Genetic differentiation among populations of Chromobotia macracanthus Bleeker from Sumatra and Kalimantan based on sequencing gene of MtDNA Cytochrome b and Nucleus DNA RAG2

Genetic Differentiation among Populations of Chromobotia 
macracanthus Bleeker from Sumatera and Kalimantan 
Based On Sequencing Gene of MtDNA Cytochrome b and 
Nucleus DNA RAG2 

KAFI HIDONIS 

DEPARTMENT OF LIVING AQUATIC RESOURCE MANAGEMENT 
FACULTY OF FISHERIES AND MARINE SCIENCE 
BOGOR AGRICULTURAL UNIVERSITY 

2008

STATEMENT ABOUT THESIS AND INFORMATION SOURCE 
Hereby I acclaim that its thesis entitled : 
Genetic Differentiation among Populations of Chromobotia Macracanthus 
Bleeker from Sumatera and Kalimantan Based On Sequencing Gene of 
MtDNA Cytochrome B and Nucleus DNA RAG2 
Is my own work and have never been submitted whatever form to any college. All 
data and information source come or quoted from other  masterpiece have been 
listed on text and listed on references in the end part of this thesis. 

Bogor, July 2008 

KAFI HIDONIS 
C24102033

I. INTRODUCTION 
A. Background 
Botia  (Chromobotia  macracanthus  Bleeker)  as  well  known as  clown  loach 
is  one  of  the  econonomically  important  species  of  freshwater  ornamental  fish. 
Botia  is  indigenous  of  Indonesian  waters  especially  in  Batanghari,  Musi,  and 
Kapuas river (Kottelat et al.,1993). 
The increase of human activity around the river, like fishing the botia from 
juvenile  to  adult  and  also  environmental  changes  due  to  the  increase  of 
development  activity  it  will  affect  the  existing  botia  population.  The  low  level 
composition  and  abundance  of  fish  (include  botia)  in  Kapuas  river  is  not  only 
affected by fishing activity, but also the pollution of peat land development activity 
(Harteman,  1998).  The  effort  for  preserving  this  population  like  conservation, 
restocking, cultivation, and domestication is needed. Nevertheless the cultivation 
of botia until now still in laboratory scale, as it has been done by LRBIHAT­DKP 
in cooperation with Institut de Recherche pour le Développement (IRD)­ France. 

The efforts above  need  much  information  on  ecobiological  characters  of 
botia  population  in  order  to  support  the  successful  management.  According  to 
Wirasatya  (1994),  the  population  of  botia  in  Batanghari  and  the  population  of 
botia in Kapuas showed morphologically difference.The color appearance of botia 
from  Sumatera  looks  different  which  from  Kalimantan.  The  color  of  botia  from 
Kapuas  river  (West Kalimantan)  looks  brighter  than  botia  from Batanghari  river. 
Fish  population  genetic  have  the  important  role  in  either  fisheries  management 
program or production. The genetic variability is an essential key for the survival 
of  a  species  to  survive  for  the  next  generation.  The  conservation  of  genetic 
diversity has become prime concern  for IUCN. Concerning the botia population, 
information  on  genetic  aspects  still  limited.  Therefore  in  order  to  maintain  the 
sustainability  of  botia  population  in  Indonesia,  especially  in  Sumatera  and 
Kalimantan, the research on genetic aspect of botia population is important to be 
carried out. 
B. Problems Definition 
The  Increasing  of  fishing  activity  and  habitat  destruction  cause  the 
degradation  of  genetic  population  diversity.  Therefore,  it  needs  control  and 
evaluation on botia population in order to keep its genetic diversity.

2 

An  effort  to  maintain  the  population  of  botia  like  restocking  and 
domestication  has  to  pay  attention  on  population  genetic  population  of  botia. 
There is no clear information whether the population of botia from Sumatera and 
Kalimantan, is similar or not genetically. Therefore it has to be very careful before 
manipulating botia population either for  restocking or aquaculture because it will 
risk  disturbing  the  original  population  genetically.  Therefore  research  on 
population genetic of botia from Sumatra and Kalimantan is needed and in order 
to give more  information needed for  its conservation and management. 
Cytochrome b is one of mitochondrial DNA. Cytochrome b analysis is  often 
used in fisheries to figure out  genetic diversity of population because it is more 
sensitive  than  protein  analysis.  Besides,  it  is  generally  used  to  study 
phylogeography (Baker,2000). 
RAG2  is one  of  gene  on  nucleus.  RAG2  encode  some  enzyme  that have 
important  role  in  gene  sequencing.  RAG2  analysis  often  used  in  studying  of 
phylogeny on teleostei fish (Sullivan, et.al., 2000). 
C. Objective 
The  objective  of  this  research  is  to  obtain  the  representation  of  genetic 
differentiation between population of botia  (Chromobotia macracanthus Bleeker) 
from  Sumatera  (Batanghari,  Tulang  Bawang,  dan  Musi)  and  Kalimantan 

(Kapuas).  The  objective  also  to  estimate  time  divergence  between  both 
population groups. 
D. Benefit 
The  benefit  of  this  research  is  giving  essential  information  on  the 
management efforts in order to maintain the sustainability of botia population  and 
other related activities such as domestication, aquaculture, and also conservation 
and restocking in the future.

