50
Lampiran 3. Komposisi dan Pembuatan Reagent serta Prekursor Medium
A. Reagen Salkowski
Solution A
Sebanyak 100 ml HClO
4
35 ditambahkan dengan 100 ml akuades lalu dihomogenkan
Solution B
Sebanyak 1,35 g FeCl
3
.6H
2
O dilarutkan dalam 10 ml akuades 0,5 M FeCl
3
.6H
2
O.
Sebanyak 4 ml solution B dimasukkan ke dalam 200 ml solution A sambil dihomogenkan. Setelah homogen, reagen kemudian disimpan pada wadah gelap.
B. Reagen Chloromolybdic Acid
Sebanyak 15 g Ammonium Molybdate dilarutkan ke dalam 400 ml akuades hangat, aduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah larut, sebanyak 342 ml 12 N HCl ditambahkan
sambil diaduk perlahan menggunakan magnetic stirrer. Larutan kemudian didinginkan dan ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml. Reagen disimpan pada botol gelap.
C. Reagen Chlorostannous Acid
Sebanyak 2,5 g SnCl
2
.2H
2
O dilarutkan ke dalam 10 ml HCl pekat sambil dipanaskan di labu takar hingga larutan berwarna jernih kemudiang dinginkan. Setelah dingin, larutan
ditambahkan dengan akuabides hingga volume mencapai 100 ml. Reagen disimpan pada botol gelas.
D. Substrat L-Tryptophan prekursor IAA
Sebanyak 200 mg L-Tryptophan Merck dilarutkan dalam 6 ml HCl 1 N. Setelah larut sempurna, tambahkan dengan 4 ml akuades kemudian diaduk hingga merata. Sebanyak 3
ml NaOH 2 N kemudian ditambahkan dan larutan diaduk hingga tercampur rata. Atur ph menjadi 7,0, kemudian ditambahkan dengan akuades hingga volume mencapai 20 ml.
Sterilisasi menggunakan milipore 0,2 µm, letakkan pada botol steril dan disimpan pada kulkas.
E. Substrat 1-Aminocyclopropane 1-Carboxylic Acid prekursor ACC Deaminase
Sebanyak 100 mg 1-Aminocyclopropane 1-Carboxylic Acid Sigma-Aldrich dilarutkan dalam 1,987 ml akuades untuk membuat konsentrasi sebanyak 0,5 M ACC. milipore 0,2
µm, letakkan pada botol steril dan disimpan pada suhu -20
o
C.
bio.unsoed.ac.id
51
Lampiran 4. Kurva Standar IAA Kolorimetri dan HPLC A.
Kurva Standar IAA Kolorimetri
Sebanyak 0,001 g Indole 3-Acetic Acid dilarutkan dalam 10 ml Methanol sehingga didapatkan larutan stok 100 mgL IAA. Seri pengenceran dibuat larutan induk dengan cara
melarutkan stok ke dalam medium Nutrient Broth 50 vv dengan ketentuan seperti berikut
mgL 2
4 6
8 10
12 14
16 18
20 22
IAA ml 0,1
0,2 0,3
0,4 0,5
0,6 0,7
0,8 0,9
1 1,1
NB 50 ml
5 4,9
4,8 4,7
4,6 4,5
4,4 4,3
4,2 4,1
4 3,9
Sebanyak 0,5 ml larutan induk dipindahkan ke tabung reaksi kosong kemudian ditambahkan dengan reagen Salkowski sebanyak 1 ml kemudian divortex dan inkubasi
pada ruang gelap selama 30 menit. Tiap seri pengenceran dibuat pengulangan dua kali duplo. Setelah inkubasi, nilai absorbansi diukur pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 530 nm. Data nilai absorbansi dibuat regresi linier untuk mendapatkan persamaan kurva standar IAA.
