Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR)

DETEKSI DIFERENSIAL POTYVIRUS DAN FABAVIRUS
DENGAN REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN
REACTION (RT-PCR)

VISHORA SATYANI

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

ABSTRAK
VISHORA SATYANI. Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA.
Tanaman nilam (Pogostemon cablin Benth) sangat potensial untuk
dikembangkan karena minyak nilam merupakan bahan baku yang penting dalam
industri. Terdapat banyak kendala dalam upaya peningkatan pengembangan
produksi tanaman nilam, salah satunya adalah adanya gangguan dari organisme
pengganggu tumbuhan (OPT). Potyvirus dan Fabavirus merupakan virus yang
yang sudah diketahui dapat menyerang tanaman nilam. Gejala yang ditimbulkan
pada tanaman nilam oleh kedua virus ini hampir tidak bisa dibedakan. Penelitian
ini bertujuan untuk menyiapkan metode diferensial yang dapat membedakan
dengan tepat infeksi Potyvirus dan Fabavirus pada tanaman nilam baik secara
tunggal maupun ganda melalui RT-PCR. Sumber virus merupakan tanaman nilam
yang terinfeksi alami Potyvirus atau Fabavirus yang telah diverifikasi dengan uji
serologi. RNA total diekstraksi dari tanaman nilam sumber virus dengan BenchTop Protocols for Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT Korea). cDNA
(complementary DNA) disintesis dengan teknik Reverse Transcription (RT). PCR
dilakukan dengan satu siklus pada 95 ºC selama 5 menit; 10 siklus pada 95 ºC
selama 1 menit, pada 51 ºC selama 1 menit, dan pada 72 ºC selama 1 menit;
30 siklus pada 94 ºC selama 1 menit, pada 54 ºC selama 1 menit, dan pada 72 ºC
selama 2 menit untuk; dan satu siklus pada 72 ºC selama 10 menit. Primer yang
digunakan untuk deteksi Potyvirus adalah CPUP-F (5’-TGAGGATCCTGGTGY
ATHGARAAYGG-3’, Y=C/T, H=A/T/C, R=A/G), CP9502-R (5’-GCGGATCCT
TTTTTTTTTTTTTTTT-3’) dan untuk Fabavirus adalah BBWVVSSP (5’GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’,B=C/G/T,D=A/G/T,Y=C/T),BBWVKMRM
(5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’, W=A/T; V=A/C/G; I=Inosine;
K=G/T). Kedua pasang primer ini dapat mengamplifikasi masing-masing genom
Potyvirus sepanjang 800 bp maupun Fabavirus sepanjang 322 bp secara spesifik
baik dalam uji terpisah maupun campuran. Metode deteksi diferensial ini berhasil
diterapkan untuk mendeteksi infeksi Potyvirus dan Fabavirus pada sampel
tanaman nilam bergejala mosaik yang dikoleksi dari wilayah Bogor yaitu Gunung
Bunder dan Cicurug. Pada deteksi tersebut dengan jelas dapat dibedakan tanamantanaman yang hanya terinfeksi Potyvirus atau Fabavirus saja atau terinfeksi ganda
kedua virus tersebut. Oleh karena itu, metode berbasis RT-PCR menggunakan
campuran pasangan primer CPUP-F/CP952-R dan BBWVVSSP/BBWVKMRM
valid digunakan untuk deteksi diferensial.
Kata kunci : Potyvirus, Fabavirus, RT-PCR, deteksi diferensial, nilam,
Pogostemon cablin

DETEKSI DIFERENSIAL POTYVIRUS DAN FABAVIRUS
DENGAN REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN
REACTION (RT-PCR)

VISHORA SATYANI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian
pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian
Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

LEMBAR PENGESAHAN
 
Judul

: Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR)

Nama

: Vishora Satyani

NRP

: A34070024 
Disetujui,
Pembimbing I

Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
NIP.19620607 198703 1 003

Diketahui,
Ketua Departemen Proteksi Tanaman

Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si.
NIP. 19650621 198910 2 001

Tanggal Lulus :

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati pada tanggal 25 Agustus 1989 dari pasangan
Harno (Alm) dan Sri Hadi Kuswariati. Penulis merupakan anak pertama dari dua
bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan menengah umum di SMA Negeri 1 Pati
pada tahun 2007. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa
program studi Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Ujian Saringan Masuk IPB (USMI).
Selama kuliah, penulis mengikuti kegiatan kepanitiaan dan organisasi di
IPB, yaitu Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman (HIMASITA) sebagai Staf
Divisi Fasilitas dan Properti periode 2009-2010. Penulis pernah mengikuti
kegiatan Magang di Laboratorium Pengamat Hama Penyakit Dinas Pertanian dan
Peternakan Kabupaten Pati pada tahun 2009. Penulis juga aktif mengikuti
kegiatan Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian (PKM-P) yang
berjudul “Pemanfaatan Bakteri Kitinolitik dalam Pengendalian Pascapanen
Penyakit Antraknosa (Colletotrichum gloeosporioides) pada Buah Cabai Merah”
pada tahun 2009-2010. Selain itu juga sebagai penyaji pada International Seminar
and The 21st National Congress of The Indonesian Phytopathological Society
2011.

