Pemanfaatan Mikroba Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME (Palm Oil Mill Effluent).
PEMANFAATAN MIKROBA PENGHIDROLISIS SELULOSA
UNTUK PRODUKSI GAS METANA DENGAN BAHAN
DASAR POME (Palm Oil Mill Effluent)
LASMA ELIEZABETH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemanfaatan Mikroba
Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME
(Palm Oil Mill Effluent) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2014
Lasma Eliezabeth
NIM G84100024
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
ABSTRAK
LASMA ELIEZABETH. Pemanfaatan Mikroba Penghidrolisis Selulosa untuk
Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME (Palm Oil Mill Effluent).
Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan I MADE SUDIANA.
Pemanfaatan POME (Palm Oil Mill Effluent) untuk produksi gas metana
mempunyai dua keuntungan, yaitu meningkatkan kualitas effluent (air buangan)
dan energi yang diperoleh dari proses methanogenesis. Mikroba penghidrolisis
berperan sentral dalam menghidrolisis senyawa komplek polisakarida menjadi
gula yang dapat difermentasi sehingga menghasilkan gas metana. Tujuan
penelitian ini adalah memanfaatkan potensi mikroba penghidrolisis selulosa untuk
meningkatkan produksi gas metana. Penelitian diawali dengan pengujian aktivitas
hidrolisis selulosa pada medium menggunakan Carboxymethyl cellulose (CMC)
menggunakan congo red sebagai indikator reaksi hidrolisis. Selanjutnya dilakukan
uji kuantitatif aktivitas selulase terhadap kultur yang dikultivasi pada suhu 30C
dan 50C serta analisis gas metana dalam sampel dengan menggunakan GC-FID.
Kemampuan ATH 2147 diperoleh mampu menghidrolisis selulosa dan POME,
serta Y34 mampu melakukan proses fermentasi. Berdasarkan hasil analisis
produksi gas metana, campuran ATH 2147+Y34 menghasilkan produksi metan
yang paling tinggi. Jumlah gas metana yang diproduksi dipengaruhi oleh jumlah
biomasa yang berperan pada proses metanogenesis. Suhu optimum
methanogenesis adalah 30°C.
Kata kunci: Hidrolisis, methanogenesis, Palm Oil Mill Effluent.
ABSTRACT
LASMA ELIEZABETH. Utilization of Hydrolizing Microbes for Methane
Production from POME (Palm Oil Mill Effluent). SYAMSUL FALAH dan I
MADE SUDIANA.
Utilization POME (Palm Oil Mill Effluent) for the production of methane
gas has double advantages: increasing effluent quality and energy obtained from
methanogenesis. Hydrolyzing microbes play key central role on hydrolyses of
complex polysaccharide into fermentable sugar to produce methane gas. The
objective of this research was to optimize hydrolyses process to enhance methane
production by hidrolizing microbes. The experiment was started with
determination of cellulolytic capacity on CMC media, and optimation of celulose
activity, focused on the effect of temperature (30C and 50C) and methane gas in
the sample analysis using GC-FID. Ability of ATH 2147 was able to hydrolyse
cellulose, using CMC and POME substrates, while Y34 was able to ferment
POME. Based on methane production consortia of ATH 2147 and Y34 was able
to produce highest methane. Amount of methane produced dependent on amount
of biomass and temperature. Optimum methanogenesis was at 30C.
Keywords: Hydrolysis, methanogenesis, Palm Oil Mill Effluent
PEMANFAATAN MIKROBA PENGHIDROLISIS SELULOSA
UNTUK PRODUKSI GAS METANA DENGAN BAHAN
DASAR POME (Palm Oil Mill Effluent)
LASMA ELIEZABETH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Pemanfaatan Mikroba Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas
Metana dengan Bahan Dasar POME (Palm Oil Mill Effluent).
Nama
: Lasma Eliezabeth
NIM
: G84100024
Disetujui oleh
Dr Syamsul Falah, S.Hut. M.Si
Pembimbing I
Prof. Dr. I Made Sudiana, M.Sc.
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji serta syukur penulis ucapkan pada Tuhan Yesus Kristus yang senantiasa
menyertai dan memberikan hikmat, hingga penulis mampu menyelesaikan
penelitian ini dengan lancar. Karya ilmiah yang berjudul “Pemanfaatan Mikroba
Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME
(Palm Oil Mill Effluent)” ini telah dilakukan sejak bulan Oktober 2013 hingga
Maret 2014.
Terima kasih juga penulis ucapkan pada Bapak Dr. Syamsul Falah, S.Hut.
M.Si dan Bapak Prof. Dr.I Made Sudiana, MSc atas bimbingan, arahan berikut
kritik dan sarannya dalam penulisan hasil penelitian ini. Secara khusus juga
penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak Yansen
Sibarani dan Tiurma Hasibuan atas doa dan dorongan semangat untuk penulis
dapat sampai pada tahap ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
teman-teman Biokimia 47, teman-teman PMK IPB, dan keluarga lab fisiologi
LIPI dengan doa, semangat, dan kasih yang diberikan kepada penulis sepanjang
perjalanan penelitian hingga penyusunan karya ilmiah ini.
Semoga hasil penelitian ini berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya
dalam pengembangan dan penerapan ilmu biokimia dalam bidang pertanian serta
menjadi berkat untuk bangsa Indonesia.
