Karakterisasi Senyawa Antimikroba Dari Bakteri Lactobacillus Fermentum Dengan Media Whey Dangke
KARAKTERISASI SENYAWA ANTIMIKROBA DARI
BAKTERI Lactobacillus fermentum DENGAN
MEDIA WHEY DANGKE
RAJMI FARIDAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Senyawa
Antimikroba dari Bakteri Lactobacillus fermentum dengan Media Whey Dangke
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2017
Rajmi Faridah
NIM D151140291
RINGKASAN
RAJMI FARIDAH. Karakterisasi Senyawa Antimikroba dari Bakteri
Lactobacillus fermentum dengan Media Whey Dangke. Dibimbing oleh EPI
TAUFIK dan IRMA ISNAFIA ARIEF.
Dangke merupakan makanan khas Kabupaten Enrekang yang dibuat tanpa
melalui proses fermentasi. Proses pembuatan dangke menghasilkan by product
(hasil sampingan) berupa whey. Whey dangke dapat digunakan sebagai media
pertumbuhan bakteri asam laktat karena mengandung nutrisi yang tinggi.
Lactobacillus fermentum (L. fermentum) merupakan salah satu bakteri asam laktat
yang mampu menghasilkan bakteriosin. Tujuan dari penelitian adalah untuk
menganalisis potensi dangke sebagai media pertumbuhan L. fermentum asal
dangke untuk menghasilkan bakteriosin.
Strain L. fermentum asal dangke yang digunakan yaitu A323L, B323K, dan
C113L. Metode penelitian meliputi beberapa tahap yaitu persiapan Bakteri Asam
Laktat (BAL) dan bakteri patogen, pengujian nutrisi whey, pewarnaan Gram,
pembuatan kurva pertumbuhan, dan purifikasi bakteriosin. Peubah yang diamati
yaitu total BAL, nilai pH, total asam tertitrasi (TAT), aktivitas antimikroba
bakteri L. fermentum, konsentrasi protein dan aktivitas antimikroba bakteriosin.
Total BAL, Nilai TAT, nilai pH dianalisis menggunakan rancangan acak
kelompok (RAK) pola faktorial, sedangkan aktivitas antimikroba bakteri,
antimikroba bakteriosin dan konsentrasi protein dianalisis dengan menggunakan
rancangan acak lengkap (RAL), data yang berbeda nyata dianalisis lebih lanjut
dengan uji Duncan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fase logaritmik pada kurva
pertumbuhan L. fermentum A323L yaitu pada waktu inkubasi 24-28 jam
sedangkan B323K dan C113L pada waktu inkubasi 20-24 jam. Zona hambat yang
dihasilkan oleh semua strain L. fermentum termasuk kategori lemah karena
diameternya hanya kurang lebih 3 mm.
Whey dangke dapat dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan L. fermentum
asal dangke karena BAL tersebut mampu mencapai fase pertumbuhan logaritmik.
Namun kebutuhan nutrisi dalam media whey dangke belum tercukupi untuk
menghasilkan bakteriosin. L. fermentum strain A323L, B323K, C113L asal
dangke hanya mampu menghasilkan daya hambat kategori lemah (zona hambat
kurang dari 3 mm) pada media whey dangke. Namun diantara ketiganya, strain
yang terbaik adalah C113L.
Kata kunci: Lactobacillus fermentum, whey dangke, bakteriosin
SUMMARY
RAJMI FARIDAH. The Characterization of Antimicrobial Coumpounds of
Lactobacillus fermentum with Whey Dangke Medium. Supervised by EPI
TAUFIK dan IRMA ISNAFIA ARIEF.
Dangke is a local dairy product of Enrekang, South Sulawesi, produced
from cow's milk or buffalo without fermentation. Dangke processing produced a
by-product called whey. Nutritional components in whey can be utilized by lactic
acid bacteria (LAB) as a nutritional source of growth. One of bacteriocin
producing lactic acid bacteria is Lactobacillus fermentum (L. fermentum). The
study was aimed to utilize whey as growth media of L. fermentum isolated from
dangke, and analyze its bacteriocins production.
L. fermentum strain isolated from dangke, which used in this research were
A323L, B323K, and C113L. Research method consist of preparation of LAB and
pathogenic bacteria, whey nutrient analysis, Gram staining, manufacture of the
growth curve and purification of bacteriocins. The variables observed were total
LAB, pH value, total titratable acid (TTA), antimicrobial activity of L.
fermentum, protein concentration and bacteriocin antimicrobial activity. Factorial
randomized block design was used for analysis total titratable acidity, pH value,
and total bacteria. Whether completely randomized design was used for analysis
of antimicrobial activity, bacteriocin and protein concentration. Data were
analyzed by analysis of variance, and if the significant different were found,
Duncan test was then used.
The result showed that, the incubation time of L. fermentum strain A323L
were occurred in were at the incubation time of 24-28 hours, whilst strain B323K
and C113L were at 20-24 hours.
Dangke whey can be used as a medium for the growth of L. fermentum it is
capable of achieving a logarithmic growth phase. The nutritional requirements of
the bacteria has not been fulfilled by whey dangke as medium to produce
bacteriocins. Inhibition zone of all strain of L. fermentum was categorized as weak
in whey dangke medium, but strain C113L was the best among them.
Key words: Lactobacillus fermentum, whey dangke, bacteriocin
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KARAKTERISASI SENYAWA ANTIMIKROBA DARI
BAKTERI Lactobacillus fermentum DENGAN
MEDIA WHEY DANGKE
RAJMI FARIDAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof Dr drh Hj Mirnawaty B Sudarwanti
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepasa Allah SWT, atas rahmat dan
karunia
yang
telah
diberikan-Nya
sehingga
penyusunan
tesis
ini
daat
diselesaikan. Shalawat dan salam semoga senantiasa dicurahkan kepada nabi
Muhammad SAW. Judul yang dipilih dalam penelitian ini dilaksanakan sejak
bulan Desember 2015 sampai Mei 2016 ialah Karaterisasi Senyawa Antimiroba
i Bakteri Lactobacilus fermentum dengan Media Whey Dangke.
Terima kasih penulis ucapkan kepada pihak-pihak yang telah banyak
membatu dalam proses penyelesaian tesis ini, terutama kepada bapak r Epi
Tauik, SPt MVPH MSi selaku ketua komisi pembimbing, dan Ibu Dr Irma
lsnaia Arief, SPt MSi selaku anggota komisi pembimbing, atas dukungan selama
membimbing penulis sejak penyusunan proposal dan pelaksanaan enelitian
hinga selesainya enulisan tesis ini. Terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Hj
Miaay B Sudawanto selaku penguji luar komisi aas saran dan nasehat
keada penulis.
Terima kasih kepada Diretorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang
telah memerikan Beasiswa Fresh Graduate (FG) kepada penulis. Dwi Febriantini
n se1h safLaboratorium Teknologi Hasil Temak dan Laboratorium Faku1tas
Paan IPB terima kasih atas banannya selama enulis melaksn
penelitian.
Terima kasih yang tak terhingga penulis haturkan kepada Ayahanda Abd.
Rajah n Ibunda Djamilah sera adik-adik penulis (Rajma Fastawa n Najmi
Nilaidah) atas doa dan dukungan yang tiada henti untuk penulis. Tenan-tean
ann 2014 Prorm Studi Ilmu Produksi dn Teknologi Petemakan s do' a,
dukungan dan kebersamaannya selama mengikuti pendidikan. Tenan satu tim
enulis Hasniar Burhan SPt, Andi Nurul Mukhlisah SPt, dan Setiawan Putra Syah
St MSi, serta sahabat penulis Fadliah SPt dan Wahyuni SPt yang senantiasa
memberi dukungan dan bantuan kepada enulis. Pihak-pihak lain yang membantu
dan mendukung penulis selama ini yang tidak dapat enulis sebutkan u ersatu.