PRAKATA
Puji serta syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan
rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi
yang berjudul “Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)”. Skripsi ini disusun
sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada program studi
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Rasa terima kasih yang tulus penulis sampaikan untuk kedua orang tua
tercinta Harno (Alm), Sri Hadi Kuswariati, adikku tersayang Desyana
Rachmawati, serta keluarga yang selalu memberikan kasih sayang, semangat,
nasihat, dan doa. Terima kasih kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. yang telah
bersedia menjadi dosen pembimbing skripsi dan dosen pembimbing akademik
yang telah memberikan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini dapat
terselesaikan dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Dr. Ir. R Yayi Munara Kusumah, M.Si. selaku dosen penguji tamu yang telah
menyediakan waktu dan perhatiannya.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan
Laboratorium Virologi Tumbuhan Mbak Tuti, Mbak Miftah, Mbak Pipit, Mbak
Mel, Mbak Dwi, Kak Aceu, Pak Irwan, Ibu Asni, Ibu Rita, Pak Edi, Sherly,
Harwan, Erika, Rizki, Avanty, Santi, Rita, Mia, Taher dan Fitri yang telah
membantu penulis selama di laboratorium. Terima kasih untuk sahabat-sahabatku
tercinta, Triyastuti Prasetyoningrum, Mey Fitriyani, Tatit Satrini dan Sani
Nihlatussania yang setia menemani dan membantu penulis serta senantiasa
memberikan motivasi, doa dan kasih sayang yang tulus. Terima kasih juga untuk
Anik, Icha, Riska, Osmond, dan teman-teman DPT 44 semua serta semua pihak
yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun
untuk kedepannya. Akhir kata penulis serahkan skripsi ini dengan penuh rasa
bangga.

Bogor, Maret 2012
Vishora Satyani

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL .....................................................................................
viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................

ix

PENDAHULUAN ....................................................................................

1

Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan Penelitian ....................................................................................
Manfaat Penelitian ..................................................................................

1
2
2

TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................

3

Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth) .........................................
Potyvirus .................................................................................................
Fabavirus................................................................................................
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ....................................
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ............

3
4
5
7
8

BAHAN DAN METODE ...........................................................................

10

Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................
Metode Penelitian ...................................................................................
Pengambilan Sampel Tanaman Nilam Bergejala Mosaik
di Lapangan .......................................................................................
Deteksi Potyvirus melalui I-ELISA ...................................................
Deteksi Fabavirus melalui DAS-ELISA ...........................................
Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus melalui RT-PCR ........
Ekstraksi RNA Total ....................................................................
Sintesis cDNA ..............................................................................
Amplifikasi DNA dengan PCR ....................................................
Elektroforesis ...............................................................................

10
10

HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................

17

Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Potyvirus ...............................
Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Fabavirus ..............................
Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Simultan
Potyvirus dan Fabavirus ....................................................................
Penerapan Metode RT-PCR untuk Deteksi Simultan Potyvirus
dan Fabavirus pada Sampel dari Lapangan ......................................

18
19

KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................

24

Kesimpulan .............................................................................................
Saran .......................................................................................................

24
24

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

25

10
10
11
11
12
12
13
14

20
21

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus
dan keduanya).........................................................................................

15

2. Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Fabavirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus
dan keduanya).........................................................................................

15

3. Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang digunakan
secara bersamaan terhadap 3 template cDNA yang berbeda
(Potyvirus, Fabavirus dan keduanya) ....................................................

16

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Partikel Potyvirus berbentuk seperti benang, memanjang
(filamentous) dan lentur (flexuous). (Natsuaki et al. 1994) .................

4

Partikel Fabavirus berbentuk seperti bulat (isometric)
(Natsuaki et al. 1994) ...........................................................................

6

Gejala mosaik pada daun nilam yang disebabkan oleh Potyvirus
dan atau Fabavirus ...............................................................................

17

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan pasangan primer spesifik Potyvirus ..............................

18

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan pasangan primer spesifik Fabavirus .............................

19

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan campuran primer Potyvirus dan Fabavirus ..................

21

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan campuran pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus
terhadap sampel dari lapangan .............................................................

22

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Minyak atsiri yang berasal dari minyak nilam (Pogostemon cablin Benth)
merupakan komoditi andalan Indonesia. Hampir 90% kebutuhan minyak nilam
dunia dipasok dari Indonesia, karena mutunya dinilai yang paling baik. Ekspor
minyak nilam Indonesia dari tahun ke tahun terus mengalami peningkatan (hampir
6% per tahun) sesuai dengan meningkatnya permintaan minyak nilam dipasaran
internasional. Volume ekspor ini juga tidak lepas dari usaha perluasan areal
pertanaman diberbagai daerah di Indonesia. Minyak nilam terutama digunakan
sebagai bahan fiksatif dan pewangi dalam industri parfurn, sabun dan kosmetika.
Selain itu minyak nilam juga digunakan sebagai bahan baku obat-obatan dan
pestisida. Hampir seluruh pertanaman nilam di Indonesia merupakan pertanaman
rakyat yang melibatkan 32.870 kepala keluarga petani (Direktorat Jenderal
Perkebunan 2006).
Namun demikian, produksi minyak atsiri di Indonesia masih rendah. Salah
satu sebabnya adalah adanya serangan organisme pengganggu tumbuhan (OPT)
yang menyerang tanaman nilam terutama virus. Penyakit virus yang banyak
menyerang

tanaman

nilam

adalah

penyakit

mosaik.

Tanaman

sakit

memperlihatkan gejala berupa perubahan warna pada daun yaitu mosaik hijau tua
dan hijau muda dan terjadi malformasi. Tanaman menjadi kerdil sehingga sangat
mengurangi kualitas dan kuantitas panen biomassa. Noveriza et al. (2010)
melaporkan bahwa penyakit mosaik pada tanaman nilam di daerah Jawa Barat
berasosiasi dengan infeksi dua jenis virus yang berbeda yaitu Potyvirus dan
Fabavirus. Kedua jenis virus ini ditemukan menginfeksi tanaman nilam di
lapangan baik secara tunggal maupun ganda dengan gejala yang tidak dapat
dibedakan.
Menurut Hartono et al. (2006) Patchouli mottle virus (PaMoV) merupakan
patogen penyebab penyakit yang sangat penting dan menyebabkan kerugian hasil
di sentra produksi nilam di Indonesia. Di samping PaMOV, Patchouli mild
mosaic virus (PaMMV) dilaporkan menyerang tanaman nilam di Jepang
(Natsuaki et al. 1994).