Bogor, April 2014
Lasma Eliezabeth
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Lokasi Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
6
11
16
Simpulan
16
Saran
16
DAFTAR PUSTAKA
17
LAMPIRAN
20
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
Produksi limbah palm oil mill effluent (POME) di Indonesia
1
Indeks selulotik pada medium CMC
6
Konsentrasi gas metana pada mikroba campuran ATH 2147+Y34 di 10
medium metan
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Zona bening pada isolat bakteri selulotik Y34 dan ATH 2147
Aktivitas enzim endoglukanase hari kedua
Aktivitas enzim endoglukanase hari ketiga
Aktivitas enzim endoglukanase hari kelima
Produksi gas metan pada perbandingan biomassa dengan sludge primer
Produksi gas metan pada perbandingan suhu
Produksi gas metan pada perbandingan biomassa dengan sludge recycle
Konsentrasi kemurnian gas metan terhadap total gas
Konsentrasi gas metan pada isolasi campuran ATH 2147+Y34 di
medium yang digunakan
Penurunan total organik karbon (TOC)
Proses hidrolisis selulosa menjadi glukosa oleh kompleks enzim
selulase
6
6
7
7
7
8
9
9
10
11
12
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Alur Penelitian
21
Perbedaan Biomassa dengan Sludge primer
22
Perbedaan Biomassa dengan Sludge Primer
23
Perbedaan Biomassa dengan Sludge Sekunder
23
Perbedaan Suhu
24
Kurva standar gula reduksi
24
Aktivitas enzim selulase pada hari kedua
25
Aktivitas enzim selulase pada hari ketiga
25
Aktivitas enzim selulase pada hari kelima
25
Gas metan dengan perbandingan biomassa pada penambahan sludge 26
primer
Gas metan dengan perbandingan suhu
26
Gas metan dengan perbandingan biomassa pada penambahan sludge 26
sekunder
Gambar Kromatogram
26
Kurva standar Total Organik Karbon (TOC)
28
Total Organik Karbon pada POME
28
Total Organik Karbon pada sampel dengan mikroba
28
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara terbesar yang memproduksi dan
mengekspor minyak sawit. Luas perkebunan kelapa sawit diperkirakan lebih dari
7 juta hektar pada tahun 2010. Selain itu, Indonesia adalah penghasil minyak
kelapa sawit kedua dunia setelah Malaysia dan dalam kurun waktu kurang lebih
15 tahun terakhir produksi minyak kelapa sawit meningkat hampir lima kali lipat
dari sebesar 4.8 juta ton minyak sawit mentah (CPO) pada tahun 1996 menjadi
19.8 juta ton pada tahun 2010 (Dirjen Jenderal Perkebunan 2010). Produksi
minyak sawit juga menyebabkan meningkatnya produksi limbah cair dari proses
pengolahan CPO (crude palm oil). Berikut adalah estimasi produksi limbah Palm
Oil Mill Effluent (POME) di Indonesia pada rentang waktu 2009-2013.
Tabel 1 Produksi limbah palm oil mill effluent (POME) di Indonesia (Abdullah
dan Sulaiman 2013)
Tahun
2009
2010
2011
2012
2013
Produksi (ton)
5.410.802
6.418.274
6.467.032
6.585.900
6.840.859
Palm Oil Mill Effluent (POME) merupakan cairan kental berwarna coklat
yang mengandung total padatan yang tinggi (40500 mg/L), minyak dan lemak
(4000 mg/L), Chemical Oxygen Demand (COD) (50000 mg/L) dan Biological
Oxygen Demand (BOD) (25000 mg/L) (Ahmad et al. 2003). Limbah POME dapat
mempunyai dampak buruk terhadap lingkungan seperti perairan sungai apabila
dibuang tanpa diolah terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan, dalam memproduksi
satu ton minyak kelapa sawit yang mentah membutuhkan air sekitar 5-6 ton dan
berakhir dengan sekitar 3-4 ton POME. Limbah POME mengandung senyawa
kompleks yang tinggi seperti karbohidrat, protein, lemak, dan mineral.
Berdasarkan komposisi kimia limbah kelapa sawit, sebagian besar limbah
merupakan senyawa polimer (polisakarida) yang tidak dapat dibuang langsung ke
badan air (Wu et al. 2009).
Untuk meningkatkan kualitas air limbah buangan (effluent), perlu diolah
menggunakan sistem pengolahan limbah. Beberapa teknologi telah banyak
diperkenalkan dalam pengolahan air limbah khususnya limbah minyak kelapa
sawit untuk memenuhi standar kualitas dari limbah cair. Sistem kolam merupakan
salah satu teknologi yang telah banyak dikenal, namun sistem ini memerlukan
biaya dan teknologi yang tinggi, kebutuhan terhadap lahan yang luas, tidak ada
nilai tambah bagi lingkungan, dan pada kolam tertutup menghasilkan gas metan
dan karbondioksida yang tidak terkendali (Hanum 2008). Oleh karena biaya
operasional pengolahan limbah yang sangat mahal, maka diperlukan teknologi
pengolahan limbah dengan menghasilkan nilai tambah.
Pengolahan limbah aerobik-anaerobik merupakan sistem pengolahan limbah
yang paling efisien (Sani E 2006). Pada kondisi aerobik dimungkinkan hidrolisis
oleh mikroba penghidrolisis senyawa lignoselulosa menghasilkan gula yang dapat
difermentasi (Seftia et al. 2012). Pada kondisi anaerobik akan terjadi fermentasi
2
gula terfermentasi menjadi asam organik. Proses ini dikenal sebagai fermentasi
anaerobik (Drapco 2008). Kondisi anaerobik ini dilakukan karena baik untuk
produksi biogas, menyediakan panas, mengurangi biaya operasional dan energi
yang digunakan (Murto et al. 2004). Jika nilai redoks potential menurun sampai
sekitar -350 mV maka akan terjadi methanogenesis dimana biogas diproduksi.
Ada dua proses methanogenesis yaitu asetoklastik dan hidrogenotrofik
(Karakashev et al. 2006). Jumlah produksi gas metana ditentukan oleh
harmonisasi hidrolisis, fermentasi dan methanogenesis (Ritari et al. 2012).
Fermentasi anaerobik akan mengkonversi bahan organik menjadi gas metan yang
dilakukan oleh bakteri-bakteri dengan kemampuan sebagai bakteri fermentasi,
bakteri asetogenik penghasil hidrogen, bakteri asetogenik pengguna hidrogen,
bakteri metanogenik pereduksi CO2, dan bakteri methanogenik asetoclastic.
Bakteri fermentasi mengubah senyawa organik kompleks menjadi senyawa yang
lebih sederhana. Bakteri asetogenik penghasil hidrogen mengubah VFA menjadi
asam asetat dan CO2/H2. Bakteri metanogenik pereduksi karbondioksida
mengubah CO2/H2 menjadi metan dan bakteri methanogenik asetoclastic
mengubah asetat menjadi gas metan (Demirel & Scherer 2008).
Proses pembentukan gas metan dikontrol oleh mikroba yang tumbuh dan
aktif pada sistem aerobik-anaerobik. Kemampuan mengontrol ketiga proses
tersebut sangat diperlukan untuk operasional sistem pengolahan limbah POME
yang efektif. Mikroba yang digunakan pada penelitian ini adalah ATH 2147
(Mucor sp.), Y34 (Candida sp.), dan campuran ATH 2147+Y34 dengan tambahan
sludge. Inokulan mikroba untuk hidrolisis dan fermentasi POME ini efektif untuk
meningkatkan produksi metana. Mikroba Flavodon flavus (ATH 2147) dan
Candida sp. (Y34) ini termasuk Oleaginous microbes yaitu mikroba penghasil
microbial oils atau Single Cell Oils (SCO) (Azocar et al. 2010).
