Isolasi Promoter -Aktin Ikan Mas

18

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi Promoter -Aktin Ikan Mas

Promoter -Aktin dari ikan mas diisolasi dengan menggunakan metode PCR dengan primer yang dibuat berdasarkan data yang ada di Bank Gen. Panjang fragmen DNA hasil amplifikasi PCR adalah sekitar 1,5 kb Gambar 8. Gambar 8. Elektroforesis hasil isolasi promoter -Aktin Ikan Mas 1 dan M marker ukuran fragmen DNA 2-log ladder Biolabs, New England. Fragmen DNA target ditunjukkan dengan tanda panah. Panjang sekuen hasil sekuensing adalah 1528 bp Gambar 9. Berdasarkan analisis sekuens diperoleh faktor transkripsi transcription factor yang merupakan elemen-elemen yang mempengaruhi aktivitas promoter. Elemen penting bagi promoter -aktin adalah boks TATA, motif CCAAT, motif CArG atau CCAT 6 GG. Hubungan tingkat aktivitas promoter -aktin dengan sekuens CCAAT telah diteliti oleh Quitschke et al. 1989. Kegunaan motif CArG sebagai elemen responsif terhadap serum terletak antara CCAAT dan boks TATA, telah dijelaskan oleh Liu et al. 1990. Boks TATA merupakan elemen yang umum dijumpai pada sekuens promoter, sebagai tempat RNA polimerase melekat pada saat transkripsi RNA berlangsung Glick Pasternak, 2003. Kerja sama antara ketiga elemen tersebut menyebabkan promoter dapat aktif dan mengendalikan ekspresi transgen pada waktu dan tempat yang tepat. Hasil analisis menunjukkan bahwa ketiga elemen faktor transkripsi ini telah dilaporkan dijumpai pada promoter -aktin dari berbagai jenis ikan juga terdapat pada sekuens DNA hasil isolasi dari ikan mas. Sekuens CCAAT pada ikan mas terletak pada nukleotida 12-16, motif CArG terletak pada nukleotida 42 - 51, serta boks TATA terletak pada nukleotida 75-80 dihitung dari ujung terminal 5. Kandidat boks TATA lainnya untuk ikan mas terletak pada nukleotida 965-970 1,5 kb 1,0 kb- 1,5 kb- 3,0 kb- 19 dari ujung terminal 5. Selain itu beberapa binding site lain yang potensial dalam transkripsi penting adalah GATA,TFIID, CBF, Sp1, TBP dan sebagainya juga ditemukan dalam sekuen ini. Elemen-elemen ini mungkin berfungsi sebagai regulasi transkripsi gen -aktin. Analisis pensejajaran alignment hasil sekuensing gen β-aktin ikan mas dengan data -aktin ikan mas dari bank gen no. Aksesi Bank Gen: M24113 terdapat kemiripan yang tinggi, yaitu 97,52 Gambar 9. Dari hasil analisis sekuen dan pensejajaran diduga bahwa sekuen hasil isolasi merupakan promoter -aktin ikan mas. Alignment hasil sekuensing promoter β-aktin ikan mas dengan ikan grass carp no. Aksesi Bank Gen: M25013, ikan medaka no. Aksesi Bank Gen: S74868 dan ikan megalobrama no. Aksesi Bank Gen: AY170122 ditunjukkan pada Gambar 10. Berdasarkan hasil alignment diketahui bahwa posisi sekuen CCAAT, motif CArG dan boks TATA promoter β-aktin ikan mas relatif sama dengan ikan grass carp, ikan medaka dan megalobrama yang telah dilaporkan sebelumnya. Hal ini memperkuat dugaan bahwa hasil kloning merupakan promoter β-aktin ikan mas.

4.2 Konstruksi pccBA-EGFP