a. Pembuatan larutan standar PTH fenil tiourea
Larutan standar yang digunakan adalah larutan PTH, hasil reaksi
glukosamin Glc standar WAKO yang dengan fenil isotiosianat PITC dalam metanol. Konsentrasi larutan Glc dan PITC yang dibuat masing-
masing adalah 3, 6, 9, 12, dan 15 mgL. Mula-mula ditimbang 0,1 gram sampel, lalu dilarutkan dalam 10 ml CH
3
COONa dan didiamkan selama 24 jam agar larutan stabil. Larutan standar induk ini kemudian diencerkan
secara bertahap hingga menjadi 100 ppm. Larutan standar 3, 6, 9, 12, dan 15 mgL dibuat dengan dipipet secara teliti 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; dan 1,5 larutan
standar 100 mgL, masing-masing diencerkan dengan pelarut CH
3
COONa dalam labu takar 10 ml hingga tanda batas tera, lalu dihomogenkan. Larutan
PITC dibuat dengan variasi konsentrasi yang sama menggunakan pelarut metanol dalam labu takar 10 ml. Selanjutnya 10 ml larutan Glc dicampurkan
dengan 10 ml larutan PITC dan dikocok dalam labu takar 25 ml selama ± 5 menit. Reaksi antara glukosamin dengan PITC menghasilkan senyawa
derivat fenil tiourea PTH.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum untuk analisis dengan
spektrofotometer UV-Vis dilakukan dengan menggunakan larutan standar glukosamin yang telah direaksikan dengan PITC. Scanning panjang
gelombang dilakukan dari panjang gelombang 200 nm sampai 350 nm.
c. Kalibrasi glukosamin sampel
Rendemen glukosamin dari setiap 5 hari inkubasi diambil 0,1 gram sebagai
sampel yang akan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel ini dilarutkan dengan natrium asetat dalam labu ukur 10 ml
sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 mgL. Larutan ini diencerkan secara bertahap sampai diperoleh konsentrasi 12 ppm, kemudian larutan sampel 12
ppm ini direaksikan dengan PITC dengan konsentrasi yang sama. Absorbansi glukosamin dalam sampel dikalibrasikan dengan kurva standar
PTH menggunakan persamaan regresi linear. Hasil yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi
glukosamin dalam rendemen hasil fermentasi tiap selang waktu 5 hari.
8. Analisis Kemurnian Glukosamin dengan HPLC
a. Pembuatan standar Glukosamin
Sebanyak 50 mg glukosamin standar dilarutkan dalam 25 ml akuabides.
Kemudian didiamkan selama ± 24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 mgL.
b. Pemeriksaan Sampel Glukosamin Hasil Fermentasi
Sebanyak 50 mg glukosamin hasil isolasi dilarutkan dalam 25 ml akuabides
selama ± 24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 ppm. Larutan sampel dibaca dengan HPLC-ELSD Evaporating Light Scattering Detection
menggunakan kolom C18, fasa gerak asetonitrilair 65:35 yang
Kategori