Keragaman Genetik Beberapa Isolat Bacillus Thuringiensis Asal Sumatera Utara
Jurnal Biologi Sumatera, Januari 2007, hlm. 1 – 3
ISSN 1907-5537
Vol. 2, No. 1
KERAGAMAN GENETIK BEBERAPA ISOLAT
Bacillus thuringiensis ASAL SUMATERA UTARA
Dwi Suryanto
Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sumatera Utara,
Jln. Bioteknologi No. 1, Kampus USU, Padang Bulan, Medan 20155
Abstract
A study on genetic variability of several Bacillus thuringiensis isolates of North Sumatra has been
conducted using pulsed-field gel electrophoresis. Bioassay of the isolates to insect larvae showed that the
isolates have different host specificity. Total genome analysis showed that all isolates were genetically different.
Keywords: Bacillus thuringiensis, genetic diversity, pulsed-field gel electrophoresis
PENDAHULUAN
Bacillus thuringiensis, satu bakteri aerob,
pembentuk spora, gram positif, merupakan bakteri
indigenous pada tanah, air, permukaan tumbuhan,
serangga mati, dan biji-bijian (Kawalek et al., 1995;
Bravo et al., 1998). Strain-strain dari bakteri ini telah
diisolasi dari banyak negara (Bravo et al., 1998).
Strain-strain ini menunjukkan kisaran spesifisitas
yang luas pada berbagai ordo serangga (Lepidoptera,
Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, dan
Mallophaga) dan Acari (Bravo et al., 1998). Bakteri
ini memproduksi protein kristal (protein cry) selama
sporulasi (Kuo & Chak, 1996). Untuk mendapatkan
strain B. thuringiensis baru untuk memproduksi
protein cry, isolasi sejumlah besar strain B.
thuringiensis baru saat ini menjadi aktivitas rutin pada
banyak industri (Kuo & Chak, 1996).
Beragam isolat dan subspesies B. thuringiensis
diketahui sebagai sumber penting biopestisida
komersial (Lopez-Meza & Ibarra, 1996). Bakteri ini
memenuhi syarat sebagai agen pengendali mikrobiologi
terhadap hama dan vektor penyakit pertanian (BenDov et al., 1999).
Identifikasi strain B. thuringiensis baru
dengan bioasai merupakan proses panjang B.
thuringiensis baru dan melelahkan, yang seringkali
mengulang isolasi dari strain B. thuringiensis yang
sama (Ben-Dov et al., 1999). Bagaimana pun,
karakterisasi dari koleksi strain B. thuringiensis akan
membantu mengetahui peranan bakteri ini di
lingkungan dan distribusi gen cry (Bravo et al., 1998).
Karena memiliki perbedaan dalam derajat
toksisitas dan spesifisitas aktivitas diperlukan suatu
marka molekuler yang dapat digunakan untuk
membedakan antar strain B. thuringiensis. Saat ini
metode
molekuler
seperti
pulsed-field
gel
electrophoresis (PFGE) DNA kromosom, dan
amplifikasi PCR sekuensing gen rRNA, telah
digunakan untuk menentukan kekerabatan genetik
dari mikroorganisme. PFGE telah digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA besar dari kromosom
bakteri setelah dipotong dengan enzim yang
mengenali sekuen potong yang jarang terdapat dalam
genom (Harrell et al., 1995). Oleh karena itu, dalam
studi ini digunakan PFGE untuk menganalisis genom
B. thuringiensis lokal Sumatera Utara, karena teknik
ini telah berhasil digunakan dalam metode typing yang
memungkinkan secara meyakinkan membandingkan
kromosom bakteri (Rivera & Priest, 2003).
BAHAN DAN METODE
Isolat Bakteri dan Uji Isolat B.
thuringiensis terhadap Larva Beberapa Jenis
Serangga. Isolat B. thuringiensis diperoleh dari studi
sebelumnya. Isolat ini berasal dari beberapa daerah di
Sumatera Utara. Uji dilakukan terhadap larva Aedes
aegypti, Culex sp., Plutella xylostella, dan Heliothis
armigera. Kemampuan isolat untuk membunuh larva
dicatat sebagai: mampu (+) dan tidak mampu (-).