Tujuan penelitian ini adalah optimasi proses hidrolisis dan methanogenesis
oleh mikroba penghidrolisis selulosa dan methanogen untuk produksi gas metana
yang paling optimal. Penelitian difokuskan kepada optimasi suhu dan jumlah
biomassa mikroba yang berperan dalam proses methanogenesis.
Penelitian ini bermanfaat untuk memproduksi gas metan sebagai komposisi
biogas melalui proses methanogenesis. Hal ini dilakukan untuk mengefektifkan
pengolahan limbah POME dengan mengoptimalkan hidrolisis substrat POME
supaya menghasilkan gula reduksi menjadi zat yang terfermentasi.
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksananakan mulai bulan Oktober 2013 hingga bulan Maret
2014 di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Biologi
bidang Mikrobiologi, Cibinong-Jawa Barat.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah adalah POME yang disterilkan dengan
menggunakan autoklaf (200°C selama 15 menit); isolat mikroba ATH 2147
3
(Flavodon flavus.), isolat mikroba Y34 (Candida sp.), dan campuran mikroba
ATH 2147+Y34, aquades, bakteri sludge, larutan DNS, yeast extract, peptone,
500 gr kentang, bubuk PDA, malt extract, agar, gas nitrogen, pipa gas, medium
metan, gas N2, CO2, H2, larutan CMC (Carboxymethyl cellulose), larutan HCl,
larutan fenol 5%, H2SO4 pekat, medium methanobacterium (KH2PO4, NH4Cl,
MgCl2.6H2O, CaCl2.2H2O, NaHCO3, yeast extract, sodium asetat, vitamin
solution (biotin, folic acid, pyridoxine-HCl, thiamine-HCl, riboflavin, nicotonic
acid, Ca-pantothenate, p-Aminobenzoic acid, vitamin B12 dan air destilasi), trace
element solution, resazurin, cystein-HCl, Na2S2O3, aquades), agar murni, jumlah
mikroba dengan biomassa I (masing-masing substrat POME dengan 2 mL Y34, 2
mL ATH 2147, dan campuran kedua mikroba yaitu 1 mL Y34 dan 1 mL ATH
2147) dan jumlah mikroba dengan biomassa II (masing-masing substrat POME
dengan 4 mL Y34, 4 mL ATH 2147, dan campuran kedua mikroba yaitu 2 mL
Y34 dan 2 mL ATH 2147).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, sentrifus,
spektrofotometer, tabung reaksi, tabung Eppendorf, pipet mikro dan tip, botol
anaerob, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, kapas, plastik, alumunium
foil, neraca analitik, penangas air, alat bioshaker, pH meter, inkubator 30° dan
50°C stopwatch, corning, magnet stiren, spatula, tusuk sate, cawan Petri, syring,
Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa (GC-FID Shimadzu 14B, Kyoto
Japan).
Metode Penelitian
Pengujian Aktivitas Selulotik oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara
Kualitatif (Pointing 1999)
Pengujian dilakukan dengan memindahkan isolat bakteri yang telah murni
ke dalam media CMC padat pada cawan Petri menggunakan tusuk gigi steril.
Kemudian bakteri diinkubasi dalam inkubator 30°C selama 3 x 24 jam. Setelah
tumbuh dilakukan pengujian zona bening dengan menambahkan larutan congo red
1.5 mL secara merata dan dibiarkan selama 10 menit kemudian dicuci dengan
larutan NaCl fisiologis 0.1 N steril dan sisa larutan dibuang. Selanjutnya
dilakukan pengukuran indeks selulotik (IS) yang dihasilkan oleh bakteri.
Pengukuran dilakukan dengan menggunakan mistar (penggaris). Zona jernih yang
terbentuk di sekitar koloni dikalkulasi untuk penentuan indeks selulotik dengan
rumus :
Penentuan Aktivitas Enzim Endoglukanase oleh Mikroba Penghidrolisis
Selulosa secara Kuantitatif (Miller 1976)
Aktivitas hidrolisis selulosa dilakukan dengan menentukan jumlah gula
reduksi dan aktivitas enzim. Sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf lalu di sentrifus 4oC kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan
diambil 0.5 mL lalu ditambahkan 0.5 mL aquades. Pada G0 (perlakuan tanpa
inkubasi) ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan dipanaskan selama 7 menit,
kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
4
Adapun Gt (perlakuan dengan inkubasi), sampel terlebih dahulu diinkubasi pada
suhu 30oC selama 60 menit, setelah itu ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan
dipanaskan selama 7 menit. Kemudian diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 540 nm.
Total Gula Reduksi =Absorbansi saat t (Gt)-Absorbansi saat 0 (G0)
Selanjutnya dari hasil pengukuran tersebut dibuat grafik lalu dicari
persamaan garisnya. Persamaan garis yang diperoleh kemudian digunakan untuk
menghitung konsentrasi glukosa (ppm).
Persamaan garis : y = ax + b
y = absorbansi
x = konsentrasi (ppm)
Konsentrasi glukosa reduksi (ppm) ditentukan dengan rumus :
X=
Dengan demikian, aktivitas enzim selulase yang didapat ditentukan dengan
rumus:
Aktivitas enzim selulase (mmol glukosa/L) =
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Biomassa pada
Penambahan Sludge Primer (Sudiana et al. 2013)
Sampel dengan biomassa I dan biomassa II masing-masing diinkubasi
selama 24 jam. Setelah itu, ditambahkan 2 mL sludge primer (sludge sebelum
perlakuan) pada sampel dengan biomassa I dan 4 mL sludge primer pada
biomassa II lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan ke
dalam POME steril sebanyak 36 mL pada masing-masing sampel. Botol ditutup
lalu udara yang ada di dalam botol dibuang dengan menggunakan syringe dan
diganti dengan gas N2. Sampel diinkubasi pada suhu 40°C. Pada hari kelima
dilakukan pengukuran gas dengan GC-FID.
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Suhu (McHug et al.