Semoga tesis ini bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Febrari 2017
Rajmi Faridah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xi
DAFTAR LAMPIRAN
xi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan Peralatan
Prosedur Penelitian
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
3
3
3
3
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Komponen Nutrisi Whey Dangke
Karakteristik L. fermentum A323L, B323K, C113L
Kurva Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Aktivitas Antimikroba
Konsentrasi Protein
Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum setelah purifikasi
7
7
8
9
13
15
16
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
17
17
17
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
21
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Kandungan Nutrisi Whey Dangke
Karakteristik Strain L. fermentum
Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Hasil Uji Aktivitas Antimikroba L. fermentum A323L, B323K, C113L
Hasil Uji Aktivitas Antimikroba bakteriosin
8
9
11
13
17
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Gambaran Umum Penelitian
Kurva Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Zona hambat aktivitas strain L. fermentum A323L, B323K, C113L
Konsentrasi protein strain L. fermentum A323L, B323K, C113L
2
10
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Analisis Ragam nilai total BAL L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam nilai TAT L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam nilai pH L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum terhadap
E. coli
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum terhadap
S.aureus
Analisis Ragam Konsentrasi Protein
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba bakteriosin terhadap E. coli
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain bakteriosin terhadap
S. aureus
Uji t-student daya hambat L. fermentum terhadap E.coli dan S.aureus
Uji t-student daya hambat bakteriosin terhadap E.coli dan S.aureus
22
24
24
25
25
25
26
26
26
26
11
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang mampu memfermentasikan
gula atau karbohidrat untuk memproduksi asam laktat dalam jumlah besar. Ciriciri bakteri asam laktat secara umum adalah selnya bereaksi positif terhadap
pewarnaan Gram, bereaksi negatif terhadap katalase dan tidak membentuk spora
(Carr et al. 2002). BAL bersifat anaerob fakultatif yang mampu hidup pada
berbagai habitat yang cukup luas di alam seperti pada tanaman, saluran
pencernaan hewan dan manusia, pada produk makanan kalengan, produk susu,
produk fermentasi, buah-buahan dan sayur-sayuran tropis (Makarova et al. 2006).
BAL yang secara alami terdapat dalam pangan dan pemanfaatannya dalam proses
fermentasi yang aman dan bermanfaat terhadap kesehatan menjadikannya sebagai
GRAS (Generally Recognized as Safe) untuk dikonsumsi oleh manusia
(FAO/WHO 2002).
Keunggulan dari BAL yaitu sifatnya yang mampu menghambat bakteri
patogen karena menghasilkan senyawa antimikroba yaitu bakteriosin. Bakteriosin
yang dihasilkan oleh BAL sangat menguntungkan untuk diterapkan pada industri
makanan pada umumnya terutama makanan-makanan hasil fermentasi karena
aman untuk kesehatan manusia (Karpinski dan Szkaradkiewicz 2013). Kelebihan
dari bakteriosin sebagai pengawet tersebut yaitu aktivitasnya yang mampu
menghambat pertumbuhan beberapa bakteri kontaminan penyebab pembusukan
makanan dan penyakit yang ditularkan melalui makanan (food borne disease)
(Abdelbasset dan Djamila 2008).
Salah satu jenis BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin yaitu
Lactobacillus fermentum (L. Fermentum) (Adedire, et al. 2016; Singh et al.
2013; Yong et al. 2010). Syah et al. (2016) mengemukakan bahwa L. fermentum
dapat diisolasi dari dangke (sejenis keju segar yang dihasilkan dari susu sapi atau
kerbau tanpa proses fermentasi). Faktor yang sangat berpengaruh untuk
pertumbuhan L. fermentum yaitu media pertumbuhannya (Fardiaz, 1992a). Media
pertumbuhan L. fermentum yang umum digunakan yaitu de Man Rogosa Sharp
Broth (MRSB), namun harga di pasaran sangat tinggi. Oleh karena itu perlu
adanya alternatif pengganti yang relatif lebih murah. Beberapa penelitian
mengemukakan bahwa whey kefir dan whey dari berbagai jenis keju dapat
dimanfatkan sebagai alternatif pengganti media tersebut (Almeida et al. 2008;
Gorsek dan Pecar, 2016; Horackova et al. 2014; Lavari et al. 2016). Whey
merupakan hasil sampingan (by product) dari pembuatan keju dan produk
sejenisnya yang pada umumnya belum termanfaatkan secara maksimal.
Whey dari pembuatan dangke Di Kabupaten Enrekang, Propinsi Sulawesi
Selatan, belum dimanfaatkan secara maksimal, sebagian besar hanya terbuang ke
lingkungan menjadi limbah. Whey dangke mengandung beberapa nutrisi yaitu
asam laktat, lemak, protein, dan laktosa (Fatma et al. 2012). Studi tentang
pemanfaatan whey dangke sebagai media pertumbuhan L. fermentum asal dangke
untuk menghasilkan bakteriosin belum banyak dilakukan. Oleh karena itu sangat
penting dilakukan kajian tentang pertumbuhan L. fermentum asal dangke tersebut
pada media whey dangke.
2
Perumusan Masalah
Whey dangke di Kabupaten Enrekang sebagian dimanfaatkan oleh peternak
sebagai minuman untuk pedet dan sebagai pupuk cair. Pemanfaatan whey dangke
tersebut belum maksimal karena whey masih ada yang terbuang menjadi limbah
setelah proses pembuatan dangke. Whey dangke memiliki kandungan nutrisi yang
dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan BAL. Oleh karena itu dalam penelitian ini
dilakukan upaya penggunaan media alternatif untuk pertumbuhan BAL penghasil
bakteriosin.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis whey dangke sebagai
media pertumbuhan L. fermentum asal dangke dan menganalisis produksi
bakteriosin L. fermentum asal dangke pada media pertumbuhan whey dangke.
Manfaat Penelitian
Memberikan informasi mengenai karakteristik whey dangke sebagai media
pertumbuhan bakteri dan bakteriosin yang dihasilkan oleh L. fermentum asal
dangke pada media whey dangke.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi: 1) Potensi whey sebagai media pertumbuhan L.
fermentum yang terdiri atas uji total BAL, TAT dan pH; 2) Purifikasi bakteriosin,
analisis kadar protein dan uji aktivitas antimikroba bakteriosin. Ruang Lingkup
penelitan dapat dilihat pada Gambar 1.
whey dangke
Persiapan BAL dan Bakteri patogen
Inokulasi L. fermentum
asal dangke
Uji kandungan
nutrisi whey
Hasil terbaik
Kurva
pertu
Pewarnaan
Gram
- Total BAL
- TAT
- pH
Uji aktivitas
antimikroba
Purifikasi bakteriosin
- Uji lowry
- Uji aktivitas antimikroba
bakteriosin
Gambar 1 Ruang lingkup penelitian
3
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Desember 2015 – Mei 2016.
Pembuatan whey dangke dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Hasil Ternak
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor, uji kandungan nutrisi whey dangke dilaksanakan di
Laboratorium PT. Bukit Baros, Sukabumi. Pembuatan kurva pertumbuhan,
purifikasi bakteriosin, uji aktivitas antimikroba dan uji lowry dilaksanakan di
Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan utama dalam penelitian ini adalah whey dangke, strain L. fermentum
A323L, B323K, dan C113L (Syah et al. 2016), papain murni 0,3%, kristal violet,
iodine, safranin, MRSB, de Man Rogosa Sharp Agar (MRSA), Muller Hinton
Agar (MHA), Tryptic Soy Agar (TSA), Trypticase Soy Broth (TSB), alkohol,
spirtus, akuades, Natrium klorida (NaCl), Natrium hidroksida (NaOH) 0,1 N,
indikator Phenolphthalein (PP), bakteri patogen yaitu Eschericia coli (E. coli)
ATCC 25922, dan Staphylococcus aureus (S. Aureus) ATCC 25293, amonium
sulfat, Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), Kalium hidrogen fosfat (K2HP4),
Natrium karbonat (Na2CO3), Natrium Kalium Tartarat (Na-K-Tatrat), Copper
sulphate (CuSO4), folin, Bovine Serum Albumin (BSA), paper disc diameter 5.5
mm membran saring miliphore berdiameter 0.22 µm.
Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, cawan petri, gelas piala, botol,
Erlenmeyer, pipet volumetrik, objek glass, paper glass, mikropipet, tip, bunsen,
pemanas, alat sentrifuse, timbangan analitik, autoklaf, refrigerator, freezer,
inkubator, waterbath, colony counter, vortex, pHmeter SCHOTT, buret, kapas,
aluminium foil, kertas saring, spektofotometer UV-VIS, tabung falcon, vial,
centrifuge dan alat tulis.
Prosedur Penelitian
Pembuatan Whey Dangke
Dangke diolah dari susu sapi yang dipanaskan dengan api kecil sampai
hampir mendidih, kemudian ditambahkan koagulan berupa papain murni 0.3%
pada suhu 80 ºC, kemudian ditambahkan garam sebanyak 0.4% (Mukhlisah 2017).
Setelah terjadi pemisahan antara gumpalan dan cairan berwarna kuning, gumpalan
tersebut dimasukkan ke dalam cetakan khusus yang terbuat dari tempurung kelapa
(bagian ujungnya dilubangi untuk jalan ke luar cairan) dan whey ditampung untuk
penelitian tahap selanjutnya (Marzoeki 1978).
