Hidrolisis Agar pada Gelidium sp Menggunakan Enzim Agarase dari Bakteri Laut untuk Pembuatan Bioetanol

HIDROLISIS AGAR PADA Gelidium sp MENGGUNAKAN
ENZIM AGARASE DARI BAKTERI LAUT UNTUK
PEMBUATAN BIOETANOL

NURAFNI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Hidrolisis Agar pada
Gelidium sp Menggunakan Enzim Agarase dari Bakteri Laut untuk Pembuatan
Bioetanol adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi
yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014
Nurafni
NIM C551120041

RINGKASAN
NURAFNI. Hidrolisis Agar pada Gelidium sp Menggunakan Enzim Agarase dari
Bakteri Laut untuk Pembuatan Bioetanol Dibimbing oleh MUJIZAT KAWAROE dan
IMAN RUSMANA.
Gelidium sp merupakan salah satu rumput laut yang memiliki kandungan
karbohidrat dan agar yang tinggi. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada Gelidium sp
dapat dijadikan sebagai sumber bahan baku bioetanol. Bakteri memiliki nilai produksi
etanol yg ckup tinggi, karena dapat mengasilkan enzim dan mudah berkembang biak
(Karimi et al. 2009). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dan
karakteristik enzim agarase yang optimum untuk hidrolisis Gelidium sp, mengetahui
konsentrasi bioetanol dengan menggunakan enzim hasil hidrolisis dan melakukan
identifikasi spesies bakteri secara molekuler.
Karakteristik enzim agarase kasar yang dihasilkan mempunyai pH dan suhu
optimum 8 Tris Hcl dan 50°C. Enzim agarase kasar yang diperoleh memiliki aktivitas

enzim sebesar 0,00214 U/ml pada media produksi. Stabilitas enzim agarase hasil
hidrolisat tertinggi pada konsentrasi 10% pada waktu inkubasi 3 hari dengan nilai
aktivitas enzim 0,1544 U/mL. Proses hidrolisat ini belum mampu menguraikan secara
sempurna komponen karbohidrat pada Gelidium sp. Proses fermentasi dilakukan untuk
mengkonversi glukosa (gula) menjadi etanol. Hasil etanol dengan menggunakan enzim
ternyata memiliki nilai yang cukup tinggi yaitu 1,04%. Enzim agarase kemudian
dilakukan pengendapan menggunakan aceton. Hasil pengendapan ini kemudian
dilakukan uji penentuan berat molekul enzim agarase menggunakan SDS PAGE. Berat
molekul enzim agarase hasil SDS-PAGE 37, 41 dan 52 kDa. Untuk isolat yang
teridentifikasi 16 sDNA adalah Pseudomonas stutzeri.

Kata kunci: bakteri, bioetanol, enzim agarase dan Gelidium sp

SUMMARY
NURAFNI. Hydrolysis agar on Gelidium sp Agarase Using Enzymes from Marine
Bacteria for Preparation of Ethanol "supervisor MUJIZAT KAWAROE and IMAN
RUSMANA.
Gelidium sp is a seaweed which has high content carbohydrate and agar. The
high carbohydrate of Gelidium sp can be used as a raw material source of bioethanol.
Bacteria has an enough high production value ethanol (Karimi et al, 2009). This study

aims was determine the activity and characteristic optimum of the enzyme agarase for
hydrolysis Gelidium sp, determine the concentration of ethanol using enzyme hydrolysis
and to identify the molecular basis of bacterial species.
Characteristics of the resulting crude agarase enzyme has an optimum pH and
temperature of 8 Tris HCl and 50°C. Obtained crude enzyme agarase enzyme activity of
0,00214 U / ml in media production. The stability of the enzyme agarase highest
hydrolyzate results in a concentration of 10% at 3 days of incubation with the enzyme
activity value 0,1544 U / mL. Hydrolyzate process has not been able to completely
decipher the carbohydrate component of Gelidium sp. Fermentation process to convert
glucose (sugar) into ethanol. Results of ethanol that using enzyme appeared to have a
high enough value that is 1.04%. Agarase enzyme then performed using acetone
precipitation. The result of the deposition is then performed test agarase enzyme
determination of molecular weight using SDS PAGE. Agarase enzyme molecular weight
SDS-PAGE results of 37, 41 and 52 kDa. For isolates identified 16 sDNA is
Pseudomonas stutzeri.

Keywords: bacteria, bioethanol, enzymes agarase and Gelidium sp

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan,
penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak
merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

HIDROLISIS AGAR PADA Gelidium sp MENGGUNAKAN ENZIM AGARASE
DARI BAKTERI LAUT UNTUK PEMBUATAN BIOETANOL

NURAFNI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Kelautan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof Dr Ir Dedi Soedharma,DEA

Judul Tesis
Nama
NIM

: Hidrolisis Agar pada Gelidium sp Menggunakan Enzim Agarase
dari Bakteri Laut untuk Pembuatan Bioetanol
: Nurafni
: C551120041

Disetujui oleh
Komisi pembimbing

Dr Mujizat Kawaroe, M.Si
Ketua

Dr Iman Rusmana, M.Si
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Ilmu Kelautan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Neviaty P Zamani,M.Sc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal ujian : 15 Agustus 2014

Tanggal lulus : 1 September 2014

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis
ini dengan judul Hidrolisis Agar pada Gelidium sp Menggunakan Enzim Agarase
dari Bakteri Laut untuk Pembuatan Bioetanol . Tesis ini merupakan salah satu
syarat untuk mendapatkan gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Kelautan,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB ini tidak lepas dari
dukungan berbagai pihak. Penulis menyampaikan banyak terima kasih dan penghargaan
yang tinggi kepada
1. Dr Ir Mujizat Kawaroe M.Si selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Ir Iman
Rusmana MSi. atas kesediaan waktu untuk membimbing, memberikan arahan
dan masukan selama penyusunan tesis ini.
2. Dr Neviaty P Zamani, M.Sc selaku ketua Program Studi Ilmu Kelautan
3. Bapak Prof Dr. Dedy Soedharma,DEA sebagai penguji luar komisi yang telah
banyak memberikan saran
4. Ayahanda Arif Abd Rahim dan Ibunda Nairia Gafur, kakak dan adik
tersayang beserta seluruh keluarga atas doa, motivasi, finansial dan semangat
selama penulis menempuh studi.
5. Bapak dan Ibu staf pengajar, staf administrasi Program Studi Ilmu Kelautan,
laboratorium Genetik Tumbuhan dan Mikrobiologi Departemen Biologi serta

laboratorium Mirobiologi dan Biokimia Hewan Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) yang telah banyak membantu dan
kerjasamanya yang baik selama penulis menempuh studi.
6. Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi, mba indah, mba tyas, mba neli, mba
oda beserta staf Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi LPPM IPB, yang
telah membantu selama kegiatan penelitian
7. Beasiswa unggulan DIKTI 2012 dan tim redaksi OLDI LIPI
8. Sahabat sahabatku Krisye dan Irma Ekawati yang telah banyak berbagi dalam
suka dan duka selama penulis menempuh studi.
9. Teman teman satu tim penelitian Bertoka Fajar, Ismed dan amy serta temanteman p a s c a s a r j a a n I K L 2 0 1 2 atas kerjasama yang baik selama
menempuh studi serta segala motivasi, persahabatan, dan diskusi selama penulis
menempuh studi, Terimakasih.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Semoga karya
ilmiah ini membawa manfaat bagi seluruh civitas IPB khususnya dan masyarakat
Indonesia umumnya.
Bogor, Agustus 2014
Nurafni

