microbiol Biotechnol 69:126–132.
Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi
fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J
Appl Environ Biol 8:285-289.
Sajuthi D, Suparto I, Yanti, Praira W. 2010. Purifikasi dan pencirian enzim
protease fibrinolitik dari ekstrak jamur merang. Makara sains 14(2):145-150.
Sugimoto S, Fujii T, Morimiya T, Johdo O, Nakamura T. 2007. The fibrinolytic
activity of a novel protease derived from tempeh producing fungus,
Fusarium sp. BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184-2189.
Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the
fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta
Haematol. 84:139-143.
Turpie AG, Chin BS, Lip GY. 2002. Venous thromboembolism: treatment
strategies. British Medical Journal 325:948–950.
Tough J. 2005. Thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Nurs Stand
19(37):55–64.
Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Wiley. hlm 1087-1095.
WHO. 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010.
World Health Organization. Geneva.
Xiao-lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X. 2005. Purification and
characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12.
Appl Microbiol Biotechnol 67(2): 209–214.
Yoon SJ, Yu MA, Sim GS, Kwon ST, Hwang JK, Shin JK, Yeo IH, Pyun YR.
2002. creening and characterization of microorganisms with fibrinolytic
activity from fermented foods. J Microbiol Biotechnol 12(4): 649–656.
2 METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai November 2013
di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati,
IPB, Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST center IPB,
Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Universitas Katholik Atma Jaya
Jakarta, dan Laboratorium Mikrobiologi, Gyeongsang National University, Jinju,
Korea.
Tahapan Penelitian
Penelitian akan melalui tiga tahapan, yaitu (1) isolasi dan identifikasi
mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat
memproduksi protease fibrinolitik, (2) pemanfaatan tepung oncom merah sebagai
media produksi protease fibrinogenolitik mikroba, (3) pemurnian dan karakterisasi
enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) studi proteomik enzim protease
fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi.
Penelitian Tahap I
Penelitian tahap pertama adalah isolasi mikroba penghasil protease
fibrinolitik dengan menggunakan media SMA. Sampel yang digunakan adalah
oncom merah segar, oncom merah yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit,
tempe gembus segar, dan tempe gembus yang telah dipanaskan 80oC selama 15
menit. Mikroba yang mampu menghasilkan zona bening ditumbuhkan dalam
media Luria Bertani broth (LB) agar dapat memproduksi protease fibrinolitik.
Protease fibrinolitik yang dihasilkan diuji aktivitasnya secara kuantitatif
menggunakan cakram fibrin (Hwang et al. 2007) dan kualitatif dengan teknik
zimografi. Substrat yang digunakan untuk zimografi adalah fibrinogen. Mikroba
terpilih adalah yang mampu menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi
substrat yang ditandai dengan adanya garis bening pada gel. Pada tahap isolasi
diutamakan untuk mendapatkan mikroba yang aman dan dapat memproduksi
protease fibrinolitik dengan berat molekul yang relatif rendah.
Mikroba terpilih kemudian disimpan dalam gliserol sebagai stok bakteri
untuk pengujian selanjutnya. Mikroba yang diharapkan adalah Bacillus yang
aman dikonsumsi sehingga pemilihan isolat dilakukan dengan tahapan identifikasi
isolat sebagai berikut: pewarnaan Gram yang dilanjutkan dengan pewarnaan spora,
uji biokimiawi dengan kit API 50CHB dan APIWEBTM software, dan identifikasi
secara molekuler dengan analisis 16S-rRNA.
Penelitian Tahap II
Tujuan dari tahap ini adalah pemanfaatan tepung oncom merah sebagai
media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik. Mikroba yang
dipilih adalah B. licheniformis RO3 yang diisolasi dari oncom merah. Mikroba
ditumbuhkan dalam tiga media yang berbeda, yaitu media Luria Bertani broth
7
(LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v)
pada suhu 37oC dalam inkubator goyang. Optical density (OD620), aktivitas
protease (Bergmeyer & Grassl 1983), aktivitas fibrinogenolitik secara kualitatif
dengan zimografi, dan konsentrasi protein (Bradford 1976) diukur setiap 12 jam
sekali selama 72 jam.