B. Kurva Standar IAA HPLC High Performance Liquid Chromatography
Sebanyak 0,01 g Indole 3-Acetic Acid dilarutkan dalam 10 ml Methanol sehingga didapatkan larutan stok 1000 mgL IAA. Seri pengenceran dibuat larutan induk dengan
cara melarutkan stok ke dalam medium Methanol vv dengan ketentuan seperti berikut
mgL 10
20 30
40 50
60 70
80 90
100 IAA ml
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
Methanol ml 5
4,95 4,9 4,85 4,8 4,75 4,7 4,65 4,6 4,55 4,5 Tiap seri pengenceran kemudian diambil sebanyak ±1 ml kemudian disaring
menggunakan milipore PTFE 0,22 µm untuk menghilangkan kotoran. Sampel kemudian diinjeksi pada alat HPLC dan tunggu hingga terbentuk peak chromatogram dan catat luas
areanya. Regresi linier dibuat berdasarkan luas area yang terbentuk.
bio.unsoed.ac.id
52
Hasil pengukuran absorbansi Kurva Standar IAA Kolorimetri
mgL abs1
abs2 Rataan
-0,0133 -0,0156 -0,01445
2 0,0162
0,0193 0,01775
4 0,0464
0,0504 0,0504
6 0,0934
0,0889 0,09115
8 0,1418
0,1392 0,1405
10 0,1611
0,178 0,178
12 0,2107
0,2281 0,2194
14 0,2485
0,262 0,25525
16 0,256
0,2991 0,2991
18 0,3126
0,332 0,332
20 0,365
0,374 0,3695
22 0,4159
0,4351 0,4159
Regresi Linier Kurva Standar IAA Kolorimetri
Berdasarkan regresi linier kurva standar IAA didapatkan persamaan :
y = 0,0197x – 0,021
Cara Perhitungan :
Abs. Sampel A = 0,567, berapa konsentrasi IAA ? y = 0,0197x - 0,021
↔ 0,0197x = y + 0,021
0,0197x = 0,567 + 0,021 0,0197x = 0,588
x = 0,5880,0197 x = 29,848
Jadi, konsentrasi IAA pada sampel A adalah 29,848 mgL.
y = 0,0197x - 0,021 R² = 0,999
-0,1 0,1
0,2 0,3
0,4 0,5
5 10
15 20
25
Nila i A
bs o
rba ns
i 5
3 nm
Konsentrasi IAA mgl
Kurva Standar IAA
Series1 Linear Series1
bio.unsoed.ac.id
53
Hasil Pengukuran Luas Area Peak Chromatogram Standar IAA HPLC mgL
Luas Peak Area
10 98409
20 248347
30 411483
40 498110
60 793498
80 1049086
90 1213242
100 1397929
Regresi Linier Kurva Standar IAA HPLC
Berdasarkan regresi linier kurva standar IAA didapatkan persamaan :
y = 13825x - 26048 Cara Perhitungan :
Luas Peak Area Sampel A = 42420, berapa konsentrasi IAA ? y = 13825x - 26048
↔ 13825x = y + 26048
13825x = 42420 + 26048 13825x = 68468
x = 6846813825 x = 4,952
Jadi, konsentrasi IAA pada sampel A adalah 4,952 mgL.
y = 13825x - 26048 R² = 0,9975
-500000 500000
1000000 1500000
20 40
60 80
100 120
A xi
s Ti
tle
Axis Title
Standar IAA-HPLC
Series1 Linear Series1
bio.unsoed.ac.id
54
Lampiran 5. Pengukuran IAA isolat Azospirillum spp. asal lahan pasir besi dengan
metode Kolorimetri
Kode Isolat
Jam Pengamatan 0 jam
24 jam 48 jam
Rataan Abs
Kons. IAA mg.L
-1
Rataan Abs
Kons.IAA mg.L
-1
Rataan Abs.