4
Uji Nutrisi Whey Dangke (Kabui et al. 2014)
Lactoscan digunakan untuk menganalisis lemak, total padatan, berat jenis,
protein, titik beku dan penambahan air. Sampel di masukkan dalam gelas ± 20 mL
kemudian Laktoscan di hidupkan dengan di aliri listrik. Sampel dimasukkan pada
tempat analisis. Prinsip kerja lactoscan yaitu sampel masuk ke dalam alat
laktoscan, lalu melewati pancaran gelombang bunyi dan sampel akan keluar lagi.
Hasil analisis keluar setelah sampel melewati gelombang bunyi.
Pemeriksaan Kemurnian Kultur Bakteri
L. fermentum yang telah yang telah diisolasi dari dangke pada penelitian
sebelumnya dikonfirmasi kembali untuk memastikan kemurniannya dengan cara
ditumbuhkan pada media MRSA dengan metode striking plate dan diinkubasi
pada suhu 37 ºC selama 24 jam, kemudian diambil satu koloni yang dianggap
sebagai koloni bakteri asam laktat dan dimasukkan ke MRSB, kultur ini disebut
kultur stok. Setiap kultur stok dilakukan penyegaran pada media MRSB sebelum
dilakukan pengujian. Sebanyak 1 ml kultur diinokulasikan ke dalam media MRSB.
Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam yang hasilnya disebut
kultur kerja. Kultur kerja ini yang digunakan untuk mengkonfirmasi bakteri uji.
Uji yang dilakukan adalah uji pewarnaan Gram.
Sampel bakteri dari koloni yang homogen dioleskan pada kaca objek
kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian diteteskan dengan Kristal
violet selama satu menit, kemudian diratakan, dibilas dengan aquades dan
dikering udarakan. Setelah kering, olesan bakteri diteteskan iodium dan diratakan
kembali, kering udara selama dua menit, kemudian dibilas aquades dan ditiriskan.
Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95% tetes demi tetes selama
30 detik, kemudian dicuci segera dengan aquades dan ditiriskan. Setelah kering
preparat diteteskan minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop untuk melihat
bentuk dan warna dinding sel setelah dilakukan pewarnaan. Bakteri yang
termasuk dalam kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau biru
keunguan, sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna
merah safranin (Waluyo 2008).
Persiapan Bakteri (Arief et al. 2015a)
Ketiga strain L. fermentum yang telah diisolasi dari dangke (Syah. et al
2016) ditumbuhkan pada MRSB sedangkan bakteri patogen ditumbuhkan pada
TSB dan TSA. Semua bakteri patogen ditumbuhkan pada TSA sebagai kultur.
Kultur disimpan pada suhu -20 ºC, kultur diinkubasi pada suhu 37 ºC sebelum
digunakan.
Pengujian Total Bakteri Asam Laktat (Kalsum dan Sjofjan 2012)
Pengujian total bakteri dilakukan dengan metode pour plate (Cawan tuang).
Sampel yang akan diuji diencerkan dengan pengenceran 10-1-10-8. Satu mL
sampel dari pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 dimasukkan ke dalam cawan petri steril.
Masing-masing sampel yang akan digunakan dibuat duplo pada cawan petri.
Cawan petri yang telah diisi dengan sampel yang telah diencerkan ditambahkan
dengan MRS agar sebanyak 15 mL kemudian cawan petri digoyang-goyangkan
melingkar atau membentuk seperti angka delapan dengan tujuan agar bakteri
menyebar rata. Cawan petri yang telah diisi dengan agar tersebut didiamkan
5
sampai memadat lalu diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 ºC selama 24 jam
dalam keadaan terbalik.
Pengukuran pH (AOAC 2005)
pH meter dinyalakan dan dinetralkan selama 15-30 menit dan
distandardisasi dengan larutan buffer pH 4 dan pH 7. Sampel dapat diukur setelah
pH meter dikalibrasi. pH meter dicelup pada sampel lalu dibiarkan sampai angka
pH meter stabil. Setelah dilakukan pengukuran, pH meter kemudian dibilas
dengan akuades dan dikeringkan dengan tissu.
Pengujian Total Asam Tertitrasi (TAT) (AOAC 2005)
Total asam tertitrasi dapat dianalisis dengan metode titrasi dengan NaOH
0.1 N dan penoftalin 1% sebagai indikator. Rumus yang digunakan adalah:
[Keasaman =
ml NaOH x N NaOH x . 9
x
Berat Sampel
]
Uji Aktivitas Antimikroba (Hosni et al. 2013)
Pengujian aktivitas antimikroba L. fermentum menggunakan metode paper
disc. E.coli dan S.aureus sebagai bakteri uji diencerkan sesuai dengan standar 0.5
McFarland (108 cfu ml-1) kemudian diratakan pada media MHA. Paper disc steril
kemudian dimasukkan ke dalam sampel 50 µL kemudian diletakkan pada media
lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Setelah diinkubasi zona bening
yang terbentuk kemudian diukur menggunakan jangka sorong. Hasil pengukuran
tersebut kemudian dikurangi dengan diameter paper disc yaitu 5.5 mm.
Purifikasi dengan Menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat (Arief et al.
2015b)
Whey 100% masing-masing diinokulasi dengan 3 strain L. fermentum asal
dangke berbeda sebanyak 10% (v/v), kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC
selama 24 jam, selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm
selama 20 menit (suhu 4 ºC). Supernatan kemudian disaring menggunakan
membran saring miliphore berdiameter 0.22 µm dengan tujuan memperoleh
supernatan bebas sel. Supernatan bebas sel kemudian dievaporasi dengan
menggunakan Heidolph VV micro evaporator sampai volumenya menjadi
setengah dari volume awal. Proses presipitasi amonium sulfat dilakukan dengan
penjenuhan supernatan dengan penambahan serbuk amonium sulfat hingga
mencapai konsentrasi 80%. Presipitan (endapan) dari proses penjenuhan ini
kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 600 rpm selama 20
menit. Presipitat bakteriosin yang diperoleh kemudian didialisis dengan
menggunakan membran dialisis berdiameter 20 μm dan direndam dalam bufer
fosfat pH 6.8 selama 12 jam. Buffer diganti sebanyak 3 kali yaitu pada jam kedua,
keempat, dan keenam. Seluruh tahapan tersebut dilakukan pada suhu 4 ˚C.
6
Analisis Kadar Protein metode Lowry (Lowry et al. 1951)
Langkah pertama dalam uji lowry yaitu dengan membuat pereaksi, pereaksi
pertama yaitu NaOH 0.1 N sebanyak 0.4 gram ditambahkan dengan akuades
sampai volumenya mencapai 100 mL. Hasil pengenceran kemudian diambil
sebanyak 2 mL dan ditambahkan dengan Na2COs sebanyak 2% (w/v). Pereaksi
kedua yaitu Na+K+ tartrate 1% (w/v) ditambahkan dengan CuSO4.5H2O 0.5%
(w/v). Pereaksi pertama dan kedua dicampur dan dihomogenisasi sebagai pereaksi
ketiga. Pereaksi keempat yaitu menggunakan Folin-ciocalteu diencerkan
menggunakan akuades dengan perbandingan 1:1.
Sampel bakteriosin kasar sebanyak 0.2 mL dimasukkan ke dalam kuvet
ditambahkan dengan akuades sebanyak 3.8 mL, selanjutnya ditambahkan dengan
pereaksi ketiga sebanyak 5.5 mL kemudian diinkubasi selama 10-15 menit.
Langkah selanjutnya yaitu menambahkan folin sebanyak 0.5 mL lalu diinkubasi
pada suhu 4 ºC selama 30 menit. Absorban dibaca pada A 650 nm. Untuk kurva
standar, digunakan BSA dengan konsentrasi 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 dan 1.0 mg
mL-1.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Total BAL, Nilai TAT dan Nilai pH
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok
(RAK) pola faktorial untuk menganalisis nilai total asam tertitrasi, nilai pH dan
total bakteri. Faktor pertama yaitu strain L. fermentum (A323L, B323K dan
C113L) dan faktor kedua yaitu waktu inkubasi (Jam), sedangkan kelompok adalah
waktu pelaksanaan penelitian yang berbeda (ulangan). Model statistika yang
digunakan sebagai berikut:
Hijk = µ + Ki + Pj + Pk + (Pj x Pk) + eijk
Keterangan:
Hijk = Nilai pengamatan dari perlakuan ke-j (j = perlakuan strain bakteriosin L.
fermentum asal dangke yang berbeda) dan perlakuan ke-k (k = waktu
inkubasi inkubasi) pada kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
µ
= Nilai tengah umum
Ki
= Pengaruh kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
Pj
= Pengaruh faktor perlakuan strain bakteriosin L. fermentum asal dangke
yang berbeda
Pk
= Pengaruh faktor waktu inkubasi inkubasi
Pj x Pk = Interaksi perlakuan strain bakteriosin L. fermentum asal dangke yang
berbeda dan waktu inkubasi inkubasi
Eijk = Galat akibat perlakuan ke-j (strain berbeda) dan perlakuan ke-k (waktu
inkubasi) pada kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam dan apabila hasil yang
diperoleh terdapat perbedaan yang nyata akan dilanjutkan dengan Uji Duncan
(Mattjik dan Sumertajaya 2013).