2003)
Sampel dengan sludge primer (sludge sebelum perlakuan) setelah dihitung
produksi metan pada hari kelima, disentrifus di wadah corning sebanyak 10 mL
pada kecepatan 2000 rpm selama 15-20 menit, sehingga didapat supernatan dan
pelet. Pelet yang dihasilkan sekitar 2 mL digunakan sebagai sludge pada
perlakuan selanjutnya (sludge recycle).
Sampel terdiri 2 mL Y34, 2 mL ATH, dan campuran kedua mikroba yaitu
1 mL Y34 dan 1 mL ATH 2147. Masing-masing diinkubasi selama 24 jam.
Setelah itu, sampel dengan masing-masing mikroba ditambahkan 2 mL sludge
recycle lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan POME
steril sebanyak 20 mL pada masing-masing sampel. Sampel diinkubasi pada suhu
30°C. Perlakuan yang sama dilakukan juga pada inkubasi suhu 50°C. Pada hari
kedua, keenam, dan kesembilan dilakukan pengukuran gas dengan GC-FID.
5
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Biomassa Pada
Penambahan Sludge Recycle (Sudiana et al. 2013)
Sampel dengan biomassa I dan biomassa II masing-masing diinkubasi
selama 24 jam. Setelah itu, masing-masing sampel ditambahkan 2 mL sludge
recycle (sludge sesudah perlakuan) pada biomassa I dan 4 mL sludge recycle pada
biomassa II lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan
POME steril sebanyak 20 mL pada masing-masing sampel. Sampel diinkubasi
pada suhu 30°C. Pada hari kedua dan keenam dilakukan analisis konsentrasi gas
metan (ppm) dan hari kesembilan dilakukan analisis konsentrasi gas metan
terhadap total gas dalam sampel (%) melalui pengukuran dengan GC-FID.
Pengukuran Gas Metan dengan GC-FID (Breysse dan Lees 2003)
Gas yang dihasilkan oleh sampel diinjeksi sebanyak 100µl, lalu gas metan
yang dihasilkan terdeteksi pada waktu retensi 0.3 – 0.4 pada alat.
Isolasi Mikrobia Methanogen (FFJ 2002)
Larutan 2 mL CH3COONa dimasukkan ke dalam botol anaerob. Sampel
dengan mikroba yang menghasilkan gas metan tertinggi sebanyak 1 mL
dimasukkan ke dalam CH3COONa tersebut dengan cara diinjeksi dari tutup
tabung. Setelah itu, diinkubasi pada 30°C dan diukur gas metan pada hari ke-5.
Selanjutnya, sampel tersebut diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan dengan 20
mL medium kemudian dimasukkan ke dalam botol anaerob dan gas yang ada di
dalam dibuang dengan menggunakan syringe lalu ditukar dengan gas CO2 dan H2
lalu diinkubasi di 30°C. Pada hari ke-7 dilakukan pengukuran gas yang terbentuk
dengan GC-FID.
Penurunan Total Organik Karbon (TOC) (Suligundi 2013)
Sampel pada perlakuan perbandingan suhu, masing-masing dibuat menjadi
konsentrasi 1000 ppm dengan 5x ulangan. Sampel tersebut sebanyak 500 µl
dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 50 µl HCl dan dipanaskan
selama 2 jam. Setelah itu ditambahkan 50 µl fenol dan 250 µl H2SO4 dan
dipanaskan kembali selama 1 jam. Kemudian diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 490 nm. Sebelum dilakukan pengukuran, kurva standar
dibuat terlebih dahulu dengan konsentrasi 50,100, 200, 300, 400, dan 500 ppm,
sehingga diperoleh persamaan garis y=0.1231x-0.0306, r=0.99 pada Gambar 12.
Penurunan TOC (%) =
Keterangan :
TOC awal: pengukuran pada limbah POME tanpa perlakuan penambahan
mikroba
TOC akhir: pengukuran pada limbah POME pada perlakuan penambahan mikroba
dengan perbandingan suhu
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Aktivitas Selulotik oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara Kualitatif
Mikroba yang memiliki kemampuan selulotik ditandai dengan
pertumbuhan di medium CMC dan adanya zona bening pada sekitar koloni
setelah diteteskan dengan congo red. Dari hasil pengujian, mikroba ATH 2147
dan Y34 menghasilkan zona bening (Gambar 1). Berdasarkan hasil
pengamatan, Y34 memiliki zona bening terbesar dibandingkan dengan ATH
2147, namun indeks selulotik (IS) tertinggi didapatkan oleh ATH 2147 (Tabel
1).
Tabel 2 Indeks selulotik mikroba pada medium CMC
Diameter zona
Indeks selulotik
bening (cm)
Y34
3.00
4.25
1.42a
ATH
2.75
4.50
1.63b
* Huruf yang berbeda pada tabel di kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P < 0.05)
Mikroba
Diameter koloni (cm)
(a)
(b)
Gambar 1 Aktivitas selulotik pada mikroba dengan pembentukkan zona bening
(a) Y34 (b) ATH 2147
Aktivitas Enzim Selulase oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara
Kuantitatif
Aktivitas selulase pada mikroba menunjukkan aktivitas hidrolisis yang
dilakukan oleh mikroba di dalam substrat POME. Penentuan aktivitas hidrolisis
ditentukan dari jumlah total gula reduksi yang dihasilkan oleh aktivitas selulase.
Metode yang dilakukan dengan penambahan Dinitrosalicyclic Acid (DNS) secara
kimiawi. Proses hidrolisis dilakukan pada sampel dengan perlakuan inkubasi suhu
30°C dan 50°C. Jumlah gula reduksi yang diperoleh pada sampel dikonversi ke
kurva standar dan dijadikan konsentrasi dalam bentuk ppm. Konsentrasi yang
diperoleh dibagi 180 menjadi satuan unit enzim selulase. Pada hari ke-2, aktivitas
enzim semua mikroba belum memperlihatkan perbedaan aktivitasnya. Sementara,
hari ke-3 aktivitas enzim mulai terlihat perbedaannya dan di suhu 50°C lebih
tinggi dibandingkan dengan suhu 30°C (Gambar 3). Pada hari ke-5, aktivitas
enzim di suhu 50°C juga lebih tinggi dibandingkan dengan suhu 30°C kecuali
pada Y34 dan mikroba ATH 2147 memiliki aktivitas enzim yang paling tinggi
yaitu 1.63 unit (mmol glukosa/L) (Gambar 4).