Sebagai kontrol digunakan isolat dari bioinsekticida
Dipel (PT Abbott Indonesia) yang berisi isolat B.
thuringiensis var kurstaki strain HD-7 yang biasa
digunakan untuk mengendalikan larva Plutella
xylostella, Crocidolomia binotalis, dan Heliothis sp.
Penyiapan DNA Genom Total. Sel untuk
isolasi genom total berasal dari kultur umur 4 jam
dalam medium Luria Bertani (dalam 100 ml media
terdapat 1 g tripton, 0.5 g ekstrak yeast, dan 1 g NaCl)
cair. Penyiapan DNA genom total dan restriksi enzim
menggunakan metode Smith & Cantor (1987). Dalam
metode ini, sel diperangkap dalam agarose untuk kemudian
dilisis sehingga genom tetap berada dalam agarose.
Universitas Sumatera Utara
2
SURYANTO
J. Biologi Sumatera
Keragaman Genetik B. thuringiensis
dengan
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism (MFLP). Untuk melihat keragaman
genetik isolat dilakukan pekerjaan sesuai dengan
prosedur kerja yang dilakukan oleh Suryanto (2001).
Pulsed-field gel electrophoresis untuk memperoleh
profile
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism menggunakan CHEF-DR®II (Bio-Rad,
Richmond, CA). Program komputer Treecon (Yves
Van de Peer of Department of Biochemistry,
University
of
Antwerp)
digunakan
untuk
mendeterminasi hubungan kekerabatan antar isolat
dalam pohon filogeni berdasarkan profil MFLP.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Isolat B. thuringiensis terhadap Larva
Beberapa Jenis Serangga. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa tidak semua isolat B.
thuringiensis mempunyai daya bunuh terhadap larva
serangga yang diuji. Isolat U1, U2, dan RP2 terlihat
dapat membunuh larva H. armigera. Di samping
dapat membunuh larva H. armigera, isolat RP2
memiliki daya bunuh terhadap larva P. xylostella. Dua
isolat lainnya, M5 dan K5 tidak mampu membunuh
larva serangga yang diujikan. Boleh jadi dua isolat ini
memiliki protein cry yang berbeda dengan dengan 3
isolat lainnya. Perbedaan protein cry menyebabkan
spesifisitas inang berbeda (Bravo et al., 1998).
Gambar 7. Profil genom isolat B. thuringiensis asal
Sumatera Utara total yang dipotong
dengan SmaI
Culex
sp.
-
P.
xylostella
-
H. armigera
U1
A.
aegypti
-
U2
-
-
-
+
RP2
-
-
+
+
M5
-
-
-
-
Analisis profil seperti ini diperlukan sebagai
basis data tentang isolat-isolat asli B. thuringiensis
asal Sumatera Utara, atau bahkan kalau mungkin dari
seluruh Indonesia sehingga dengan demikian penyebaran
galur dari isolat B. thuringiensis dapat diketahui.
Keragaman genetik bakteri ini dengan membawa
keragaman gen cry dapat menurunkan kemungkinan
resistensi hama karena banyak pilihan dalam
penggunaan bakteri sebagai agen pengendali hayati.
Ucapan Terima Kasih. Terima kasih kepada
Laboratorium RCMD Fakultas MIPA, IPB Bogor atas
fasilitas penelitian yang diberikan. Penelitian ini
merupakan sebagian dari penelitian yang dibiayai
melalui Hibah Pekerti 1, DP3M, Dikti.
K5
-
-
-
-
DAFTAR PUSTAKA
Tabel 1. Bioasai isolat B. thuringiensis lokal terhadap
larva beberapa jenis serangga
Isolat
Keterangan: + : mati
+
- : tidak mati
Keragaman Genetik B. thuringiensis
dengan
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism (MFLP). Hasil PFGE memperlihatkan
adanya profil yang berbeda antar-isolat B.
thuringiensis yang dianalisis (Gambar 1). Hasil ini
menunjukkan adanya keragaman isolat yang diperoleh
dari beberapa tempat di Sumatera Utara. Pengambilan
contoh lebih banyak dari daerah dan sumber diyakini
menambah keragaman genetik isolat B. thuringiensis.
Ben-dov E., Wang Q., Zaritzky A., Manasherob R.,
Barak Z., Schneider B., Khamraev A.,
Baizhanov M., Glupov V., Margalith Y. 1999.