7
Aktivitas Antimikroba Bakteri, Bakteriosin dan Uji Lowry
Rancangan yang digunakan untuk menganalisis uji aktivitas antimikroba
bakteri, bakteriosin dan uji Lowry adalah rancangan acak lengkap (RAL). Faktor
perlakuan adalah strain L. fermentum (A323L, B323K dan C113L). Model
statistik rancangan acak lengkap (RAL) berdasar pada Mattjik dan Sumertajaya
(2013) adalah sebagai berikut:
Yijk = µ + i + ij
Keterangan:
Yijk = Nilai respon akibat pengaruh perlakuan pada taraf ke-i (i = perlakuan strain
bakteriosin L. fermentum asal dangke yang berbeda) pada ulangan ke-j
µ = Nilai tengah umum
i
= Pengaruh perlakuan jenis bakteriosin strain L. fermentum asal dangke yang
berbeda pada taraf ke-i
ij = Pengaruh galat percobaan ke- i dan pada ulangan ke- j.
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam dan apabila hasil yang
diperoleh adalah nyata akan dilanjutkan dengan Uji Duncan (Mattjik dan
Sumertajaya, 2013).
Perbandingan daya hambat L. fermentum terhadap S. aureus dan E. coli
dianalisis menggunakan student t test dengan persamaan sebagai berikut:
�=
−µ
s/√n
Keterangan:
t
= t hitung
= rata-rata daya hambat strain L. fermentum
µ
= rata-rata terhadap S. aureus dan E. coli
s
= standar deviasi daya hambat terhadap S. aureus dan E. coli
n
= jumlah sampel strain L. fermentum
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Komponen Nutrisi Whey Dangke
Whey susu merupakan serum atau bagian air dari susu yang tersisa setelah
pemisahan curd yang merupakan hasil koagulasi protein susu dengan penambahan
asam atau enzim proteolitik (Vinderola et al. 2000). Salah satu hasil olahan susu
yang menghasilkan whey yaitu proses pembuatan dangke. Kandungan nutrisi whey
dangke dapat dilihat pada Tabel 1.
Nilai komponen padatan whey dangke yaitu 7.55% (Tabel 1). Hasil tersebut
sejalan dengan penelitian Panesar et al. (2007) bahwa total padatan yang
dihasilkan dari whey keju manis dan asam yaitu sebesar 6.3-7%. Lemak dari whey
dangke yaitu sebesar 0.83 %. Hasil tersebut berbeda dengan beberapa penelitian
8
sebelumnya. Fatma et al. (2013) mengemukakan bahwa whey dangke
menghasilkan lemak sebesar 0.2% (Tabel 1). Penelitian yang dilakukan oleh
Almeida et al. (2008) menggunakan whey keju menghasilkan lemak sebesar 0.5%.
Perbedaan kandungan nutrisi whey yang dihasilkan dalam pembuatan keju
disebabkan karena komposisi susu, proses pembuatan, dan bahan penggumpal
yang digunakan tidak sama (Altiok 2004).
Komponen
Padatan (%)
Lemak (%)
Laktosa (%)
Protein (%)
pH
Tabel 1 Komponen nutrisi whey dangke
Nilai
7.55
0.83
5.49
0.36
6.40
Laktosa yang dihasilkan dari whey dangke yaitu sebesar 5.49% (Tabel 1).
Hasil tersebut sejalan dengan hasil penelitian Fatma et al. (2013) bahwa
kandungan laktosa whey dangke yaitu sebesar 5.08%. Panesar et al. (2007)
menyatakan bahwa komponen laktosa dalam whey berpotensi dimanfaatkan oleh
BAL untuk pertumbuhannya. Kandungan protein dalam whey dangke yaitu 0.36
%. Hasil tersebut sangat rendah dibandingkan dengan beberapa penelitian
sebelumnya. Hal tersebut mungkin disebabkan karena dalam proses pembuatan
dangke dengan menggunakan papain murni, protein dari susu yang digunakan
sebesar 2.76% hampir terkoagulasi sempurna sehingga protein whey sangat
rendah. Protein whey yang dihasilkan umumnya berkisar 0.6-1% (Fatma et al.
2013; Panesar et al. 2007; Gallardo et al. 2005).
Nilai pH dari whey dangke yaitu 6.40 (Tabel 1), nilai tersebut sejalan
dengan penelitian yang telah dikemukakan oleh Fatma et al. (2013) bahwa nilai
pH whey dangke yaitu sebesar 6. 31. Gallardo et al. (2005) mengemukakan bahwa
nilai pH dari berbagai macam whey berbeda-beda tergantung pada jenis dan
konsentasi bahan penggumpal, perlakuan pemisahan curd dengan whey, dan
pemisahan sisa lemak dari whey.
Karakteristik L. fermentum A323L, B323K, C113L
Karakteristik strain L. fermentum dilakukan untuk membuktikan kemurnian
dari bakteri yang digunakan. Karakterisasi yang dilakukan meliputi sifat
morfologi dan bentuk dari strain L. fermentum. Hasil pewarnaan Gram (Tabel 2)
menunjukkan bahwa ketiga strain L. fermentum termasuk bakteri Gram positif,
berbentuk batang tunggal atau koloni, susunan rantai pendek. Syah et al. (2016)
menyatakan bahwa BAL yang diisolasi dari dangke merupakan beberapa strain
dari L. fermentum diantaranya yaitu A323L, B323K dan C113L. Ketiga strain L.
fermentum merupakan Gram positif dan dapat tumbuh pada suhu 37-45 ºC serta
tidak menghasilkan katalase, pertumbuhan ketiga strain tersebut termasuk kategori
bagus jika dibandingkan strain lainnya. Agati et al. (1998) menambahkan bahwa
L. fermentum yang diisolasi dari air susu ibu adalah Gram positif, non motil,
9
katalase negatif, dan tidak berspora. L. fermentum tersebut berbentuk batang
tunggal, koloni dan susunan rantai pendek.
Tabel 2 Karakteristik strain L. fermentum
Strain
Pewarnaan Gram Morfologi
Gambar Morfologi
L. fermentum Gram positif
Berbentuk batang
A323L
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
L. fermentum
B323K
Gram positif
Berbentuk batang
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
L. fermentum
C113L
Gram positif
Berbentuk batang
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
Prinsip kerja pewarnaan Gram yaitu kristal violet akan terserap oleh dinding
sel bakteri, selanjutnya iodine akan mempertahankan kristal violet. Penambahan
alkohol akan menghidrasi peptidoglikan sehingga kristal violet dan iodine tertahan
pada bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram positif tersusun atas 90%
peptidoglikan, sedangkan sisanya adalah lipid. Hal tersebut menyebabkan poripori dinding sel mengecil, permeabilitas berkurang dan warna ungu kristal violet
tidak dapat keluar (Pelczar dan Chan 2007).
Kurva Pertumbuhan (Total BAL, Nilai TAT dan Nilai pH)
Kurva pertumbuhan L. fermentum diperoleh dari hasil pengukuran populasi
BAL, uji total asam tertitrasi, dan uji pH pada waktu inkubasi yang berbeda yaitu
setiap 4 jam. Bakteri asam laktat memiliki beberapa fase pertumbuhan yaitu fase
adaptasi, logaritmik (eksponensial), tetap (statis) dan penurunan (kematian). Fase
tersebut dimulai dari adaptasi, pertumbuhan cepat, tetap sampai pada fase
kematian bakteri (Fardiaz 1992a). Kurva pertumbuhan L. fermentum dapat dilihat
pada Gambar 2.