7
* Huruf-huruf pada diagram batang menunjukkan berbeda nyata antar kelompok perlakuan
(P
UNTUK PRODUKSI GAS METANA DENGAN BAHAN
DASAR POME (Palm Oil Mill Effluent)
LASMA ELIEZABETH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemanfaatan Mikroba
Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME
(Palm Oil Mill Effluent) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2014
Lasma Eliezabeth
NIM G84100024
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
ABSTRAK
LASMA ELIEZABETH. Pemanfaatan Mikroba Penghidrolisis Selulosa untuk
Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME (Palm Oil Mill Effluent).
Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan I MADE SUDIANA.
Pemanfaatan POME (Palm Oil Mill Effluent) untuk produksi gas metana
mempunyai dua keuntungan, yaitu meningkatkan kualitas effluent (air buangan)
dan energi yang diperoleh dari proses methanogenesis. Mikroba penghidrolisis
berperan sentral dalam menghidrolisis senyawa komplek polisakarida menjadi
gula yang dapat difermentasi sehingga menghasilkan gas metana. Tujuan
penelitian ini adalah memanfaatkan potensi mikroba penghidrolisis selulosa untuk
meningkatkan produksi gas metana. Penelitian diawali dengan pengujian aktivitas
hidrolisis selulosa pada medium menggunakan Carboxymethyl cellulose (CMC)
menggunakan congo red sebagai indikator reaksi hidrolisis. Selanjutnya dilakukan
uji kuantitatif aktivitas selulase terhadap kultur yang dikultivasi pada suhu 30C
dan 50C serta analisis gas metana dalam sampel dengan menggunakan GC-FID.
Kemampuan ATH 2147 diperoleh mampu menghidrolisis selulosa dan POME,
serta Y34 mampu melakukan proses fermentasi. Berdasarkan hasil analisis
produksi gas metana, campuran ATH 2147+Y34 menghasilkan produksi metan
yang paling tinggi. Jumlah gas metana yang diproduksi dipengaruhi oleh jumlah
biomasa yang berperan pada proses metanogenesis. Suhu optimum
methanogenesis adalah 30°C.
Kata kunci: Hidrolisis, methanogenesis, Palm Oil Mill Effluent.
ABSTRACT
LASMA ELIEZABETH. Utilization of Hydrolizing Microbes for Methane
Production from POME (Palm Oil Mill Effluent). SYAMSUL FALAH dan I
MADE SUDIANA.
Utilization POME (Palm Oil Mill Effluent) for the production of methane
gas has double advantages: increasing effluent quality and energy obtained from
methanogenesis. Hydrolyzing microbes play key central role on hydrolyses of
complex polysaccharide into fermentable sugar to produce methane gas. The
objective of this research was to optimize hydrolyses process to enhance methane
production by hidrolizing microbes. The experiment was started with
determination of cellulolytic capacity on CMC media, and optimation of celulose
activity, focused on the effect of temperature (30C and 50C) and methane gas in
the sample analysis using GC-FID. Ability of ATH 2147 was able to hydrolyse
cellulose, using CMC and POME substrates, while Y34 was able to ferment
POME. Based on methane production consortia of ATH 2147 and Y34 was able
to produce highest methane. Amount of methane produced dependent on amount
of biomass and temperature. Optimum methanogenesis was at 30C.
Keywords: Hydrolysis, methanogenesis, Palm Oil Mill Effluent
PEMANFAATAN MIKROBA PENGHIDROLISIS SELULOSA
UNTUK PRODUKSI GAS METANA DENGAN BAHAN
DASAR POME (Palm Oil Mill Effluent)
LASMA ELIEZABETH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Pemanfaatan Mikroba Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas
Metana dengan Bahan Dasar POME (Palm Oil Mill Effluent).
Nama
: Lasma Eliezabeth
NIM
: G84100024
Disetujui oleh
Dr Syamsul Falah, S.Hut. M.Si
Pembimbing I
Prof. Dr. I Made Sudiana, M.Sc.
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji serta syukur penulis ucapkan pada Tuhan Yesus Kristus yang senantiasa
menyertai dan memberikan hikmat, hingga penulis mampu menyelesaikan
penelitian ini dengan lancar. Karya ilmiah yang berjudul “Pemanfaatan Mikroba
Penghidrolisis Selulosa untuk Produksi Gas Metana dengan Bahan Dasar POME
(Palm Oil Mill Effluent)” ini telah dilakukan sejak bulan Oktober 2013 hingga
Maret 2014.
Terima kasih juga penulis ucapkan pada Bapak Dr. Syamsul Falah, S.Hut.
M.Si dan Bapak Prof. Dr.I Made Sudiana, MSc atas bimbingan, arahan berikut
kritik dan sarannya dalam penulisan hasil penelitian ini. Secara khusus juga
penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak Yansen
Sibarani dan Tiurma Hasibuan atas doa dan dorongan semangat untuk penulis
dapat sampai pada tahap ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
teman-teman Biokimia 47, teman-teman PMK IPB, dan keluarga lab fisiologi
LIPI dengan doa, semangat, dan kasih yang diberikan kepada penulis sepanjang
perjalanan penelitian hingga penyusunan karya ilmiah ini.
Semoga hasil penelitian ini berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya
dalam pengembangan dan penerapan ilmu biokimia dalam bidang pertanian serta
menjadi berkat untuk bangsa Indonesia.