Multiplex PCR screening to detect cry9 genes
in Bacillus thuringiensis strains. Appl Environ
Microbiol 65: 3714-3716.
Bravo A., Sarabia S., Lopez L., Ontiveros H., Abarca C.,
Ortiz A., Ortiz M., Lina L., Villalobos F.J., Pena
G., Nunez-Valdez M-E, Soberon M., Quintero R.
1998. Characterization of cry genes in a Mexican
Bacillus thuringiensis strain collection. Appl
Environ Microbiol 64: 4965-4972.
Universitas Sumatera Utara
Vol. 2, 2007
Harrell LJ, Andersen GL, Wilson KH. 1995. Genetic
Variability of Bacillus anthracis and Related
Species. J Clin Microbiol 33: 1847–1850.
Kawalek MD, Benjamin S., Lee HL, Gill SS. 1995.
Isolation and Identification of Novel Toxins
from a New Mosquitocidal Isolate from
Malaysia, Bacillus thuringiensis subsp.
jegathesan. Appl Environ Microbiol 61:
2965-2969.
Kuo W-H, Chak K-F. 1996. Identification of novel
cry-type genes from Bacillus thuringiensis
strains on the basis of restriction fragment
length polymorphism of the PCR-Amplified
DNA. Appl Environ Microbiol 62: 13691377.
J. Biologi Sumatera
3
Lopez-Meza JE, Ibarra JE. 1996. Characterization of a
Novel Strain of Bacillus thuringiensis. Appl
Environ Micorbiol 62: 1306-1310.
Rivera AMG, Priest FG. 2003. Pulsed field gel
electrophoresis of chromosomal DNA reveals
a clonal population structure to Bacillus
thuringiensis that relates in general to crystal
protein gene content. FEMS Microbiol Lett
223: 61-66.
Smith RJ, Cantor CR. 1987. Purification specific
fragmentation and separation of large DNA
molecules. Methods Enzymol 155: 449-467.
Suryanto D. 2001. Selection and characterization of
bacterial isolates for monocyclic aromatic
degradation. Desertasi. IPB. Bogor.
Universitas Sumatera Utara
ISSN 1907-5537
Vol. 2, No. 1
KERAGAMAN GENETIK BEBERAPA ISOLAT
Bacillus thuringiensis ASAL SUMATERA UTARA
Dwi Suryanto
Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sumatera Utara,
Jln. Bioteknologi No. 1, Kampus USU, Padang Bulan, Medan 20155
Abstract
A study on genetic variability of several Bacillus thuringiensis isolates of North Sumatra has been
conducted using pulsed-field gel electrophoresis. Bioassay of the isolates to insect larvae showed that the
isolates have different host specificity. Total genome analysis showed that all isolates were genetically different.
Keywords: Bacillus thuringiensis, genetic diversity, pulsed-field gel electrophoresis
PENDAHULUAN
Bacillus thuringiensis, satu bakteri aerob,
pembentuk spora, gram positif, merupakan bakteri
indigenous pada tanah, air, permukaan tumbuhan,
serangga mati, dan biji-bijian (Kawalek et al., 1995;
Bravo et al., 1998). Strain-strain dari bakteri ini telah
diisolasi dari banyak negara (Bravo et al., 1998).
Strain-strain ini menunjukkan kisaran spesifisitas
yang luas pada berbagai ordo serangga (Lepidoptera,
Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, dan
Mallophaga) dan Acari (Bravo et al., 1998). Bakteri
ini memproduksi protein kristal (protein cry) selama
sporulasi (Kuo & Chak, 1996). Untuk mendapatkan
strain B. thuringiensis baru untuk memproduksi
protein cry, isolasi sejumlah besar strain B.
thuringiensis baru saat ini menjadi aktivitas rutin pada
banyak industri (Kuo & Chak, 1996).
Beragam isolat dan subspesies B. thuringiensis
diketahui sebagai sumber penting biopestisida
komersial (Lopez-Meza & Ibarra, 1996). Bakteri ini
memenuhi syarat sebagai agen pengendali mikrobiologi
terhadap hama dan vektor penyakit pertanian (BenDov et al., 1999).