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xi

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup Penelitian

2

METODE

3

Bahan

3

Alat

3

Prosedur Penelitian

4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN

9
9
16
18

Simpulan

18

Saran

18

DAFTAR PUSTAKA

19

LAMPIRAN

23

DAFTAR TABEL
1. Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian

3

DAFTAR GAMBAR
1. Prosedur penelitian

4

2. Zona bening isolat BSUC4

9

3. Zona bening isolat BSUC2

9

4. Kurva pertumbuhan BSUC4

10

5. Kurva pertumbuhan BSUC2

10

6. Kurva aktivitas enzim dan jumlah sel bakteri BSUC4

11

7. Kurva aktivitas enzim dan jumlah sel bakteri BSUC2

11

8. Kurva karakteristik Enzim agarase BSUC4

12

9. Kurva konsentrasi gula pereduksi(ppm) BSUC4

14

10. Hasil elektroforesis SDS PAGE isolat BSUC4

14

11. Konsentrasi Bioetanol

15

12. Pohon filogenik BSUC4

16

DAFTAR LAMPIRAN
1. Pembuatan media produksi aktivitas enzim agarase

24

2. Pembuatan larutan lugol

24

3. Larutan DNS

24

4. Kurva standar glukosa

25

5. Tabel pertumbuhan Isolat BSUC4

26

6. Tabel pertumbuhan BSUC2

27

7. Tabel uji aktivitas enzim BSUC4

28

8. Kurva aktivitas enzim pada Media Produksi BSUC4

28

9. Tabel uji aktivitas enzim pada media produksi isolat BSUC2

28

10. Kurva Aktivitas enzim pada media produksi BSUC2

29

11. Hasil fermentasi Bioetanol BSUC4

29

12. Tabel hasil uji karakteristik enzim agarase BSUC4

30

13. Kurva standar SDS PAGE BSUC4

31

14. Hasil sequensing bakteri 16 sDNA

32

15. Hasil GenBank Isolat BSUC4

34

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kebutuhan energi fosil seperti bensin atau solar semakin meningkat dalam
beberapa tahun. Hal ini menjelaskan bahwa kebutuhan energi masih tergantung
pada ketersediaan energi fosil ini padahal ketersediaan energi fosil berbanding
terbalik dengan kebutuhannya karena sifat energi fosil yang tidak terbarukan.
Hal ini telah menjadi semakin penting untuk mengembangkan teknik
pengurangan dan mempromosikan sumber-sumber energi terbarukan.
Gelidium sp.
merupakan salah satu rumput laut yang memiliki
kandungan karbohidrat dan agar yang tinggi. Kandungan karbohidrat yang tinggi
pada Gelidium sp. dapat dijadikan sebagai sumber bahan baku bioetanol. Hal ini
juga didukung oleh hasil penelitian (Nahak et al. 2011) Gelidium sp
menghasilkan agar 44 %, di laboratorium Jepang menunjukkan kandungan
karbohidrat 67.85 - 76.15% (Salamah 2005) dan kandungan lignin yang rendah
(Wi et al. 2009). Penelitian sebelumnya telah banyak dilakukan, akan tetapi lebih
memanfaatkan selulosa, pati dan hemiselulosa, limbah hasil pengolahan rumput
laut yang dapat menghasilkan selulosa sebagai bahan baku bioetanol (Ramadhini
2012) dan pati yang terdapat pada tumbuhan darat seperti padi, jagung, gandum,
jenis ubi dan pada batang pohon aren dan sagu (Latifah 2009).
Bioetanol merupakan produk fermentasi yang dapat dibuat dari substrat
yang mengandung karbohidrat (gula,selulosa dan pati). Etanol adalah salah satu
senyawa alcohol dengan rumus kimia C2H5OH yang merupakan cairan tidak
berwarna,berbau dan cepat menguap.
Enzim merupakan katalisator yang mampu meningkatkan kecepatan
reaksi kimia spesifik tanpa ikut bereaksi. Sedangkan enzim agarase merupakan
salah satu enzim yang digolongkan dalam dua katagori yaitu -agarase dan agarase. Struktur dasar agarase terdiri dari unit
D-galaktosa dan 3,6 anhydro-L-galaktosa. Agarase memiliki kegunaan lain sebagai alat untuk mengisolasi
protoplas dari rumput laut dan untuk memulihkan DNA dari gel agarosa (Xiao
and Sang 2010). Sebagian besar karbohidrat pada rumput laut masih berupa
senyawa polisakarida sehingga diperlukan adanya proses hidrolisis untuk
menguraikan senyawa tersebut menjadi gula sederhana agar dapat dimanfaatkan
sebagai sumber bahan baku bioetanol. Sampai saat ini penggunaan bahan baku
bioetanol lebih banyak menggunakan selulosa dibandingkan agar. Padahal agar
memiliki komponen yang bisa juga dijadikan bahan baku dasar bioetanol.
Unit fungsional dalam metabolisme sel ini bekerja dengan urutan yang
teratur. Enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang mengurai molekul
nutrisi, menyimpan dan mengubah energi kimiawi yang membuat
makromolekul sel dari prekursor sederhana (Lehninger 1993). Peranan enzim
sebagai biokatalisator dalam berbagai bidang industri semakin penting. Enzim
yang diproduksi secara komersial, telah banyak digunakan dalam bidang industri,
analisis, dan kedokteran. Oleh karena itu, berkembangnya berbagai teknologi
proses pada industri biologi yang menggunakan enzim akan memerlukan
berbagai jenis enzim dengan spesifikasi masing-masing (Richan et al. 2009).