Penelitian Tahap III
Penelitian tahap ketiga merupakan tahap pemurnian dan karakterisasi enzim
yang dihasilkan oleh mikroba terpilih. Mikroba yang dipilih adalah B. pumilus 2.g
yang diisolasi dari tempe gembus. Sebelum dilakukan pemurnian, pemilihan
media produksi dilakukan pada 4 media yang berbeda, yaitu Luria Bertani broth
(LB), tryptic soy broth (TSB), nutrient broth (NB), dan brain heart infusion (BHI).
Pemurnian enzim dilakukan dengan pengendapan amonium sulfat, kromatografi
penukar ion, dan kromatografi interaksi hidrofobik. Karakteristik yang diamati
adalah berat molekul, stabilitas pH, stabilitas suhu, pengaruh inhibitor dan
aktivator, spesifisitas substrat, dan degradasi fibrinogen.
Penelitian Tahap IV
Penelitian tahap keempat merupakan studi proteomik enzim protease
fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Mikroba yang dipilih adalah B.
licheniformis RO3 dengan media produksi ½ LB + tepung oncom merah 1%
(LBO) dan B. pumilus 2.g dengan media produksi NB. Studi proteomik diawali
dengan elektroforesis satu dimensi, kemudian elektroforesis dua dimensi dan
dilanjutkan identifikasi protein dengan Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF).
9
Tahap I
Isolasi dan identifikasi mikroba
dari pangan fermentasi oncom
merah dan tempe gembus yang
dapat memproduksi protease
fibrinolitik
Sampel
Tahap II
Pemanfaatan tepung
oncom merah sebagai
media produksi protease
fibrinogenolitik mikroba
Mikroba terpilih
B. licheniformis RO3
Isolasi pada media SMA
Fermentasi pada 3 media
yang berbeda
Isolat
Produksi pada media LB
Enzim
(supertnatan)
Uji aktivitas protease,
konfirmasi kemampuan
fibrinolitik dengan cakram
fibrin dan zimografi
Enzim
(supernatan)
Uji aktivitas protease,
aktivitas fibrinolitik dan
konsentrasi protein
Pengukuran
OD620
Kondisi pertumbuhan
terpilih
Identifikasi isolat:
Pewarnaan gram dan
spora
Uji biokimiawi dengan
API 50CHB
Analisis 16S-rRNA
Produksi enzim
Supernatan
Freezing dry
Dua mikroba
terpilih
Pelet (Enzim kasar)
Karakterisasi
biokimia enzim
Gambar 1 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap I dan II
9
Tahap III
Pemurnian dan
karakterisasi enzim
fibrinolitik mikroba
Mikroba terpilih
B. pumilus 2.g
Tahap IV
Studi proteomik protease dari
mikroba pangan fermentasi
Mikroba terpilih
B. licheniformis RO3
Mikroba terpilih
B.pumilus 2.g
Fermentasi pada 4
media yang berbeda
Produksi enzim
Produksi enzim
Kondisi pertumbuhan
terpilih
Supernatan
Enzim murni
Elektroforesis satu dimensi
(SDS-PAGE)
Elektroforesis satu dimensi
(SDS-PAGE)
Elektroforesis dua dimensi
(2D)
MALDI-TOF
MALDI-TOF
Identifikasi
Produksi enzim
supernatan
salting-out dengan
amonium sulfat
pelet
Identifikasi
dialisis dan freeze dry
Enzim kasar
Kromatografi penukar ion,
dialisis, freeze dry
Enzim semi murni
Kromatografi interaksi
hidrofobik, dialisis, freeze
Enzim murni
Karakterisasi
biokimia enzim
Gambar 2 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap III dan IV
10
3
PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL
MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND
TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES1
Abstract
This study was to isolate, screen, and identify microorganisms from
fermented food Red Oncom and Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic
proteases. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar,
while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on a fibrin plate and
a fibrinogen zymography. The isolates that showed activity in fibrin plate and
fibrinogen zymography with lower molecular weight and considered as safe were
chosen and identified as Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus by using API
CHB kit and 16S rRNA. The novel fibrinolytic microorganisms were referred to
as B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Red Oncom and Tempeh Gembus are
potential sources of microbial fibrinolytic protease. This is the first time that Red
Oncom and Tempeh Gembus as Indonesian fermented foods based on soybean
cake were shown having fibrinolytic microorganism. Microbial fibrinolytic
enzymes from these fermented foods can be used for functional food formulation
to prevent thrombosis and other related diseases.