Pada ketiga strain L. fermentum memenuhi populasi (total BAL) yang
berpengaruh nyata pada media whey dangke (P
BAKTERI Lactobacillus fermentum DENGAN
MEDIA WHEY DANGKE
RAJMI FARIDAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Senyawa
Antimikroba dari Bakteri Lactobacillus fermentum dengan Media Whey Dangke
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2017
Rajmi Faridah
NIM D151140291
RINGKASAN
RAJMI FARIDAH. Karakterisasi Senyawa Antimikroba dari Bakteri
Lactobacillus fermentum dengan Media Whey Dangke. Dibimbing oleh EPI
TAUFIK dan IRMA ISNAFIA ARIEF.
Dangke merupakan makanan khas Kabupaten Enrekang yang dibuat tanpa
melalui proses fermentasi. Proses pembuatan dangke menghasilkan by product
(hasil sampingan) berupa whey. Whey dangke dapat digunakan sebagai media
pertumbuhan bakteri asam laktat karena mengandung nutrisi yang tinggi.
Lactobacillus fermentum (L. fermentum) merupakan salah satu bakteri asam laktat
yang mampu menghasilkan bakteriosin. Tujuan dari penelitian adalah untuk
menganalisis potensi dangke sebagai media pertumbuhan L. fermentum asal
dangke untuk menghasilkan bakteriosin.
Strain L. fermentum asal dangke yang digunakan yaitu A323L, B323K, dan
C113L. Metode penelitian meliputi beberapa tahap yaitu persiapan Bakteri Asam
Laktat (BAL) dan bakteri patogen, pengujian nutrisi whey, pewarnaan Gram,
pembuatan kurva pertumbuhan, dan purifikasi bakteriosin. Peubah yang diamati
yaitu total BAL, nilai pH, total asam tertitrasi (TAT), aktivitas antimikroba
bakteri L. fermentum, konsentrasi protein dan aktivitas antimikroba bakteriosin.
Total BAL, Nilai TAT, nilai pH dianalisis menggunakan rancangan acak
kelompok (RAK) pola faktorial, sedangkan aktivitas antimikroba bakteri,
antimikroba bakteriosin dan konsentrasi protein dianalisis dengan menggunakan
rancangan acak lengkap (RAL), data yang berbeda nyata dianalisis lebih lanjut
dengan uji Duncan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fase logaritmik pada kurva
pertumbuhan L. fermentum A323L yaitu pada waktu inkubasi 24-28 jam
sedangkan B323K dan C113L pada waktu inkubasi 20-24 jam. Zona hambat yang
dihasilkan oleh semua strain L. fermentum termasuk kategori lemah karena
diameternya hanya kurang lebih 3 mm.
Whey dangke dapat dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan L. fermentum
asal dangke karena BAL tersebut mampu mencapai fase pertumbuhan logaritmik.
Namun kebutuhan nutrisi dalam media whey dangke belum tercukupi untuk
menghasilkan bakteriosin. L. fermentum strain A323L, B323K, C113L asal
dangke hanya mampu menghasilkan daya hambat kategori lemah (zona hambat
kurang dari 3 mm) pada media whey dangke. Namun diantara ketiganya, strain
yang terbaik adalah C113L.
Kata kunci: Lactobacillus fermentum, whey dangke, bakteriosin
SUMMARY
RAJMI FARIDAH. The Characterization of Antimicrobial Coumpounds of
Lactobacillus fermentum with Whey Dangke Medium. Supervised by EPI
TAUFIK dan IRMA ISNAFIA ARIEF.
Dangke is a local dairy product of Enrekang, South Sulawesi, produced
from cow's milk or buffalo without fermentation. Dangke processing produced a
by-product called whey. Nutritional components in whey can be utilized by lactic
acid bacteria (LAB) as a nutritional source of growth. One of bacteriocin
producing lactic acid bacteria is Lactobacillus fermentum (L. fermentum). The
study was aimed to utilize whey as growth media of L. fermentum isolated from
dangke, and analyze its bacteriocins production.
L. fermentum strain isolated from dangke, which used in this research were
A323L, B323K, and C113L. Research method consist of preparation of LAB and
pathogenic bacteria, whey nutrient analysis, Gram staining, manufacture of the
growth curve and purification of bacteriocins. The variables observed were total
LAB, pH value, total titratable acid (TTA), antimicrobial activity of L.
fermentum, protein concentration and bacteriocin antimicrobial activity. Factorial
randomized block design was used for analysis total titratable acidity, pH value,
and total bacteria. Whether completely randomized design was used for analysis
of antimicrobial activity, bacteriocin and protein concentration. Data were
analyzed by analysis of variance, and if the significant different were found,
Duncan test was then used.
The result showed that, the incubation time of L. fermentum strain A323L
were occurred in were at the incubation time of 24-28 hours, whilst strain B323K
and C113L were at 20-24 hours.
Dangke whey can be used as a medium for the growth of L. fermentum it is
capable of achieving a logarithmic growth phase. The nutritional requirements of
the bacteria has not been fulfilled by whey dangke as medium to produce
bacteriocins. Inhibition zone of all strain of L. fermentum was categorized as weak
in whey dangke medium, but strain C113L was the best among them.
Key words: Lactobacillus fermentum, whey dangke, bacteriocin
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KARAKTERISASI SENYAWA ANTIMIKROBA DARI
BAKTERI Lactobacillus fermentum DENGAN
MEDIA WHEY DANGKE
RAJMI FARIDAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof Dr drh Hj Mirnawaty B Sudarwanti
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepasa Allah SWT, atas rahmat dan
karunia
yang
telah
diberikan-Nya
sehingga
penyusunan
tesis
ini
daat
diselesaikan. Shalawat dan salam semoga senantiasa dicurahkan kepada nabi
Muhammad SAW. Judul yang dipilih dalam penelitian ini dilaksanakan sejak
bulan Desember 2015 sampai Mei 2016 ialah Karaterisasi Senyawa Antimiroba
i Bakteri Lactobacilus fermentum dengan Media Whey Dangke.
Terima kasih penulis ucapkan kepada pihak-pihak yang telah banyak
membatu dalam proses penyelesaian tesis ini, terutama kepada bapak r Epi
Tauik, SPt MVPH MSi selaku ketua komisi pembimbing, dan Ibu Dr Irma
lsnaia Arief, SPt MSi selaku anggota komisi pembimbing, atas dukungan selama
membimbing penulis sejak penyusunan proposal dan pelaksanaan enelitian
hinga selesainya enulisan tesis ini. Terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Hj
Miaay B Sudawanto selaku penguji luar komisi aas saran dan nasehat
keada penulis.
Terima kasih kepada Diretorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang
telah memerikan Beasiswa Fresh Graduate (FG) kepada penulis. Dwi Febriantini
n se1h safLaboratorium Teknologi Hasil Temak dan Laboratorium Faku1tas
Paan IPB terima kasih atas banannya selama enulis melaksn
penelitian.
Terima kasih yang tak terhingga penulis haturkan kepada Ayahanda Abd.
Rajah n Ibunda Djamilah sera adik-adik penulis (Rajma Fastawa n Najmi
Nilaidah) atas doa dan dukungan yang tiada henti untuk penulis. Tenan-tean
ann 2014 Prorm Studi Ilmu Produksi dn Teknologi Petemakan s do' a,
dukungan dan kebersamaannya selama mengikuti pendidikan. Tenan satu tim
enulis Hasniar Burhan SPt, Andi Nurul Mukhlisah SPt, dan Setiawan Putra Syah
St MSi, serta sahabat penulis Fadliah SPt dan Wahyuni SPt yang senantiasa
memberi dukungan dan bantuan kepada enulis. Pihak-pihak lain yang membantu
dan mendukung penulis selama ini yang tidak dapat enulis sebutkan u ersatu.