2

Proses untuk menghasilkan bioetanol dapat dilakukan dengan dua cara
yaitu dengan cara fermentasi dan hidrolisis. Fermentasi merupakan proses
pemecahan senyawa organik (khususnya gula dan lemak) oleh mikroorganisme
dalam kondisi anaerob menghasilkan produk-produk organik yang lebih
sederhana. Sedangkan Hidrolisis pada umumnya dibagi menjadi dua yaitu,
hidrolisis asam dan hidrolisis enzim. Menurut (Riyanti 2008) efisiensi proses
hidrolisis dengan menggunakan asam masih rendah karena proses yang dilakukan
masih panjang dan membutuhkan banyak tahap dan dampak yang sangat
merugikan adalah penanganan limbah asam yang tidak mudah.
Pengembangan teknologi hidrolisis dengan menggunakan enzim
merupakan suatu proses yang lebih ramah lingkungan dibandingkan hidrolisis
asam. Hidrolisis secara enzimatik akan berjalan spesifik dan efisien sehingga
produk yang dihasilkan lebih tinggi dan menghasilkan produk monosakarida
dengan biaya produksi rendah. Pada proses hidrolisis enzim ini menggunakan
mikroorganisme salah satunya bakteri. Bakteri merupakan mikroorganisme
uniseluler yang sangat cepat pertumbuhannnya pada media.
Beberapa bakteri yang hidup pada rumput laut diduga dapat menghasilkan
enzim untuk mengurai sumber isolat rumput laut agarase menjadi sumber nutrisi
pertumbuhannya. Enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut dapat
menghidrolisis dan mendegradasi agar menjadi agarooligosakarida dan galaktosa
dari enzim agarase, yang selanjutnya dapat digunakan sebagai bahan untuk
bioetanol. Telah banyak peneliti yang mengisolasi bakteri air tawar dibandingkan
bakteri air laut dan memanfaatkan senyawa metabolit bakteri tersebut.
Penggunaan dan pemanfaatan enzim agarase hasil isolasi dari lingkungan
hidup rumput laut untuk hidrolisis enzim merupakan penelitian baru yang perlu
dikembangkan. Hal inilah yang melatarbelakangi sehingga penelitian ini
dilakukan.
Tujuan Penelitian
1. Memperoleh karakteristik enzim agarase yang optimum untuk hidrolisis
Gelidium sp
2. Mengetahui konsentrasi bioetanol dengan menggunakan enzim hasil
hidrolisis
3. Mengidentifikasi isolat bakteri dengan menggunakan metode 16 sDNA
Manfaat Penelitian
Studi mengenai bakteri pada enzim agarase serta aplikasinya pada substrat
Gelidium sp merupakan sesuatu yang baru untuk mengetahui kemampuan enzim
dari bakteri sebagai penghidrolisis agar untuk pembuatan bioetanol yang lebih
ramah lingkungan.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini diawali dengan uji kualitatif dengan melakukan screening
bakteri, pertumbuhan bakteri pada media hidup dan uji kuantitatif dengan
melakukan produksi enzim pada bakteri yang menghasilkan enzim agarase
sehingga didapat isolat terbaik yang akan menghidrolisis Gelidium sp dan
difermentasi menjadi bioetanol kemudian bakteri yang menghasilkan enzim akan
diidentifikasi secara molekuler untuk mengetahui spesies dari bakteri tersebut.

3

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2013 sampai Februari 2014 di
Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC), Institut
Pertanian Bogor (IPB) Kampus IPB Baranang Siang, Laboratorium Genetik
Tumbuhan Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat dalam
bentuk tabel 1 dan tabel 2 berikut ini:
Tabel 1. Alat yang digunakan untuk penelitian
Alat
Hotplate
Mikropipet
Jarum tanam bulat (ose)
Oven
Waterbatt
Gunting
Pematik api mekanik
Cawan petri steril
Tabung reaksi
Tabung erlenmeyer
Gelas beaker
Gelas ukur
Tabel 2. Bahan yang digunakan untuk penelitian
Bahan
Isolat bakteri (Koleksi SBRC)
Marine agar
Spirtus
Akuades steril
Alkohol 70%
Malt ekstrak
kaldu nutrien (NB)
Agar bacto
MgSO4.7H2O
K2HPO4
FeSO4.7H2O

Pembakar spritus
Botol alcohol
Sentrifugasi mikro suhu rendah
Coolbox
Timbangan digital
Laminari
Vorteks
Tabung mikro
Autoclave
Inkubator
Inkubator statis/goyang
Lemari pendingin

NH4NO3,
Akuabides
Lugol
Bovin serum albumin (BSA) standar
Popypepton
Asam dinitrosalisilat (DNS)
Bufer sitrat-fosfat
Bufer asetat
Bufer tris-HCl
NaCl
CaCl2.2H2O

4

Prosedur Penelitian
Penelitian dimulai dari peremajaan bakteri, uji kualitatif bakteri
(screening, penentuan waktu optimum enzim agarase dan produksi enzim agarase)
dan uji kuantitatif yaitu karakteristik enzim agarase meliputi suhu,pH, SDSPAGE, dan identifikasi bakteri secara molekuler. Analisis data dapat disajikan
dalam bentuk grafik dan tabel kemudian dibahas berdasarkan hasil dan literatur.
Berikut prosedur penelitian disajikan dalam bentuk gambar dibawah ini.

Isolat

Uji Kualitatif

Screening aktivitas
enzim

Kurva
pertumbuhan NB

Isolat terbaik

Produksi enzim kasar

Kurva Aktivitas
Enzim

Karakteristik Enzim

Uji Kuantitatif

Isolat aktivitas terbaik

Molekuler

Aplikasi pada Gellidium sp

Gambar 1. Prosedur penelitian

5

Peremajaan Isolat Bakteri
Bakteri dikembangbiakkan dengan menginokulasikan bakteri ke agar
nutrien. Bakteri diinkubasi dalam inkubator selama 1 x 24 jam pada suhu 370C
(Munifah et al. 2011). Setiap koloni tumbuh dan telah beberapa kali dimurnikan
dipindahkan ke dalam media agar miring MA (Marine Agar) pada tabung reaksi
dengan menggunakan jarum ose. Di inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
Uji Kualitatif Enzim Agarase
Uji aktivitas agarase dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji
kualitatif dilakukan dengan metode pewarnaan lugol iodin 0,1 mL ditotolkan pada
media agar-agar YPA. Bakteri diinkubasi selama 5 hari pada suhu 370C.
Kemudian dilakukan uji aktivitas bakteri dengan menambahkan lugol 0,1%
sebanyak 15 mL dan didiamkan selama 30-60 menit. Setelah itu dibilas sebanyak
2-3 kali dengan 15 mL NaCl 1 M dan didiamkan selama 15 menit. Diameter zona
bening dan diameter koloni yang terbentuk diukur. Uji aktivitas agarase dilihat
dari indeks agarase yang terbentuk. Indeks agarase merupakan nisbah antara
diameter zona bening dengan diameter koloni. Semakin besar indeks agarolitik
yang dihasilkan maka semakin besar enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri
tersebut. Indeks selulolitik atau indeks aktivitas agarase (IAS) diperoleh dengan
menggunakan rumus sebagai berikut (Kader dan Omar 1998):
Indeks Agarolitik= Diameter zona bening (mm) Diameter koloni (mm)
Diameter koloni (mm)
DDDDDDDDD
Penentuan Waktu Optimum Produksi Enzim Agarase
Penentuan waktu optimum produksi enzim agarase diawali dengan
penentuan waktu penuangan inokulum pada media NB + NaCl. Hal ini dilakukan
agar dapat diketahui waktu pertumbuhan eksponensial bakteri pada inokulum
yang akan digunakan. Penentuan waktu inokulum dilakukan dengan mengkultur 2
lup isolat di dalam 5 mL kaldu nutrien dan diinkubasi selama 620 menit. Kultur
diinkubasi pada suhu ruang di dalam shaker dengan kecepatan agitasi 85 rpm.
Pengambilan sampel dilakukan selama 620 menit inkubasi dengan rentang waktu
sampling 30 menit untuk BSUC4 dan 1 jam untuk isolate BSUC2 untuk diukur
nilai Optical Density (OD) pada panjang gelombang 600 nm. Setelah itu, dibuat
kurva pertumbuhan bakteri untuk menentukan waktu yang terbaik pada
penuangan inokulum pada media produksi.
Setelah waktu penuangan inokulum ke dalam media produksi diketahui,
dilanjutkan dengan penentuan waktu optimum aktivitas enzim agarase. Sebanyak
5 mL kaldu nutrien yang telah mengandung biakan sel diinokulasikan ke dalam
500 mL media produksi dan diinkubasi didalam waterbatt. Waktu penuangan
inokulum dilihat dari waktu pertumbuhan eksponensial bakteri (fase pertumbuhan
logaritmik) yang telah diketahui dari kurva pertumbuhan bakteri. Pengambilan
sampel dilakukan setiap 6 jam sekali selama 42 jam waktu inkubasi dilakukan.
Selanjutnya, dilakukan penghitungan jumlah koloni total pada cawan (TPC) untuk
memperkirakan jumlah sel bakteri pada setiap nilai OD yang dihasilkan dan
perhitungan aktivitas enzim dengan menggunakan metode Miller yang

