ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA - Repository Universitas Muhammadiyah Semarang

  1

  

PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA

FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

Manuscript

  

Disusun oleh :

Nining Mony

G1C217189

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

  

2018

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  2

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

  1 Muhammadiyah Semrang 50273

  E-mail: niningn223@gmail. com

  3

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273

  2 E-mail: niningn223@gmail. com

  4

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

  1

  2

  3 Nining Mony , Stalis Norma Ethica , Ana Hidayati Mukromah 1.

  Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas _. Muhammadiyah Semrang

  

2. Laboratorium Paologi Klinik Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah

Semarang

  3. Laboraorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah Semarang Info Artikel Abstrak

  Enzyme is a complex molecule of proteins are produced by living and working cells as catalyst in various chemical processes in the body . In Keywords: medical world, enzyme proteases used as medical therapy for treatment Identifikasi molekuler, of tumors , inflammation, an abnormality of blood and arrangement of bakteri proteolitik, gen immunity . The purpose of this research is to know the presence of

  16S rRNA, Bacillus bacteria producing protease that is found in the tempe gembus after cereus fermentation 48 hours, as well as to find out the type of bacteria producing protease that is found in tempe gembus after fermentation 48 hours based on 16S rRNA gene analysis. The process of isolation and purification bacteria colonies is done on media nutrient agar by using speread method, while production of enzyme proteases test carried out using selective media skim milk Agar (SMA). Molecular identification process based on 16S rRNA gene sequence analysis done by Polymerase Chain Reaction (PCR), and followed by sequencing. From the process of isolation obtained results in from of a single isolate bacterial have proteolytic activity is demonstrated by the existence of a clear zone of Skim Milk Agar media that have a sizeable diameter is 85.00 mm.

  Based on 16S rRNA gene sequence analysis showed that proteolytic bacteria isolates in this study, That isolation ISTD 2.1 has a semblance of 98% 16S rRNA gene fragments with isolates of bacteria Bacillu cereus KAVK5 ( genbank the access codes: kp792776.1 ) . Based on the results of this research it can be concluded that isolates ISTD 2.1 potential producers of proteolytic enzymes and based on molecular identification of isolates, ISTD, exercised 2.1 expressed as Bacillus cereus ISTD1

(Indonesian Soybean Tempeh Day-1).

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  5

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah

Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com PENDAHULUAN

  Tempe merupakan makanan tradisional khas dan telah dikenal lama di fermentasi Indonesia. Dalam SNI 3144 - 2009 tempe didefinisikan sebagai produk makanan hasil biji kedelai oleh jamur tertentu, berbentuk padatan kompak, berbau khas serta berwarna putih atau sedikit keabu-abuan, dan beraroma khas tempe. Salah satu yang mendukung popularitas tempe di kalangan internasional adalah kandungan gizi tempe yang cukup tinggi. Berdasarkan kandungan nutrisi makro pada tempe, 100 g tempe segar dapat berkontribusi pada 16.9-17.9 g protein, 20-20.1 g lemak, dan 21.5-27.6 g karbohidrat dengan energi sebesar 350.5-380.8 kalori (Efriwati dan Nuraida 2013).

  Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme penghasil enzim yang paling banyak digunakan sebagai sumber enzim. Bakteri lebih dianggap menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang relatif murah dan mampu menghasilkan enzim (Akhdiya, 2003).

  Protease adalah enzim yang berperan dalam reaksi biokatalis yang menyebabkanpemecahan protein. Enzim protease dapat dihasilkan oleh tanaman, hewan maupun mikroorganisme seperti bakteri. Indonesia merupakan salah satu negara yang telah memanfaatkan enzim protease dalam bidang industri. Protease digunakan dari berbagai aplikasi industri seperti detergen, farmasi, produk-produk kulit dan produk- produk makanan (Fatoni dkk., 2008).

  Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode molekuler untuk membuat salinan segmen spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklon gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro (Campbell, 2002). Gen pengkode

  16S rRNA terdapat bagian penyimpan yangberguna untuk mendisain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa fragmen gen 16S rRNA dari semua bakteri patogen dan nonpatogen. Fragmen ini termasuk bagian hipervariable yang tidak mudah termutasi dan mengandung tanda urutan spesifik spesies yang berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga ke level spesies (Israhmadini, 2008).

  Penelitian ini perlu dilakukan karena pada penelitian sebelumnya telah dilaporkan adanya bakteri penghasil dari protease yang dihasilkan dari fermentasi tempe gembus. Namun belum ada laporan tentang isolasi bakteri proteolitik dari sampel yang sama pasca fermentasi. Penelitian ini adalah bagian dari penelitian tentang keanekaragaman bakteri proteolitik yang terdapat pada bahan makanan sumber protein hasil fermentasi yang ada di Indonesia.

  METODE dan BAHAN

  Jenis penelitian yang digunakan merupakan analisis deskriptif. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian adalah cawan petri, mikropipet, inkubator, autoklaf, oven, hot plate, tabung reaksi, erlenmeyer, rak tabung, gelas ukur, laminar, lampu spirtus, ose jarum, pinset, neraca analitik, mikrotube, waterbath, vortex,

  termal cyler , cetakan gel agarose, alat

  elektroforesis, power supply , ultraviolet transilluminator , dan tabung ependrof.

  Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sampel tempe gembus, NaCl fiologis, dH ^{2 O, kapas dan kasa, plastik dan} plastik wrap, aluminium foil, kertas label, media Skim Milk Agar, aquades, Nuclease free water (NFW), Promega Kit, Etanol absolut 70%, TE Buffer, DNA Template (isolat DNA genom /total), PCR Master Mix (Promega), Primer Forward 8F 16S rRNA, Primer Reverse 1492R 16S rRNA, gel agarose, Loading dye, Larutan Tris Borat EDTA, media Nutrien

  

  6

  Agar , dan Ethidium Bromida HASIL PENELITIAN Gambaran Sampel

  Setelah dilakukan penelitian mengenai (a) ISTD2.1 (b) ISTD2.2 (c) ISTD2.3 isolasi dan identifikasi molekuler bakteri penghasil protease pada tempe gembus pasca fermentasi 48 jam maka diperoleh hasil sebagai berikut:

  Setelah difermentasi 2 hari tempe gembus yang awalnya semua putih berubah (d) ISTD2.4 (e) ISTD2.5 menjadi sedikit kecoklatan disertai tekstur lembek dan sedikit berair serta agak berbau,

  Gambar 2. (a) Karakteristik morfologi isolat tertera pada Gambar 1 bakteri

  ISTD2.1 (b) bakteri

  ISTD2.2 (c) bakteri ISTD2.3 (d) bakteri

  ISTD2.4 (e) bakteri

  ISTD2.5

  Tabel 1 Morfologi Koloni Bakteri

  (a) (b) Gambar 1. (a) Tempe gembus sebelum fermentasi 48 jam (b) Tempe gembus pasca fermentasi 48 jam

  Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri

  Dari Tabel 1. Diketahui mayoritas Total bakteri koloni yang ditemukan bakteri berbentuk bulat. Sedangkan dari dari isolasi satu sampel tempe gembus pasca karakteristik warna mayoritas warna koloni fermentasi 48 jam didapatkan sebanyak 5 putih dan kuning. Selanjutnya ditemukan koloni bakteri murni dengan morfologi klobi yang mempunyai tepi rata. Dari segi koloni yang berbeda. Karakteristik morfologi elevasi, semua kloni mempunyai elevasi pada masing-masing koloni bakteri yang cambung dan mempunyai ukuran besar, keil didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca dan sedang dengan kosisten tidak berlendir fermentasi 48 jam, koloni dapat dilihat pada

  Pewaarnaan Gram gambar 2 dan tabel 1 Koloni bakteri yang ditemukan pada isolasi bakteri pada sampel tempe gembus pasca fermentasi 48 jam diidentifikasi karakteristik dan jernihnya berdasarkan pewarnaan Gram.

  Hasil pewarnaan Gram koloni bakteri didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca fermentasi 48 jam dapat dilihat pada tabel 2

  Tabel 2. Pewarnan Gram Bakteri

  Sampel Hasil Pewarnaan Gram

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  Hasil amplifiksi dicek dengan uji elektroforesis, dan hasilnya ditunjukkan pada gambar 4 adalah sebagai berikut:

  Pada gambar 3 dapat dilihat aktivitas protease isolat ISTD2.1 pada media agar yang mengandung substrat susu milk agar. Terlihat adanya zona bening atau zona protease yang memenuhi permukaan petri disekitar koloni bakteri.

  Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain. Prinsip metode ini yaitu isolasi Genom dilakukan dengan cara penghancur (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti protein dan pemurnian DNA, sel tersebut diharapkan akan pecah dan DNA genom keluar dari sel. Hasil isolasi DNA genom yang ditunjukkan pada gambar 4. memperlihatkan adanya satu pita DNA yang menujukkan adanya DNA genom dari hasil isolasi.

  3 perhitungan nilai absorbansi pada merupakan hasil kemurnian isolat DNA genom bakteri berupa nilai absorbansi. Isolat DNA genom yang diperoleh akan digunakan sebagai template atau cetakan dalam proses PCR untuk amplifikasi fragmen gen 16S rRNA bakteri. Berdasarkan hasil perhitungan absorbansi dapat dikatakan genom bakteri dengan kemurnian yang cukup dapat digunakan sebagai template untuk PCR gen 16S rRNA.