2

PaMoV merupakan spesies virus yang termasuk ke dalam genus Potyvirus,
sedangkan PaMMV merupakan spesies virus yang termasuk ke dalam genus
Fabavirus (Natsuaki et al. 1994). Gejala yang ditimbulkan oleh PaMoV maupun
PaMMV secara sendiri-sendiri maupun bersama pada tanaman nilam tidak dapat
dibedakan (Natsuaki et al. 1994). Hasil pengujian ELISA sampel tanaman nilam
dari Bogor dan Cianjur menunjukkan reaksi positif terhadap Potyvirus dan CMV
(Sukamto et al. 2007).
Hal ini menunjukkan bahwa Potyvirus dan Fabavirus telah dilaporkan
keberadaannya di pertanaman nilam di Indonesia. Oleh karena itu, diperlukan
suatu metode yang dapat mendeteksi kedua virus ini secara terpisah (differensial
diagnostic metode). Pada penelitian ini, digunakan dua pasang primer dalam
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) yang dapat
mengamplifikasi sebagian genom Potyvirus dan Fabavirus secara terpisah.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menyiapkan metode deteksi diferensial
Potyvirus dan Fabavirus yang menginfeksi tanaman nilam.

Manfaat Penelitian
Metode yang diperoleh dalam penelitian ini akan sangat berguna untuk
mendeteksi Potyvirus dan Fabavirus yang menginfeksi tanaman nilam secara
akurat.

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth)
Nilam (Pogostemon cablin Benth) merupakan bahan baku minyak nilam
(patchouli oil) yang merupakan komoditi ekspor terbesar (60%) dari ekspor
minyak atsiri Indonesia (Balai Besar Pelatihan Pertanian 2011). Nilam menjadi
komoditas ekspor penting di Indonesia karena 90% kebutuhan dunia akan minyak
nilam dipasok oleh Indonesia. Minyak nilam banyak digunakan sebagai bahan
baku, bahan pencampur dan fiksatif (pengikat wangi-wangian) dalam industri
parfum, farmasi dan kosmetik, serta industri makanan dan minuman (Balai
Penelitian Tanaman Rempah dan Obat 1991 & Mustofa 1991). Hal ini disebabkan
karena daya lekatnya yang kuat sehingga aroma wangi tidak mudah hilang karena
tercuci atau menguap, dapat larut dalam alkohol dan dapat dicampur dengan
minyak eteris lainnya.
Terdapat tiga jenis tanaman nilam yang tumbuh di Indonesia, yaitu : nilam
Aceh (Pogostemon cablin Benth) yang kandungan minyaknya tinggi, yaitu
2,5-5%, nilam Jawa atau nilam hutan (Pogostemon heyneanus Benth) dan nilam
sabun (Pogostemon hortensis Backer) kandungan minyaknya masing-masing 0,51,5%. Pada bulan Agustus tahun 2005 Menteri Pertanian telah melepas tiga
varietas nilam unggul yaitu : Sidikalang, Lhokseumawe dan Tapak Tuan dengan
kadar minyak cukup tinggi yaitu 2-4% dan produksi minyak per hektar relatif
tinggi. Produk yang dihasilkan dari usaha tani nilam adalah terna (daun dan
ranting), melalui proses penyulingan dihasilkan minyak nilam.
Tanaman nilam dapat tumbuh dan berproduksi pada daerah dengan
ketinggian 0-1.200 m di atas permukaan laut (dpl), namun akan tumbuh dan
berproduksi optimum pada daerah dengan ketinggian 10-400 m dpl. Curah hujan
yang dikehendaki sekitar 2.300-3.000 mm per tahun dan kelembaban lebih dari
60%. Suhu udara antara 24-28 oC dengan intensitas penyinaran matahari berkisar
75-100%. Tanah yang dikehendaki adalah subur, gembur dan mengandung bahan
organik dengan pH 5,5-7. Membutuhkan banyak air, tetapi tidak tahan genangan
air sehingga perlu dibuat drainase yang baik.

4

Potyvirus
Potyvirus merupakan virus yang menyerang tanaman nilam dan termasuk
ke dalam famili Potyviridae yang merupakan famili terbesar dalam virus tanaman
yang tergolong positif sense single-stranded RNA (ssRNA(+)) yang dikenal
sekarang ini dan merupakan genus terbesar dalam famili tersebut. Semua anggota
dari genus tersebut memiliki virion berbentuk filamen dan fleksibel (Gibs et al.
2008). Seperti yang dilaporkan juga oleh Natsuaki et al. (1994), bahwa partikel
Potyvirus berbentuk seperti benang, memanjang (filamentous) dan lentur
(flexuous) (Gambar 1).

Gambar 1 Partikel Potyvirus berbentuk seperti benang, memanjang (filamentous)
dan lentur (flexuous) (Natsuaki et al. 1994)
Taksonomi Potyvirus, sebagai kelompok virus tumbuhan terbesar yang
menyerang tanaman, sampai saat ini masih menjadi perdebatan karena besarnya
variasi antara spesies (Ward & Shukla 1990). Runutan asam amino protein
selubung (coat protein/CP) telah dicoba digunakan untuk menilai kekerabatan
17 isolat dari delapan spesies Potyvirus (Shukla & Ward 1988). Hasil kajian
menunjukkan antara spesies Potyvirus yang berbeda terdapat tingkat kesamaan
runutan asam amino dari CP sebesar 38-71% dan antara galur yang berbeda dalam
spesies virus yang sama mempunyai tingkat kesamaan mencapai 99% (Akin
2002).
Genus Potyvirus memiliki inang yang cukup banyak dan bervariasi dari
beberapa famili tanaman diantaranya yaitu Amaranthaceae, Chenopodiaceae,
Compositae, Labiateae, dan Solanaceae. Anggota dari genus Potyvirus memiliki
panjang partikel minimal 700 nm. Genom dikarakteristikkan oleh 5’untranslated
region (5’UTR) dimana terhubung dengan genome-linked protein (VPg), mayor
tunggal open reading frame (ORF) dan 3’UTR region mengakhiri di ujung poly-