6

dimodifikasi berdasarkan absorbansi maksimum larutan pereaksi (Wood dan
Saddler 1988).. Sebanyak 1 mL dari campuran reaksi yang telah disentrifus
selama 15 menit ditambah 3 mL pereaksi DNS. Larutan divortex untuk
homogenisasi kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Blanko
dibuat dengan mengganti sampel dengan DNS dan diperlakukan sama. Setelah itu
diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang (X) 550
nm. Kurva standar dibuat dengan memplot data konsentrasi glukosa (sumbu X)
versus absorbansinya (sumbu Y). Aktivitas agarase dinyatakan dalam satuan
internasional yaitu U/mL. Satu unit merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan
untuk memecah 1 mol agarase menjadi gula pereduksi per menit pada kondisi
pengujian. Kadar glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis agarase dengan enzim
agarase berdasarkan nilai absorbansi pada 550 nm.
Absorbansi = ((As Ak))
Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam
persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa. Kemudian, aktivitas
agarase dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Irawan et al. 2008) yang
dimodifikasi.
Aktivitas agarase (U/mL) = Kadar glukosa ( mg/L) x V.enzim
BM x t xVenzim x fp
Keterangan :
As = Absorbansi sampel
Ak = Absorbansi kontrol
V = volume enzim (0,2 mL)
t = waktu inkubasi (30 menit)
BM = Berat molekul glukosa (180 Dalton) 0.18 gr
Produksi Enzim Kasar Agarase
Produksi enzim agarase dilakukan berdasarkan prosedur dan waktu
inkubasi yang telah diketahui aktivitas agarase tertinggi pada kurva aktivitas
agarase yang dihasilkan. Media pertumbuhan produksi diinkubasi pada suhu 50
0
C di dalam waterbatt dengan kecepatan agitasi 100 rpm, kemudian enzim agarase
dipanen selama waktu produksi tertinggi yang telah didapatkan sebelumnya.
Selama masa inkubasi dilakukan, sampling untuk perhitungan gula pereduksi
dilakukan sebanyak 1 mL dengan penambahan 3 mL. Kultur sel pada media
produksi yang mengandung enzim agarase ekstraseluler disentrifugasi pada
kecepatan 2500 selama 30 menit pada suhu 40C untuk memisahkan larutan enzim
dengan pelet bakteri. Supernatan hasil sentrifugasi kemudian disimpan pada suhu
100C sebagai enzim ekstrak kasar berupa supernatan.
Uji kuantitatif
Karakterisasi Enzim Agarase
Penentuan pH Optimum
Optimasi kondisi kultur untuk pertumbuhan bakteri dan produksi enzim
agarase terhadap pengaruh pH pada pertumbuhan dan produksi enzim dilakukan
pada kisaran pH berkisar antara 3 sampai 9 dengan menambahkan sebanyak 0,2
mL enzim yang direaksikan dengan 1,8 mL substrat. Substrat dibuat dengan

7

mencampurkan 1,8 gr dari 0,5% agar bacto ke dalam buffer masing-masing enzim
diinkubasi pada suhu 300C selama 30 menit. Dengan komposisi buffer yang
digunakan adalah buffer asetat pH 3, 4 dan 5, fosfat pH 5,6 dan 7 dan Tris HCl
pH 7,8 dan 9. Aktivitas enzim agarase diukur sesuai dengan prosedur pengujian
sebelumnya dengan menambahkan 3 mL larutan DNS, dipanaskan 2 menit
kemudian dispektro dengan panjang gelombang 575 nm (Ramadhini 2012).
Penentuan Suhu Optimum
Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri dan produksi enzim.
Pertumbuhan kultur bakteri dan produksi enzim yang dioptimalkan untuk suhu
berkisar dari 20 sampai 800C dengan menambahkan sebanyak 0,2 mL enzim yang
direaksikan dengan 1,8 mL substrat. Substrat dibuat dengan mencampurkan 1,8 g
agar bacto ke dalam buffer optimum Aktivitas enzim agarase diukur sesuai
dengan prosedur pengujian sebelumnya (Ramadhini 2012).
Stabilitas Enzim
Uji kuantitatif dilakukan dengan menguji enzim hasil produksi dengan
karakteristik dari suhu dan pH yang telah diketahui hasil optimumnya. Sebanyak
15 gr Gelidium kering dan telah digunting sampai halus ditambahkan dengan
akuades selanjutnya di autoclave selama 30 menit pada suhu 121 0C dan tekanan 1
atm. Selanjutnya, hasil autoclave didinginkan kemudian ditambahkan enzim
dalam buffer optimum dengan konsentrasi 5%, 10%, 15% dan 20% dilakukan
inkubasi pada suhu optimum yang telah diketahui. Waktu pengamatan dilakukan
setiap 24 jam selama 72 jam. Kadar glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis agar
dengan enzim agarase berdasarkan nilai absorbansi pada 540 nm.
Fermentasi Bioetanol
Hasil konsentrasi terbaik dari stabilitas enzim difermentasi menjadi
bioetanol dengan menggunakan rumput laut (Gelidium sp) kering yang telah
digunting kecil sebanyak 15 gr dari 500 mL. Timbang rumput laut 75 gr dan
masukkan kedalam erlenmeyer yang telah berisi akuades 500 mL ditambahkan 5
mL enzim dan buffer optimum 45 mL kemudian disterelisasi kedalam autoclave
selama 15 menit pada tekanan 121 atm. Hidrolisat rumput laut di inkubasi selama
3 hari waktu optimum didalam waterbatt suhu 500C. Setelah selesai diinkubasi,
hidrolisat Gelidium diperas menggunakan kertas whatman 41 didalam gelas ukur
dan dituang kedalam 2 erlenmeyer masing masing berukuran 100 mL dan 50 ml,
ambil 1 ml untuk uji gula pereduksi pada panjang gelombang 540 nm dan 1 ml
diukur nilai brixnya menggunakan handrefraktometer, nilai brix yang telah diukur
kemudian dicatat hasilnya. Hasil perasan hidrolisat pada kedua erlenmeyer
dipanaskan selama 15 menit dengan kisaran suhu 70-800C. Sampel hidrolisat 100
mL dibawah kedalam laminari untuk penambahan media YMGP 10 mL khamir,
NPK dan Urea hasil perhitungan brix. Kemudian hasil hidrolisat 100 mL
difermentasi selama 5 hari kedalam waterbatt. Setelah selesai waktu fermentasi
kemudian didestilasi 30 menit untuk memperoleh cairan bioetanol sebanyak 10 ml
didalam botol. Sampel 10 ml bioetanol kemudian diukur nilai densitas dan
konsentrasi bioetanol.