Keywords: microbial fibrinolytic enzyme, red oncom, zymography,
B. licheniformis, B. pumilus
Introduction
Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world,
including in Indonesia (WHO 2011). Accumulation of fibrin in the blood vessels
usually results in thrombosis, leading to myocardial infarction and other
cardiovascular diseases (Peng et al. 2005). Fibrin is the major protein component
of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin. Insoluble fibrin
can be hydrolyzed to fibrin degradation products by plasmin, which is generated
from plasminogen by plasminogen activators such as tissue plasminogen activator,
vascular plasminogen activator, blood plasminogen activator, urokinase, Hageman
factor and plasminogen-streptokinase complex (Collen and Lijnen 2004).
Thrombolytic therapy by injection and oral thrombolytic agents to degrade
the thrombus in the blood have been widely studied and practiced (Tough 2005).
Based on its mechanism of action, thrombolytic agents are classified into two
types. The first is a plasminogen activator, such as tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase which activates plasminogen to plasmin and further
hydrolyses fibrin (Collen and Lijnen 2004). Other type for thrombolytic therapy is
using plasmin-like proteins, which directly degrade fibrin in the blood clotting,
thus dissolve the thrombus quickly and perfectly. Lumbrokinase of earthworms
and fibrolase of snake venom are known as plasmin-like protein (Mihara et al.
1991). Although t-PA and urokinase are still widely used in thrombolytic therapy,
its price and the side effects possibility of undesirable such as the risk of bleeding
in the gut when taken orally (Peng et al. β005), prevent it’s normal utilization.
1
Abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4 th Annual International Symposium on
Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013,
sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of
Microbiology
11
This encourages study to find the source of thrombolytic agent that is cheaper and
safer.
Fibrinolytic enzyme originated from microbes has attracted the attention of
many researchers to be applied as a thrombolytic agent. Streptokinase from
Streptococcus hemolyticus and Staphylokinase from Staphylococcus sp. are
potential alternative plasminogen activator and had proven effective in
thrombolytic therapy (Banarjee et al. 2004). However, Streptokinase is available
in large quantities at high prices and during the production and purification is
easily contaminated by other proteins that can cause antigenic effect. Furthermore,
repeated use for a long time can induce allergies (Banerjee et al. 2004).
Recently, many fibrinolytic enzymes have been identified from traditional
fermented foods such as Japanese Natto (Fujita et al. 1993), Chinese Douchi
(Peng and Zhang 2002), Korean Doen-jang (Choi et al. 2005), Korean
Cheonggukjang (Jeong et al. 2007) and Korean Meju (Jo et al. 2011a). These
interesting reports imply some fermented foods contain enzymes that can
potentially prevent cardiovascular diseases. This fact opens opportunities to
explore new sources of fibrinolytic enzyme from typical Indonesian fermented
food. Red Oncom and Tempeh Gembus are two of the typical Indonesian
fermented foods made from fermented soy pulp. Until now there has been no
research on the fibrinolytic enzyme from Red Oncom and Tempeh Gembus, either
isolation of bacteria producing enzymes or extraction of fibrinolytic enzyme
present in Red Oncom and Tempeh Gembus. The purpose of this study was to
isolate, screen, and identify microbes from fermented food Red Oncom and
Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic proteases.
