Persiapan Inokulum Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup Batch Kitin dengan Actinomycetes

a. Pembuatan larutan standar PTH fenil tiourea

Larutan standar yang digunakan adalah larutan PTH, hasil reaksi glukosamin Glc standar WAKO yang dengan fenil isotiosianat PITC dalam metanol. Konsentrasi larutan Glc dan PITC yang dibuat masing- masing adalah 3, 6, 9, 12, dan 15 mgL. Mula-mula ditimbang 0,1 gram sampel, lalu dilarutkan dalam 10 ml CH 3 COONa dan didiamkan selama 24 jam agar larutan stabil. Larutan standar induk ini kemudian diencerkan secara bertahap hingga menjadi 100 ppm. Larutan standar 3, 6, 9, 12, dan 15 mgL dibuat dengan dipipet secara teliti 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; dan 1,5 larutan standar 100 mgL, masing-masing diencerkan dengan pelarut CH 3 COONa dalam labu takar 10 ml hingga tanda batas tera, lalu dihomogenkan. Larutan PITC dibuat dengan variasi konsentrasi yang sama menggunakan pelarut metanol dalam labu takar 10 ml. Selanjutnya 10 ml larutan Glc dicampurkan dengan 10 ml larutan PITC dan dikocok dalam labu takar 25 ml selama ± 5 menit. Reaksi antara glukosamin dengan PITC menghasilkan senyawa derivat fenil tiourea PTH.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum untuk analisis dengan spektrofotometer UV-Vis dilakukan dengan menggunakan larutan standar glukosamin yang telah direaksikan dengan PITC. Scanning panjang gelombang dilakukan dari panjang gelombang 200 nm sampai 350 nm.

c. Kalibrasi glukosamin sampel

Rendemen glukosamin dari setiap 5 hari inkubasi diambil 0,1 gram sebagai sampel yang akan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel ini dilarutkan dengan natrium asetat dalam labu ukur 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 mgL. Larutan ini diencerkan secara bertahap sampai diperoleh konsentrasi 12 ppm, kemudian larutan sampel 12 ppm ini direaksikan dengan PITC dengan konsentrasi yang sama. Absorbansi glukosamin dalam sampel dikalibrasikan dengan kurva standar PTH menggunakan persamaan regresi linear. Hasil yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi glukosamin dalam rendemen hasil fermentasi tiap selang waktu 5 hari.

8. Analisis Kemurnian Glukosamin dengan HPLC

a. Pembuatan standar Glukosamin

Sebanyak 50 mg glukosamin standar dilarutkan dalam 25 ml akuabides. Kemudian didiamkan selama ± 24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 mgL.

b. Pemeriksaan Sampel Glukosamin Hasil Fermentasi

Sebanyak 50 mg glukosamin hasil isolasi dilarutkan dalam 25 ml akuabides selama ± 24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 ppm. Larutan sampel dibaca dengan HPLC-ELSD Evaporating Light Scattering Detection menggunakan kolom C18, fasa gerak asetonitrilair 65:35 yang