8

Penentuan berat molekul (SDS-PAGE)
Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam analisis ini adalah 10%
(w/v). Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan perak. Deteksi SDS-PAGE
dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur dari
jarak migrasi brompenol blue. Gel tersebut dicelup dan direndam dalam larutan
fiksasi (25% methanol + 12% asam asetat) selama 1 jam digoyang konstan.
Kemudian direndam dalam 50% (v/v) etanol selama 2x20 menit. Larutannya
diganti dengan larutan pengembang kemudian dicuci dengan akuadebistilata.
Setelah dicuci ditambahkan larutan perak nitrat selama 30 menit kemudian dicuci
lagi dengan akuabiddestilata 2x20 detik dan ditambahkan larutan campuran
Na2CO3 dan formal dehida dan terakhir dengan larutan fiksasi (Rosenberg 1996).
Identifikasi Isolat Bakteri
Identifikasi isolat bakteri secara molekuler dilakukan berdasarkan gen
penyandi 16S-DNA. Analisis DNS dilakukan dengan menggunakan primer 1
(63F) CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC dan primer 2 (1387R) GGG CGG
WGC GTA CAA GGC. Metode isolasi bakteri sesuai dengan petunjuk DNA Mini
Kit Qiagen. Hasil analisis kemudian diblast dan dibandingkan dengan data base
pada NCBI (http://www.ncbi.nml.nih.gov/BLAST/) untuk mengetahui nama
spesies dari isolate bakteri (Marchesi et al. 1998)

9

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan Bakteri dan Produksi Enzim Agarase
Isolat BSUC4 dan BSUC2 ditumbuhkan pada media yeast pepton agar
diinkubasi selama 3 hari dan suhu 370C kemudian menggunakan pewarnaan lugol
iodin 0,1% membentuk zona bening pada uji kualitatif yang dilakukan. Zona
bening yang terbentuk menunjukkan bahwa adanya aktivitas enzim agarase
ekstrakseluler yang dikeluarkan oleh isolat BSUC4 dan BSUC2. Indeks agarolitik
yang terbentuk dari isolat BSUC4 adalah 4,28 mm dan 4,18 mm saat ditetesi
lugol selama 30 menit.

(a)

(b)

Gambar 1. Zona bening isolat BSUC4 (a) dan BSUC2 (b)
Pertumbuhan bakteri yang baik akan memperbesar kemampuan bakteri
agarolitik dan untuk menyesuaikan dengan kondisi lingkungannnya dilakukan
optimasi produksi enzim dilihat dari nilai kerapatan optis yang dihasilkan pada
setiap jam pengukuran yaitu setiap 1 jam dengan menggunakan suhu ruang dan
kecepatan agitasi 85-100 rpm pada panjang gelombang 600 nm. Penentuan waktu
optimum untuk uji lanjut diawali dengan pembuatan kurva pertumbuhan pada
media NB + NaCl dan optimasi produksi enzim dengan DNS per 6 jam selama 42
jam. Berdasarkan hasil pengamatan pola pertumbuhan isolat bakteri BSUC4 dan
BSUC2 dalam media NB pada Gambar 2 dan 3, dimana pada isolat BSUC4
bakteri mulai beradaptasi pada jam ke 2 dengan nilai 0.2215 hingga puncak
pertumbuhan pada jam ke 8 lewat 30 menit dengan nilai 1.573 dimana pada
waktu tersebut telah terjadi kekurangan nutrien atau makanan sehingga jumlah sel
hidup menjadi tetap dan mengalami penurunan atau fase kematian pada jam ke 9.
Sementara untuk kode isolat BSUC2 mulai beradaptasi pada jam ke 5 dengan nilai
0.055 dan terus terjadi peningkatan pada jam ke 14 dengan nilai 1.503 dan jam ke
15 pada fase ini mikroorganisme tidak lagi melakukan pembelahan sehingga jumlah
sel cenderung tetap karena persediaan nutrisi terbatas dan mulai memasuki fase
kematian.

10

Gambar 2. Kurva pertumbuhan bakteri BSUC4 pada media NB+NaCl

Gambar 3. Kurva pertumbuhan bakteri BSUC2 pada media NB+NaCl
Kurva pertumbuhan dari isolat BSUC4 dan BSUC2 yang dihasilkan
menjadikan waktu penentuan pada saat penuangan inokulum ke media produksi.
Isolat BSUC4 optimum penuangan inokulum pada jam ke 8 lewat 30 menit dan
BSUC2 pada jam ke 14. Selanjutnya, optimasi produksi enzim dilakukan dengan
lama waktu inkubasi. Aktivitas enzim agarase dilakukan selama 42 jam waktu
inkubasi.
Kurva pertumbuhan dan produktivitas gula pereduksi yang diperoleh
disajikan pada Gambar 3. Pertumbuhan bakteri agarolitik (Gambar 3) ditandai
dengan meningkatnya nilai densitas (kekeruhan) medium sejalan dengan meningkatnya
lama waktu inkubasi. Tahapan fase yang terjadi pada pertumbuhan bakteri agarolitik.
Pada jam ke-18 kadar gula reduksi yang dihasilkan meningkat, hal ini diduga
enzim
agarase telah mencapai waktu inkubasi yang optimal sehingga dapat
menghasilkan gula reduksi yang tinggi. Setelah melewati jam ke-18 absorbansi
menurun yang mungkin disebabkan banyaknya kematian sel dalam media, sehingga
kadar gula pereduksi yang dihasilkan juga mengalami penurunan (Dees et al 1995).
Berdasarkan kurva pertumbuhan dan aktivitas enzim agarase pada Gambar 4 waktu

11

panen enzim adalah pada jam ke-18 dengan nilai aktivitas enzim yaitu 0.00214
U/mL.
Kurva pertumbuhan dan produktivitas gula pereduksi yang diperoleh
disajikan pada Gambar 4. Pertumbuhan bakteri agarolitik (Gambar 4) ditandai
dengan meningkatnya nilai densitas (kekeruhan) medium sejalan dengan meningkatnya
lama waktu inkubasi. Tahapan fase yang terjadi pada pertumbuhan bakteri agarolitik.
Kadar gula reduksi pada jam ke-18 yang dihasilkan meningkat, hal ini
diduga enzim agarase telah mencapai waktu inkubasi yang optimal sehingga dapat
menghasilkan gula reduksi yang tinggi. Setelah melewati jam ke-18 absorbansi
menurun yang mungkin disebabkan banyaknya kematian sel dalam media, sehingga
kadar gula pereduksi yang dihasilkan juga mengalami penurunan (Dees,et.al., 1995).
Berdasarkan kurva pertumbuhan danaktivitas enzim agarase pada Gambar 4 waktu
panen enzim adalah pada jam ke-18 dengan nilai aktivitas enzim yaitu 0,00214
U/mL.

Gambar 4. Aktivitas Enzim dan Jumlah Bakteri (BSUC4)
Konsentrasi gula pereduksi (Gambar 5) pada isolat BSUC2 tidak terlihat
adanya aktivitas dengan jumlah bakteri yang semakin meningkat pada jam ke 42.
Tidak adanya aktivitas enzim dengan hasil optimum menyebabkan isolat BSUC2
tidak dilakukan uji lanjut pada tahapan berikutnya.