5

adenylated. Kode ORF merupakan polyprotein tunggal dan besar yang kemudian
diproses menjadi 10 protein fungsional (Adam et al. 2005). Protein tersebut yaitu
first protein (P1), helper component protease (HC-Pro), third protein (P3), 6K1,
cylindrical inclusion protein (CI), 6K2, small nuclear inclusion protein (NIa;
including the VPg and protease (NIa-Pro) domains), large nuclear inclusion
protein (NIb; replicase) dan coat protein (CP).
Anggota dari genus Potyvirus ditularkan oleh kutu daun secara
nonpersisten dan menginfeksi banyak spesies tanaman monokotil dan dikotil
(Shukla et al. 1998) dan sebagian juga ditularkan melalui benih yang berasal dari
tanaman sakit (Gibs et al. 2008). Beberapa ratus spesies kutu daun diketahui
sebagai vektor dalam penyebaran Potyvirus dan kebayakan berasal dari subfamili
Aphidinae diantaranya yaitu beberapa spesies dari Aphis sp, Myzus sp dan
Rhopalosiphum sp (Gibs et al. 2008). Pembagian genus dalam famili tersebut
berdasarkan penularan yang dilakukan oleh vektor pada virus tersebut dan
karakteristik genom (Berger et al. 2005).

Fabavirus
Virus yang berasal dari genus Fabavirus (famili Comoviridae) dapat
menginfeksi tanaman dalam berbagai kisaran inang, termasuk tanaman yang
memiliki nilai ekonomi tinggi dan tanaman holtikultura dalam berbagai spesies.
Virus ini sangat berpotensi menyebabkan kehilangan hasil yang sangat tinggi pada
tanaman di dunia setiap tahunnya (Ferrer et al. 2007). Sekarang ini, terdapat tiga
spesies yang telah diakui termasuk dalam genus Fabavirus yaitu Broad bean wilt
virus 1 (BBWV 1), Broad bean wilt virus 2 (BBWV 2), Lamium mild mosaic
virus (LaMMV) dan kandidat spesies baru, Gentian mosaic virus (GeMV)
(Kobayashi 2005).
BBWV 1 dan BBWV 2 dapat dibedakan berdasarkan uji serologi
(Uyemoto 1974). Pada penelitian sebelumnya, telah ditentukan bahwa seluruh
sekuen nukleotida dari RNA BBWV-1 dan BBWV-2 dilaporkan memiliki
hubungan genetik satu dengan lainnya (Kobayashi et al. 2003). Tanaman yang
terdeteksi tunggal BBWV memiliki gejala mosaik, vein-clearing, rugosity, dan

6

malformasi pada daun (Kondo et al. 2005). BBWV memiliki kisaran inang yang
luas pada tanaman dikotil dan beberapa famili tanaman monokotil (Qi et al.
2000). Patchouli mild mosaic virus (PaMMV) juga telah diklasifikasikan sebagai
spesies yang termasuk dalam Fabavirus (Ferrer 2005 & Kobayashi 2003) yang
telah diusulkan sebagai salah satu isolat BBWV-2 (Ikegami 1998 & 2001).
Virus yang termasuk kedalam genus Fabavirus dapat ditularkan oleh kutu
daun secara nonpersisten dan dapat menyebabkan penyakit pada bagian tanaman
dan buah (Kobayashi 2005). Selain itu, dapat juga ditularkan secara mekanis,
namun tidak melalui benih.
Partikel dari Fabavirus berbentuk icosahedral, diameter sekitar 30 nm,
dan terbagi menjadi 3 komponen yaitu bentuk T, M, dan B, selama density
gradient uhra-centrifugation (DGC) (Wellink et al. 2000). Genom RNA terdiri
dari dua molekul single strand dari 6.0-6.3 kb (RNA1) dan 3.9-4.5 kb (RNA2)
dimana terjadi pemisahan encapsid pada komponen B dan M secara berturut-turut.
Masing-masing dari 3 komponen tersebut disusun dari 2 protein yang berbeda
yaitu Mr 40 x 103 sampai 45 x 103 (large coat protein; LCP) dan 21 x 103 sampai
27 x 103 (small coat protein; SCP)(Kobayashi 2005). RNA Fabavirus
ditranslasikan menjadi single polyprotein awal, dimana protein fungsional
diperoleh dari pemecahan proteolytic yang terjadi seperti pada Comoviridae
(Wellink 2000). Seperti tampak pada Gambar 2, partikel Fabavirus berbentuk
seperti bulat (isometric) (Natsuaki et al. 1994).

Gambar 2

Partikel Fabavirus berbentuk seperti bulat (isometric) (Natsuaki et
al. 1994)

7

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan teknik serologi
canggih yang menjanjikan untuk deteksi dan identifikasi patogen tumbuhan
(Seal & Elpninstone 1994, Converse & Martin 1990). Teknik ini dapat diterima
secara luas oleh penggunanya, karena: (1) efisien menggunakan bahan kimia,
1,0 ml antiserum dapat digunakan untuk menguji 10-20 ribu sampel; (2) bahan
kimia yang digunakan tidak berbahaya dan memiliki daya simpan lama; (3) bahan
yang diuji dapat langsung berupa ekstrak tanaman sakit tanpa harus mengisolasi
patogennya

terlebih

dahulu;

(4)