Kons.IAA mg.L
-1
HR154 0,0715
4,695 0,083
5,279 0,937
48,629 KR33
0,0804 5,147
0,818 42,589
0,7 36,599
HR92 0,0914
5,706 1,47275
75,825 1,89025
97,018 HR124
0,1051 6,401
0,36775 19,734
0,53075 28,008
HR141 0,0968
5,980 1,09625
56,713 0,952
49,391 HR152
0,1073 6,513
1,015 52,589
0,8515 44,289
Keterangan : Abs = Absorbansi; Kons = Konsentrasi
Cara Perhitungan :
Abs. Sampel A = 0,567, berapa konsentrasi IAA ? y = 0,0197x - 0,021
↔ 0,0197x = y + 0,021
0,0197x = 0,567 + 0,021 0,0197x = 0,588
x = 0,5880,0197 x = 29,848
Jadi, konsentrasi IAA pada sampel A adalah 29,848 mgL.
bio.unsoed.ac.id
55
Lampiran 6. Pengukuran IAA isolat Azospirillum spp. asal lahan pasir besi dengan
metode HPLC
Kode Isolat
Jam pengamatan 24 jam
48 jam Luas
Peak Area Jumlah IAA
mg.L
-1
Luas Peak Area Jumlah IAA
mg.L
-1
HR154 36649
4,535045 72680
7,141266 KR33
57444 6,039204
42420 4,952477
HR92 407168
31,3357 584574
44,16796 HR124
173539 14,43667
239456 19,20463
HR141 114991
10,20174 112839
10,04608 HR152
47414 5,313707
112446 10,01765
Cara Perhitungan :
Luas Peak Area Sampel A = 42420, berapa konsentrasi IAA ? y = 13825x - 26048
↔ 13825x = y + 26048
13825x = 42420 + 26048 13825x = 68468
x = 6846813825 x = 4,952
Jadi, konsentrasi IAA pada sampel A adalah 4,952 mgL.
bio.unsoed.ac.id
56
Lampiran 7. Kurva Standar Fosfat Anorganik Terlarut KH
2
PO
4
Sebanyak 0,2199 g KH
2
PO
4
dikeringkan pada oven bersuhu 60
o
C selama satu jam kemudian didinginkan di dalam dessicator hingga bobot konstan lalu dilarutkan dalam 500
ml akuades sehingga didapatkan larutan induk fosfat 100 mgL. Larutan induk kemudian dibuat seri pengenceran dengan cara memasukkan sejumlah variasi volume larutan induk
ke dalam labu takar 50 ml sehingga didapatkan konsentrasi seri pengenceran seperti berikut
mgL 5
10 15
20 30
35 40
45 Volume Lar.Induk
2,5 5
7,5 10
15 17,5
20 22,5
Larutan induk yang telah dimasukkan dalam labu takar kemudian ditambahkan dengan 10 ml reagen Chloromolybdic Acid kemudian dikocok hingga homogen. Setelah homogen
kemudian ditambahkan dengan 100 µl reagen Chlorostannous Acid dan dikocok hingga tercampur rata lalu ditambahkan akuades hingga 50 ml. Larutan akan berubah warna
menjadi biru dan tunggu hingga 10 menit kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Data absorbansi kemudian dibuat
analisis regresi liniernya sehingga didapatkan persamaan kurva standar fosfat.
bio.unsoed.ac.id
57
Hasil pengukuran nilai absorbansi kurva standar Fosfat Anorganik Terlarut mgL
Abs1 Abs2
Rataan
0,0059 0,006
0,00595
5 0,0398
0,04 0,0399
10 0,0613
0,0623 0,0618
15 0,0895
0,0901 0,0898
25 0,1356
0,1456 0,1406
30 0,1612
0,1723 0,16675
35 0,1865
0,1867 0,1866
40 0,2132
0,2201 0,21665
45 0,2358
0,241 0,2384
Regresi Linier Kurva Standar Fosfat Anorganik Terlarut Spektrofotometri
Berdasarkan regresi linier kurva standar fosfat anorganik terlarut didapatkan persamaan :
y = 0,005x + 0,0109 Cara Perhitungan :
Abs. Sampel A = 0,425, berapa konsentrasi fosfat anorganik terlarut dengan faktor pengenceran 50x ?