Gambar 5. Aktivitas Enzim dan Jumlah Bakteri (BSUC2)

12

Karakteristik Enzim Agarase
Karakterisasi enzim agarase dilakukan untuk menentukan karakteristik dari
enzim agarase yang telah diekstrak. Karakterisasi meliputi penentuan derajat
keasaman (pH) optimum, suhu optimum. Menurut (Ottaway 1984). faktor-faktor
utama yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah derajat keasaman (pH), suhu
dan senyawa penghambat.
Derajat keasaman (pH) dan Suhu optimum
Enzim merupakan bio-katalisator yang tersusun dari protein. Enzim
memiliki aktivitas yang spesifik terhadap pH. Hal ini terkait dengan sifat dasar
protein yang dapat mengalami denaturasi akibat adanya pengaruh nilai pH (basa
ataupun asam). Hasil penentuan pH optimum dari ekstrak kasar enzim agarase
terlihat pada Gambar 6. Pada grafik tersebut terlihat pH optimum agarase pH 8
Tris Hcl dengan nilai aktivitas enzim 0.00169 U/ml. Nilai pH meningkat dari pH
5 sampai 8. Hasil penelitian yang dilakukan (Saraswathi et al. 2011) menunjukkan
hasil tertinggi pada pH 8 dan penelitian yang dilakukan (Potin et al.1993) hasil
tertinggi pada pH 7,2, (Wang et al 2005) nilai pH tertinggi 7. Berdasarkan hasil
penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa aktivitas pHoptimum enzim agarase
pada kisaran 7-8.

Gambar 6. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim Agarase
Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium tempat reaksi terjadi.
Setiap enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan
aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat
pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada
tingkat ionisasi yang diinginkan. Namun pada saat pH mengalami penurunan
dapat menyebabkan enzim terdenaturasi yang menyebabkan enzim kehilangan
aktivitas biologisnya (Lehninger 1993).
Suhu merupakan salah satu yang berpengaruh terhadap aktivitas enzim
agarase. Hal ini disebabkan karena enzim tersusun atas protein. Hasil pengujian

13

suhu terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada Gambar 7. Aktivitas enzim
agarase tertinggi pada suhu 50°C dengan nilai aktivitas enzim 0.00133 U/ml.

Gambar 7. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim Agarase
Berdasarkan hasil penelitian Potin et al 1993 terhadap enzim agarase
yang berasal dari bakteri moluska diketahui bahwa enzim tersebut memiliki
aktivitas optimum pada suhu 45o C. Saraswathi et al. 2011 menyatakan bahwa
enzim agarase yang berasal dari bakteri estuari memiliki aktivitas optimal pada
suhu 40 ºC. Penelitian di Jepang dari sampel bakteri laut oleh Dong et al. 2006
40oC dan Wang et al 2005 suhu optimum 35oC. Hal ini menunjukkan bahwa
aktivitas optimum pada suhu aktivitas enzim agarase berkisar antara 35-50o C.
Stabilitas Enzim Agarase
Stabilitas enzim dilakukan guna mengetahui seberapa lama enzim bekerja
secara maksimal. Hasil stabilitas enzim menunjukkan peningkatan terjadi secara
perlahan dari jam ke 24 dan sampai jam ke 72 pada konsentrasi 10% (Gambar 8).
Hidrolisis pada Gelidium sp. dengan konsentrasi enzim 10% memberikan nilai
gula pereduksi sebesar 667 ppm sedangkan pada perlakuan konsentrasi enzim 15
% dan 20% pada jam ke 72 mengalami penurunan. Hal ini menunjukkan bahwa
enzim telah bekerja secara maksimal untuk menghidrolisis substrat Gelidium sp.
selama 72 jam di konsentrasi enzim 10%. Peningkatan konsentrasi enzim
ternyata tidak berpengaruh terhadap peningkatan gula yang dihasilkan. Menurut
(Suhartono 1989) gula pereduksi yang dihasilkan sama dengan aktivitas enzim
yang dihasilkan, semakin tinggi gula pereduksi yang dihasilkan maka semakin
tinggi juga aktivitas enzim. Saraswhati et al (2011) mengatakan bahwa waktu
stabilitas enzim agarase akan berjalan maksimal pada jam ke 24 72 jam.

14

Gambar 8. Konsentrasi gula (ppm) pereduksi hasil hidrolisis agar oleh enzim
agarase isolat bakteri BSUC4
Penentuan Berat Molekul
Penentuan bobot molekul dilakukan menggunakan SDS Page,hasil analisis
SDS Page dapat dilihat pada Gambar 9. Penentuan berat molekul dihitung
berdasarkan nilai y = -1,5311x + 2,2827 kurva standar dimana y sebagai berat
molekul marker (kDa) sedangkan x = mobilitas relatif protein (cm). Pita protein
yang dihasilkan dari isolat BSUC4 terdapat 3 band yaitu 37 kDa, 41 kDa dan 52
kDa. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa berat molekul
enzim agarase rendah ( 100) (Saraswati et al. 2011) berat molekul enzim 20 kDa
dari spesies Bacilus subtilis, 33 kDa dari Pseudualteromonas sp. (Oh et al. 2010)
39,5 kDa dari Alteromonas sp. (Wang et al. 2005). 42 kDa dari spesies Vibrio sp
(Sugano et al. 1994) dan Pseudomonas sp 60 kDa (Liao et al. 1997). Berdasarkan
hasil klasifikasi berat molekul protein, enzim agarase yang dihasilkan dari isolat
BSUC4 adalah 60 kDa.

M

1
1

Gambar 9. Hasil elektroforesis SDS PAGE (M) marker dan pengendapan aceton
fraksi (1) ekstrak kasar enzim agarase.

15

Fermentasi
Hasil fermentasi dari Gelidium sp. dengan menggunakan enzim agarase
BSUC4 menghasilkan kadar etanol sebesar 1,04 % (Gambar 10). Kadar etanol
yang difermentasi menggunakan enzim memiliki hasil yang lebih tinggi dari pada
menggunakan asam yang telah dilakukan sebelumnya oleh Saputra et al. (2013)
menggunakan asam 0,5% dan menghasilkan kadar etanol sebesar 0,7% dan Sari
(2013) menggunakan asam 1% menghasilkan kadar etanol 0,5%. Hal ini
menunjukkan bahwa penggunaan enzim agarase dalam menghidrolisis Gelidium
sp. untuk produksi bioetanol lebih efektif dibandingkan menggunakan asam.

Gambar 10. Produksi bioethanol yang dihasilkan oleh isolat BSUC4
Identifikasi Isolat
Isolat BSUC4 merupakan koleksi SBRC yang diisolasi dari lingkungan
hidup Caulerpa sp Pulau Pari, Kepulauan Seribu, Jakarta. Isolat bakteri BSUC4
termasuk bakteri mesofilik karena hidup pada suhu 370C pada media agar,
memiliki warna putih kekuningan dan hidup pada substrat. Berdasarkan analisis
sekuen DNA tersebut isolat BSUC4 memiliki tingkat kemiripan atau homologi
hasil identifikasi sebesar 99% dengan nilai e value 0, query cover 91% dari total
skore 1380 jenis Pseudomonas stutzeri (Gambar 11). Klasifikasi Pseudomonas
termasuk dalam kingdom Bacteria, filum Proteobacteria, Kelas Gamma
proteobacteria, Ordo Pseudomonadales, Famili Pseudomonadaceae, Genus
Pseudomonas, Spesies Pseudomonas stutzeri (Lalucat et al 2006). Bakteri
Pseudomonas stutzeri merupakan bakteri yang bisa menghasilkan biosurfactan
dan banyak membantu dalam proses pencemaran hidrokarbon. Beberapa
penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa bakteri dapat menghasilkan

16

enzim agarase diantaranya penelitian dari Bakteri jenis Pseudoalteromonas sp
(Vera et al 1998), Agarivorans sp (Hu et al. 2008), Psedoalteromonas sp (Oh et
al. 2010), Acinotobacter sp (Laksmikanth et al. 2009), Vibrio sp (Sugano et al.
1994), Bacilus subtilis (Saraswathi et al. 2011), Alteromonas agaryticus (Potin et
al. 1993), Pseudomonas sp (Thulasidas et al. 2012). Berdasarkan hasil penelitian
tersebut penelitian menunjukkan bahwa bakteri dari spesies Pseudomonas stutzeri
merupakan laporan pertama mengenai jenis tersebut yang dapat menghasilkan
enzim agarase dibandingkan dengan penelitian (Thulasidas et al. 2012 ) dengan
menggunakan bakteri tetapi hanya sampai pada tingkat genera Pseudomonas sp
tanpa diketahui dari spesies apa.