Semoga tesis ini bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Febrari 2017
Rajmi Faridah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xi
DAFTAR LAMPIRAN
xi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan Peralatan
Prosedur Penelitian
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
3
3
3
3
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Komponen Nutrisi Whey Dangke
Karakteristik L. fermentum A323L, B323K, C113L
Kurva Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Aktivitas Antimikroba
Konsentrasi Protein
Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum setelah purifikasi
7
7
8
9
13
15
16
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
17
17
17
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
21
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Kandungan Nutrisi Whey Dangke
Karakteristik Strain L. fermentum
Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Hasil Uji Aktivitas Antimikroba L. fermentum A323L, B323K, C113L
Hasil Uji Aktivitas Antimikroba bakteriosin
8
9
11
13
17
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Gambaran Umum Penelitian
Kurva Pertumbuhan L. fermentum A323L, B323K, C113L
Zona hambat aktivitas strain L. fermentum A323L, B323K, C113L
Konsentrasi protein strain L. fermentum A323L, B323K, C113L
2
10
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Analisis Ragam nilai total BAL L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam nilai TAT L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam nilai pH L. fermentum asal dangke
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum terhadap
E. coli
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain L. fermentum terhadap
S.aureus
Analisis Ragam Konsentrasi Protein
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba bakteriosin terhadap E. coli
Analisis Ragam Aktivitas Antimikroba Strain bakteriosin terhadap
S. aureus
Uji t-student daya hambat L. fermentum terhadap E.coli dan S.aureus
Uji t-student daya hambat bakteriosin terhadap E.coli dan S.aureus
22
24
24
25
25
25
26
26
26
26
11
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang mampu memfermentasikan
gula atau karbohidrat untuk memproduksi asam laktat dalam jumlah besar. Ciriciri bakteri asam laktat secara umum adalah selnya bereaksi positif terhadap
pewarnaan Gram, bereaksi negatif terhadap katalase dan tidak membentuk spora
(Carr et al. 2002). BAL bersifat anaerob fakultatif yang mampu hidup pada
berbagai habitat yang cukup luas di alam seperti pada tanaman, saluran
pencernaan hewan dan manusia, pada produk makanan kalengan, produk susu,
produk fermentasi, buah-buahan dan sayur-sayuran tropis (Makarova et al. 2006).
BAL yang secara alami terdapat dalam pangan dan pemanfaatannya dalam proses
fermentasi yang aman dan bermanfaat terhadap kesehatan menjadikannya sebagai
GRAS (Generally Recognized as Safe) untuk dikonsumsi oleh manusia
(FAO/WHO 2002).
Keunggulan dari BAL yaitu sifatnya yang mampu menghambat bakteri
patogen karena menghasilkan senyawa antimikroba yaitu bakteriosin. Bakteriosin
yang dihasilkan oleh BAL sangat menguntungkan untuk diterapkan pada industri
makanan pada umumnya terutama makanan-makanan hasil fermentasi karena
aman untuk kesehatan manusia (Karpinski dan Szkaradkiewicz 2013). Kelebihan
dari bakteriosin sebagai pengawet tersebut yaitu aktivitasnya yang mampu
menghambat pertumbuhan beberapa bakteri kontaminan penyebab pembusukan
makanan dan penyakit yang ditularkan melalui makanan (food borne disease)
(Abdelbasset dan Djamila 2008).
Salah satu jenis BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin yaitu
Lactobacillus fermentum (L. Fermentum) (Adedire, et al. 2016; Singh et al.
2013; Yong et al. 2010). Syah et al. (2016) mengemukakan bahwa L. fermentum
dapat diisolasi dari dangke (sejenis keju segar yang dihasilkan dari susu sapi atau
kerbau tanpa proses fermentasi). Faktor yang sangat berpengaruh untuk
pertumbuhan L. fermentum yaitu media pertumbuhannya (Fardiaz, 1992a). Media
pertumbuhan L. fermentum yang umum digunakan yaitu de Man Rogosa Sharp
Broth (MRSB), namun harga di pasaran sangat tinggi. Oleh karena itu perlu
adanya alternatif pengganti yang relatif lebih murah. Beberapa penelitian
mengemukakan bahwa whey kefir dan whey dari berbagai jenis keju dapat
dimanfatkan sebagai alternatif pengganti media tersebut (Almeida et al. 2008;
Gorsek dan Pecar, 2016; Horackova et al. 2014; Lavari et al. 2016). Whey
merupakan hasil sampingan (by product) dari pembuatan keju dan produk
sejenisnya yang pada umumnya belum termanfaatkan secara maksimal.
Whey dari pembuatan dangke Di Kabupaten Enrekang, Propinsi Sulawesi
Selatan, belum dimanfaatkan secara maksimal, sebagian besar hanya terbuang ke
lingkungan menjadi limbah. Whey dangke mengandung beberapa nutrisi yaitu
asam laktat, lemak, protein, dan laktosa (Fatma et al. 2012). Studi tentang
pemanfaatan whey dangke sebagai media pertumbuhan L. fermentum asal dangke
untuk menghasilkan bakteriosin belum banyak dilakukan. Oleh karena itu sangat
penting dilakukan kajian tentang pertumbuhan L. fermentum asal dangke tersebut
pada media whey dangke.
2
Perumusan Masalah
Whey dangke di Kabupaten Enrekang sebagian dimanfaatkan oleh peternak
sebagai minuman untuk pedet dan sebagai pupuk cair. Pemanfaatan whey dangke
tersebut belum maksimal karena whey masih ada yang terbuang menjadi limbah
setelah proses pembuatan dangke. Whey dangke memiliki kandungan nutrisi yang
dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan BAL. Oleh karena itu dalam penelitian ini
dilakukan upaya penggunaan media alternatif untuk pertumbuhan BAL penghasil
bakteriosin.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis whey dangke sebagai
media pertumbuhan L. fermentum asal dangke dan menganalisis produksi
bakteriosin L. fermentum asal dangke pada media pertumbuhan whey dangke.
Manfaat Penelitian
Memberikan informasi mengenai karakteristik whey dangke sebagai media
pertumbuhan bakteri dan bakteriosin yang dihasilkan oleh L. fermentum asal
dangke pada media whey dangke.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi: 1) Potensi whey sebagai media pertumbuhan L.
fermentum yang terdiri atas uji total BAL, TAT dan pH; 2) Purifikasi bakteriosin,
analisis kadar protein dan uji aktivitas antimikroba bakteriosin. Ruang Lingkup
penelitan dapat dilihat pada Gambar 1.
whey dangke
Persiapan BAL dan Bakteri patogen
Inokulasi L. fermentum
asal dangke
Uji kandungan
nutrisi whey
Hasil terbaik
Kurva
pertu
Pewarnaan
Gram
- Total BAL
- TAT
- pH
Uji aktivitas
antimikroba
Purifikasi bakteriosin
- Uji lowry
- Uji aktivitas antimikroba
bakteriosin
Gambar 1 Ruang lingkup penelitian
3
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Desember 2015 – Mei 2016.
Pembuatan whey dangke dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Hasil Ternak
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor, uji kandungan nutrisi whey dangke dilaksanakan di
Laboratorium PT. Bukit Baros, Sukabumi. Pembuatan kurva pertumbuhan,
purifikasi bakteriosin, uji aktivitas antimikroba dan uji lowry dilaksanakan di
Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan utama dalam penelitian ini adalah whey dangke, strain L. fermentum
A323L, B323K, dan C113L (Syah et al. 2016), papain murni 0,3%, kristal violet,
iodine, safranin, MRSB, de Man Rogosa Sharp Agar (MRSA), Muller Hinton
Agar (MHA), Tryptic Soy Agar (TSA), Trypticase Soy Broth (TSB), alkohol,
spirtus, akuades, Natrium klorida (NaCl), Natrium hidroksida (NaOH) 0,1 N,
indikator Phenolphthalein (PP), bakteri patogen yaitu Eschericia coli (E. coli)
ATCC 25922, dan Staphylococcus aureus (S. Aureus) ATCC 25293, amonium
sulfat, Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), Kalium hidrogen fosfat (K2HP4),
Natrium karbonat (Na2CO3), Natrium Kalium Tartarat (Na-K-Tatrat), Copper
sulphate (CuSO4), folin, Bovine Serum Albumin (BSA), paper disc diameter 5.5
mm membran saring miliphore berdiameter 0.22 µm.
Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, cawan petri, gelas piala, botol,
Erlenmeyer, pipet volumetrik, objek glass, paper glass, mikropipet, tip, bunsen,
pemanas, alat sentrifuse, timbangan analitik, autoklaf, refrigerator, freezer,
inkubator, waterbath, colony counter, vortex, pHmeter SCHOTT, buret, kapas,
aluminium foil, kertas saring, spektofotometer UV-VIS, tabung falcon, vial,
centrifuge dan alat tulis.
Prosedur Penelitian
Pembuatan Whey Dangke
Dangke diolah dari susu sapi yang dipanaskan dengan api kecil sampai
hampir mendidih, kemudian ditambahkan koagulan berupa papain murni 0.3%
pada suhu 80 ºC, kemudian ditambahkan garam sebanyak 0.4% (Mukhlisah 2017).
Setelah terjadi pemisahan antara gumpalan dan cairan berwarna kuning, gumpalan
tersebut dimasukkan ke dalam cetakan khusus yang terbuat dari tempurung kelapa
(bagian ujungnya dilubangi untuk jalan ke luar cairan) dan whey ditampung untuk
penelitian tahap selanjutnya (Marzoeki 1978).