Identifikasi strain B. thuringiensis baru
dengan bioasai merupakan proses panjang B.
thuringiensis baru dan melelahkan, yang seringkali
mengulang isolasi dari strain B. thuringiensis yang
sama (Ben-Dov et al., 1999). Bagaimana pun,
karakterisasi dari koleksi strain B. thuringiensis akan
membantu mengetahui peranan bakteri ini di
lingkungan dan distribusi gen cry (Bravo et al., 1998).
Karena memiliki perbedaan dalam derajat
toksisitas dan spesifisitas aktivitas diperlukan suatu
marka molekuler yang dapat digunakan untuk
membedakan antar strain B. thuringiensis. Saat ini
metode
molekuler
seperti
pulsed-field
gel
electrophoresis (PFGE) DNA kromosom, dan
amplifikasi PCR sekuensing gen rRNA, telah
digunakan untuk menentukan kekerabatan genetik
dari mikroorganisme. PFGE telah digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA besar dari kromosom
bakteri setelah dipotong dengan enzim yang
mengenali sekuen potong yang jarang terdapat dalam
genom (Harrell et al., 1995). Oleh karena itu, dalam
studi ini digunakan PFGE untuk menganalisis genom
B. thuringiensis lokal Sumatera Utara, karena teknik
ini telah berhasil digunakan dalam metode typing yang
memungkinkan secara meyakinkan membandingkan
kromosom bakteri (Rivera & Priest, 2003).
BAHAN DAN METODE
Isolat Bakteri dan Uji Isolat B.
thuringiensis terhadap Larva Beberapa Jenis
Serangga. Isolat B. thuringiensis diperoleh dari studi
sebelumnya. Isolat ini berasal dari beberapa daerah di
Sumatera Utara. Uji dilakukan terhadap larva Aedes
aegypti, Culex sp., Plutella xylostella, dan Heliothis
armigera. Kemampuan isolat untuk membunuh larva
dicatat sebagai: mampu (+) dan tidak mampu (-).
Sebagai kontrol digunakan isolat dari bioinsekticida
Dipel (PT Abbott Indonesia) yang berisi isolat B.
thuringiensis var kurstaki strain HD-7 yang biasa
digunakan untuk mengendalikan larva Plutella
xylostella, Crocidolomia binotalis, dan Heliothis sp.
Penyiapan DNA Genom Total. Sel untuk
isolasi genom total berasal dari kultur umur 4 jam
dalam medium Luria Bertani (dalam 100 ml media
terdapat 1 g tripton, 0.5 g ekstrak yeast, dan 1 g NaCl)
cair. Penyiapan DNA genom total dan restriksi enzim
menggunakan metode Smith & Cantor (1987). Dalam
metode ini, sel diperangkap dalam agarose untuk kemudian
dilisis sehingga genom tetap berada dalam agarose.
Universitas Sumatera Utara
2
SURYANTO
J. Biologi Sumatera
Keragaman Genetik B. thuringiensis
dengan
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism (MFLP). Untuk melihat keragaman
genetik isolat dilakukan pekerjaan sesuai dengan
prosedur kerja yang dilakukan oleh Suryanto (2001).
Pulsed-field gel electrophoresis untuk memperoleh
profile
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism menggunakan CHEF-DR®II (Bio-Rad,
Richmond, CA). Program komputer Treecon (Yves
Van de Peer of Department of Biochemistry,
University
of
Antwerp)
digunakan
untuk
mendeterminasi hubungan kekerabatan antar isolat
dalam pohon filogeni berdasarkan profil MFLP.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Isolat B. thuringiensis terhadap Larva
Beberapa Jenis Serangga. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa tidak semua isolat B.
thuringiensis mempunyai daya bunuh terhadap larva
serangga yang diuji. Isolat U1, U2, dan RP2 terlihat
dapat membunuh larva H. armigera. Di samping
dapat membunuh larva H. armigera, isolat RP2
memiliki daya bunuh terhadap larva P. xylostella. Dua
isolat lainnya, M5 dan K5 tidak mampu membunuh
larva serangga yang diujikan. Boleh jadi dua isolat ini
memiliki protein cry yang berbeda dengan dengan 3
isolat lainnya. Perbedaan protein cry menyebabkan
spesifisitas inang berbeda (Bravo et al., 1998).