Gambar 11. Pohon filogenetik isolat bakteri BSUC4
PEMBAHASAN

Uji kualitatif enzim agarase dari hasil terbentuknya zona bening isolat
BSUC4 dan BSUC2 adalah 4,28 mm dan 4,18 mm pada media yeast,pepton dan
agar. (Zverlova et al.2003) menyatakan bahwa diameter zona bening umumnya
berukuran besar dibandingkan dengan diameter koloni. Media pertumbuhan (NB)
BSUC4 mulai memasuki fase eksponensial pada pada jam ke 2 dengan nilai 0.2215
hingga puncak pertumbuhan pada jam ke 8 lewat 30 menit dengan nilai 1.573
dimana pada waktu tersebut telah terjadi kekurangan nutrien atau makanan
sehingga jumlah sel hidup menjadi tetap dan mengalami penurunan atau fase
kematian pada jam ke 9. Sementara untuk kode isolat BSUC2 mulai beradaptasi
pada jam ke 5 dengan nilai 0.055 dan terus terjadi peningkatan pada jam ke 14
dengan nilai 1.503 dan jam ke 15 pada fase ini mikroorganisme tidak lagi melakukan
pembelahan sehingga jumlah sel cenderung tetap karena persediaan nutrisi terbatas
dan mulai memasuki fase kematian dan tidak dapat mengalami pertumbuhan lagi.
Selanjutnya, optimasi produksi enzim dilakukan dengan lama waktu
inkubasi. Aktivitas enzim agarase dilakukan selama 42 jam waktu inkubasi.Waktu
penentuan untuk penuangan inokulum kemedia produksi diambil dari waktu
optimum pertumbuhan bakteri. Isolat BSUC4 pada jam ke 8 dan isolat BSUC2
pada jam ke 14. Penuangan inokulum ke media produksi dilakukan agar isolat
tidak membutuhkan waktu yang lama untuk beradaptasi dengan media yang baru.

17

Isolat BSUC4 mulai memasuki fase adaptasi pada jam ke 6 ditandai dengan
meningkatnya nilai densitas (kekeruhan) medium sejalan dengan meningkatnya lama
waktu inkubasi. Tahapan fase yang terjadi pada pertumbuhan bakteri agarolitik dan
mengalami peningkatan sampai jam ke 18 dengan jumlah bakteri 864.000 CFU/mL.
Hal ini juga dapat dilihat pada jam ke-18 kadar gula reduksi yang
dihasilkan meningkat, hal ini diduga enzim agarase telah mencapai waktu inkubasi
yang optimal sehingga dapat menghasilkan gula reduksi yang tinggi dengan nilai
aktivitas enzim 0.00214 U/mL. Setelah melewati jam ke-18 absorbansi menurun
yang mungkin disebabkan banyaknya kematian sel dalam media, sehingga kadar gula
pereduksi yang dihasilkan juga mengalami penurunan (Dees et.al 1995). Namun,
untuk Isolat BSUC2 konsentrasi gula pereduksi pada isolat BSUC2 tidak terlihat
adanya aktivitas dengan jumlah bakteri yang semakin meningkat pada jam ke 42.
Tidak adanya aktivitas enzim dengan hasil optimum menyebabkan isolat BSUC2
tidak dilakukan uji lanjut pada tahapan berikutnya.
Aktivitas enzim agarase pada uji karakteristik agarase isolat BSUC4
memiliki nilai 0.00169 U/ml pH 8 Tris HCl dengan suhu optimum 50oC. Aktivitas
enzim pada suhu mengalami penurunan setelah 50oC disebabkan terputusnya
ikatan sekunder enzim karena besar energi kinetika dibandingkan molekul enzim
atau substrat tidak melekat secara sempurna pada sisi aktif enzim sehingga
hilangnya aktivitas enzim (Suhartono 1989).
Enzim agarase dari isolat BSUC4 memiliki aktivitas yang paling baik
karena paling optimum pada aktivitas enzim media produksi, menghidrolisis
Gelidium sp dengan nilai gula pereduksi yang tinggi sampai menghasilkan
konsentrasi etanol 1,04% dan hasil sequen 16sDNA spesies yang teridentifikasi
adalah Pseudomonas stutzeri.

18

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian, kondisi optimum pada pengujian karakteristik
enzim agarase adalah pada pH 8 buffer Tris Hcl dengan nilai aktivitas enzim
0.00169 U/mL, suhu optimum 500C aktivitas enzim 0,00133 U/mL dan kadar
etanol 1.04% dan spesies bakteri yang teridentifikasi adalah Pseudomonas stutzeri.
Saran
Perlu adanya penelitian lanjutan dengan penentuan bobot molekul
menggunakan metode zimogram dan pemurnian bioetanol dari enzim sehingga
dapat mengkarakteristik enzim ini lebih detail.