Bogor, April 2014
Lasma Eliezabeth
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Lokasi Penelitian
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
6
11
16
Simpulan
16
Saran
16
DAFTAR PUSTAKA
17
LAMPIRAN
20
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
Produksi limbah palm oil mill effluent (POME) di Indonesia
1
Indeks selulotik pada medium CMC
6
Konsentrasi gas metana pada mikroba campuran ATH 2147+Y34 di 10
medium metan
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Zona bening pada isolat bakteri selulotik Y34 dan ATH 2147
Aktivitas enzim endoglukanase hari kedua
Aktivitas enzim endoglukanase hari ketiga
Aktivitas enzim endoglukanase hari kelima
Produksi gas metan pada perbandingan biomassa dengan sludge primer
Produksi gas metan pada perbandingan suhu
Produksi gas metan pada perbandingan biomassa dengan sludge recycle
Konsentrasi kemurnian gas metan terhadap total gas
Konsentrasi gas metan pada isolasi campuran ATH 2147+Y34 di
medium yang digunakan
Penurunan total organik karbon (TOC)
Proses hidrolisis selulosa menjadi glukosa oleh kompleks enzim
selulase
6
6
7
7
7
8
9
9
10
11
12
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Alur Penelitian
21
Perbedaan Biomassa dengan Sludge primer
22
Perbedaan Biomassa dengan Sludge Primer
23
Perbedaan Biomassa dengan Sludge Sekunder
23
Perbedaan Suhu
24
Kurva standar gula reduksi
24
Aktivitas enzim selulase pada hari kedua
25
Aktivitas enzim selulase pada hari ketiga
25
Aktivitas enzim selulase pada hari kelima
25
Gas metan dengan perbandingan biomassa pada penambahan sludge 26
primer
Gas metan dengan perbandingan suhu
26
Gas metan dengan perbandingan biomassa pada penambahan sludge 26
sekunder
Gambar Kromatogram
26
Kurva standar Total Organik Karbon (TOC)
28
Total Organik Karbon pada POME
28
Total Organik Karbon pada sampel dengan mikroba
28
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara terbesar yang memproduksi dan
mengekspor minyak sawit. Luas perkebunan kelapa sawit diperkirakan lebih dari
7 juta hektar pada tahun 2010. Selain itu, Indonesia adalah penghasil minyak
kelapa sawit kedua dunia setelah Malaysia dan dalam kurun waktu kurang lebih
15 tahun terakhir produksi minyak kelapa sawit meningkat hampir lima kali lipat
dari sebesar 4.8 juta ton minyak sawit mentah (CPO) pada tahun 1996 menjadi
19.8 juta ton pada tahun 2010 (Dirjen Jenderal Perkebunan 2010). Produksi
minyak sawit juga menyebabkan meningkatnya produksi limbah cair dari proses
pengolahan CPO (crude palm oil). Berikut adalah estimasi produksi limbah Palm
Oil Mill Effluent (POME) di Indonesia pada rentang waktu 2009-2013.
Tabel 1 Produksi limbah palm oil mill effluent (POME) di Indonesia (Abdullah
dan Sulaiman 2013)
Tahun
2009
2010
2011
2012
2013
Produksi (ton)
5.410.802
6.418.274
6.467.032
6.585.900
6.840.859
Palm Oil Mill Effluent (POME) merupakan cairan kental berwarna coklat
yang mengandung total padatan yang tinggi (40500 mg/L), minyak dan lemak
(4000 mg/L), Chemical Oxygen Demand (COD) (50000 mg/L) dan Biological
Oxygen Demand (BOD) (25000 mg/L) (Ahmad et al. 2003). Limbah POME dapat
mempunyai dampak buruk terhadap lingkungan seperti perairan sungai apabila
dibuang tanpa diolah terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan, dalam memproduksi
satu ton minyak kelapa sawit yang mentah membutuhkan air sekitar 5-6 ton dan
berakhir dengan sekitar 3-4 ton POME. Limbah POME mengandung senyawa
kompleks yang tinggi seperti karbohidrat, protein, lemak, dan mineral.
Berdasarkan komposisi kimia limbah kelapa sawit, sebagian besar limbah
merupakan senyawa polimer (polisakarida) yang tidak dapat dibuang langsung ke
badan air (Wu et al. 2009).
Untuk meningkatkan kualitas air limbah buangan (effluent), perlu diolah
menggunakan sistem pengolahan limbah. Beberapa teknologi telah banyak
diperkenalkan dalam pengolahan air limbah khususnya limbah minyak kelapa
sawit untuk memenuhi standar kualitas dari limbah cair. Sistem kolam merupakan
salah satu teknologi yang telah banyak dikenal, namun sistem ini memerlukan
biaya dan teknologi yang tinggi, kebutuhan terhadap lahan yang luas, tidak ada
nilai tambah bagi lingkungan, dan pada kolam tertutup menghasilkan gas metan
dan karbondioksida yang tidak terkendali (Hanum 2008). Oleh karena biaya
operasional pengolahan limbah yang sangat mahal, maka diperlukan teknologi
pengolahan limbah dengan menghasilkan nilai tambah.
Pengolahan limbah aerobik-anaerobik merupakan sistem pengolahan limbah
yang paling efisien (Sani E 2006). Pada kondisi aerobik dimungkinkan hidrolisis
oleh mikroba penghidrolisis senyawa lignoselulosa menghasilkan gula yang dapat
difermentasi (Seftia et al. 2012). Pada kondisi anaerobik akan terjadi fermentasi
2
gula terfermentasi menjadi asam organik. Proses ini dikenal sebagai fermentasi
anaerobik (Drapco 2008). Kondisi anaerobik ini dilakukan karena baik untuk
produksi biogas, menyediakan panas, mengurangi biaya operasional dan energi
yang digunakan (Murto et al. 2004). Jika nilai redoks potential menurun sampai
sekitar -350 mV maka akan terjadi methanogenesis dimana biogas diproduksi.
Ada dua proses methanogenesis yaitu asetoklastik dan hidrogenotrofik
(Karakashev et al. 2006). Jumlah produksi gas metana ditentukan oleh
harmonisasi hidrolisis, fermentasi dan methanogenesis (Ritari et al. 2012).
Fermentasi anaerobik akan mengkonversi bahan organik menjadi gas metan yang
dilakukan oleh bakteri-bakteri dengan kemampuan sebagai bakteri fermentasi,
bakteri asetogenik penghasil hidrogen, bakteri asetogenik pengguna hidrogen,
bakteri metanogenik pereduksi CO2, dan bakteri methanogenik asetoclastic.
Bakteri fermentasi mengubah senyawa organik kompleks menjadi senyawa yang
lebih sederhana. Bakteri asetogenik penghasil hidrogen mengubah VFA menjadi
asam asetat dan CO2/H2. Bakteri metanogenik pereduksi karbondioksida
mengubah CO2/H2 menjadi metan dan bakteri methanogenik asetoclastic
mengubah asetat menjadi gas metan (Demirel & Scherer 2008).
Proses pembentukan gas metan dikontrol oleh mikroba yang tumbuh dan
aktif pada sistem aerobik-anaerobik. Kemampuan mengontrol ketiga proses
tersebut sangat diperlukan untuk operasional sistem pengolahan limbah POME
yang efektif. Mikroba yang digunakan pada penelitian ini adalah ATH 2147
(Mucor sp.), Y34 (Candida sp.), dan campuran ATH 2147+Y34 dengan tambahan
sludge. Inokulan mikroba untuk hidrolisis dan fermentasi POME ini efektif untuk
meningkatkan produksi metana. Mikroba Flavodon flavus (ATH 2147) dan
Candida sp. (Y34) ini termasuk Oleaginous microbes yaitu mikroba penghasil
microbial oils atau Single Cell Oils (SCO) (Azocar et al. 2010).