II. LITERATURE REVIEW 
A. Biology of Chromobotia macracanthus 
1. Classification, nomenclature, and morphology 
Classification  of  Chromobotia  macracanthus  according  to  Weber  & 
Beaufort  (1916),  Kottelat  (2004),  and  Šlechtová  et.al.(2006)  are  mentioned 
below: 
kingdom 

: Animalia 

phylum 

: Chordata 

class 

: Pisces 

subclass 

: Teleostei 

order 

: Ostariophysi 

suborder 

: Cyprinoidea 

family 

: Cobitidae 

subfamily 

: Botiinae 

genus 

: Chromobotia 

species 

: Chromobotia macracanthus Bleeker 

The  common  name  of  Chromobotia  macracanthus  is  clown  loach.  In 
Indonesia  it  is  known  as  botia.  It  also  has  local  name  such  as  Ikan  Macan 
(Sumatera); Gecuban (Lampung); Biju Bana (Jambi) and Langli (Mahakam river, 
Kalimantan)  (Weber  &  Beafourt,  1916).  Botia  was  classified  in  Genus  Botia, 
named Botia macracanthus. According to Kottelat (2004), botia is defined in new 
genus  Chromobotia,  and  the  same  family  called  Cobitidae.  Since  2006,  all  of 

tetraploid  (4n)  species  (include  Chromobotia  macracanthus)  in  family  Cobitidae 
are  defined  in  subfamily  Botiinae  and  diploid  (2n)  species  are  defined  in 
subfamily Leptobotiinae (Šlechtová, 2006). 
Morphologically botia have  orange  color  body with 3 black bars , its eyes 
not  covered  with  skin  as  shown  on  picture  (Kottelat  et.al.,  1993).  According  to 
Wirasatya  (1994),  the  population  of  botia  in  Batanghari  and  the  population  of 
botia in Kapuas showed morphologically difference. Botia of Kalimantan (figure 1) 
is brighter than that of Sumatera (figure 2). The different varieties of colour  can 
represent the distinct species, similar case  as the different varieties of colour of 
the  asian  arowana  (Scleropages  formosus)  are  also  represent  distinct  species 
(Pouyaud et.al.,2003).

4 

Figure 1. Chromobotia macracanthus Bleeker of Kalimantan (personal 
documentation) 

Figure 2. Chromobotia macracanthus Bleeker of Sumatera (Sudarto’s 
documentation) 
2. Habitat and distribution 

The  habitat  of  botia  in  Batanghari’s  upstream  on  pH  5  ­  5,5  during  dry 
season, and pH 6,5  ­  7 on downstream (Utami, 2003). While in aquarium, botia 
live as well on water with pH 6,8 – 7 (Lesmana, 2002). 
Cyprinid  fish  included  botia  dominated  freshwater  habitat  of  Southeast 
Asia, where about  70 genera  of cyprinid are endemic to the area. While botia  in 
Indonesia    its  endemic  especially  in  Sumatera  and  Kalimantan  (Ismail,  1994). 
The botia live in Kalimantan especially on Barito, Kahayan, Kapuas, Bongan and 
Mahakam  river.  While  in  Sumatera,  botia  live  on  Pangabuang  river;  Kwanten 
river; Batanghari river; Teluk Betung river; Musi river; and Maninjau lake (Weber 
and de Beaufort, 1916).

5 

3. Reproduction 
According  to  Kamal  (1992),  botia  spawns  on  the  upstream  since  early  of 
wet  season.  The  eggs  hatch  on  downstream  and  during  the  dry  season  the 
juvenile migrate to the upstream. 
4. Foods and feeding habit 
The  botia  foods  on  Musi  river  are  group  of  insecta  (order:  Diptera, 
Tricoptera  and  others),  worm,  micro  algae,  molusca,  arthropods  (spider)  and 

other unidentified materials (Sawaliyah, 2007). While According to Kamal (1994) 
the  botia  food  on  Batanghari  river  are  group  of  crustacean,  insect,  nematode, 
molusca,  algae,  and  other  unidentified  materials.  Botia  feeds  on  the  night 
(nocturnal) while only hide on the day. 
B. Mitochondrial DNA (mtDNA) 
Mitochondrial DNA is one of the genome in somatic cell. Beside mtDNA is 
small size of haploid molecule, round and simpler than gene in nucleus cell, and 
able  to  do  self  replication  (Baker,  2000).  mtDNA  has  a  role  in  encoding  some 
tRNA,  rRNA,  and  some proteins  that  used on  protein  synthesis  in  mitochondria 
(Griffiths et al., 2000). The size of mtDNA’s is  less than 20 kb and it is  inherited 
through  female  ancestor.  All  mtDNA  have  many  gene  that  encode  for  protein 
enzymatic  in  respiratory  such  as:  cytochrome  b,  NADH  1­7,  NADH­41, 
cytochrome  c  oxidase  (COX­1­3),  ATP  6;8;9,  12s  rRNA,  16s  RNA,  and  tRNA 
(figure 3). 

Figure 3. Human’s mtDNA map (Lemire, 2005)

6 

The difference  between mtDNA gene and nucleus gene include 2 factors. 

First,  mtDNA  inherit  maternally  (from  female  ancestor),  it  does  not  follow  the 
mendellian’s law. Second, mtDNA is haploid and mutation rate of mtDNA is 5­10 
times  faster  than  nucleus  gene.  The  average  divergence  rate  of  mtDNA  in 
vertebrate  is  1­2%  per  million  year  (Randi,  2000).  Mutation  rate  on  mtDNA 
increase caused by environment factor or mutation in nucleus gene that affect on 
mtDNA (Lemire,2005). 
C. Cytochrome b 
Cytochrome  b  is  part  of  mtDNA,  it  is  one  of  the  cytochrome  that  role  in 
mitochondria respiratory. Cytochrome b is commonly used in phylogenetic study, 
because  it  has enough  variable  in population  level  (Oulu,  2000).  Cytochrome  b 
also  generally  used  for  phylogeographic  studies.  Doadrio  and  Perdices  (2005) 
have  developed  time  divergence  for  Cobitis  (family:  Cobitidae)  based  on  the 
Cytochrome  b  gene  is  0,68%  per  pairwise  per  1  million  year.  The  location 
cytochrome b on Chromobotia macracanthus is 14380­15516 bp (NCBI, 2007). 
D. RAG 2 (Recombination Activating Gene 2) 
RAG  is  one  of  gene  on  nucleus.  RAG  encode  some  enzyme  that  have 
important role in gene sequencing on immunoglobulin and T molecule during VDJ 
recombination. RAG2 very important for lymphocyte B and T, both of them is the 
essential component in body immune. RAG enzyme work as a complex sub unit 
that affect to fission in double helix DNA molecule. RAG protein is many, such as 

RAG  2  on  mouse  consist  of  527  amino  acid.  The  enzymatic  activity  on  RAG 
centralized  in  nucleus,  the  rest  of  RAG2  obstruct  most  of  DNA  fission  activity 
(Wikipedia, 2007). 
E. Biogeography 
Biogeography  is  study  of  organism  distribution  on  space  and  time 
(Wiley,1981). Modern biogeography start since 1960, on the same time develop 
also tectonic plate theory, so it has important role in biogeography. 
Modern  biogeography  related  with  dispersal  and  vicariance  theory. 
Dispersal  theory  consider  that  ancestor  population  zone  bordered  by 
geographical obstruction, than its border passed by some member of population. 
If  its  member  success  in  growing  up  on  new  area  so  its  member  include  in

7 

different taxa. Vicariance theory consider that ancestor population divided on sub 
population  when  barrier  is  appear  so  its  population  cannot  pass  it.  Then,  that 
different sub population grow into different taxa. 
Rainboth (1991) in Gustiano (2003) say that the fauna of Perak river in the 
west  side  of  malayan  peninsula  has  relationship  with  the  fauna  on  North 
Sumatera.  The  Fauna  on  center  of  Sumatera  is  the  most  similar  with  fauna  on 
Kapuas (Kalimantan). 
F. River System History 
There  are  two  processes  that  have  important  role  in    river  alteration  on 
South East Asia, that are climate process that affect on shift of sea level altitude, 
and  the  tectonic  process  that  affecting  shift,  slope,  and  other  moving  of  earth 
plate. 
In  the pleistocene  era,  India,  Malayan  peninsula and all  islands on  Sunda 
shelf,  Kalimantan,  Sumatera,  Java  was  connected  when  sea  level  down.  The 
continent  was  acrossed  by  river  system  and  its  stream  into  sea  (De  Beaufort, 
1951 in Gustiano, 2003). 
Kottelat et. al.(1993) explain that Sunda shelf (20­40 meter under sea level) 
was  wide  mainland  and  there  are  three  main  rivers  across  Malaya,  Sumatera, 
Kalimantan, and Java stream until South China Sea. Batanghari river, Musi river 
and Kapuas river joined into one primary river to South China Sea (figure 4). The 
fish on Batanghari and Musi and are similar with fish on Kapuas river. 

Figure 4. Ancient rivers in South East Asia at Pleistocene era (Voris, 2000).

8 

G. Genetic Variation 
In the fisheries resource management, population genetic structure of fish 
which  live  in  an  habitat  become  very  serious  concern  especially  in  the  case  of 
fish  facing  on  immeasurable  ecological  pressure.  Immeasurable  progressively 
genetic  variation  owned  by fish  strengthen  the fish  to  live  in  long  time  because 
owning adaptation ability to high environment change also. High genetic variation 
have  many  gene  that  able  to  coping  with  environmental  change,  while  low 
genetic  variation  have  less  gene  that able  to  coping  with  environmental  change 
(Soewardi, 2007). 
According  to  Dunham  (2004),  genetic  variation  is  importance  to  live  long 
time  a  species.  Dunham  (2004)  say  that  genetic  variation  can  ascertain  fitness 
from population or species to able adapting environmental change. According to 
Rina  (2001),  genetic  variation  can  influence  response  population  to  selection, 
include natural selection and also artificial selection. 
H. Conservatian Genetic 
Frankham et.al. (2002) defined the conservation genetic as the application 
of  genetics  to  preserve  species  as  dynamic  entities  capable  of  coping  with 
environmental change. Human derive  many direct and indirect benefits from the 
living  world.  Thus,  it  need  effort  to  conserving biodiversity  for  the  resources  we 
use, for the ecosystem services it provides us, for pleasure we derive from living 
organisms and for ethical reasons (Meffe and Carrol, 1994). 
Population  genetic  has  an  important  role  in  fisheries  management.  It  is 
because that the genetic resources determine the fitness of a population and it is 
an important keys for  species to survive until  next generation (Soewardi, 2007). 
Therefore conservation on genetic resources become prime interest for IUCN. 
I. Transition and Transversion 
Kimura  (1980)  said  there  are  two  base  substitutions  which  affect  on 
evolutionary distances between homologous  sequences  its  called  transition  and 
transversion.  Transition  is  a  mutation  changing  a  purine  to  another  purine 
nucleotide  (Adenine  with  Guanine)  or  a  pyrimidine  to  another  pyrimidine 
nucleotide (Cytosine with Thymine). While transversion  refers to the substitution 
of a purine for a pyrimidine or vice versa.

III. METHODOLOGY 
A. Time and Location of Research 
The  research  was  conducted  from  January  2007  until  March  2007  in 
Biological and  Nutrition Laboratory of  Loka  Riset  Budidaya  Ikan  Hias Air  Tawar 
Depok, Department of Marine Affair and Fisheries of Indonesia. 
B. Tools and Materials 
Tools  used in the research are : pincers, micropipette, scissor, Eppendorf 
microtube, waterbath incubator, vortex mixer, microcentrifuge, Centrifuge Kubota 
3740,  vacuum  desicator,  PTC­100  Master  Cycler  MJ  Research,  UV  iluminator, 
Geneaid Purification Kit, Horizontal Mini gel Kit, Digital weighing machine, Heater 
and  stirrer,  and  also  microwave  (appendix  1).  The  function  of  each  tools  are 
shown on table 1. 
Table 1. Tools used in reseach and function 
Tools 

Function 

Pincers 

putting and holding the fin 

Micropipette 

sucking and spending off the solution 

Scissor 

cutting the fin 

Eppendorf microtube 

saving the tissue or sample 

Waterbath incubator 

incubating the solution 

Vortex mixer 

mixing the solution 

Centrifuge Kubota 3740 

separate the solution in high speed 

Microcentrifuge 

separate the solution in medium speed 

Vacuum desicator 

drying the tissue 

PTC­100 Master Cycler MJ 
Research 

running the PCR process 

UV iluminator 

checking the aleles in agarose gel 

Geneaid Purification Kit 

purifying the DNA 

Horizontal Mini gel Kit 

running the electrophoresis process 

Digital weighing machine 

estimating the materials for agarose gel. 

Heater and stirrer 

stirring the agarose gel solution 

Microwave 

heating the agarose gel solution

10 

The  materials  used  are  botia’s  fin,  Proteinase­K,  buffer  solution  for 
Proteinase­K,  CTAB,  buffer  solution  CTAB,  Chloroform,  Isopropanol,  TAE  0.5x, 
ddH2O,  primer  RAG2F2  5’­ARA  CGC  TCM  TGT  CCM  ACT  GG­3’,  primer 
RAG2R6  5’  –TTT  GGR  CAR  AAG  GGC  TGG  CC­  3’,  primer  L15267  5’  –AAT 
GAC TTG AAG AAC CAC CGT­ 3’, primer  H15526 5’­CTT TGG GAG YYR RGG 
GTG RGA­ 3’, primer VGLU 5’­GAC TTG AAG AAC CAC CGT TG­ 3’, Agarose 
gel. 
C. Sampling 
Botia  samples  were  taken  from  population  of  Kalimantan  (Kapuas  river, 
West  Kalimantan)  and  Sumatera  (Batang  Hari  river,  Jambi;  Musi  river,  South 
Sumatera and Tulang Bawang river, Lampung) (shown on figure 5). The samples 
are  collected  from  fisherman  in  each  location.  There  are  5  samples  from  each 
location. 

Figure 5. Sampling location 
D. Laboratory Analysis 
Laboratory  analysis  consist  of:  DNA  extraction,  PCR  amplification, 
Electroforesis,  DNA  estimation,  DNA  purification,  and  DNA  sequencing.  The 
complete step can be seen on appendix 2.

11 

1. DNA extraction 
The  cell  was  taken  from  tissue  of  caudal  fin  for  each  extraction,  each  of 
them is 5 mg. The tissue is put into 2ml eppendorf microtube, and then it is add 
with  1010µl Proteinase­K and 400µl buffer  solution and mixed with vortex mixer 
until  homogen.  Then  it  is  incubated  in  water  bath  incubator  on  37 o C  during  12 
hours. 
Next  step,  the  mixture  added  CTAB  5%  and  600µl  buffer  solution.  Enter 
into  vortex  for  a  while  and  incubate  in  waterbath  incubator  on  60 o C  for  1  hour. 
Then  entered  into  centrifuge  Kubota  3740  on  rate  800G  for  5  minute,  then  the 
supernatant (the top layer) taken for 750µl and put into new microtube. 
Next, add 750µl chloroform 100% then put into centrifuge Kubota on 8000G 
for 5 minute, so the solution become heterogen. Take the supernatant 500µl and 
put  into  new  microtube  1,5ml  then  add  750µl  isopropanol,  put  into  centrifuge 
Kubota again on 12000G for 15 minutes, throw the dilution so only DNA remains, 
then add 750µl ethanol 70%, put into centrifuge again for 15 minutes on 12000G 
rate,  then  throw  away  the  dilution  so,  only  the  DNA  is  remains,  then  dry  its  on 
vacuum desicator for 2 hours, then add 30µl ddH2O. 
2. PCR amplification 
Total  DNA  that  we  have  gotten  amplified  to each  sample  every  5  µl  DNA 
enhanced by 25 µl Gotaq Polymerase, 2 µl Primer Forward, 2 µl Primer Reverse, 
16 µ l ddH2O. The  Primer that used for cytochrome­b amplification are L15267 
(AAT GAC TTG AAG AAC CAC CGT)  and H15526 (CTT TGG GAG YYR RGG 
GTG RGA), while for RAG2 amplified using RAG2F2 (FIG CGC TCM TGT CCM 
ACT GG), and RAG2R6 (TTT GGR CAR AAG GGC TGG CC) (based on Sullivan 
et.al.,  2000).  Hereinafter  at  tabletop  dropped  with  mineral  oil  and  entered  into 
PTC­100  Master  Cycler  MJ  Research  with  programmed  temperature  cycle  like 
seen on table 2. 
Table 2. Temperature change cycle for amplification 
o 

Step 

Temp (  C) 

Time (minute) 

Cycle 

Initial Denaturate 

95 

1 

1 

Denaturate 

92 

1 

Annealing 

50 

1 

Extension 

72 

2,5 

Final Extension 

72 

10 

35 
1

12 

3. Electrophoresis 
On this step, the DNA that have been amplified by PCR, then put into the 
hole  in  2%  Agarose  gel  (it  contain  Ethidium  Bromide)  that  have  been  put  on 
Horizontal Mini Gel Kit, with buffer TAE 0.5x solution, then flowed by electricity on 
50­70mA current for 15­30 minutes. 
4. DNA estimation 
DNA estimated by doing observation the agarose gel on UV iluminator. The 
objective  of  this  step  is  to  search  the  DNA  appearance  on  amplification  result, 
and also check alleles on DNA RAG2. 
5. DNA purification 
The  result  of  DNA  amplification  need  to  proceed  with 

purification 

processes  in order  to  separate  the  DNA  with  the  residue  of  Tag Polymerase 
enzyme  and  the  primer  used  in  amplification  step.  Geneaid  Purification  Kit  is 
used to purified DNA and the result is 35­40 ng/µl of DNA. 
6. DNA sequencing 
DNA sequencing has been done to describe  base  sequence of DNA. The 
sequencing process is done by the sequencing service of Macrogen Inc., South 
Korea  using  3730xl  DNA  analyzer.  The  data  result  in  text  data  or  fluorogram 
(appendix 3) can be downloaded from http://www.macrogen.com 
E. Data analysis 
Data  analysis  done  using  APE  packages  (Paradis  et.al.,  2004)  on  R 
language. Based on that calculation, it can be estimated  the haplotype diversity 
and genetic distance of intra population and inter population. The R script can be 
seen on appendix 4. 
1. Nucleotide diversity 
The  analysis  of  nucleotide  diversity  is  done  by  calculating  the  haplotype 
frequencies of inter population based on Nei’s formula (1987) : 

p=

å Xi
n (n - 1 ) / 2 

13 

Information : 
Л = nucleotide diversity 
Xi = different sequence frequency 
N = Number sequence 
2. Genetic distance (D) 
Genetic  distance  represent  size  measure  the  genetics  differences  among 
population.  Calculation  of  genetic  distance  based  on  Kimura  (1980)  using 
program APE (Paradis, et. al., 2004), with formula : 
D = ½ln(1­2P­Q) – ¼ln(1­2Q) 
Information : 
D = genetic distance 
P = frequencies of transition on sequence 
Q= frequencies of transversion on sequence 
3. Neighbor­joining tree 
The  neighbor­joining  tree  is  reconstructed  in  order  to  show  the  phylogeny 
tree (relationship tree). The distance among each branches represent the genetic 
distance. The neighbor joining tree is based on Saitou and Nei (1987) is done by 
using APE (Paradis, et. al., 2004).

IV. RESULT AND DISCUSSION 
A. Results 
1. Nucleotide diversity 
The result of nucleotide sequencing of  mtDNA Cytochrome b and nucleus 
DNA  RAG2  of  Chromobotia  macracanthus  showed  that  the  total  length  of 
sequence  is  about  1137  bp  for  Cytochrome  b,  and  1232  bp  for  RAG2.  The 
nucleotide composition as a result of sequencing  is presented  in table 3. 
Table 3. Nucleotide composition of Cytochrome­b and RAG2 
DNA 

Nucleotide 
A 

C 

G 

T 

Cytochrome­b 

30,54 % 

27,04 % 

14,14 % 

28,28 % 

RAG2 

24,81 % 

25,31 % 

25,49 % 

24,39 % 

Table  3  shows  that  the  nucleotide  composition  of  Cytochrome  b  are  not 
balanced  where  the  nucleotide  A  (Adenine)  on  Cytochrome  b  has  the  biggest 
composition  (30,54%)  ,  while    nucleotide  G  (Guanine)  has 

the  smallest 

composition  (14,14%).  Whereas  nucleotide  composition  of  RAG2  is  relatively 
balance  (nearly  the  same)  with  the  composition  of  nucleotide  G  (Guanine)  is 
slightly bigger (25,49%) than the  other nucleotide. 
Nucleotide diversity calculated  using APE  (Paradis, 2004)  is presented in 
table 4. 
Table 4. Nucleotide diversity on Chromobotia macracanthus population 
Population 
Batanghari 

Nucleotide diversity (Є) 
Cytochrome ­ b 

RAG2 

0,001055409 (0,01967975) 

0,0004870130 (0,01336799) 

Tulang Bawang 

0,0007036060 (0,01606845) 

0 (0) 

Musi 

0,0026385224 (0,03111641) 

0,0006493506 (0,01543603) 

Kapuas 

0,0014072120 (0,02272422) 

0 (0) 

Population of  Musi  has  the  highest  nucleotide  diversity  (0,0026385224 on 
mtDNA  Cytochrome  b  and  0,0006493506  on  nucleus  DNA  RAG2)  than  other 
population. Similarly, population of Musi has also the highest diversity based on

15 

nucleus  DNA  RAG2  sequencing.  While  for  the  other  two  population  namely 
Tulang  Bawang  and  Kapuas  nucleotide  diversity  based  on  nucleus  DNA  RAG2 
sequencing is homogen. 
2. Genetic distance based on mtDNA Cytochrome b 
The  Kimura  (1980)  genetic  distances  of  botia  populations  calculated 
using APE (Paradis,2004) of mtDNA Cytochrome b  are presented in table 5. 

Table  5.  Genetic  distance  of  Chromobotia  macracanthus  populations  based  on 
mtDNA Cytochrome b 
Population 

Batanghari 

Batanghari 

­ 

Tulang 
Bawang 

0,0014093826 

Musi 
Kapuas 

Tulang Bawang 

Musi 

Kapuas 

0,0014093826  0,0026457524  0,0629659173 
­ 

0,0026457524  0,0027173587 

0,0027173587  0,0633613309 
­ 

0,0629659173  0,0633613309  0,0643429202 

0,0643429202 
­ 

The  average  genetic  distance  of  Chromobotia  macracanthus  is  about 
0,026290. The longest genetic distance is between  Musi and Kapuas population 
(0,0643429202) as shown on table 5 . 
3. Neigbor­joining tree based on mtDNA Cytochrome b 
Based on genetic distance based on mtDNA Cytochrome b, the neighbor­ 
joining  tree  was  constructed  by  using  APE  program  (Paradis,  2004).  The 
neighbor­joining tree based on mtDNA Cytochrome b is presented in figure 6.

16 

Figure  6.  Neighbor­joining  tree  of  Chromobotia macracanthus based  on  mtDNA 
Cytochrome b. 
Based on Neighbor­joining Chromobotia macracanthus tree above showed 
that  population  of  botia  divided  into  2  group,  namely  group  of  Sumatera  and 
group of Kalimantan. 
4. Genetic distance based on nucleus DNA RAG2 
The  genetic  distance  that  have  calculated  according  to  Kimura  (1980) 
using  APE  program  (Paradis,  2004)  based  on  Nucleus  DNA  RAG2  shown  on 
table 6. 

Table 6. Genetic distance of  Chromobotia macracanthus  populations based on 
nucleus DNA RAG2 : 
Population 

Batanghari 

Batanghari 

­ 

Tulang 
Bawang 

0,0004873097 

Musi 
Kapuas 

Tulang Bawang 

Musi 

Kapuas 

0,0004873097  0,0006173712  0,0061945706 
­ 

0,0006173712  0,0003250382 

0,0003250382  0,0057036724 
­ 

0,0061945706  0,0057036724  0,0060312396 

0,0060312396 
­ 

The  genetic  distance  based  on  Nucleus  DNA  RAG2  give  more  clear 
information  that  population  of  botia  from  Sumatra  and  Kalimantan  is  separated 
genetically.  Table  6  shows  that  the  genetic  distances  among  botia  populations

17 

from  Sumatera  is  relatively  closed,  while  the  genetic  distances  among  each 
populations of  Sumatera and Kalimantan has  much more  longer distance. 
5. Neigbor­joining tree based on nucleus DNA RAG2 
The  neighbor­joining  tree  using  APE  program  (Paradis,  2004)  based  on 
nucleus DNA RAG2 is presented in figure 7. 

Figure 7. Neighbor­joining tree of Chromobotia macracanthus based on nucleus 
DNA RAG2. 

Based  on  the  neighbor­joining  tree  of  Chromobotia  macracanthus  above, 
convince  the  previous  analysis  that  the  population  of  botia  is  divided  into  2 
group, namely  group of Sumatera and group of Kalimantan  which is separated 
one and another as shown in figure 7. 
B. Discussion 
1. Genetic differentiation 
The sequencing result of DNA based on mtDNA Cytochrome b has higher 
nucleotide  diversity  than  nucleus  DNA  RAG2  because  the  mutation  rate  of 
mtDNA is relatively faster than nucleus DNA. 
The  Musi  population  has  the  biggest  nucleotide  diversity  than  other 
population. Whereas nucleotide diversity for nucleus DNA RAG2 only present on

18 

Batanghari  and  Musi  population,  while  Tulang  Bawang  and  Kapuas  are 
homogen. The high genetic diversity of Musi and Batanghari populations  may be 
determined  by  the  habitat  of  both populations as  big  river  system  so  it has  big 
population, as it was stated  by Kusumah (2007). 
Population  of  Tulang  Bawang  has  low  genetic  diversity.  It  is  because 
Tulang Bawang river  is the small  river  system on Sumatera. Small  river  system 
also  indicate  that  it  has  small  population.  In  small  population,  genetic  drift  has 
bigger role in degrading or deleting the genetic diversity of population than in big 
population (Frankham, et al., 2002). 
Population of Kapuas also has low genetic diversity. It is indicate that there 
were  bottleneck effect on  long  time ago  which affect the  genetic drift, as  it  was 
stated  by  Kusumah  (2007).  This  low  genetic  diversity  is  also  caused  by 
population restriction that happened long time ago that cause most of population 
separated with the main population. 
The genetic distance based on mtDNA Cytochrome b  among population of 
Kapuas  and  other  populations  from  Sumatera  have  long  genetic  distance,  its 
range  between  0,0629659173  (Kapuas  and  Batanghari)  and  0,0643429202 
(Kapuas  and  Musi).  In  addition  the  genetic  distance  based  on  nucleus  DNA 
RAG2  has  also  long  genetic  distance  among  Kalimantan  and  Sumatera 
population (see table 6), it is an indication  that both population groups may have 
been separated for long time. 
The botia  populations of Sumatera have closer  genetic distance, its range 
between  0,0014093826  and  0,0027173587  based  on  mtDNA  Cytochrome  b.  In 
addition  the  genetic  distance  based  on  nucleus  DNA  RAG2  has  also  closer 
genetic distance  among  populations  of  Sumatera  (see  table  6).  It  is  shown  that 
Musi, Tulang Bawang, and Batanghari have ever merged. 
Musi  and  Tulang  Bawang  population  have  closer  genetic  distance 
(0,0027173587  on  mtDNA  Cytochrome  b,  and  0,0003250382  on  nucleus  DNA 
RAG2).  It  is  suggested  that  Musi  and  Tulang  Bawang  may  have  ever  merged 
before. 
Neighbor­joining  tree  Chromobotia  macracanthus  based  on  mtDNA 
Cytochrome  b  and  nucleus  DNA  RAG2  shown  that  there  are  2  group  of 
population botia namely population group of Sumatera (Musi, Batanghari, Tulang 
Bawang) and population group of Kalimantan (Kapuas).

19 

2. Time Divergence and Speciation Process 
The  mutation  rate  on  mtDNA  Cytochrome  b  is  faster  than  nucleus  DNA 
(Baker, 2003). Doadrio and Perdices (2005) have developed time divergence for 
Cobitis (family: Cobitidae) based on the mtDNA Cytochrome b gene is 0,68% per 
pairwise  per  1  million  year.  Based  on  this  rate  of  time  divergence  it  can  be 
calculated the time divergence between population of Kalimantan with Sumatera. 
Genetic  distance  among  population  of  Kalimantan  and  Sumatera    based  on 
mtDNA  Cytochrome  b  is  6,29%­6,43%,  so  the  time  divergence  between 
population  of  Kalimantan  with  Sumatera  is  about  9,25­9,46  million  years  ago 
(Miocene era). 
The  previous  study  (Kusumah,  2007)  showed  the  botia  population  of 
Sumatera  and  Kalimantan  have  some  common  alleles  so  it  mean  that  the  two 
populations  has ever  merged  long time  before. Kottelat  et.al.  (1993)  stated  that 
Kalimantan, Sumatera, Java, and Malayan Peninsula merged into one mainland 
with Sunda shelf on pleistocene era (10.000­2.000.000 years ago). Although the 
rivers  on  Sumatera  (Musi  and  Batanghari)  merged  with  Kapuas  river  into  one 
river  system  that  flown  into  South  China  Sea  (figure  8),  there  is  no  genetic 
evidence  of  mixing  between  the  two  populations  during  the  glacial  times. 
Environmental  factor  such  as  acidity,  conductivity,  water  depth,  salinity  or 
vegetation  covered  the  area  may  have  become  the  barrier  of  both  population 
group for mixing. 

Figure 8. Map of ancient rivers system on pleistocene era (Voris, 2000)

20 

Musi  and  Batanghari  river  ever  merged  into  one ancient  river  system  that 
flow  into  South  China  Sea  (Kottelat  et.al.,  1993  and  Voris,  2000).  The  rising  of 
sea level caused by ice melting when last pleistocene era cause the ancient river 
system  sunk,  both  Musi  and  Batanghari  are  finally  separated  in  different  river 
system until now. 
Although  Musi  and  Tulang  Bawang  river  never  merged  into  one  river 
system  since  pleistocene era,  both  of populations  have  little genetic differences 
based  on  mtDNA  Cytochrome  b  and  nucleus  DNA  RAG2.  It  show  that  the 
population botia on Musi river and Tulang Bawang ever merged. Perhaps both of 
populations mixed through the flood plain area during wet season, it is also stated 
by Kusumah (2007). 
3. Population management of botia 
Population  genetic  has  an  important  role  in  fisheries  management.  It  is 
because that the genetic resources determine the fitness of a population and it is 
an  important keys for  species to  survive  until  next generation  (Soewardi, 2007). 
Therefore conservation on genetic resources become prime interest for IUCN. 
The  result  of  the  research  showed  that  there  is  low  diversity  on  botia 
population of Kapuas, so it is needed to increase the diversity in order to sustain 
the  population  of  Kalimantan.  Besides,  the  result  of  the  research  also  showed 
that there are big genetic differences between population group of Sumatera with 
population group of Kalimantan. The restocking effort for population of botia could 
not be done from population botia of Sumatera to Kalimantan and vice versa. The 
population  botia  of  Sumatera  could  not  mix  into  original  habitat  of  botia 
Kalimantan, and it may cause disturb genetically botia population of Kalimantan. 
Besides,  the botia  of Sumatera  live  as  well  in  pH  6,8­7  (Lesmana,  2002), 
while  the  pH  of  Kapuas  river  is  6,1­6,5  (Yulistiana,  2007).  The  pH  difference 
among Sumatera and Kalimantan will cause botia population of Sumatera cannot 
survive in Kalimantan. 
In  order  to  increase  the  botia  population  of  Kalimantan  diversity,  the 
artificial  selection  is  needed.  The  artificial  selection  could  be  done  by  breeding 
the  botia  of  Kapuas  with  other  botia  population  from  Kalimantan  such  as  botia 
from Mahakam river.

V. CONCLUSION AND RECOMMENDATION 
A. Conclusion 
The sequencing result of DNA based on mtDNA cytochrome b has higher 
nucleotide  diversity  than  nucleus  DNA  RAG2  because  the  mutation  rate  of 
mtDNA is relatively faster than nucleus DNA. 
Genetic  distance  between  population  group  of  Sumatera  (Musi, 
Batanghari,  Tulangbawang)  and  population group  of  Kalimantan  (Kapuas)  have 
long  genetic  distance  so  It  is  suggested  that the  botia  population  in Kalimantan 
probably considered  as a distinct species . 
The  previous  study  (Kusumah,  2007)  showed  the  botia  population  of 
Sumatera  and  Kalimantan  have  some  common  allele  so  it  mean  that  the  two 
populations has ever  merged long time before. Based on  mtDNA  Cytochrome­b 
sequencing,  the  time  divergence  between  population  group  of  Sumatera  and 
Kalimantan is about 9,25­9,46 million years ago (miocene era). 
B. Recommendation 
The  clear  genetic  differentiation  between  population  group  of  Sumatera 
and  population  group  of  Kalimantan  give  important  information  for  future 
management of botia population. 
In order  to strengthen the conclusion that botia population of Kalimantan 
is  a  distinct  species,  further  research  has  to  be  done  by  adding  some  more 
samples of botia population from different river system in Kalimantan.

REFERENCES 
Baker, A.J. 2000. Molecular  Ecology. In  : A.J. Baker. editor. Molecular  Methods 
In Ecology. Oxford : Blackwell Science. pp 1­6. 
Doadrio, I. and A. Perdices.  2005. Phylogenetic Relationships Among The Ibero­ 
African  Cobitids  (Cobitis,  Cobitidae)  Based  On  Cytochrome  b  Sequence 
Data. Molecular Phylogenetic Evolution 37: 484–493. 
Dunham,  R.  A.  2004.  Aquaculture  and  Fisheries  Biotechnology  :  Genetic 
Aprroaches. CABI Publishing. 452 p. 
Frankham, R., J. D. Ballou and D. A. Briscoe. 2002. Introduction to Conservation 
Genetics. Cambridge University Press. 617 p. 
Gustiano, R. 2003. Taxonomy and Phylogeny of Pangasiidae Catfishes from Asia 
(Ostariophysi, Siluriformes). Belgia :Katholieke Universteit Leuven. 452 p 
Griffiths, R.C., M. Bahlo and S. Tavare. 2000.  Inference From Gene Trees in A 
Subdivided Population­Theory. Population Biology 57(2): 79–95. 
Harteman,  E. 1998.  Afinitas  Komunitas  Ikan  dengan  Habitat  di  Sungai  Kapuas, 
Kabupataen  Kapuas,  Kalimantan  Tengah.  [tesis].  Program  Pasca 
Sarjana. Institut Pertanian Bogor 
Ismail,  M.Z.  1994.  Zoogeography  and  Biodiversity  of  The  Freshwater  Fishes  of 
Southeast Asia. Hydrobiologia 285 : 41­48. 
Kamal,  M.  M.  1992.  Bioekologi  Ikan  Botia  (Botia  macracanthus  Bleeker)  di 
Sungai  Batanghari,  Propinsi  Jambi.  [skripsi].  Fakultas  Perikanan.  Institut 
Pertanian Bogor. 
Kimura,  M.  1980.  Estimation  of  Evolutionary  Distance  Between  Homologous 
Nucleotide Sequences. Genetics 78: 454­458. 
Kottelat, M., A. J. Whitten, S. N. Kartikasari and S. Wirjoatmodjo. 1993. Ikan Air 
Tawar  Indonesia  Bagian  Barat  dan  Sulawesi.  Hong  Kong:  Periplus 
Editions. 575 p. 
Kottelat, M. 2004. Botia kubotai, A New Species of Loach (Teleostei : Cobitidae) 
from  The  Ataran  River  Basin  (Myanmar),  With  Comments  on  Botiinae 
Nomenclature and Diagnosis of A New Genus. Zootaxa 401: 1 ­ 18. 
Kusumah,  R.V.  2007.  Struktur  Populasi  dan  Sejarah  Kolonisasi  Ikan  Botia 
(Chromobotia  Macracanthus  Bleeker)  Berdasarkan  Sequence  (Urutan 
Basa)  Intron  dari  Gen  Aldolase  B  [skripsi].  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu 
Kelautan. Institut Pertanian Bogor. 
Lemire, 
B. 
2005. 
Mitochondrial 
Genetics. 
[serial 
http://www.wormbook.org/mitogenetics.pdf. [21 March 2007].

online]. 

23 

Lesmana, D.S. 2002. Kualitas Air  Untuk Ikan Hias Air  Tawar. Jakarta : Penebar 
Swadaya. 317 p. 
Meffe,  G.K.  and  C.R.  Carroll.  1994.  Principles  of  Conservation  Biology.  USA  : 
Sinauer Associatees. 600 p. 
NCBI.  2007.  [serial  online].  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db= 
nucleotide&val=119360455. [12 April 2007]. 
Nei,  M.  1987.  Molecular  Evolutionary  Genetics.  New  York:  Columbia  University 
Press. 565 p. 
Oulu.  2000.  Phylogeny  and  Phylogeography  of  European  Parids.  [serialonline]. 
http://herkules.oulu.fi/isbn9514255364/. [25 April 2007]. 
Paradis E., J. Claude, K. Strimmer. 2004. APE : Analyses of Phylogenetics and 
Evolution in R Language. Bioinformatics 20(2) : 289­290. 
Pouyaud  L.,  Sudarto,  G.  Teugels.  2003.  The  different  Colour  Varieties  of  The 
Asian  Arowana  Scleropages  formosus  (Osteoglossidae)  Are  Distinct 
Species: Morphologic and Genetic Evidences. Cybium 27(4) :287­305. 
Randi, E. 2000. Mitochondrial DNA. In : A.J. Baker. editor. Molecular Methods In 
Ecology. Oxford : Blackwell Science. pp 136­167. 
Rina. 2001. Keragaman Genetik Ikan Pangasius Indonesia Berdasarkan Analisa 
DNA  Mitokondria  dengan  Teknik  PCR­RFLP  [tesis].  Program  Pasca 
Sarjana. Institut Pertanian Bogor. 
Saitou,  N.  and  M.  Nei  1987.  The  Neighbor­joining  Method:  A  New  Method  for 
Reconstructing  Phylogenetic  Trees.  Molecular  Biology  and  Evolution  4: 
406–425. 
Sawaliyah,  S.R.N.  2007.  Kebiasaan  Makanan  Ikan  Botia  (Chromobotia 
macracanthus) di Daerah Aliran Sungai Musi, sumatera Selatan.[skripsi]. 
Bogor : Institut Pertanian Bogor. 

Šlechtová, V., J. Bohlen, J. Freyhof and P. Rab. 2006. Molecular Phylogeny 
of Southeast Asian Freshwater Family Botiidae (Teleostei : Cobitidae) and 
The Origin of Polyploidy in Their  Evolution. Molecular  Phylogenetics and 
Evolution 39: 529­541. 

Soewardi,  K.  2007.  Pengelolaan  Keragaman  Genetik  Sumberdaya  Perikanan 
dan  kelautan.  Departemen  Manajemen  Sumberdaya  Perairan.  Fakultas 
Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. 153 p. 
Sullivan, J., S. Lavoué, C. Hopkins. 2000. Molecular Systematics of The African 
Electric Fishes (Mormyroidea: Teleostei)  and A Model For  The Evolution 
of Their Electric Organs. Journal of Experimental Biology 203 : 665­683. 
Utami,  E.  2003.  Pengaruh  Derajat  Keasaman  Air  yang  Berbeda  Terhadap  Laju 
Pertumbuhan  dan  Kelangsungan  Hidup  Benih  Ikan  Botia  (Botia

24 

macracanthus  Bleeker).  [skripsi].  Fakultas  Perikanan  dan  ilmu  Kelautan. 
Institut Pertanian Bogor. 
Voris, H.K. 2000. Maps of Pleistocene Sea Levels in Southeast Asia : Shorelines, 
River  Systems and  Time  Durations.  Journal of  Biogeography  27  :  1153­ 
1167. 
Weber,  M.  and  L.  F.  de  Beaufort.  1916.  The  Fishes  of  the  Indo­Australian 
Archipelago. Vol VIII. E. J. Brill, Ltd. Leiden. 456 p. 
Wiley,  E.O.  1981.  Phylogenetics  :  The  Theory  and  Practice  of  Phylogenetic 
Systematics. Canada: John Wiley & Sons. 439 p. 
Wirasatya,  H.  1994.  Penelaahan  Beberapa  Karakteristik  Biologi  Populasi  Ikan 
Botia  (Botia  macracanthus  Bleeker)  di  Sungai  Batanghari  dan  Sungai 
Kapuas.[skripsi]. Fakultas Perikanan. Institut Pertanian Bogor. 
Wikipedia.2007.RAG.[serialonline].http://www.wikipedia.org/wiki/RAG.html. 
March 2007]. 

[01 

Yulistiana,  L.  2007.  Penentuan  Kualitas  Air  dan  Kajian  Daya  Tampung  Sungai 
Kapuas,  Kota  Pontianak.  [tesis].  Sekolah  Pasca  Sarjana.  Institut 
Pertanian Bogor.

26 

Appendix 1. Tools on reseach 
Microwave 

Waterbath Incubator 

PTC­100 
Research 

Master 

Cycler 

MJ 

Centrifuge Kubota 3740 

Horizontal Mini gel Kit 
Geneaid Purification Kit 

UV illuminator 

Microcentrifuge

27 

Appendix 1. Continued 
Heater and stirer 

Vacuum desicator 

Digital weighing machine 

Eppendorf microtube 

Micropipette 

Vortex mixer

28 

Appendix 2. Laboratory analysis steps 
DNA Extraction 

PCR Amplification 
+primer L15267 & H15526 
(for Cytochrome b) 
+primer RAG2F2 & 
RAG2R6 (for RAG2) 

+ 

Using PTC­100 Master Cycler MJ 
Research 

Electroforesis 
Using Horizontal Mini gel kit 
+ 2% Agarose  gel 

DNA estimation 
Result 

Using UV iluminator

DNA Purification

DNA Sequencing 

Using Macrogen Service 

DNA sequence data 
ATGGCAAGCCTACGCA 
AAACGCACCCCCTCAT 
TAAAATCGCACCCCCT 
CATTAAAATCGCACCC 
CCTCATTAAAATCG 
Fluorogram 

Text data

29 

Appendix 3. Fluorogram of sequencing result using Automatic Sequencer 3730xl machine. 
A. Forward primer

30 

Appendix 3. Continued 
B. Reverse Primer

31 

Appendix 4. R script using APE packages 
library(ape) 
cytb.botia