  2.38 Dari tabel

  1 ISTD2.1 54.5 ng/µl 1.091 0.458

  A260 A280 260/ 280

  ID Nucleic Acid Conc

  Tabel 3. Hasil Nilai Absorbansi isolasi DNA genom isolat ISTD2.1 No Sampel

  Pengukuran dilakukan menggunakan alat jangka sorong. Selanjutnya dilakukan isolasi genom bakteri penghasil protease untuk keperluan identifikasi molekuler

  Berdasarkan hasil uji enzimatik gambar 3, isolat ISTD2.1 mempunyai aktivitas proteolitik dengan diameter zona bening yang relatif besar yaitu 85,00 mm.

  susu milk agar

  7

  Hasil uji enzimatik penghasil protease isolate ISTD2.1 yang dilakukan pada media skim milk agar dapat dilihat pada gambar 3 sebagai berikut: Gambar 3. Uji enzimatik protease pada media

  Koloni bakteri yang telah diisolasi dan identifikasi kemudian dilakukan uji enzimatik untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memecah protein.

  Uji Enzimatik Penghasil Protease

  ISTD2.5 Basil Gram-positif Berdasarkan Tabel 2 pewarnaan Gram yang telah dilakukan, mayoritas bakteri berbentuk kokus dan merupakan kelompok Gram-positif. Namun demikian ditemukan pula bakteri yang berbentuk basil baik Gram- positif maupun Gram-negatif. Dari koloni yang ada, dipilih satu isolat dengan bentuk sel yang unik yaitu isolat kode ISTD2.1 untuk dilanjukan pada uji penghasilan enzim protease menggunakan media Skim Milk Agar (SMA).

  ISTD2.4 Kokus Gram-negatif

  ISTD2.3 Basil Gram-positif

  ISTD2.2 Basil Gram-positif

  ISTD2.1 Basil Gram-negatif

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  8

• – masing pengenceran di ambil 1 ml lalu diratakan diatas media Nutrient Agar menggunakan triangle. Kemudian di inkubasi selama 24-48 jam pada temperatur 37 ^o C.
• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com (b) (a)

  Gambar 4. Hasil Amplifikasi Fragmen 16S rRNA isolasi ISTD2.1 (a) Marker (b) Sampel ISTD2.4

  Pada gambar 4 dapat dilihat hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada gel elektroforesis berupa pita atau band DNA tunggal berukuran sekitar 1500 bp. Karena hasil amplifikasi 16S rRNA didapatkan pita gen 16S rRNA pada 1500 bp yang sesuai dengan ukuran gen tersebut pada bakteri, maka pekerjaan penelitian dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing. Hasil Sekuensing

  Dari hasil sekuensing Gen 16S rRNA didapatkan kemiripan 98% dengan fragmen gen 16S ribosomal RNA isolate bakteri Bacillus cereus strain KAVK5 (Genbank kode akses : KP792776.1) sehingga isolat diberi nama Bacillus cereus ISTD1 (ISTD1 = Indonesian Soybean Tempeh Day-1).

  DISKUSI

  Penelitian ini diawali dengan pengenceran 10- ¹ -10- ⁵ . Tempe utuh pasca fermentasi 48 jam ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan dalam tabung dan diberi label tanpa pengenceran. Dari 1 tabung dipipet 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung II kemudian dihomogenkan diberi label 10- ¹ . Perlakuan ini dilakukan berulang kali sampai pengenceran 10- ⁵ . Dari masing

  Pengamatan tentang karakeristik morfologi koloni bakteri perlu dilakukan agar bakteri tidak menumpuk dan memudahkan pengamatan morfologi koloni (sitasi). Setelah pengamatan morfologi koloni dilajutkan dengan pewarnaan Gram yang dibaca pada mikroskop cahaya untuk melihat jenis bakteri Gram-negatif dan Gram-positif. Pada penelitian ini isolat ISTD2.1 diketahui merupakan bakteri basil Gram-negatif. (Jawetz, dkk., 2004).

  Menurut klasifikasinya bakteri dibagi menjadi 2 yaitu bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Beberapa bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif merupakan flora normal. Flora normal adalah mikroorganisme yang menempati suatu daerah tanpa menimbulkan penyakit pada inang yang ditempati.

  Poernomo dan Purwanto (2003), menyatakan bahwa zona bening terjadi apabila protein yang terdapat dalam media susu skim dihidrolisis oleh enzim ekstraseluler menjadi asam amino yang dapat digunakan secara langsung oleh sel sebagai sumber nutrisi. Hal ini dilakukan karena sel tidak mampu memanfaatkan protein yang bersifat makromolekul secara langsung untuk ditransfer ke dalam sel.

  Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai indikator identifikasi mikroorganisme yang bersifat universal berukuran sekitar 1500 pb. Dengan demikian identifikasi suatu bakteri dapat dilakukan dengan mengamplifikasi daerah 16S rRNA dari genom bakteri (Rinata, 2011).