y = 0,005x + 0,0109 ↔
0,005x = y - 0,0109 0,005x = 0,425
– 0,0109 0,005x = 0,406
x = 0,4060,005 x = 81,2
x = 81,2 x 50 = 4060 Jadi, konsentrasi fosfat anorganik terlarut pada sampel A adalah 4060 mgL.
y = 0,005x + 0,0109 R² = 0,999
0,05 0,1
0,15 0,2
0,25
10 20
30 40
50
N il
ai A
b sor
b an
si 600
n m
Konsentrasi Fosfat mgL
Standar Fosfat Anorganik Terlarut
Series1 Linear Series1
bio.unsoed.ac.id
58
Lampiran 8. Analisis Perkecambahan Biji
Perlakuan Ulangan
Rataan Deviasi
1 2
3
KONTROL 70
80 90
80 10
HR154
90 60
60 70
17,32051 KR33
80 60
30 56,66667
25,16611 HR92
100 80
80 86,66667
11,54701 HR141
100 100
100 100
HR124
80 60
50 63,33333
15,27525 HR152
80 90
80 83,33333
5,773503
ANOVA : Faktor Tunggal
Groups Count
Sum Average
Variance
KONTROL
3 240
80 100
HR154
3 210
70 300
KR33
3 170 56,66667
633,3333 HR92
3 260 86,66667
133,3333 HR141
3 300
100
HR124
3 190 63,33333
233,3333 HR152
3 250 83,33333
33,33333
Sumber Variasi JK
DB KT
Fhitung F tabel
Perlakuan 3961,9048
6 660,3175 3,224806 2,847726
Galat 2866,6667
14 204,7619 Total
6828,5714 20
UJI BEDA NYATA TERKECIL Tabel Korelasi
KONTROL HR154
KR33 HR92
HR141 HR124 HR152
KONTROL 1
HR154 10
1 KR33
23,33333 13,33333 1
HR92 6,666667 16,66667
30 1
HR141 20
30 43,33333 13,33333 1
HR124 16,66667 6,666667 6,666667 23,33333 36,66667
1 HR152
3,333333 13,33333 26,66667 3,333333 16,66667 20
1
bio.unsoed.ac.id
59
Lampiran 9. Analisis Seedling Bioassay 15 hari setelah tanam A.
Tinggi Tanaman
Perlakuan Ulangan
Rataan Deviasi
1 2
3
KONTROL 8,7
7,3 6,2
7,400 1,253
HR154 6,8
9,8 10,5
9,033 1,966
KR33 8,5
8,3 9,8
8,867 0,814
HR92 7,2
8,4 4,6
6,733 1,943
HR141 9,5
9,1 8,9
9,167 0,306
HR124 8,7
9,5 7,8
8,667 0,850
HR152 7,6
8,2 8,4
8,067 0,416
ANOVA : Faktor Tunggal
Perlakuan Jumlah
Jumlah Rataan
Variansi
KONTROL 3
22,2 7,4
1,57 HR154
3 27,1 9,033333 3,863333
KR33 3
26,6 8,866667 0,663333 HR92
3 20,2 6,733333 3,773333
HR141 3
27,5 9,166667 0,093333 HR124
3 26 8,666667 0,723333
HR152 3
24,2 8,066667 0,173333 ANOVA
Sumber Variasi JK
DB KT
Fhitung F tabel
Perlakuan 15,1781
6 2,529683 1,63055ns 2,847726 Galat
21,72 14 1,551429
Total 36,8981
20
bio.unsoed.ac.id
60
B. Panjang Akar
