IV.1 Tahapan Pelaksanaan
IV.2.1 Persiapan hewan coba Tikus diberi makan berupa makanan standar dan minum
ad libitum
selama 2 minggu untuk penyetaraan sebelum diberikan intervensi. IV.2.2 Pembuatan Zichoat
Sebanyak 200 mg asetat kitosan yang dibuat dengan melarutkan kitosan berat molekul rendah 15-50 kDa dalam asam asetat lalu
dilarutkan dalam 30 ml air deionisasi.
Succinic anhydride
ditambahkan dalam bentuk padat ke larutan kitosan sambil. pH campuran reaksi
dipertahankan pada kisaran 6 –6.5, kemudian dinaikkan hingga pH 8–9
dengan menambahkan 1 N NaHCO
3
. Setelah itu diamkan semalam pada temperatur ruangan dan dengan pengadukan, campuran reaksi
kembali didialisis terhadap air dan pH dipertahankan pada kisaran 8-9 dengan 1 N NaOH. Dilanjutkan dengan dipresipitasi menggunakan
etanol. Presipitat yang terbentuk dicuci dengan aseton kemudian dikeringkan pada suhu 50°C. Sebelum diadministrasikan ke tikus,
disiapkan larutan dengan konsentrasi volume Zichoat per 100 ml pelarut etanol menjadi 5, 10, 25, dan 50.
IV.2.3 Induksi adrenalin, pemberian diet kuning telur dan zichoat Ekor tikus dikompres dengan kapas berisi hangat sampai terjadi
dilatasi vena, kemudian dilakukan injeksi adrenalin intravena dengan dosis 0,006 mg konversi dosis kelinci 0,018. Induksi adrenalin
dilakukan sebanyak satu kali pada awal perlakuan. Adapun diet kuning telur diberikan melalui sonde lambung sebesar 3-4 BB tikus ±5 gr,
dicampur dengan zichoat sebanyak 1 cc, diberikan 1 kali setiap hari selama 30 hari.
IV.2.4 Pembedahan, pengambilan aorta, dan parafinisasi Tikus dieutanasia dengan ketamine dosis tinggi lalu diemboli. Setelah
itu dilakukan pembedahan dan diambil bagian aorta abdominalis sepanjang 5 cm di bawah arteri renalis sampai percabangan arteri
iliaca termasuk bifurcatio aorta. Aorta kemudian dimasukkan ke dalam fiksatif formalin 10 selama 24 jam, lalu dibuatkan blok parafin.
IV.2.5 Pemeriksaan Imunohistokimia Ekspresi CD36 Makrofag pada Tunika Intima
Sampel aorta yang telah disayat dengan mikrotom tebal 6 mikron diletakan pada slide polilisin dan difiksasi dengan menggunakan etanol
95 dan direhidrasi menggunakan 0,1 M PBS
phosphate
-
buffered saline
dalam pH 7,4. Selanjutnya dilakuan inkubasi 3 kali dengan hidrogen peroksida 3 selama 30 menit pada ruang kedap cahaya, 5
serum fetus sapi dan antibodi primer rabbit
anti CD36
selama 2 jam dalam suhu ruangan, dan inkubasi dengan antibodi sekunder selama 2
jam. Reaksi positif dideteksi dengan meneteskan
substrate chrommogen
DAB dilanjutkan
counterstain
dengan
hematoxylin
dan
kemudian ditutup dengan cover glass untuk diamati di bawah mikroskop cahaya pembesaran 100x.
IV.2.6 Pengukuran Ketebalan Intimal dan Hiperplasia Dinding Aorta Setelah proses deparafinisasi, dibuat sayatan histologi dengan
mikrotom, tebal 4 mikron, dan dilakukan pemulasan dengan HE. Pengukuran pertama menggunakan mikroskop cahaya perbesaran
100x untuk mengukur ketebalan neointimal pada 8 zona jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00, 22.30. Dilanjutkan dengan
pemeriksaan hiperplasia dengan pembesaran 400x.
IV.2.7 Prosedur Pengumpulan Data Data dikumpulkan berupa data kuantitatif imunohistokimia ekspresi
CD36 makrofag tunika intima dan gambaran mikroskopik penebalan intimal berupa ketebalan dan hiperplasia dinding aorta abdominalis.
Untuk pengukuran ekspresi CD36 dihitungan dengan skala rasio menggunakan aplikasi imagescope aperio, sementara untuk ketebalan
intimal dan hiperplasia dihitung dengan aplikasi aperio. IV.2.8 Teknik Analisa Data
Analisa data yang dipergunakan adalah Kolmogorov - Smirnov test, Levenne test, uji statistik parametric Anova satu arah dan uji beda
nyata terkecil
. Derajat kemaknaan yang ditetapkan adalah α=0,05.
IV.3 Instrumen Pelaksanaan
Kategori