mempunyai

kepekaan

deteksi

tinggi

(1-10 ng virus/ml dan 103-104 sel bakteri/ml); (5) prosedurnya relatif sederhana
dan cepat, antara 5-24 jam; (6) hasilnya dapat kuantifikasi; (7) dapat digunakan
untuk menguji sampel dalam jumlah besar sekaligus; dan (8) dapat digunakan
langsung di lapangan (Thomas et al. 1989, Converse & Martin 1990). Seiring
dengan perkembangannya, teknik ELISA mengalami berbagai modifikasi baik
dari segi praktis maupun kehandalannya, sehingga muncul berbagai variannya
(Randles et al. 1996 & Seal 1997). Sebagai teknik serologi, prinsip dasar ELISA
adalah reaksi antara antigen (Ag) dengan antibodi (Ab) menjadi molekul Ag-Ab
yang lebih besar dan mudah mengendap. Perbedaannya, pengamatan hasil reaksi
pada serologi biasa berdasarkan endapan molekul Ag-Ab, sedangkan pada ELISA
berdasarkan perubahan warna yang terjadi pada substrat pereaksi sesuai dengan
label atau imunoprob (immuno probe) konjugat antibodi-enzim. Perubahan warna
terjadi akibat hidrolisa enzimatik pada reaksi antara konjugat antibodi-enzim
dengan substratnya, sehingga hasil ELISA lebih peka dan dapat dikuantifikasi
(Converse & Martin1990). Tahapan umum ELISA meliputi penempelan
(trapping) Ag atau Ab pada media reaksi (solid phase), seperti cawan ELISA,
diikuti penambahan konjugat, dan diakhiri dengan penambahan substrat serta
bufer penghenti reaksi (blocking buffer).
Dalam perkembangannya, metode ini mengalami modifikasi dalam
prosedur pelaksanaan pengujian, diantaranya adalah pengujian standar (direct)
Double Antibody Sandwich-Enzyme Link Immunosorbent Assay (DAS ELISA)
dan Indirect-Enzyme Link Immunosorbent Assay (I-ELISA). Perbedaan kedua
metode ini adalah pada tempat enzim terikat. Bila konjugasi enzim dilakukan pada

8

imunoglobulin antivirus maka metode itu termasuk DAS-ELISA, tetapi bila
konjugasi enzim dilakukan pada imunoglobulin dari serum darah hewan maka
metode tersebut diklasifikasikan sebagai I-ELISA (Badan Karantina Tanaman
2009).

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)
Sebagian besar komponen genetik virus tanaman adalah RNA, terutama
jenis-jenis viroid yang hanya terdiri dari RNA. Untuk melipat gandakan DNA dari
cetakan yang berupa RNA maka sebelumnya perlu dilakukan sebuah tahapan
yaitu transkripsi balik (reverse transcription). Pada tahap ini cetakan RNA
terlebih dahulu diubah menjadi cDNA (complementary DNA) menggunakan
enzim reverse transcriptase.
Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode deteksi
yang sensitif dan cepat dalam mendeteksi virus. PCR merupakan sebuah metode
yang digunakan untuk memperbanyak suatu fragmen DNA yang spesifik secara
invitro. Posisi fragmen DNA yang spesifik tersebut ditentukan oleh sepasang
primer yang akan menjadi cetakan awal untuk proses perbanyakan fragmen DNA
selanjutnya

dengan

bantuan

enzim polimerase

dan deoxyribonucleotide

triposphate (dNTPs) yang dikondisikan pada suhu tertentu. Fragmen DNA, yang
pada awalnya terdapat dalam konsentrasi yang sangat rendah akan diperbanyak
menjadi cetakan fragmen DNA baru yang cukup untuk dapat divisualisasi pada
gel agarosa (Badan Karantina Tanaman 2009).
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara
20–30 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap kerja
PCR dalam satu siklus:
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada
suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA
menjadi berutas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan
agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah.
Pemisahan ini DNA tidak stabil dan siap menjadi template bagi primer. Durasi
tahap ini 1–2 menit.

9

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
template yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara
45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis
DNA polymerase yang dipakai. Dengan Taq-polymerase, proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian
Survei penyakit mosaik dan koleksi sampel tanaman nilam sakit dilakukan
di Kebun Percobaan Balai Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah
Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Deteksi virus dilakukan di
Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Maret sampai November
2011.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Tanaman Nilam Bergejala Mosaik di Lapangan
Sampel tanaman nilam yang bergejala mosaik diperoleh dari Kebun
Percobaan Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah
Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Sampel daun yang diambil dari
lapangan dideteksi di laboratorium.
Deteksi Potyvirus melalui I-ELISA
Teknik deteksi diawali dengan menggerus sampel tanaman nilam
sebanyak 0,1 g dalam buffer coating pH 9,6 dengan perbandingan 1:5 (b/v).
Sebanyak 100 µl sampel tanaman kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing
sumuran plat mikrotiter ELISA dan diinkubasi semalam pada suhu 4 °C. Cairan
sampel tanaman dalam plat mikrotiter dibuang kemudian plat di cuci dengan
phosphate buffer saline tween-20 (PBST) sebanyak dua kali kemudian masingmasing sumuran diisi dengan 100 µl skim milk 2%. Plat diinkubasi selama
30 menit pada suhu 37 °C. Setelah itu buang dan keringkan plat mikrotiter
kemudian masing-masing sumuran diisi dengan antiserum Potyvirus sebanyak
100 µl dan diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 °C. Antiserum tersebut
telah diencerkan terlebih dahulu menggunakan buffer conjugate dengan
perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian dicuci dengan PBST sebanyak
tiga kali dan kemudian diisi dengan 100 µl konjugat yang dilarutkan dalam
conjugate buffer dengan perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian
diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi selama 2 jam plat

11

mikrotiter dicuci menggunakan PBST sebanyak tiga kali. Masing-masing
sumuran kemudian diisi dengan 100 µl PNP yang telah dilarutkan dalam substrate
buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan di tempat gelap. Plat mikrotiter
kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan ELISA reader (Bio-RAD 550)
pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit selama 60 menit. Dalam setiap
pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman sehat dan bufer. Pengujian
dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji 2 kali lebih besar daripada
kontrol negatif tanaman sehat.

Deteksi Fabavirus melalui DAS-ELISA
Teknik deteksi diawali dengan mengencerkan antiserum Fabavirus pada
coating buffer dengan perbandingan 1:500. Sebanyak 100 µl antiserum
dimasukkan kedalam masing-masing sumuran pada plat mikrotiter dan
diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 °C. Plat mikrotiter kemudian dicuci
menggunakan PBST sebanyak 2 kali. Sampel tanaman sebanyak 0,1 g digerus
menggunakan extract buffer dengan perbandingan 1:5 (b/v) kemudian 100 µl
dimasukan ke dalam masing-masing sumuran dan diinkubasi pada suhu 4 °C
selama semalam. Plat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak
3 kali. Pada masing-masing sumuran dimasukkan 100 µl konjugat yang telah
diencerkan pada conjugate buffer dengan perbandingan 1:500 dan diinkubasikan
selama 4 jam pada suhu 37 °C. Masing-masing sumuran dicuci kembali
menggunakan PBST sebanyak 3 kali dan kemudian ditambahkan 100 µl PNP
yang telah dilarutkan dalam substrate buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan
di tempat gelap. Plat mikrotiter kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan
ELISA reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit
selama 60 menit. Dalam setiap pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman
sehat dan bufer. Pengujian dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji
2 kali lebih besar daripada kontrol negatif tanaman sehat.

Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus Melalui RT-PCR
Untuk dapat membedakan Potyvirus dan Fabavirus yang menginfeksi
tanaman nilam, dilakukan deteksi virus melalui metode RT-PCR dan

12

menggunakan primer khusus yang dapat digunakan dalam RT-PCR yang dapat
mengamplifikasi virus secara terpisah.
Ekstraksi RNA total. RNA total diekstraksi dari jaringan daun tanaman
nilam bergejala penyakit mosaik dengan menggunakan Bench-Top Protocols for
Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT Korea). Tanaman yang diekstraksi merupakan
tanaman yang telah diuji menggunakan ELISA dan positif Potyvirus dan
Fabavirus. Tahapannya adalah sebanyak 0,1 g sampel daun digerus dengan
menggunakan mortar dan pistil steril dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan
dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl bufer XPRB
yang mengandung 1% mercaptoethanol, kemudian dihomogenkan. Sampel
dipipet, lalu dimasukkan ke dalam filter coloumn putih dan ditempatkan pada
tabung koleksi 2 ml, lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit.
Supernatan dipipet tanpa menyentuh pelet dalam tabung koleksi, ukur volume
supernatan yang diperoleh lalu dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml baru.
Kemudian ditambahkan ethanol 96% (setengah dari volume supernatan) dan
dicampur dengan rata. Sampel dimasukkan ke dalam XPPLR

mini coloumn

merah, kemudian ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu disentrifuse pada
kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi
dibuang, kemudian ditambahkan 500 µl wash buffer 1 ke dalam XPPLR mini
coloumn, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm
selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian
ditambahkan 700 µl wash buffer 2 ke dalam XPPLR mini coloumn, lalu ditutup
dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan
yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian untuk mengeringkan
XPPLR

mini coloumn disentrifuse selama 3 menit pada 12000 rpm. Untuk

meyakinkan bahwa coloumn telah kering, coloumn dipindahkan pada tabung
koleksi baru. Selanjutnya, 50 µl RNAse free water ditambahkan ke dalam pusat
membran XPPLR

mini coloumn, didiamkan 1 menit lalu disentrifuse pada

kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Siapan RNA total ini digunakan sebagai
template dalam reaksi RT-PCR.
Sintesis cDNA. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi
cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan teknik Reverse Transcription

13

(RT). Reaksi RT dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA
total, 2 µl bufer RT 10X, 0,35 µl 50 mM DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mM dNTP
(deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M-MuLV Rev, 0,35 µl RNase
inhibitor, 0,75 µl oligo (dT), dan 2,2 µl H2O. Komponen-komponen tersebut
digunakan untuk satu kali reaksi RT. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah
Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied
Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25 ºC selama
5 menit, 42 ºC selama 60 menit, dan 70 ºC selama 15 menit. cDNA hasil RT
digunakan sebagai DNA template dalam reaksi PCR.
Amplifikasi DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA virus dilakukan
dengan metode PCR dengan menggunakan pasangan primer yang telah didesain
khusus untuk mengamplifikasi virus secara terpisah. Pasangan primer yang
spesifik

digunakan

untuk

mendeteksi

Potyvirus

yaitu

CPUP(F)

(5’-

TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3’, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G),
spesifik

untuk

coat

protein

pada

Potyvirus

dan

CP9502(R)

(5’-

GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) spesifik untuk ujung 3’ genom
Potyvirus dengan prediksi ukuran produk 800 bp (Singh et al. 2009). Sedangkan
pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yaitu
[BBWVVSSP (5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A,
G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICK
CATTTT-3’, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan
prediksi ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat
protein (LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP) (Kondo et al. 2005).
Metode yang digunakan dalam penelitian ini untuk mengamplifikasi DNA
Potyvirus, Fabavirus, dan keduanya yaitu digunakan pasangan primer Potyvirus,
pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang
dicampur untuk mengamplifikasi DNA Potyvirus, Fabavirus, dan campuran
kedua DNA tersebut. Reaksi PCR dengan total volume 25 µl, terdiri atas 1 µl
masing-masing primer, 12,5 µl Go Tag Green Master Mix 2x (Promega, Madison,
USA), 9,5 µl H2O, dan 1 µl DNA template. Amplifikasi ini dilakukan pada
Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied
Biosystem, USA). Untuk Potyvirus amplifikasi ini didahului dengan denaturasi

14

awal pada 94 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus yang
terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing)
pada 54 ºC selama 2 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit. Khusus
untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk tahapan sintesis,
dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk Fabavirus amplifikasi ini didahului
dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC selama 1 menit, penempelan
primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC
selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 5 menit pada 72 ºC
untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk pengujian yang
dilakukan bersamaan menggunakan primer Potyvirus dan Fabavirus (Mix)
amplifikasi ini didahului dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit.
Kemudian dilanjutkan dengan 10 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC
selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan
pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, kemudian dilanjutkan dengan 30 siklus
yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer
(annealing) pada 54 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama
2 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk
tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Setelah dilakukan PCR,
maka hasil yang diperoleh dapat dielektroforesis.
Elektroforesis. Agarose sebanyak 0,3 gr dimasukkan ke dalam tabung
Erlenmeyer 100 ml, lalu ditambahkan 30 ml bufer Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x
(0,045 M Tris-Borate, 0,01 M EDTA), untuk pembuatan gel agarose. Kemudian
dipanaskan dalam microwave selama 2 menit atau sampai agarose larut. Larutan
agar didinginkan terlebih dahulu selama kurang lebih 15 menit, kemudian
ditambahkan 1,5 µl ethidium bromida kemudian diaduk. Cetakan gel telah
disiapkan terlebih dahulu dan ‘sisir’ gel diletakkan di bagian atas pencetak gel
kemudian larutan agarose dituang ke dalam cetakan. Gel didiamkan sampai
mengeras (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke dalam
bak elektroforesis yang berisi buffer TBE 0,5 kali. DNA hasil PCR dimasukkan
ke dalam sumur gel elektroforesis sebanyak 5 µl dan 100 bp DNA ladder
dimasukkan pada sumuran gel elektroforesis yang berada di posisi sebelah kiri