Materials and Methods
Materials
Red oncom was obtained from the traditional markets in Bogor, West Java,
whereas Tempeh Gembus was obtained from the traditional markets in Semarang,
Central Java. Growth media including skim milk agar (SMA) was purchased from
Difco. Luria-Bertani broth (LB) was made from yeast extract and tryptone were
purchased from Oxoid. Fibrinogen from bovine plasma was purchased from
Sigma. API 50CHB kit was purchased from bioMerieux.
Isolation of Proteolytic Bacterial Strain
Heat pretreatment at 80oC for 15 min was applied to some of the samples to
avoid possible pathogen contamination. One-tenth gram of the sample was
suspended in sterile physiological saline (0.85% NaCl). The suspension was
plated on sterile skim milk agar (SMA), and then incubated at 37oC for 48 h. A
clear zone of skim milk hydrolysis gave an indication of protease producing
organisms. At the end of incubation period, the protease colonies were picked,
purified and sent for further fibrinolytic screening.
Fibrinolytic protease production
A loop of selected microorganisms was cultivated in 25 mL LB broth and
incubated at 37oC in a shaking incubator (120 rpm) for 48 h. At the end of
12
incubation, the fermentation broth was centrifuged at 6000 g at 4oC for 15 min.
The clear supernatant was collected as source of enzyme.
Analysis of protease activity and protein determination
Protease activity was measured according to the Bergmeyer method
(Bergmeyer et al. 1λ83) with casein (1%) as the substrate. As much as 50 l
enzyme filtrate was mixed with 250 l substrate and incubated at 37oC for 10 min.
Trichloroacetic acid (TCA) 0.1 M was added and incubated at 37oC for 10 min,
and centrifuged at 4000 g for 10 min. The supernatant was mixed with Na2CO3
0.4 M, followed by addition of Folin Ciocalteau reagent (1:2) and incubated
further at 37°C for 20 min. The reaction products were measured at
578 nm.
Substrate solution without enzyme was used as control. One unit (U) of enzyme
activity was defined as enzyme which produces 1 mol of tyrosine per min.
Protein concentration was analysed by Bradford’s method (1λ76) using
reagents consisted of 100 mg Coomassie brilliant blue (CBB) G-250 in 50 ml
ethanol 95% and 100 ml phosphate acid 85% in 1 liter. Bovine serum albumin
was used as the protein standard. Triplicate experiments were conducted for each
measurement.
Screening of Fibrinolytic Bacterial Strain
Fibrinolytic bacterial strain was screened by fibrin plate and fibrinogen
zymography (Hwang et al. 2007). 0.2% fibrinogen solution in 50 mM sodium
phosphate buffer (pH 8) was mixed with 2% agarose solution along with 0.02 ml
of a thrombin solution (100 NIH units). The solution was applied to a petri dish
and left for 1 h at room temperature to form a fibrin clot layer. Twenty l of the
enzymes was dropped onto a fibrin plate and incubated at 37oC for 5 h. The
activity of fibrinolytic enzyme was estimated by measuring the dimensions of the
clear zone on the fibrin plate. Fibrinogen zymography was carried out in 12%
polyacrylamide gels containing 0.1% fibrinogen. The enzymes were diluted in 5x
sample buffer, which consisted of 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 2%
SDS, and 0.1% bromophenol blue. Electrophoresis was carried out at 70 V and 50
A for 4 h until the bromophenol blue reached the bottom of the gel. After
electrophoresis, the gel was soaked in 2.5% Triton X-100, for 1 hour at room
temperature for enzyme renaturation. The gel was washed with distilled water to
remove Triton X-100, and then incubated with 50 mM phosphate buffer (pH 8) at
37oC for 12 hours. The gel was stained with Coomassie blue for 1 h and then
destained. The clear bands, correspond to the areas where fibrinogen was digested.
Identification of microorganisms
Identification of microorganisms followed three steps. First is microbiology
analysis i.e. Gram staining, spore staining, and morphological examination.