4
Uji Nutrisi Whey Dangke (Kabui et al. 2014)
Lactoscan digunakan untuk menganalisis lemak, total padatan, berat jenis,
protein, titik beku dan penambahan air. Sampel di masukkan dalam gelas ± 20 mL
kemudian Laktoscan di hidupkan dengan di aliri listrik. Sampel dimasukkan pada
tempat analisis. Prinsip kerja lactoscan yaitu sampel masuk ke dalam alat
laktoscan, lalu melewati pancaran gelombang bunyi dan sampel akan keluar lagi.
Hasil analisis keluar setelah sampel melewati gelombang bunyi.
Pemeriksaan Kemurnian Kultur Bakteri
L. fermentum yang telah yang telah diisolasi dari dangke pada penelitian
sebelumnya dikonfirmasi kembali untuk memastikan kemurniannya dengan cara
ditumbuhkan pada media MRSA dengan metode striking plate dan diinkubasi
pada suhu 37 ºC selama 24 jam, kemudian diambil satu koloni yang dianggap
sebagai koloni bakteri asam laktat dan dimasukkan ke MRSB, kultur ini disebut
kultur stok. Setiap kultur stok dilakukan penyegaran pada media MRSB sebelum
dilakukan pengujian. Sebanyak 1 ml kultur diinokulasikan ke dalam media MRSB.
Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam yang hasilnya disebut
kultur kerja. Kultur kerja ini yang digunakan untuk mengkonfirmasi bakteri uji.
Uji yang dilakukan adalah uji pewarnaan Gram.
Sampel bakteri dari koloni yang homogen dioleskan pada kaca objek
kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian diteteskan dengan Kristal
violet selama satu menit, kemudian diratakan, dibilas dengan aquades dan
dikering udarakan. Setelah kering, olesan bakteri diteteskan iodium dan diratakan
kembali, kering udara selama dua menit, kemudian dibilas aquades dan ditiriskan.
Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95% tetes demi tetes selama
30 detik, kemudian dicuci segera dengan aquades dan ditiriskan. Setelah kering
preparat diteteskan minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop untuk melihat
bentuk dan warna dinding sel setelah dilakukan pewarnaan. Bakteri yang
termasuk dalam kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau biru
keunguan, sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna
merah safranin (Waluyo 2008).
Persiapan Bakteri (Arief et al. 2015a)
Ketiga strain L. fermentum yang telah diisolasi dari dangke (Syah. et al
2016) ditumbuhkan pada MRSB sedangkan bakteri patogen ditumbuhkan pada
TSB dan TSA. Semua bakteri patogen ditumbuhkan pada TSA sebagai kultur.
Kultur disimpan pada suhu -20 ºC, kultur diinkubasi pada suhu 37 ºC sebelum
digunakan.
Pengujian Total Bakteri Asam Laktat (Kalsum dan Sjofjan 2012)
Pengujian total bakteri dilakukan dengan metode pour plate (Cawan tuang).
Sampel yang akan diuji diencerkan dengan pengenceran 10-1-10-8. Satu mL
sampel dari pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 dimasukkan ke dalam cawan petri steril.
Masing-masing sampel yang akan digunakan dibuat duplo pada cawan petri.
Cawan petri yang telah diisi dengan sampel yang telah diencerkan ditambahkan
dengan MRS agar sebanyak 15 mL kemudian cawan petri digoyang-goyangkan
melingkar atau membentuk seperti angka delapan dengan tujuan agar bakteri
menyebar rata. Cawan petri yang telah diisi dengan agar tersebut didiamkan
5
sampai memadat lalu diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 ºC selama 24 jam
dalam keadaan terbalik.
Pengukuran pH (AOAC 2005)
pH meter dinyalakan dan dinetralkan selama 15-30 menit dan
distandardisasi dengan larutan buffer pH 4 dan pH 7. Sampel dapat diukur setelah
pH meter dikalibrasi. pH meter dicelup pada sampel lalu dibiarkan sampai angka
pH meter stabil. Setelah dilakukan pengukuran, pH meter kemudian dibilas
dengan akuades dan dikeringkan dengan tissu.
Pengujian Total Asam Tertitrasi (TAT) (AOAC 2005)
Total asam tertitrasi dapat dianalisis dengan metode titrasi dengan NaOH
0.1 N dan penoftalin 1% sebagai indikator. Rumus yang digunakan adalah:
[Keasaman =
ml NaOH x N NaOH x . 9
x
Berat Sampel
]
Uji Aktivitas Antimikroba (Hosni et al. 2013)
Pengujian aktivitas antimikroba L. fermentum menggunakan metode paper
disc. E.coli dan S.aureus sebagai bakteri uji diencerkan sesuai dengan standar 0.5
McFarland (108 cfu ml-1) kemudian diratakan pada media MHA. Paper disc steril
kemudian dimasukkan ke dalam sampel 50 µL kemudian diletakkan pada media
lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Setelah diinkubasi zona bening
yang terbentuk kemudian diukur menggunakan jangka sorong. Hasil pengukuran
tersebut kemudian dikurangi dengan diameter paper disc yaitu 5.5 mm.
Purifikasi dengan Menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat (Arief et al.
2015b)
Whey 100% masing-masing diinokulasi dengan 3 strain L. fermentum asal
dangke berbeda sebanyak 10% (v/v), kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC
selama 24 jam, selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm
selama 20 menit (suhu 4 ºC). Supernatan kemudian disaring menggunakan
membran saring miliphore berdiameter 0.22 µm dengan tujuan memperoleh
supernatan bebas sel. Supernatan bebas sel kemudian dievaporasi dengan
menggunakan Heidolph VV micro evaporator sampai volumenya menjadi
setengah dari volume awal. Proses presipitasi amonium sulfat dilakukan dengan
penjenuhan supernatan dengan penambahan serbuk amonium sulfat hingga
mencapai konsentrasi 80%. Presipitan (endapan) dari proses penjenuhan ini
kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 600 rpm selama 20
menit. Presipitat bakteriosin yang diperoleh kemudian didialisis dengan
menggunakan membran dialisis berdiameter 20 μm dan direndam dalam bufer
fosfat pH 6.8 selama 12 jam. Buffer diganti sebanyak 3 kali yaitu pada jam kedua,
keempat, dan keenam. Seluruh tahapan tersebut dilakukan pada suhu 4 ˚C.
6
Analisis Kadar Protein metode Lowry (Lowry et al. 1951)
Langkah pertama dalam uji lowry yaitu dengan membuat pereaksi, pereaksi
pertama yaitu NaOH 0.1 N sebanyak 0.4 gram ditambahkan dengan akuades
sampai volumenya mencapai 100 mL. Hasil pengenceran kemudian diambil
sebanyak 2 mL dan ditambahkan dengan Na2COs sebanyak 2% (w/v). Pereaksi
kedua yaitu Na+K+ tartrate 1% (w/v) ditambahkan dengan CuSO4.5H2O 0.5%
(w/v). Pereaksi pertama dan kedua dicampur dan dihomogenisasi sebagai pereaksi
ketiga. Pereaksi keempat yaitu menggunakan Folin-ciocalteu diencerkan
menggunakan akuades dengan perbandingan 1:1.
Sampel bakteriosin kasar sebanyak 0.2 mL dimasukkan ke dalam kuvet
ditambahkan dengan akuades sebanyak 3.8 mL, selanjutnya ditambahkan dengan
pereaksi ketiga sebanyak 5.5 mL kemudian diinkubasi selama 10-15 menit.
Langkah selanjutnya yaitu menambahkan folin sebanyak 0.5 mL lalu diinkubasi
pada suhu 4 ºC selama 30 menit. Absorban dibaca pada A 650 nm. Untuk kurva
standar, digunakan BSA dengan konsentrasi 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 dan 1.0 mg
mL-1.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Total BAL, Nilai TAT dan Nilai pH
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok
(RAK) pola faktorial untuk menganalisis nilai total asam tertitrasi, nilai pH dan
total bakteri. Faktor pertama yaitu strain L. fermentum (A323L, B323K dan
C113L) dan faktor kedua yaitu waktu inkubasi (Jam), sedangkan kelompok adalah
waktu pelaksanaan penelitian yang berbeda (ulangan). Model statistika yang
digunakan sebagai berikut:
Hijk = µ + Ki + Pj + Pk + (Pj x Pk) + eijk
Keterangan:
Hijk = Nilai pengamatan dari perlakuan ke-j (j = perlakuan strain bakteriosin L.
fermentum asal dangke yang berbeda) dan perlakuan ke-k (k = waktu
inkubasi inkubasi) pada kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
µ
= Nilai tengah umum
Ki
= Pengaruh kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
Pj
= Pengaruh faktor perlakuan strain bakteriosin L. fermentum asal dangke
yang berbeda
Pk
= Pengaruh faktor waktu inkubasi inkubasi
Pj x Pk = Interaksi perlakuan strain bakteriosin L. fermentum asal dangke yang
berbeda dan waktu inkubasi inkubasi
Eijk = Galat akibat perlakuan ke-j (strain berbeda) dan perlakuan ke-k (waktu
inkubasi) pada kelompok ke-i (waktu pelaksanaan)
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam dan apabila hasil yang
diperoleh terdapat perbedaan yang nyata akan dilanjutkan dengan Uji Duncan
(Mattjik dan Sumertajaya 2013).