Gambar 7. Profil genom isolat B. thuringiensis asal
Sumatera Utara total yang dipotong
dengan SmaI
Culex
sp.
-
P.
xylostella
-
H. armigera
U1
A.
aegypti
-
U2
-
-
-
+
RP2
-
-
+
+
M5
-
-
-
-
Analisis profil seperti ini diperlukan sebagai
basis data tentang isolat-isolat asli B. thuringiensis
asal Sumatera Utara, atau bahkan kalau mungkin dari
seluruh Indonesia sehingga dengan demikian penyebaran
galur dari isolat B. thuringiensis dapat diketahui.
Keragaman genetik bakteri ini dengan membawa
keragaman gen cry dapat menurunkan kemungkinan
resistensi hama karena banyak pilihan dalam
penggunaan bakteri sebagai agen pengendali hayati.
Ucapan Terima Kasih. Terima kasih kepada
Laboratorium RCMD Fakultas MIPA, IPB Bogor atas
fasilitas penelitian yang diberikan. Penelitian ini
merupakan sebagian dari penelitian yang dibiayai
melalui Hibah Pekerti 1, DP3M, Dikti.
K5
-
-
-
-
DAFTAR PUSTAKA
Tabel 1. Bioasai isolat B. thuringiensis lokal terhadap
larva beberapa jenis serangga
Isolat
Keterangan: + : mati
+
- : tidak mati
Keragaman Genetik B. thuringiensis
dengan
Macro-restricted
Fragment
Length
Polymorphism (MFLP). Hasil PFGE memperlihatkan
adanya profil yang berbeda antar-isolat B.
thuringiensis yang dianalisis (Gambar 1). Hasil ini
menunjukkan adanya keragaman isolat yang diperoleh
dari beberapa tempat di Sumatera Utara. Pengambilan
contoh lebih banyak dari daerah dan sumber diyakini
menambah keragaman genetik isolat B. thuringiensis.
Ben-dov E., Wang Q., Zaritzky A., Manasherob R.,
Barak Z., Schneider B., Khamraev A.,
Baizhanov M., Glupov V., Margalith Y. 1999.
Multiplex PCR screening to detect cry9 genes
in Bacillus thuringiensis strains. Appl Environ
Microbiol 65: 3714-3716.
Bravo A., Sarabia S., Lopez L., Ontiveros H., Abarca C.,
Ortiz A., Ortiz M., Lina L., Villalobos F.J., Pena
G., Nunez-Valdez M-E, Soberon M., Quintero R.
1998. Characterization of cry genes in a Mexican
Bacillus thuringiensis strain collection. Appl
Environ Microbiol 64: 4965-4972.
Universitas Sumatera Utara
Vol. 2, 2007
Harrell LJ, Andersen GL, Wilson KH. 1995. Genetic
Variability of Bacillus anthracis and Related
Species. J Clin Microbiol 33: 1847–1850.
Kawalek MD, Benjamin S., Lee HL, Gill SS. 1995.
Isolation and Identification of Novel Toxins
from a New Mosquitocidal Isolate from
Malaysia, Bacillus thuringiensis subsp.
jegathesan. Appl Environ Microbiol 61:
2965-2969.
Kuo W-H, Chak K-F. 1996. Identification of novel
cry-type genes from Bacillus thuringiensis
strains on the basis of restriction fragment
length polymorphism of the PCR-Amplified
DNA. Appl Environ Microbiol 62: 13691377.
J. Biologi Sumatera
3
Lopez-Meza JE, Ibarra JE. 1996. Characterization of a
Novel Strain of Bacillus thuringiensis. Appl
Environ Micorbiol 62: 1306-1310.
Rivera AMG, Priest FG. 2003. Pulsed field gel
electrophoresis of chromosomal DNA reveals
a clonal population structure to Bacillus
thuringiensis that relates in general to crystal
protein gene content. FEMS Microbiol Lett
223: 61-66.
Smith RJ, Cantor CR. 1987. Purification specific
fragmentation and separation of large DNA
molecules. Methods Enzymol 155: 449-467.
Suryanto D. 2001. Selection and characterization of
bacterial isolates for monocyclic aromatic
degradation. Desertasi. IPB. Bogor.
Universitas Sumatera Utara