15

sebanyak 5 µl. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 volt selama
25 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator ultraviolet.
Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut difoto dengan
menggunakan kamera digital.
PCR dilakukan berkali-kali untuk melihat validitas pasangan primer
Potyvirus, pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer keduanya.

Tabel 1 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan
keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer CPUP-F
Primer CP9502-R
cDNA
Total Volume (µl)

Volume(µl)1
9,5
12,5
1
1
1
25

1)

Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi

2)

Volume(µl)2
28,5
37,5
3
3
3
75

Volume total yang diperlukan

Tabel 2 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Fabavirus yang digunakan secara terpisah
terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan
keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer BBWVVSSP
Primer BBWVKMRM
cDNA
Total Volume (µl)
1)

Volume(µl)1
9,5
12,5
1
1
1
25

Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi

2)

Volume(µl)2
28,5
37,5
3
3
3
75

Volume total yang diperlukan

16

Tabel 3 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi
validitas pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang digunakan
secara bersamaan terhadap 3 template cDNA yang berbeda (Potyvirus,
Fabavirus dan keduanya).
Komponen
H2O
Gotag Green Master Mix 2x
Primer CPUP-F
Primer CP9502-R
Primer BBWVVSSP
Primer BBWVKMRM
cDNA
Total Volume (µl)
1)

Volume(µl)1

Volume(µl)2

7,5
12,5

22,5
37,5

1
1
1
1
1
25

3
3
3
3
3
75

Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi;
sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi

2)

Volume total yang diperlukan

HASIL DAN PEMBAHASAN

Metode deteksi yang dilakukan untuk mengetahui keberadaan Potyvirus
dan Fabavirus di pertanaman nilam yaitu dengan DAS-ELISA untuk mendeteksi
Fabavirus, I-ELISA untuk mendeteksi Potyvirus dan RT-PCR untuk mendeteksi
keduanya secara molekuler. Sampel tanaman yang diambil dari areal pertanaman
nilam di daerah Bogor yaitu di Gunung Bunder dan di Cicurug memiliki gejala
mosaik. Berdasarkan hasil ELISA pada sampel di lapangan, diketahui bahwa
tanaman nilam positif terserang Potyvirus, Fabavirus dan keduanya. Tanaman
yang positif terserang berdasarkan uji ELISA kemudian diekstraksi dan dilakukan
uji molekuler menggunakan RT-PCR.
Penyakit mosaik tanaman nilam yang disebabkan oleh Potyvirus dan
Fabavirus memiliki gejala yang tidak dapat dibedakan di lapangan (Gambar 3).
Oleh karena itu deteksi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang
telah didesain khusus.

N

Gambar 3

Gejala mosaik pada daun nilam yang disebabkan oleh Potyvirus dan
atau Fabavirus

Deteksi dengan RT-PCR memerlukan sepasang primer yang didesain
khusus untuk mendeteksi virus secara terpisah. Primer-primer yang digunakan
dalam metode ini yaitu CPUP(F)(5’-TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG3’, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G), spesifik untuk coat protein pada Potyvirus dan
CP9502(R)(5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) spesifik untuk ujung
3’ genom Potyvirus dengan prediksi ukuran produk 800 bp. Sedangkan pasangan
primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yaitu [BBWVVSSP

18

(5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T;
Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’,
W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan prediksi
ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat protein
(LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP).

Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Potyvirus
Berdasarkan hasil deteksi RT-PCR menggunakan primer CPUP(F)(5’TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3’) dan CP9502(R)(5’-GCGGATCC
TTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) terhadap sampel tanaman nilam yang telah
diketahui terinfeksi Potyvirus dan Fabavirus secara tunggal dan ganda, dapat
diketahui bahwa primer tersebut hanya memberikan sinyal positif pada sampel
yang telah diketahui terserang Potyvirus. Seperti hasil yang tertera pada
Gambar 4, terlihat bahwa pada sampel tanaman nilam yang terinfeksi tunggal oleh
Potyvirus terbentuk pita DNA berukuran 800 bp.
M

1

2

3

4

800 bp

Gambar 4

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan pasangan primer spesifik Potyvirus. Lajur 1: kontrol
negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA ladder;
lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal
oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang positif
terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun tanaman
nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus Potyvirus dan
Fabavirus.

19

Pada sampel tanaman yang terinfeksi tunggal oleh Fabavirus tidak muncul
pita karena Fabavirus tidak dapat dideteksi oleh primer Potyvirus. Pada sampel
tanaman yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan Fabavirus terlihat hanya satu
pita DNA saja, yaitu pita DNA berukuran 800 bp saja yang merupakan pita DNA
Potyvirus dan tidak terdapat pita yang berukuran 322 bp yang merupakan pita
DNA Fabavirus. Demikian juga pada sampel tanaman yang sehat tidak terdapat
pita DNA. Hasil ini menunjukkan kespesifikan pasangan primer CPUP(F) dan
CP9502(R) untuk mendeteksi keberadaan Potyvirus.