  Bacillus cereus ialah bakteri berbentuk

  batang yang berspora dan bersifat Gram- positif, selnya berukuran besar dibandingkan dengan bakteri batang lainnya serta tumbuh secara aerob fakultatif. Untuk membedakan Bacillus cereus dengan Bacillus lainnya digunakan ciri morfologi dan biokimia. Bacillus cereus merupakan salah satu jenis bakteri yang masuk ke dalam genus Bacillus. yang banyak ditemukan pada makanan dan dapat menyebabkan sakit pada manusia sehingga digolongkan ke dalam bakteri patogen. Bakteri ini mampu menghasilkan

  1500 bp

Molekul, 6, pp.93 –104

  Penulis ucapkan terima kasih kepada ibu Dr. Stalis Norma Ethica, M. Si, selaku pembimbing pertama yang telah banyak memberi waktu, semangat, ilmu dan bimbingan selama penulisan skripsi ini.

  Poernomo AT, DA Purwanto, 2003. Uji aktivitas crude enzim proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majalah Farmasi Airlagga. 3(3):103-107. Rinanta, R. 2011. Analisis Sekuensing 16S rRNA diBidang Mikroorganisme.Vol 11 No3 Sambrook J, dan Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3. Cold Spring Habor: Cold Spring Laboratory Pres. ISBN: 0-87969-576-3 Sambrook J, Russell DW. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual 3 rdedition. New York : Laboratory Pr.

  Mikrobiologi Pangan. Yogyakarta: UGM. Nicholl, dan Soeka, Y.S. 2011. Kemampuan Bacillus lichenoformis Dalam Mempreduksi Enzim Protease Yang Bersifat Alkali dan Termofilik. 20. 2.

  Jawetz, E., J, Melnick dan Adelberg. 2004. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. EGC. Jakarta Kuswanto, R. K., Sudarmadji, Slamet. 1989.

  Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.

  Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P., Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, T.J., 2013. Comparative Evaluation of Conventional Versus Rapid Methods for Amplifiable Genomic DNA Isolation of Cultured Azospirillum sp. JG3. Indonesian Journal of Chemistry, 13(3), pp.248-253.

  Dewi, R.S. & Aziz, S., 2011. Isolasi Rhizopus oligosporus pada beberapa inokulum tempe di kabupaten banyumas.

  REFERENSI

  Ibu Andri sukeksi, SKM., M.Si, selaku ketua program studi diploma IV analis kesehatan universitas muhammadiah semarang, kepada kedua orang tua saya Ayahanda Mansur Mony, ibunda Sattia Ridi yang telah memberikan do'a dan bimbingan secara materal dan moril, serta semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu yang turut membantu dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini

  Ibu Dr. Ana Hidayati Mukromah, M.Si, selaku pembimbing kedua yang telah memberikan waktu ilmu dan membimbing selama menulis skripsi ini.

  Ucapan Terima Kasih

  9

  Disarankan dilakukan isolasi bakteri enzim penghasil proetase pada produk hasil fermentasi makanan lain.

  Saran

  ISTD2.1 merupakan akteri Bacillus cereus.

  ISTD2.1 menghasilkan sekuen gen 16S rRNA dengan urutan nukleotida yang menunjukkan tingkat kesamaan dengan urutan nukleotida gen 16S rRNA bakteri Bacillus cereus . Maka disimpulkan bahwa isolasi dengan sampel

  Berdasarkan hasil penelitian yang berjudul Isolasi dan Identifiksi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim Protease Pada Tempe Gembus Pasca Fermentasi 48 Jam Berdasarkan Analisis Gen 16S rRNA dapat disimpulkan dari kelima isolasi bakteri yang berhasil disolasi dari sampel tempe gembus pasca fermentasi 48 jam, terdapat satu isolate bakteri, yaitu ISTD2.1 yang kemudian diberi label ISTD2.1 yang memiliki aktivitas protease ditandai dengan terbentuknya zona bening yang berdiameter 85,00 mm disekelilingi koloni bakteri pada medium Skim Milk Agar. Kemudin Proses identifikasi molekuler isolat

  Kesimpulan

  Pada penelitian ini bakteri Bacillus cereus ditemukan pada tempe gembus pasca fermentasi 48 jam. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya kontaminan terhadap makanan lain saat proses pembuatan tempe gembus yang tidak steril dilakukan.

  spora yang tahan terhadap panas dan proses dehidrasi (Nurwidiani, 2010).

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  10 Sambrook, J.R. and Russel, D.W., 2001. DW 2001. Molecular Cloning: A Laboratory. Sirvia, M.O, dkk. 2011. Isolasi Bakt

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com

  11

• *Corresponding Author : Nining Mony

  

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah

Semrang 50273 E-mail: niningn223@gmail. com