19

DAFTAR PUSTAKA

Anggadiredja J. T Zatnika, A Purwoto, Istini. 2008. Rumput Laut. Penebar
Swadaya. Jakarta
Araki, T, Hayakawa M, Zhang L, Karita S, Morishita T. . 1998. Purification and
characterization of agarases from a marine bacterium, Vibrio sp. PO-303. J
Mar Biotechnol. 6:260 265.
Cappucino JG, Sherman N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Wesley:
Addison
Chi WJ, Chang YK, Hong SK. 2012. Agar degradation by microorganism and
agar degrading enzymes. Appl Microbial Bioethanol. 94:917-930.
Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology. Di dalam: Brock TD, editor. A
Textbook of Industrial Microbiology. Sunderland: Minuaer Associates.
hlm 267-276
Deng SP, Tabatabai MA. 1994. Cellulase activity of soils. Soil Biol Biochem
26:1347-1354.
Dong J, Tamaru Y dan Araki O. 2006. A unique -agarase, AgaA, from a marine
bacterium ,Vibrio sp. strain PO-303. Appl Microbiol Biotechnol.
74:1248 1255.
Goh CS, Lee KT. 2010. A visionary and conceptual macroalgae-based thirdgeneration bioethanol (TGB) biorefinery in Sabah, Malaysia as an
underlay for renewable and sustainable development. Renew Sustainable
Energy Rev. 14:842-848.
Hu Z, Lin BK, Xu Y, Zhong M.Q, Liu G.M. Production and purification of
agarase from a marine agarolytic bacterium Agarivorans sp. HZ105.
2008. J Appl Microbiol. 106(181 190).
Irawan B, Sutihat, Sumardi. 2008. Uji aktivitas selulase dan lipase pada
mikrofungi selama proses dekomposisi limbah cair kelapa sawit dengan
pengujian kultur murni. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan
Pengabdian kepada Masyarakat. Lampung: Universitas Lampung. hlm
284-291.
Jang JS, Cho YK, Jeong GT, Kim SK. 2012. Optimization of saccharification and
ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) from seaweed Saccharina japonica. Bioprocess Biosyst Eng.
35:11 18
Jiangxue W, Haijin M, Xiaolu J dan Huashi G. 2005. Characterization of a novel
-agarase from marine Alteromonas sp. SY37-12 and its degrading
Products. Appl Microbial Bioethanol. 71:833-839.
Jinhua D, Yutaka T dan Araki O. 2006. A unique -agarase, AgaA, from a
marine bacterium ,Vibrio sp. strain PO-303. Appl Microbiol Biotech.
74:1248 1255.
Kader AJ, Omar O. 1998. Isolation of Cellulolytic fungi from Sayap. Kinabaku
Park. Sabah Serawak. J Biodiversity Bio-Conserv (ARBEC) 1-6.
Kim CH, Kim DS. 1995. Purification and specificity of specific endo- -Dgluconase (Avicelase II) resembling exo-cellobiohydrolase from Bacillus
circulan. Enzyme Microbial Technol. 17: 248:254.

20

Kim GS, Myung KS, Kim YJ, OH KK, Kim JS, Ryu HJ, Kim KH. 2008. Method
of Produching Biofuel Using Sea Algae. Seoul: World Intelectual
Property Organization.
Lalucat, Bennasar A, Bosch R, Garcia-Valdes, E, Palleroni NJ .2006. Biology of
Pseudomonas stutzeri. Microbiol Mol Biol Rev.70 (2): 510 47.
Lathifah HN. 2009. Pembuatan Bioetanol Dari Sirup Glukosa Umbi Ganyong
(Canna edulis Kerr) Menggunakan Khamir Schizosaccharomyces
pombe.Institut Pertanian Bogor.
Lehninger AL. 1993. Dasar dasar Biokimia jilid 1. Jakarta:Erlangga. Terjemah
dari : The Foundation of Biochemistry
Liao, C.H. D.E. McCallus. 1997. Biochemical and genetic characterization of an
extracellular protease from Pseudomonas fluorescens CY091. Appl
Environ Microbiol. 64:914-921.
Marchesi JRT, Sato AJ, Weightman TA, Martin JC, Fry SJ, Hiam D, Dymnock,
Wade WG. 1998. Design and evaluation of useful bacterium specific PCR
primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl Environ
Microbial. 64:795-799.
Moat AG, Foster JW, Spector MP. 2002. Microbial Physiology 4th ed. New York
(USA): Wiley-Liss.
Munifah I, Chasanah E, Fawzya YN. 2011. Screening of cellulolytic bacteria from
Indonesia s marine environment. Di dalam: Prosiding Seminar ISISM
(International Seminar of Indonesian Society for Microbiology); Bogor, 26
Juni 2011. Bogor: Perhimpunan Mikrobiologi Cabang Bogor.
Nahak S, Gayatri N, Itishree P, Sahu RK. 2011. Bioethanol from Marine Algae: A
Solution to Global Warming Problem. J Appl Environ Biol Sci.1(4):74-80.
Nguyen, Minh TH, Hanh V. Bioethanol production from marine algae biomass:
prospect and troubles. 2012. J Viet Env. 3:25-29.
Oh C, Nikapitiya C, Lee Y, Whang I, Kang DH, Heo SJ, Choi YU, LeeJ. 2010.
Moleculer cloning, characterization and enzymatic properties of a novel
etaagarase from a marine isolate Psedoalteromonas sp. AG52. Brazilian J
Microbiol 41: 876-889
Ottaway JH,Apph DK.1984. Bichemistry. Ed ke-4. Cambridge:ELBS.
Potin P, Christope R, Cyrille R, Bernard K. 1993. Purification and
Characterization of the -agarase from Alteromonas agarlyticus (cataldi)
comb. Nov.,Strain GJ1B. Eur J Biochem. 214:599-607.
Rahmadini I. 2012. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulose Dari Bakteri
Yang Diisolasi Dari Limbah Rumput Laut. TESIS. Institut Pertanian
Bogor
Richan, N., Ahmad T, Pia P., 2009. Tehnik Produksi Amilase Skala Pilot dari
Isolat Rekombinan Pembawa Gen Amilase . Prosiding Seminar Hasil
Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. Hlm.365-372.
Riyanti EI. 2008. Biomassa sebagai bahan baku bioetanol. Bogor. Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika
Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Rosenberg IM. 1996. Protein analysis and purification: Benchtop technique.
Boston: Birkhauser.

21

Salamah E, Susanti D, Wikanta T. 2005. Kualitas Agarosa Hasil Isolasi dari
Rhodymenia ciliate Menggunakan DEAE-SELULOSA. Buletin
Teknologi Hasil Perikanan. Vol.8
Saputra WA, Susanto AB, Pramesti R. 2013. Produksi Bioetanol Dari Tepung
Gelidium verrucosa (Hudson) Papenfuss yang Dihidrolisis Dengan
Menggunakan Larutan Asam Sulfat. J Mar Research. Vol 2(2): 22-29.
Saraswathi, V. Vasanthabharathi, V. Kalaiselvi, S. Jayalakshmi. 2011.
Characterization and optimization of agarase from an estuarine
Bacillus subtilis. African J Research. 5(19):2960-2968.
Sari DW.2013. Optimasi Hidrolisis dan Fermentasi Makroalga Gelidium
latifolium dan Gracilaria verrucosa sebagai Penghasil Bioetanol.
TESIS. Institut Pertanian Bogor.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Antar Universitas
Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Sugano Y, Kodama H, Terada Ichiro, Yosini Y, Noma M. 1994. Purification and
characterization of a Novel Enzyme, ot-Neoagarooligosaccharide
Hydrolase(Ol-naos Hydrolase) from a Marine Bacterium, Vibrio sp
strain JT0107. Bacteriology.. 176 (22):6812-6818.
Suwanto, Yogiana, Suryanto D, Tan I, Puspitasari E. 2000. Selected Protocols
Training Course on Advances in Molekuler Biology Technique to Asses
Microbial Diversity. Bogor: SEAMEO-BIOTROP. Hlm 22-31
Thulasidas. Isolation and characterization of Agarolytic Microorganisms and
Purification of an Extracellular Enzyme Agarase. 2012. Int al Pharmaceut
Biol Arc. 3(4):965-968).
Tiwari KL, Jadhav SK, Fatima A. 2007. Culture Condition for the Production of
Thermostable Amylase by Penicillium rugulosum .Global J
Biochemistry 2. 1:21-24.
Van Y, De Watcher. 1993. TREECON: asoftware package for the construction
and drawing of evolutionary trees. Comput Applic Biosci 9:177-182.
Vera J, Alvarez R, Murano E, Slebe JC, Leon O. Identification of a marine
agarolytic Pseudoalteromonas isolate and characterization of its
extracellular agarase. 1998. Appl. Envir