Validasi Pasangan Primer untuk DeteksiFabavirus
Berdasarkan hasil deteksi RT-PCR menggunakan primer BBWVVSSP
(5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T;
Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’,
W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T) terhadap sampel
tanaman nilam yang telah diketahui terinfeksi Potyvirus dan Fabavirus secara
tunggal dan ganda, dapat diketahui bahwa primer tersebut hanya memberikan
sinyal positif pada sampel yang telah diketahui terserang Fabavirus. Seperti hasil
yang tertera pada Gambar 5, terlihat bahwa pada sampel tanaman nilam yang
terinfeksi tunggal oleh Fabavirus terbentuk pita DNA berukuran 322 bp.
M

1

2

3

4

322 bp

Gambar 5

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan pasangan primer spesifik Fabavirus. Lajur 1: kontrol
negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA ladder;
lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal
oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang positif
terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun tanaman
nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus Potyvirus dan
Fabavirus.

20

Pada sampel tanaman yang terinfeksi tunggal oleh Potyvirus tidak muncul
pita karena Potyvirus tidak dapat dideteksi oleh primer Fabavirus. Pada sampel
tanaman yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan Fabavirus terlihat hanya satu
pita DNA saja, yaitu pita DNA berukuran 322 bp saja yang merupakan pita DNA
Fabavirus dan tidak terdapat pita yang berukuran 800 bp yang merupakan pita
DNA Potyvirus. Demikian juga pada sampel tanaman yang sehat tidak terdapat
pita DNA. Hasil ini menunjukkan kespesifikan pasangan primer BBWVVSSP dan
BBWVKMRM untuk mendeteksi Fabavirus.

Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Simultan Potyvirus dan Fabavirus
Metode RT-PCR dengan menggunakan primer Potyvirus dan Fabavirus
telah terbukti dapat mendeteksi kedua virus secara terpisah. Untuk mendeteksi
secara simultan Potyvirus dan Fabavirus pada tanaman nilam yang terinfeksi
ganda digunakan metode yang berbeda dimana kedua pasangan primer Potyvirus
dan Fabavirus digunakan secara bersamaan tercampur dengan komponen PCR
yang lain. Hasil yang diperoleh jika pasangan primer tersebut digunakan secara
bersamaan terlihat pada Gambar 6.
Seperti terlihat pada gambar tersebut, pada lajur 1 tidak terdapat pita DNA
yang muncul karena sampel merupakan kontrol tanaman sehat. Pada lajur 2 yang
merupakan sampel positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus terlihat hanya pita
DNA Potyvirus berukuran 800 bp. Hal ini disebabkan pasangan primer Potyvirus
hanya mendeteksi virus yang spesifik yaitu Potyvirus saja, sedangkan Fabavirus
tidak terdeteksi. Begitu pula jika sampel yang digunakan merupakan sampel yang
terinfeksi tunggal oleh Fabavirus seperti ditunjukkan pada lajur 3 maka pita DNA
yang muncul yaitu pita DNA Fabavirus dengan panjang 322 bp.

21

M

1

2

3

4

800 bp
322 bp

Gambar 6

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan campuran primer Potyvirus dan Fabavirus. Lajur 1:
kontrol negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA
ladder; lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi
tunggal oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang
positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun
tanaman nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus
Potyvirus dan Fabavirus.

Pada lajur 4, yang merupakan sampel tanaman yang terinfeksi ganda oleh
Potyvirus dan Fabavirus, terdapat 2 pita DNA yang muncul karena kedua virus
tersebut terdeteksi oleh kedua pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus sehingga
kedua pasangan primer akan menempel pada pasangan DNA masing-masing.
Pasangan primer Potyvirus akan menempel pada DNA Potyvirus dan pasangan
primer Fabavirus akan menempel pada DNA Fabavirus. Meskipun terdapat pada
satu lajur, kedua pita tersebut dapat terlihat jelas karena perbedaaan ukurannya.
Pita DNA Potyvirus berada di bagian atas dengan panjang 800 bp sedangkan pita
DNA Fabavirus berada di bagian bawah dengan panjang 322 bp.
 

Dengan metode pencampuran kedua primer ini maka dapat diketahui

bahwa kedua primer Potyvirus dan Fabavirus dapat digunakan untuk mendeteksi
kedua virus ini, baik yang terinfeksi tunggal maupun yang terinfeksi ganda. Selain
untuk mendeteksi virus, metode RT-PCR dengan kedua pasang primer ini juga
dapat diterapkan untuk diagnostik sampel dari lapangan.

Penerapan Metode RT-PCR untuk Deteksi Simultan Potyvirus dan Fabavirus
pada Sampel dari Lapangan
Hasil deteksi dengan menggunakan RT-PCR untuk sampel yang berasal
dari lapangan dapat dilihat pada Gambar 7. Pada lajur 1,2 dan 3 berfungsi sebagai

22

kontrol, yaitu untuk lajur 1 merupakan sampel tanaman sehat, lajur 2 merupakan
sampel tanaman yang positif terinfeksi tunggal Potyvirus dan lajur 3 oleh
Fabavirus. Lajur 4 sampai lajur 16 merupakan sampel dari lapangan, yaitu dari
Gunung Bunder dan Cicurug, keduanya dari wilayah Bogor.

M

1 2 3 4

5 6

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

800 bp
322 bp

Gambar 7

Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR
menggunakan campuran pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus
terhadap sampel dari lapangan. Daun tanaman nilam yang positif
sehat (lajur 1), sampel yang positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus
(lajur 2), sampel yang positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus (lajur
3), sampel yang berasal dari Cicurug (lajur 4, 7, 11, 15), Gunung
Bunder (lajur 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16), dan marker 100 bp DNA
ladder (lajur M).

Berdasarkan RT-PCR yang dilakukan dengan menggunakan pasangan
primer Potyvirus dan Fabavirus yang dicampur dapat diketahui bahwa sampel
yang positif terinfeksi oleh Potyvirus ditandai adanya pita DNA dengan panjang
800 bp dan yang terinfeksi oleh Fabavirus ditandai oleh adanya pita DNA 322 bp.
Terlihat juga bahwa dua sampel lajur 4 yang berasal dar

Dokumen yang terkait

Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR)