26 ditunggu sampai parasitoid tersebut melakukan kopulasi. Pada tahapan
berikutnya, masing-masing parasitoid betina dipelihara secara individual dalam sebuah tabung dan setiap tabung disebut satu populasi atau satu female line.
Parasitoid telur dipelihara di laboratorium menggunakan telur inang pengganti, yaitu Corcyra cephalonica yang merupakan hama gudang. Telur inang
ini ditempelkan pada kertas karton yang disebut pias menggunakan gum arabic. Setelah itu pias disimpan dalam freezer selama 2 jam. Selanjutnya pias
dimasukkan ke dalam tiap tabung agar dapat diparasit dan sebagai pakan bagi parasitoid dewasa, ke dalam tabung tersebut dioleskan madu 10. Pengamatan
pias dilakukan setiap hari dan kira-kira 7-9 hari pias akan menetas.
Identifikasi spesies parasitoid telur T. armigera
Penelitian ini difokuskan pada spesies di atas sehingga semua sampel female line
harus diidentifikasi. Identifikasi dilakukan setelah female line berkembang biak dengan baik. Kemudian membuat spesimen dari beberapa ekor parasitoid
jantan masing-masing female line tersebut. Identifikasi dengan cara melakukan pengamatan terhadap alat genitalianya. Hasil pengamatan dibandingkan dengan
gambar identifikasi menurut Alba 1988. Female line yang telah teridentifikasi spesiesnya dengan tepat, digunakan untuk penelitian ini.
Analisis Struktur Populasi Parasitoid Telur T. armigera
Berdasarkan Karakter Molekuler Isolasi DNA genom total
T. armigera
DNA genom total T. armigera diisolasi berdasarkan metode Bahagiawati et al
. 2005 yang dimodifikasi. Sebanyak 50-100 ekor parasitoid dari masing- masing populasi dimasukkan dalam tabung eppendorf. Masing-masing sampel
digerus dalam tabung yang ditambahkan sebanyak 400 μl buffer ekstraksi TEN
1X Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 2 mM pH 8, dan NaCl 0.4 M. Setelah diperoleh hasil gerusan yang halus dan homogen, ditambahkan sebanyak 40
μl SDS 20 dan 8
μl Proteinase K 20 mgml sambil diaduk-aduk. Selanjutnya tabung diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55
C. Dan tambahkan 300 μl NaCl 5
M. DNA dipisahkan dengan komponen kontaminannya seperti pecahan sel
27 dengan cara teknik sentrifugasi selama 15 menit pada 12000 rpm. Pindahkan
supernatan yang mengandung DNA kira-kira 700 μl ke dalam tabung eppendorf
yang baru. DNA dipresipitasi dengan menambahkan 1X volume isopropanol dingin
vv yaitu 700 μl dan diinkubasi pada suhu –20
C selama semalam. Kemudian tabung disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit untuk
mendapatkan pelet DNA. Pelet DNA yang diperoleh dicuci 2 kali dengan ETOH 70 vv dan dikeringanginkan. Pada tahapan terakhir pelet DNA diresuspensi
dengan 30 μl buffer TE 1X dan disimpan di freezer untuk digunakan selanjutnya.
Amplifikasi DNA dengan teknik RAPD-PCR
Teknik PCR dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen DNA dari sampel yang diisolasi tersebut di atas dengan menggunakan 4 primer RAPD, yaitu RUT1
5’-ccctggacgtctacaat-3’, RUT2 5’-ggtgcgggaa-3’, IDT45 5’-tggcgcagtg-3’ dan IDT48 5’-acgccagagg-3’. Reaksi PCR dilakukan dalam volume total 22
μl, yang terdiri dari 18
μl PCR supermix dari Invitrogen, 2 μl primer 5 pmolμl, dan 2
μl DNA sampel. Proses amplifikasi dilakukan dalam mesin PCR MJ Research PCT-100 dengan tahapan pre- denaturate pada suhu 94
°C selama 2 menit, dilanjutkan dengan 45 siklus tahapan denaturate pada suhu 94
°C selama 45 detik, annealing 36
°C selama 1 menit, dan elongation pada suhu 72°C selama 2 menit. Proses amplifikasi diakhiri dengan tahapan final elongation pada suhu
72 °C selama 8 menit.
Separasi dan visualisasi hasil PCR
Hasil PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis menggunakan gel agarose 1.2 di dalam buffer TBE 0.5X. Sebanyak 8
μl produk PCR ditambah dengan 2
μl loading dye pewarna dan pemberat DNA dengan komposisi loading
dye : produk PCR = 1 : 4, dimasukkan ke dalam well pada gel, dengan
mengikutkan 100 bp DNA ladder 8 μl DNA ladder 100ngμl dan 2 μl loading
dye sebagai penanda untuk memudahkan penentuan pola pita DNA hasil PCR
dari masing-masing sampel berdasarkan ukuran basanya. Selanjutnya gel
28 Alel : AA = p
2
Aa = 2pq aa = q
2
Jadi nilai hi = 2pq dan nilai Heterosigositas H = direndam dalam larutan ethidium bromida selama 10 menit dan dibilas di air
selama 30 menit sambil digoyang. Setelah itu fragmen DNA divisualisasi dan didokumentasi dengan meletakkan gel di bawah sinar UV dengan bantuan alat
Chemidoc.
Skoring dan analisis pola pita DNA
Tiap pita yang muncul pada gel diskor secara visual. Pita yang muncul pada ukuran yang sama diberi skor 1 dan jika tidak muncul diberi skor 0. Setiap pita
DNA yang muncul dan mempunyai ukuran berbeda dengan pita yang lain disebut sebagai satu lokus dan dalam satu lokus terdapat alel. Hasil skoring kemudian
dianalisis dengan program komputer untuk mengetahui nilai-nilai berikut ini, yaitu
1 nilai PIC Polymorphic Information Contents yang bertujuan untuk mengetahui tingkat polimorfisme yang dihasilkan oleh masing-masing primer.
Dengan mengetahui nilai ini maka dapat diketahui primer mana yang dapat terus digunakan dalam penelitian-penelitian selanjutnya yang sejenis.
2 nilai heterosigositas genetik H dengan menghitung frekuensi alel pada setiap lokus menggunakan program SPSS ver.11. Nilai H ini untuk mengetahui lokus-
lokus dominan yang muncul dalam bentuk pita apakah merupakan homosigot atau heterosigot. Dengan mengetahui nilai heterosigositas maka dapat diketahui tingkat
keragaman genetik suatu individu. Rumus yang digunakan merupakan rumus turunan dari asumsi kesetimbangan Hardy-Weinberg yaitu :
PIC Value = Jumlah skor 1 yang polimorfik
Jumlah pita dari satu primer X Jumlah sampel X 100
1 n
∑ hi
29 s
q
Heterosigositas subpopulasi H
s
= 1 - ∑
k
w
k
∑
iX 2
ki
3 nilai H’Nei, merupakan nilai heterosigositas yang dirumuskan oleh Nei 1973 dan terdapat dalam software komputer. Nilai ini menunjukkan nilai keragaman
genetik dalam populasi dan antar populasi.
4 nilai F
st
fixation index menunjukkan ada tidaknya aliran genetik pada populasi atau mengindikasikan terjadinya perkawinan dengan populasi asing.
Serta 5 nilai N
m
migration rate menunjukkan nilai laju migrasi genetik atau ada tidaknya pengaruh aliran genetik terhadap populasi. Nilai H’Nei, F
st
, dan N
m
tersebut dihitung menggunakan program komputer POPGENE ver 1.32.
Disamping itu, data yang diperoleh juga ditampilkan dalam bentuk dendrogram berdasarkan metode UPGMA dengan menggunakan program
komputer NTSys versi 2.1. Kemudian tingkat kepercayaan pohon filogenetik yang diperoleh dianalisa menggunakan Bootstrap iterasi 1000x dengan program
komputer Freetree dan Treeview32. Dengan program ini juga dapat dihasilkan tabel matrik jarak genetik antar female line sehingga dapat diketahui seberapa jauh
perbedaan genetik female line satu dengan yang lain.
Uji Ketidaksesuaian Reproduksi reproductive incompatibility test
Kegiatan ini memerlukan imago betina yang masih perawan dari masing- masing populasi female line, yaitu yang baru keluar dari telur inang dan belum
pernah berkopulasi. Imago betina perawan diperoleh dengan memisahkan setiap q
Heterosigositas total H
t
= 1 - ∑
i
χ
i 2
F
st
= 1 - H
s
H
t
N
m
= 0.5 x 1 – F
st
F
st
30 telur terparasit dari pias, satu-persatu disimpan dalam masing-masing tabung
eppendorf. Setelah telur menetas diamati apakah ada jantan yang dihasilkan, karena jika terdapat jantan dari telur yang sama dikhawatirkan betina tersebut
telah melakukan kopulasi, sehingga tidak dapat digunakan dalam uji ini. Begitu juga jantan yang akan digunakan, walaupun jantan dapat melakukan kopulasi
beberapa kali tetapi dalam uji ini diharapkan jantan sama sekali belum melakukan kopulasi. Sehingga untuk mendapatkannya sama dengan betina perawan.
Jantan dan betina perawan yang diperoleh dari masing-masing populasi kemudian diperlakukan dengan perkawinan silang, yaitu mengawinkan satu
individu jantan, misalnya yang berasal dari populasi A dengan satu individu betina perawan yang berasal dari populasi B, begitu juga sebaliknya, satu individu
betina perawan A dikawinkan dengan satu individu jantan dari populasi B. Jadi ada dua jenis perlakuan kawin antar dua populasi sedangkan populasi-populasi
yang digunakan yaitu dari semua populasi female line dengan dikombinasikan. Dari dua jenis perlakuan kawin ini kemudian diulang sebanyak empat kali.
Masing-masing ulangan menggunakan individu yang berbeda tetapi berasal dari populasi yang sama tiap perlakuan.
Proses kopulasi dilakukan dengan cara memasukkan setiap pasangan dalam satu tabung kemudian diamati perilakunya apakah terjadi kopulasi atau tidak
kemudian dibiarkan sampai beberapa jam. Setelah itu dimasukkan pias dengan jumlah telur inang sebanyak kira-kira 30 butir dan diolesi madu.
Setiap hari pias diganti sampai betina mati. Pias diamati sampai menetas kemudian dilakukan pengamatan terhadap jenis kelamin keturunannya. Apabila
semua anaknya jantan maka pada data ditulis negatif, yang berarti tidak terjadi kopulasi akan tetapi jika ada anaknya yang betina maka ditulis positif yaitu telah
terjadi kopulasi. Data dari keempat ulangan kemudian dikompilasi menjadi satu tabel yang berisi nilai positif atau negatif dari uji ketidaksesuaian reproduksi ini.
31
HASIL PENELITIAN Sampling
T. armigera dan persebaran hama jagung H. armigera