7
Aktivitas Antimikroba Bakteri, Bakteriosin dan Uji Lowry
Rancangan yang digunakan untuk menganalisis uji aktivitas antimikroba
bakteri, bakteriosin dan uji Lowry adalah rancangan acak lengkap (RAL). Faktor
perlakuan adalah strain L. fermentum (A323L, B323K dan C113L). Model
statistik rancangan acak lengkap (RAL) berdasar pada Mattjik dan Sumertajaya
(2013) adalah sebagai berikut:
Yijk = µ + i + ij
Keterangan:
Yijk = Nilai respon akibat pengaruh perlakuan pada taraf ke-i (i = perlakuan strain
bakteriosin L. fermentum asal dangke yang berbeda) pada ulangan ke-j
µ = Nilai tengah umum
i
= Pengaruh perlakuan jenis bakteriosin strain L. fermentum asal dangke yang
berbeda pada taraf ke-i
ij = Pengaruh galat percobaan ke- i dan pada ulangan ke- j.
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam dan apabila hasil yang
diperoleh adalah nyata akan dilanjutkan dengan Uji Duncan (Mattjik dan
Sumertajaya, 2013).
Perbandingan daya hambat L. fermentum terhadap S. aureus dan E. coli
dianalisis menggunakan student t test dengan persamaan sebagai berikut:
�=
−µ
s/√n
Keterangan:
t
= t hitung
= rata-rata daya hambat strain L. fermentum
µ
= rata-rata terhadap S. aureus dan E. coli
s
= standar deviasi daya hambat terhadap S. aureus dan E. coli
n
= jumlah sampel strain L. fermentum
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Komponen Nutrisi Whey Dangke
Whey susu merupakan serum atau bagian air dari susu yang tersisa setelah
pemisahan curd yang merupakan hasil koagulasi protein susu dengan penambahan
asam atau enzim proteolitik (Vinderola et al. 2000). Salah satu hasil olahan susu
yang menghasilkan whey yaitu proses pembuatan dangke. Kandungan nutrisi whey
dangke dapat dilihat pada Tabel 1.
Nilai komponen padatan whey dangke yaitu 7.55% (Tabel 1). Hasil tersebut
sejalan dengan penelitian Panesar et al. (2007) bahwa total padatan yang
dihasilkan dari whey keju manis dan asam yaitu sebesar 6.3-7%. Lemak dari whey
dangke yaitu sebesar 0.83 %. Hasil tersebut berbeda dengan beberapa penelitian
8
sebelumnya. Fatma et al. (2013) mengemukakan bahwa whey dangke
menghasilkan lemak sebesar 0.2% (Tabel 1). Penelitian yang dilakukan oleh
Almeida et al. (2008) menggunakan whey keju menghasilkan lemak sebesar 0.5%.
Perbedaan kandungan nutrisi whey yang dihasilkan dalam pembuatan keju
disebabkan karena komposisi susu, proses pembuatan, dan bahan penggumpal
yang digunakan tidak sama (Altiok 2004).
Komponen
Padatan (%)
Lemak (%)
Laktosa (%)
Protein (%)
pH
Tabel 1 Komponen nutrisi whey dangke
Nilai
7.55
0.83
5.49
0.36
6.40
Laktosa yang dihasilkan dari whey dangke yaitu sebesar 5.49% (Tabel 1).
Hasil tersebut sejalan dengan hasil penelitian Fatma et al. (2013) bahwa
kandungan laktosa whey dangke yaitu sebesar 5.08%. Panesar et al. (2007)
menyatakan bahwa komponen laktosa dalam whey berpotensi dimanfaatkan oleh
BAL untuk pertumbuhannya. Kandungan protein dalam whey dangke yaitu 0.36
%. Hasil tersebut sangat rendah dibandingkan dengan beberapa penelitian
sebelumnya. Hal tersebut mungkin disebabkan karena dalam proses pembuatan
dangke dengan menggunakan papain murni, protein dari susu yang digunakan
sebesar 2.76% hampir terkoagulasi sempurna sehingga protein whey sangat
rendah. Protein whey yang dihasilkan umumnya berkisar 0.6-1% (Fatma et al.
2013; Panesar et al. 2007; Gallardo et al. 2005).
Nilai pH dari whey dangke yaitu 6.40 (Tabel 1), nilai tersebut sejalan
dengan penelitian yang telah dikemukakan oleh Fatma et al. (2013) bahwa nilai
pH whey dangke yaitu sebesar 6. 31. Gallardo et al. (2005) mengemukakan bahwa
nilai pH dari berbagai macam whey berbeda-beda tergantung pada jenis dan
konsentasi bahan penggumpal, perlakuan pemisahan curd dengan whey, dan
pemisahan sisa lemak dari whey.
Karakteristik L. fermentum A323L, B323K, C113L
Karakteristik strain L. fermentum dilakukan untuk membuktikan kemurnian
dari bakteri yang digunakan. Karakterisasi yang dilakukan meliputi sifat
morfologi dan bentuk dari strain L. fermentum. Hasil pewarnaan Gram (Tabel 2)
menunjukkan bahwa ketiga strain L. fermentum termasuk bakteri Gram positif,
berbentuk batang tunggal atau koloni, susunan rantai pendek. Syah et al. (2016)
menyatakan bahwa BAL yang diisolasi dari dangke merupakan beberapa strain
dari L. fermentum diantaranya yaitu A323L, B323K dan C113L. Ketiga strain L.
fermentum merupakan Gram positif dan dapat tumbuh pada suhu 37-45 ºC serta
tidak menghasilkan katalase, pertumbuhan ketiga strain tersebut termasuk kategori
bagus jika dibandingkan strain lainnya. Agati et al. (1998) menambahkan bahwa
L. fermentum yang diisolasi dari air susu ibu adalah Gram positif, non motil,
9
katalase negatif, dan tidak berspora. L. fermentum tersebut berbentuk batang
tunggal, koloni dan susunan rantai pendek.
Tabel 2 Karakteristik strain L. fermentum
Strain
Pewarnaan Gram Morfologi
Gambar Morfologi
L. fermentum Gram positif
Berbentuk batang
A323L
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
L. fermentum
B323K
Gram positif
Berbentuk batang
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
L. fermentum
C113L
Gram positif
Berbentuk batang
tunggal atau koloni,
susunan rantai
pendek
Prinsip kerja pewarnaan Gram yaitu kristal violet akan terserap oleh dinding
sel bakteri, selanjutnya iodine akan mempertahankan kristal violet. Penambahan
alkohol akan menghidrasi peptidoglikan sehingga kristal violet dan iodine tertahan
pada bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram positif tersusun atas 90%
peptidoglikan, sedangkan sisanya adalah lipid. Hal tersebut menyebabkan poripori dinding sel mengecil, permeabilitas berkurang dan warna ungu kristal violet
tidak dapat keluar (Pelczar dan Chan 2007).
Kurva Pertumbuhan (Total BAL, Nilai TAT dan Nilai pH)
Kurva pertumbuhan L. fermentum diperoleh dari hasil pengukuran populasi
BAL, uji total asam tertitrasi, dan uji pH pada waktu inkubasi yang berbeda yaitu
setiap 4 jam. Bakteri asam laktat memiliki beberapa fase pertumbuhan yaitu fase
adaptasi, logaritmik (eksponensial), tetap (statis) dan penurunan (kematian). Fase
tersebut dimulai dari adaptasi, pertumbuhan cepat, tetap sampai pada fase
kematian bakteri (Fardiaz 1992a). Kurva pertumbuhan L. fermentum dapat dilihat
pada Gambar 2.
Pada ketiga strain L. fermentum memenuhi populasi (total BAL) yang
berpengaruh nyata pada media whey dangke (P