Tujuan penelitian ini adalah optimasi proses hidrolisis dan methanogenesis
oleh mikroba penghidrolisis selulosa dan methanogen untuk produksi gas metana
yang paling optimal. Penelitian difokuskan kepada optimasi suhu dan jumlah
biomassa mikroba yang berperan dalam proses methanogenesis.
Penelitian ini bermanfaat untuk memproduksi gas metan sebagai komposisi
biogas melalui proses methanogenesis. Hal ini dilakukan untuk mengefektifkan
pengolahan limbah POME dengan mengoptimalkan hidrolisis substrat POME
supaya menghasilkan gula reduksi menjadi zat yang terfermentasi.
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksananakan mulai bulan Oktober 2013 hingga bulan Maret
2014 di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Biologi
bidang Mikrobiologi, Cibinong-Jawa Barat.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah adalah POME yang disterilkan dengan
menggunakan autoklaf (200°C selama 15 menit); isolat mikroba ATH 2147
3
(Flavodon flavus.), isolat mikroba Y34 (Candida sp.), dan campuran mikroba
ATH 2147+Y34, aquades, bakteri sludge, larutan DNS, yeast extract, peptone,
500 gr kentang, bubuk PDA, malt extract, agar, gas nitrogen, pipa gas, medium
metan, gas N2, CO2, H2, larutan CMC (Carboxymethyl cellulose), larutan HCl,
larutan fenol 5%, H2SO4 pekat, medium methanobacterium (KH2PO4, NH4Cl,
MgCl2.6H2O, CaCl2.2H2O, NaHCO3, yeast extract, sodium asetat, vitamin
solution (biotin, folic acid, pyridoxine-HCl, thiamine-HCl, riboflavin, nicotonic
acid, Ca-pantothenate, p-Aminobenzoic acid, vitamin B12 dan air destilasi), trace
element solution, resazurin, cystein-HCl, Na2S2O3, aquades), agar murni, jumlah
mikroba dengan biomassa I (masing-masing substrat POME dengan 2 mL Y34, 2
mL ATH 2147, dan campuran kedua mikroba yaitu 1 mL Y34 dan 1 mL ATH
2147) dan jumlah mikroba dengan biomassa II (masing-masing substrat POME
dengan 4 mL Y34, 4 mL ATH 2147, dan campuran kedua mikroba yaitu 2 mL
Y34 dan 2 mL ATH 2147).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, sentrifus,
spektrofotometer, tabung reaksi, tabung Eppendorf, pipet mikro dan tip, botol
anaerob, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, kapas, plastik, alumunium
foil, neraca analitik, penangas air, alat bioshaker, pH meter, inkubator 30° dan
50°C stopwatch, corning, magnet stiren, spatula, tusuk sate, cawan Petri, syring,
Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa (GC-FID Shimadzu 14B, Kyoto
Japan).
Metode Penelitian
Pengujian Aktivitas Selulotik oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara
Kualitatif (Pointing 1999)
Pengujian dilakukan dengan memindahkan isolat bakteri yang telah murni
ke dalam media CMC padat pada cawan Petri menggunakan tusuk gigi steril.
Kemudian bakteri diinkubasi dalam inkubator 30°C selama 3 x 24 jam. Setelah
tumbuh dilakukan pengujian zona bening dengan menambahkan larutan congo red
1.5 mL secara merata dan dibiarkan selama 10 menit kemudian dicuci dengan
larutan NaCl fisiologis 0.1 N steril dan sisa larutan dibuang. Selanjutnya
dilakukan pengukuran indeks selulotik (IS) yang dihasilkan oleh bakteri.
Pengukuran dilakukan dengan menggunakan mistar (penggaris). Zona jernih yang
terbentuk di sekitar koloni dikalkulasi untuk penentuan indeks selulotik dengan
rumus :
Penentuan Aktivitas Enzim Endoglukanase oleh Mikroba Penghidrolisis
Selulosa secara Kuantitatif (Miller 1976)
Aktivitas hidrolisis selulosa dilakukan dengan menentukan jumlah gula
reduksi dan aktivitas enzim. Sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf lalu di sentrifus 4oC kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan
diambil 0.5 mL lalu ditambahkan 0.5 mL aquades. Pada G0 (perlakuan tanpa
inkubasi) ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan dipanaskan selama 7 menit,
kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
4
Adapun Gt (perlakuan dengan inkubasi), sampel terlebih dahulu diinkubasi pada
suhu 30oC selama 60 menit, setelah itu ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan
dipanaskan selama 7 menit. Kemudian diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 540 nm.
Total Gula Reduksi =Absorbansi saat t (Gt)-Absorbansi saat 0 (G0)
Selanjutnya dari hasil pengukuran tersebut dibuat grafik lalu dicari
persamaan garisnya. Persamaan garis yang diperoleh kemudian digunakan untuk
menghitung konsentrasi glukosa (ppm).
Persamaan garis : y = ax + b
y = absorbansi
x = konsentrasi (ppm)
Konsentrasi glukosa reduksi (ppm) ditentukan dengan rumus :
X=
Dengan demikian, aktivitas enzim selulase yang didapat ditentukan dengan
rumus:
Aktivitas enzim selulase (mmol glukosa/L) =
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Biomassa pada
Penambahan Sludge Primer (Sudiana et al. 2013)
Sampel dengan biomassa I dan biomassa II masing-masing diinkubasi
selama 24 jam. Setelah itu, ditambahkan 2 mL sludge primer (sludge sebelum
perlakuan) pada sampel dengan biomassa I dan 4 mL sludge primer pada
biomassa II lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan ke
dalam POME steril sebanyak 36 mL pada masing-masing sampel. Botol ditutup
lalu udara yang ada di dalam botol dibuang dengan menggunakan syringe dan
diganti dengan gas N2. Sampel diinkubasi pada suhu 40°C. Pada hari kelima
dilakukan pengukuran gas dengan GC-FID.
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Suhu (McHug et al.
2003)
Sampel dengan sludge primer (sludge sebelum perlakuan) setelah dihitung
produksi metan pada hari kelima, disentrifus di wadah corning sebanyak 10 mL
pada kecepatan 2000 rpm selama 15-20 menit, sehingga didapat supernatan dan
pelet. Pelet yang dihasilkan sekitar 2 mL digunakan sebagai sludge pada
perlakuan selanjutnya (sludge recycle).