Second is biochemical tests with API 50CHB kit for Bacillus spp. followed by
identification using Apiweb™ software. Third is molecular identification for the
best fibrinolytic bacterial strain. The selected microorganisms were enriched, and
its 16SrRNAs were analyzed in order to identify the microorganisms at the
species level. Amplification of 16SrRNA was performed with universal primers,
63Fμ 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ and 1387Rμ 5’-GGG CGG
WGT GTA CAA GGC-3’, using a 2720 thermal cycler (Applied Biosystems).
13
PCR products was isolated from the agarose gel and sequenced with a BidDye
Terminator v3.1 cycle sequencing chemistry, genetic analyzer 3730XL (Applied
Biosystems). A sequence similarity search was performed using BLAST in the
NCBI database.
Results
Proteolytic activity of several microorganisms
Isolation of microbes from Red oncom and Tempeh Gembus revealed 43
isolates, 30 isolates from Red Oncom and 13 isolates from Tempeh Gembus that
produce protease enzyme characterized by their ability to produce clear zones on
the SMA plate. Figure 1 showed the clearing zone observed from the best
proteolytic microorganism when grown in SMA. Isolates tested were: RO3 and
2.g.
RO3
2.g
Figure 1 Proteolytic activity of several microorganisms
Fibrinolytic and fibrinogenolytic activity of several microorganisms
Fibrinolytic activity on the fibrin plate showed that 40 isolates were able to
produce a clear zone. The activity of fibrinolytic enzyme was estimated by
measuring the dimensions of the clear zone on the fibrin plate (Table 1).
Table 1 Fibrinolytic activities on fibrin plate
Isolate
Fibrinolytic
Isolate
Fibrinolytic
activities (cm)
activities (cm)
RO1
0.90±0.10
RO16
0.47±0.15
RO2
0.87±0.15
RO17
0.37±0.12
RO3
1.00±0.10
RO18
0.33±0.06
RO4
None
RO19
0.30±0.00
RO5
1.23±0.25
ROa
0.50±0.00
RO6
0.97±0.12
ROb
0.37±0.12
RO7
1.23±0.15
ROc
0.33±0.06
RO8
1.13±0.32
ROd
0.50±0.10
RO9
0.67±0.15
ROe
0.30±0.00
RO10
0.47±0.15
ROf
0.30±0.00
RO11
1.35±0.35
ROg
0.80±0.14
RO12
None
ROh
0.30±0.00
RO13
None
ROi
0.33±0.14
RO14
0.87±0.21
ROj
0.35±0.07
RO15
1.17±0.06
ROk
0.35±0.07
Isolate
1.g
2.g
3.g
4.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
d.g
e.g
f.g
---
Fibrinolytic
activities (cm)
0.90±0.00
1.45±0.07
0.90±0.14
1.00±0.00
0.70±0.14
1.00±0.00
0.45±0.07
0.50±0.00
0.50±0.00
0.35±0.07
0.30±0.00
0.30±0.00
0.35±0.07
---
kDa
M
1
kDa
M
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
3.g
4.g
14
15
16
17
18
19
a
b
c
d
d.g
e.g
f.g
260
140
100
70
50
40
35
25
15
10
e
f
g
h
i
j
k
1.g
2.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
260
140
100
70
50
40
35
25
15
10
Figure 2 Fibrinolytic activity analyzed by zymography
M, Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); 1-19 refer to enzymes from isolates RO1-19; a-k refer to enzyme
from isolates ROa-k (Red Oncom); 1.g-7.g and a.g-f.g refer to enzyme from isolates 1.g-7.g and a.g-f.g (Tempeh Gembus)
15
Table 2 Fibrinolytic fractions with various molecular weight
MW
kDa
Isolate
RO1
RO2
RO3
RO4
RO5
RO6
RO7
RO8
RO9
RO10
RO11
RO12
RO13
RO14
RO15
RO16
RO17
RO18
RO19
ROa
ROb
ROc
ROd
ROe
ROf
ROg
ROh
ROi
ROj
ROk
1.g
2.g
3.g
4.g
5.g
6.g
7.g
a.g
b.g
c.g
d.g
e.g
f.g
15-25
30-50
60-80
100-140
>160