Sampel terdiri 2 mL Y34, 2 mL ATH, dan campuran kedua mikroba yaitu
1 mL Y34 dan 1 mL ATH 2147. Masing-masing diinkubasi selama 24 jam.
Setelah itu, sampel dengan masing-masing mikroba ditambahkan 2 mL sludge
recycle lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan POME
steril sebanyak 20 mL pada masing-masing sampel. Sampel diinkubasi pada suhu
30°C. Perlakuan yang sama dilakukan juga pada inkubasi suhu 50°C. Pada hari
kedua, keenam, dan kesembilan dilakukan pengukuran gas dengan GC-FID.
5
Penentuan Produksi Gas Metan dengan Perbandingan Biomassa Pada
Penambahan Sludge Recycle (Sudiana et al. 2013)
Sampel dengan biomassa I dan biomassa II masing-masing diinkubasi
selama 24 jam. Setelah itu, masing-masing sampel ditambahkan 2 mL sludge
recycle (sludge sesudah perlakuan) pada biomassa I dan 4 mL sludge recycle pada
biomassa II lalu dipindahkan ke botol anaerob untuk kemudian dimasukkan
POME steril sebanyak 20 mL pada masing-masing sampel. Sampel diinkubasi
pada suhu 30°C. Pada hari kedua dan keenam dilakukan analisis konsentrasi gas
metan (ppm) dan hari kesembilan dilakukan analisis konsentrasi gas metan
terhadap total gas dalam sampel (%) melalui pengukuran dengan GC-FID.
Pengukuran Gas Metan dengan GC-FID (Breysse dan Lees 2003)
Gas yang dihasilkan oleh sampel diinjeksi sebanyak 100µl, lalu gas metan
yang dihasilkan terdeteksi pada waktu retensi 0.3 – 0.4 pada alat.
Isolasi Mikrobia Methanogen (FFJ 2002)
Larutan 2 mL CH3COONa dimasukkan ke dalam botol anaerob. Sampel
dengan mikroba yang menghasilkan gas metan tertinggi sebanyak 1 mL
dimasukkan ke dalam CH3COONa tersebut dengan cara diinjeksi dari tutup
tabung. Setelah itu, diinkubasi pada 30°C dan diukur gas metan pada hari ke-5.
Selanjutnya, sampel tersebut diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan dengan 20
mL medium kemudian dimasukkan ke dalam botol anaerob dan gas yang ada di
dalam dibuang dengan menggunakan syringe lalu ditukar dengan gas CO2 dan H2
lalu diinkubasi di 30°C. Pada hari ke-7 dilakukan pengukuran gas yang terbentuk
dengan GC-FID.
Penurunan Total Organik Karbon (TOC) (Suligundi 2013)
Sampel pada perlakuan perbandingan suhu, masing-masing dibuat menjadi
konsentrasi 1000 ppm dengan 5x ulangan. Sampel tersebut sebanyak 500 µl
dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 50 µl HCl dan dipanaskan
selama 2 jam. Setelah itu ditambahkan 50 µl fenol dan 250 µl H2SO4 dan
dipanaskan kembali selama 1 jam. Kemudian diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 490 nm. Sebelum dilakukan pengukuran, kurva standar
dibuat terlebih dahulu dengan konsentrasi 50,100, 200, 300, 400, dan 500 ppm,
sehingga diperoleh persamaan garis y=0.1231x-0.0306, r=0.99 pada Gambar 12.
Penurunan TOC (%) =
Keterangan :
TOC awal: pengukuran pada limbah POME tanpa perlakuan penambahan
mikroba
TOC akhir: pengukuran pada limbah POME pada perlakuan penambahan mikroba
dengan perbandingan suhu
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Aktivitas Selulotik oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara Kualitatif
Mikroba yang memiliki kemampuan selulotik ditandai dengan
pertumbuhan di medium CMC dan adanya zona bening pada sekitar koloni
setelah diteteskan dengan congo red. Dari hasil pengujian, mikroba ATH 2147
dan Y34 menghasilkan zona bening (Gambar 1). Berdasarkan hasil
pengamatan, Y34 memiliki zona bening terbesar dibandingkan dengan ATH
2147, namun indeks selulotik (IS) tertinggi didapatkan oleh ATH 2147 (Tabel
1).
Tabel 2 Indeks selulotik mikroba pada medium CMC
Diameter zona
Indeks selulotik
bening (cm)
Y34
3.00
4.25
1.42a
ATH
2.75
4.50
1.63b
* Huruf yang berbeda pada tabel di kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P < 0.05)
Mikroba
Diameter koloni (cm)
(a)
(b)
Gambar 1 Aktivitas selulotik pada mikroba dengan pembentukkan zona bening
(a) Y34 (b) ATH 2147
Aktivitas Enzim Selulase oleh Mikroba Penghidrolisis Selulosa secara
Kuantitatif
Aktivitas selulase pada mikroba menunjukkan aktivitas hidrolisis yang
dilakukan oleh mikroba di dalam substrat POME. Penentuan aktivitas hidrolisis
ditentukan dari jumlah total gula reduksi yang dihasilkan oleh aktivitas selulase.
Metode yang dilakukan dengan penambahan Dinitrosalicyclic Acid (DNS) secara
kimiawi. Proses hidrolisis dilakukan pada sampel dengan perlakuan inkubasi suhu
30°C dan 50°C. Jumlah gula reduksi yang diperoleh pada sampel dikonversi ke
kurva standar dan dijadikan konsentrasi dalam bentuk ppm. Konsentrasi yang
diperoleh dibagi 180 menjadi satuan unit enzim selulase. Pada hari ke-2, aktivitas
enzim semua mikroba belum memperlihatkan perbedaan aktivitasnya. Sementara,
hari ke-3 aktivitas enzim mulai terlihat perbedaannya dan di suhu 50°C lebih
tinggi dibandingkan dengan suhu 30°C (Gambar 3). Pada hari ke-5, aktivitas
enzim di suhu 50°C juga lebih tinggi dibandingkan dengan suhu 30°C kecuali
pada Y34 dan mikroba ATH 2147 memiliki aktivitas enzim yang paling tinggi
yaitu 1.63 unit (mmol glukosa/L) (Gambar 4).
7
* Huruf-huruf pada diagram batang menunjukkan berbeda nyata antar kelompok perlakuan
(P